JP2003508491A - 癌および癌に関連する骨損失の予防または治療のための組成物および方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、癌に関連する骨損失の予防および／または治療のための組成物および方法に関する。詳細には本発明は、ＯＰＧ組成物ならびにその組成物を含む骨損失の予防および／または治療のための方法に関する。本発明はさらに、多発性骨髄腫の治療へのＯＰＧ組成物の使用に関するものでもある。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 （技術分野） 本発明は、癌に関連する骨損失の予防および／または治療のための組成物およ
び方法に関する。詳細には本発明は、ＯＰＧを含む組成物ならびにその組成物を
含む骨損失の予防および／または治療方法に関するものである。本発明はまた、
多発性骨髄腫の治療のためのＯＰＧ組成物の使用に関するものでもある。

【０００２】 （背景技術） 多くの癌が、腫瘍増殖の原発部位から遠く離れた組織および臓器で生じ得る。
転移癌と呼ばれるそのような癌は、多くの場合致死的な広範な合併症を引き起こ
す場合がある。骨格は、固形腫瘍が広がる一般的な部位であり、それより頻度が
高いのは肝臓および肺のみである。癌細胞が侵襲することで、骨吸収を促進する
骨における主要な細胞である破骨細胞が過度に活性化され、加速度的に骨を破壊
する。破骨細胞は、いずれも骨の微小環境で増えて腫瘍細胞によっても産生され
る副甲状腺ホルモン関連ペプチド（ＰＴＨｒＰ）およびインターロイキン−１（
ＩＬ−１）などの物質によって活性化される。骨癌患者は、破骨細胞の活動亢進
の結果として細胞溶解性骨病変を生じる場合が非常に多い。その状態は、骨溶解
性骨転移と称される。骨溶解は、病的骨折、脊髄陥凹、高カルシウム血事象およ
び骨痛を生じる場合があり、死亡および罹患の主要な原因となっている。別の形
態では、前立腺癌骨転移の場合のように、破骨細胞骨破壊の増加に、増加してい
るが無秩序な骨形成が伴う（Kylmaelae et al., Brit. J. Cancer 71, 1061-106
4 (1995)）。最初の骨が除かれ、線維性の非構造的な骨に代わることで、骨の構
造的完全性が失われる。それはまた、骨痛および他の罹患をも生じ得る。

【０００３】 さらに破骨細胞活性は、癌細胞が骨に転移してその環境で成長する性向を高め
る可能性がある。破骨細胞は、多発性骨髄腫細胞などの一部の血液腫瘍細胞にお
ける成長因子であるＩＬ−６などのサイトカイン類を放出することが明らかにな
っている（O’Keefe et al., Lab. Invest. 76, 457-465 (1997)）。さらに破骨
細胞は、骨吸収時に骨基質から成長因子を放出することが明らかになっている。
それには、多くの固形腫瘍の成長を促進することが知られている線維芽細胞成長
因子および形質転換成長因子βなどがある。そのようにして破骨活動によって、
骨内の転移播種の良好な環境が整うものと考えられ、腫瘍細胞が成長し骨吸収を
促進し始めると、骨からの成長因子を引き起こして腫瘍の拡大を促進すると考え
られる。

【０００４】 現在利用可能な癌療法薬は、腫瘍増殖を低下させたり阻害することができるが
、基礎となる溶解性骨疾患に対してはほとんど効果がない。一部の化学療法薬投
与法は実際には、多発性骨髄腫およびホジキン病などの血液癌に関連する骨損失
に寄与することが報告されており、性腺刺激ホルモン放出ホルモン受容体作働薬
の場合がある。さらに、癌が骨に広がると、現在の治療法を用いて治療すること
はより困難になる。従って、骨転移の発生を予防でき、骨転移を治療して早期に
骨損失を予防できることが望ましい。

【０００５】 骨抗吸収薬は、破骨細胞の数および／または活性を阻害し、骨が破壊される速
度を低下させる。抗吸収化合物であるリセドロネート（risedronate）、イバン
ドロネート（ibandronate）およびパミドロネート（pamidronate）などのビスホ
スホネート類が、マウス腫瘍モデルにおいて、さらには乳癌および多発性骨髄腫
ならびに他の腫瘍骨転移を患う患者において、骨格事象（例：病的骨折、脊髄陥
凹、骨の放射線照射または骨の手術）の重度を低下し得ることが報告されている
。さらにビスホスホネート類は、前立腺癌骨転移において骨痛および他の骨格事
象を軽減することが報告されている。しかしながらビスホスホネート類は効力が
限られていることが報告されており、注入によって高用量で投与した場合であっ
てもごくわずかに軽減できるだけである。経口投与した場合、ビスホスホネート
の効力は低下し、消化管刺激（例：胸焼け、消化不良および吐き気）を引き起こ
したり、場合によっては適切に投与されないと食道潰瘍を引き起こす場合がある
。

【０００６】 オステオプロテゲリン（osteoprotegerin）（ＯＰＧ）がＰＣＴ公開ＷＯ９７
／２３６１４に記載されており、in vitroおよびin vivoで破骨細胞形成を低下
させることが認められている。ＯＰＧは、ＯＰＧポリペプチドを発現するトラン
スジェニックマウスにおける骨密度を大幅に上昇させ、卵巣摘出ラットに投与し
た場合に骨損失程度を低下させた。in vitroでの破骨細胞形成におけるＯＰＧ活
性の分析から、ＯＰＧが単核球／マクロファージ前駆体からの破骨細胞の分化を
遮断することが明らかになった。ＯＰＧは、破骨細胞形成の程度を調節する上で
特異性を有するように思われる。ＯＰＧは骨吸収の遮断において強力な因子であ
り、骨量損失の予防および治療において用いることができる。破骨細胞形成阻害
および骨損失遮断のin vitroおよびin vivoでの活性も、ＯＰＧおよびＦｃドメ
インを有する融合蛋白で認められた。

【０００７】 従って本発明の目的は、現行の治療法に関連する問題の多くを克服する、癌に
関連する骨損失の治療のための代替の方法および組成物を提供することにある。

【０００８】 本発明の別の目的は、骨転移の発生率を低下させたり、骨転移の発症を遅らせ
る予防処置によって、癌に関連する骨損失を予防するための代替の方法および組
成物を提供することにある。

【０００９】 本発明のさらに別の目的は、多発性骨髄腫の予防および／または治療のための
代替の方法および組成物を提供することにある。

【００１０】 （発明の開示） 本発明は、哺乳動物における溶解性骨疾患の予防または治療方法において、治
療上有効量のＯＰＧポリペプチドを投与する段階を有することを特徴とする方法
を提供する。溶解性骨疾患は、骨に転移した癌を患う哺乳動物で一般に認められ
る。そのような癌の例としては、乳癌、前立腺癌、甲状腺癌、腎臓癌、肺癌、食
道癌、直腸癌、膀胱癌および子宮頸癌ならびに消化管の癌などがある。多発性骨
髄腫、白血病およびホジキン病などのリンパ腫のようなある種の血液癌も含まれ
る。さらには、前立腺癌などの腫瘍の場合のように、骨吸収および骨形成の両方
を増加させて、骨痛および骨の構造的完全性喪失に関連する骨硬化性骨転移ある
いは溶解性転移と骨硬化性転移の混在したものを起こす転移性骨疾患などもある
。

【００１１】 本発明はさらに、骨への癌の転移を予防する方法において、治療上有効量のＯ
ＰＧポリペプチドを投与する段階を有することを特徴とする方法をも提供する。

【００１２】 本発明はさらに、哺乳動物における転移骨疾患の予防または治療方法において
、治療上有効量のＯＰＧポリペプチドを癌治療薬との併用で投与する段階を有す
ることを特徴とする方法をも提供する。癌治療薬は、放射線療法および化学療法
薬を含む腫瘍増殖治療に使用される薬剤であればいずれであっても良い。そのよ
うな薬剤の例としては、アントラサイクリン類、タキソール、タモキシフェン、
抗Ｈｅｒ２や抗ＣＤ２０抗体のような抗体、ならびに黄体形成ホルモン放出ホル
モン（ＬＨＲＨ）拮抗薬のような受容体作働薬および拮抗薬などがある。ＯＰＧ
ポリペプチド組成物は、癌治療薬投与の前、同時または後に投与することができ
る。

【００１３】 本発明はさらに、多発性骨髄腫の治療方法において、治療上有効量のＯＰＧポ
リペプチドを投与する段階を有することを特徴とする方法をも提供する。

【００１４】 本発明のＯＰＧポリペプチドは、骨吸収阻害活性を有し、骨量損失の予防およ
び／または治療あるいは骨硬化性骨転移（構造的健全な骨が無秩序な構造的に欠
陥のある骨に代わること）の予防に用いることができるポリペプチドを包含する
。好ましい実施態様では、ＯＰＧポリペプチドは、ＯＰＧおよび異種ペプチドも
しくは蛋白を含む融合蛋白である。そのような融合蛋白は、循環半減期延長およ
びクリアランス時間の延長を示すことで、より持続的な抗吸収活性を与え、投与
回数を減らすことができる。１態様において、異種蛋白は免疫グロブリンＦｃ領
域またはそれの変異体、断片もしくは誘導体である。

【００１５】 図１は、ヒトＩｇＧγ１のヒンジ領域、ＣＨ２領域およびＣＨ３領域のアミノ
酸配列を示す図である。

【００１６】 図２は、ヒトＯＰＧのアミノ酸配列を示す図である［１−４０１］。

【００１７】 図３は、ＯＰＧ［２２−１９４］−Ｆｃのアミノ酸配列を示す図である。

【００１８】 図４は、ＯＰＧ［２２−２０１］−Ｆｃのアミノ酸配列を示す図である。

【００１９】 図５は、ＯＰＧ［２２−１９４］−ＦｃΔＣのアミノ酸配列を示す図である。

【００２０】 図６は、ＯＰＧ［２２−２０１］−ＦｃΔＣのアミノ酸配列を示す図である。

【００２１】 図７は、ＯＰＧ［２２−１９４］−ＦｃＧ_１０のアミノ酸配列を示す図である
。

【００２２】 図８は、ｍｅｔＦｃΔＣ−ＯＰＧ［２２−１９４］のアミノ酸配列を示す図で
ある。

【００２３】 図９は、骨への腫瘍転移のＣ２６−ＤＣＴモデルおよびＭＤＡ−ＭＢ−２３１
モデルにおける溶骨性骨破壊の予防を示す図である。いずれの細胞種も、マウス
の左心室に直接接種した後に、局所骨破壊（黄色矢印）を生じる。左側のパネル
は、Ｘ線写真病変がＣ２６−ＤＣＴ細胞の投与から１０日後およびＭＤＡ−ＭＢ
−２３１細胞投与から２８日後に明らかであることを示している。右側のパネル
は、１０日間にわたって３日ごとに（Ｃ２６−ＤＣＴマウスの場合）または４週
間にわたって３回／週で（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１マウスの場合）ｍｅｔＦｃΔＣ
−ＯＰＧ［２２−１９４］投与した後に、病変形成が防止されることを示してい
る。

【００２４】 図１０は、Ｃ２６−ＤＣＴ細胞を接種したマウスでＸ線写真的に明らかな溶骨
性病巣の数におけるｍｅｔＦｃΔＣ−ＯＰＧ［２２−１９４］用量依存性低下を
示す図である。

【００２５】 図１１Ａおよび１１Ｂは、マウスＣ２６−ＤＣＴ腫瘍モデルでの悪性腫瘍に関
連する高カルシウム血症の予防および回復を示す図である。予防試験では、ｍｅ
ｔＦｃΔＣ−ＯＰＧ［２２−１９４］を１日１回皮下注射によって投与した。回
復試験では、ｍｅｔＦｃΔＣ−ＯＰＧ［２２−１９４］を単回静脈注射によって
投与した。平均血中カルシウム濃度±ＳＥＭを報告している。

【００２６】 （発明を実施するための最良の形態） 本発明は、癌に関連する骨損失の予防および治療のための組成物および方法を
提供する。本発明はさらに、抗骨吸収剤を用いる癌の予防および治療方法をも提
供する。本発明の好ましい組成物および方法には、ＯＰＧおよびＯＰＧ融合ポリ
ペプチドが含まれる。詳細には本発明は、癌の予防および／または治療あるいは
癌に関連する骨損失の予防および／または治療のためのＯＰＧ融合蛋白組成物の
使用に関するものである。

【００２７】 予想外に、切断ＯＰＧポリペプチドへのＦｃ領域の融合が、未融合切断ＯＰＧ
ポリペプチドや全長成熟ＯＰＧでは認められない利点を示すことが認められた（
全長成熟ＯＰＧは、図２に示した残基２２〜４０１（両端を含む）（配列番号２
）のような３８０のアミノ酸を有する）。さらに、ＯＰＧのカルボキシ末端での
Ｆｃ領域の融合によって、ＯＰＧポリペプチドのアミノ末端でのＦｃ領域の融合
と比較して予想外の利点が得られることも認められた。従って、ＯＰＧ融合蛋白
およびそれの変異体、断片および誘導体ならびに関連する使用・製造方法につい
て以下で詳細に説明する。

【００２８】 「ＯＰＧ」または「ＯＰＧポリペプチド」という用語は、図２に示したアミノ
酸配列（配列番号２）を有するポリペプチドおよび本明細書に記載の関連ポリペ
プチドを指す。関連ポリペプチドには、対立遺伝子変異体；スプライス変異体；
断片；誘導体；置換、欠失および挿入変異体；融合ポリペプチド；ならびに非ヒ
ト相同体などがある。ＯＰＧポリペプチドは本明細書で定義の成熟ポリペプチド
であることができ、それは製造方法に応じてアミノ末端メチオニン残基を有して
いても有していなくても良い。

【００２９】 「ＯＰＧ融合蛋白」という用語は、異種のペプチドまたはポリペプチドに結合
したＯＰＧ蛋白またはＯＰＧポリペプチドを指す。本発明のＯＰＧ融合蛋白は、
ＯＰＧおよび異種ペプチドまたはポリペプチド部分の遺伝子的または化学的融合
など、当業界で公知の好適な手段によって製造することができる。本発明の１実
施態様では、異種ペプチドまたはポリペプチドは、免疫グロブリン、好ましくは
ヒト免疫グロブリンのＦｃ領域である。異種ペプチドまたは蛋白は、ＯＰＧポリ
ペプチドのアミノ末端またはカルボキシ末端のいずれかに結合させることができ
る。

【００３０】 「成熟ＯＰＧポリペプチド」または「成熟ＯＰＧ融合ポリペプチド」という用
語は、リーダー配列を持たないポリペプチドまたは融合ポリペプチドを指し、ア
ミノ末端（リーダー配列を有するものや有しないもの）および／またはカルボキ
シ末端の蛋白分解処理、相対的に大きい前駆体からの相対的に小さいポリペプチ
ドの切断、Ｎ−連結および／またはＯ−連結糖付加などの他の修飾もあり得る。

【００３１】 「Ｆｃ」という用語は、モノマー形または多重結合形を問わず、抗体の非抗原
結合部分の配列を有する分子または配列を指す。Ｆｃの元の免疫グロブリン源は
好ましくはヒト起源であり、例えばＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥまたはＩｇ
Ｄのいずれのアイソタイプからのものでもよい。単離Ｆｃ分子のある製造方法で
は、パパインで抗体を消化することで、抗体の抗原結合部分と非抗原結合部分を
分離する。単離Ｆｃ分子の別の製造方法は、組換えＤＮＡ発現と、その後のそう
して発現されたＦｃ分子の精製による製造である。全長ＦｃはＣ_Ｈ１、Ｃ_Ｈ２お
よびＣ_Ｈ３というＩｇのＨ鎖領域からなり、Ｃ_Ｈ１領域およびＣ_Ｈ２領域は代表
的には可撓性のヒンジ領域によって結合している。１実施態様ではＦｃは、図１
に示したものなどのＩｇＧ_１のアミノ酸配列を有する。「Ｆｃ蛋白」、「Ｆｃ配
列」、「Ｆｃ分子」、「Ｆｃ領域」および「Ｆｃ部分」という用語は、「Ｆｃ」
と同様の意味を有するものである。

【００３２】 ＦｃまたはＯＰＧポリペプチドあるいはそれらの融合ポリペプチドとの関連で
使用される場合の「断片」という用語は、ＦｃまたはＯＰＧポリペプチドの全長
より短いアミノ酸配列を有するペプチドまたはポリペプチドを指す。そのような
断片は例えば、アミノ末端での切断、カルボキシ末端での切断および／またはア
ミノ酸配列からの残基の内部欠失から生じ得るものである。ＯＰＧまたはＦｃ断
片は、選択的ＲＮＡスプライシングまたはin vivoプロテアーゼ活性によって得
られる場合がある。

【００３３】 ＦｃまたはＯＰＧポリペプチドあるいはそれらの融合ポリペプチドとの関連で
使用される場合の「変異体」という用語は、自然のＦｃまたはＯＰＧポリペプチ
ドアミノ酸配列と比較して１以上のアミノ酸配列の置換、欠失および／または付
加を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドを指す。変異体は、天然由来でもよ
く、人工的に構築してもよい。本発明の変異体は、自然のＦｃまたはＯＰＧポリ
ペプチドについてのＤＮＡ配列からは相応に変わっているＤＮＡ配列を有する前
記変異体をコードする相当する核酸分子から製造することができる。

【００３４】 ＦｃまたはＯＰＧポリペプチドあるいはそれらの融合ポリペプチドとの関連で
使用される場合の「誘導体」という用語は、例えば水溶性ポリマー、Ｎ−連結も
しくはＯ−連結炭水化物、糖類、リン酸および／または他のそのような分子など
の（それらに限定されるものではない）１以上のポリマーの共有結合的結合によ
って化学的に修飾されたＦｃまたはＯＰＧポリペプチド変異体またはそれの断片
を指す。誘導体は、ポリペプチドに結合した分子の種類または位置において、自
然のＦｃやＯＰＧとは異なる形で修飾される。誘導体にはさらに、ＦｃまたはＯ
ＰＧポリペプチドに自然に結合した１以上の化学基の欠失も含まれる。

【００３５】 「融合」という用語は、異なるペプチドまたは蛋白の断片の結合を指し、ペプ
チド部分もしくは蛋白部分の結合端は、互いに直接隣接していても良いか、ある
いはアミノ酸残基その他の連結基などのリンカー部分またはスペーサー部分によ
って分離されていても良い。融合は、当業者には利用可能な手順を用いる遺伝子
的または化学的手段によって行うことができる。ただし、結合手段は本明細書に
開示のものに限定されるものではない。

【００３６】 ポリペプチド類 本発明は、ＯＰＧ融合ポリペプチドおよびそれの組成物を提供し、詳細にはＯ
ＰＧ部分およびＦｃ部分を有する融合ポリペプチドを提供する。ＯＰＧポリペプ
チドへのＦｃ領域の融合は、ＯＰＧのアミオン末端で行うことができる。すなわ
ち、Ｆｃ領域のカルボキシ末端をＯＰＧのアミノ末端に融合させる。その融合蛋
白（およびそれをコードする核酸）を本明細書ではＦｃＯＰＧと称する。ＯＰＧ
のカルボキシ末端をＦｃ領域のアミノ末端に融合させることが望ましい場合もあ
る。その融合蛋白（およびそれをコードする核酸）を本明細書ではＯＰＧＦｃと
称する。

【００３７】 Ｆｃあるいはそれの変異体、断片または誘導体は、免疫グロブリン（Ｉｇ）類
からのものとすることができる。１実施態様においてＦｃは、ＩｇＧ_１、ＩｇＧ _２ 、ＩｇＧ_３およびＩｇＧ_４などのＩｇＧ類からのものである。別の実施態様で
は、ＦｃはＩｇＧ_１からのものである。Ｆｃはまた、ＩｇＧ_１およびＩｇＧ_２か
らの残基あるいはＩｇＧ_１、ＩｇＧ_２およびＩｇＧ_３からの残基など、いずれか
２以上のＩｇ類の組合せによって表されるアミノ酸残基を有することもできる。
１実施態様において、ＯＰＧ融合蛋白のＦｃ領域は、ヒトＩｇＧ_１のヒンジＣ_Ｈ ２およびＣ_Ｈ３領域を有する図１に示した配列（配列番号＿）を有する（Elliso
n et al., Nucleic Acids Res., 10, 4071-4079 (1982)参照）。

【００３８】 Ｆｃ領域における天然の変異以外に、Ｆｃの変異体、断片および誘導体は、例
えば自然または天然のＦｃにおける残基もしくは配列の置換、負荷、挿入もしく
は欠失を導入したり、あるいは化学修飾などによってＦｃ部分を修飾することで
構築されるＦｃにおける人為的変化を含んでいても良い。概してＦｃの変異体、
断片および誘導体の製造は、ＯＰＧへのＦｃ融合の循環半減期延長がかなり保持
されるように行う。

【００３９】 本発明によっては、保存的アミノ酸置換を有するＦｃおよびＯＰＧ変異体も提
供される。「保存的アミノ酸置換」という用語は、自然アミノ酸残基の人工的残
基による置換を、その位置でのアミノ酸残基の極性または電荷にほとんど影響が
ないように行うことを指す。例えば、保存的置換は、ポリペプチドにおける非極
性残基を他の非極性残基で置き換えることで行われる。保存的アミノ酸置換の一
般原則を以下の表Ｉに示してある。

【００４０】

【表１】

【００４１】 保存的アミノ酸置換はさらに、代表的には生体系での合成ではなく化学的ペプ
チド合成によって組み込まれる人為的アミノ酸残基をも含む。それには、ペプチ
ド様化合物ならびに他の逆または反転形のアミノ酸部分などがある。アミノ酸配
列への保存的修飾（およびコードヌクレオチドへの相当する修飾）は、未修飾の
Ｆｃ、ＯＰＧおよびＯＰＧ融合蛋白のものと同様の機能的および化学的特性を有
するＦｃおよびＯＰＧ分子（およびＯＰＧ融合蛋白）を生成すると予想される。

【００４２】 表Ｉに示した置換以外に、Ｆｃ領域やＯＰＧポリペプチド（またはＦｃＯＰＧ
融合蛋白）での自然残基も、「アラニン走査突然変異誘発（alanine scanning
mutagenesis」（Cunningham et al., Science 244, 1081-1085 (1989)）で既
報のように、アラニンで置換することができる。

【００４３】 ＦｃまたはＯＰＧポリペプチド（およびＯＰＧ融合蛋白）の機能的および／ま
たは化学的特性における大幅な修飾は、（ａ）シートまたはヘリカル構造として
の置換領域での分子骨格の構造、（ｂ）標的部位での分子の電荷または疎水性、
あるいは（ｃ）側鎖の嵩高さの維持に対する効果が大きく異なる置換を選択する
ことで行うことができる。天然残基は、共通の側鎖特性に基づいて以下のように
群分けすることができる。

【００４４】 １）疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ； ２）中性親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ； ３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ； ４）塩基性：Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ； ５）鎖の配向に影響する残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、ならびに ６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ。

【００４５】 非保存的置換では、別の種類からのものをそれらの種類のいずれかのものに交
換することができる。そのような置換残基は、非ヒトＦｃまたはＯＰＧと相同性
のＦｃまたはＯＰＧ分子の領域に、あるいはその分子の非相同性領域に導入する
ことができる。

【００４６】 Ｆｃ分子におけるシステイン残基を欠失させたり他のアミノ酸で置き換えるこ
とで、ジスルフィド架橋の形成を防止することができる。詳細には、図１（配列
番号１）の位置５におけるシステイン残基は、アラニンまたはセリンなどの１以
上のアミン酸で置換されても良い。別の形態として、位置５のシステイン残基は
欠失しても良いと考えられる。

【００４７】 Ｆｃ断片は、図１（配列番号１）に示したように、位置１、２、３、４および
５のいずれかでの１以上のアミン酸の欠失によって得ることができる。あるＦｃ
分子ＦｃΔＣでは、位置１〜５（両端を含む）のアミノ酸残基が欠失されている
。これらの位置での置換も行うことができ、それは本発明の範囲に含まれるもの
である。

【００４８】 抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ）および補体活性化などのエフェクター機能を
誘発するＦｃ受容体への結合低下を示すＦｃ変異体も得ることができる。そのよ
うな変異体には、欠失しているかグルタミン残基で置換された位置２０のロイシ
ン、欠失しているかアラニン残基で置換された位置１０３のグルタメート、欠失
しているかアラニン残基で置換された位置１０５および１０７のリジン（図１に
示した番号割り付けに従った）などがあり得る。そのような置換の１以上が想到
される。

【００４９】 １実施態様においてＦｃ変異体は、自然Ｆｃと比較して、ＦｃＲｎ受容体（「
サルベージ受容体」）に対する強い結合ならびに長い循環半減期を示す。そのよ
うな変異体の例としては、図１（配列番号１）に示した残基３３、３５〜４２、
５９、７２、７５、７７、９５〜９８、１０１、１７２〜１７４、２１５および
２２０〜２２３での１以上のアミノ酸置換などがあり、その場合に置換は、Ｆｃ
変異体のＦｃＲｎ受容体への比較的強い結合を与える。

【００５０】 他のＦｃ変異体には、例えばフェニルアラニン残基で置き換わった１以上のチ
ロシン残基などがある。さらに、他の変異アミノ酸の挿入、欠失および／または
置換も想到され、それらは本発明の範囲に含まれる。例としては、ＷＯ９６／３
２４７８およびＷＯ９７／３４６３０（引用によって本明細書に含まれる）に開
示のＦｃ変異体などがある。さらに変化は、ペプチド様化合物またはＤ−アミノ
酸などの変化したアミノ酸の形であることができる。

【００５１】 Ｆｃ蛋白は、スペーサー部分またはリンカー部分によって、ＯＰＧ融合ポリペ
プチドのＯＰＧ部分に連結していても良い。そのようなスペーサーまたはリンカ
ーは、１以上のアミノ酸を有するか化学的リンカーであることができる蛋白様の
ものであることができる。そのような化学的リンカーは当業界では公知である。
アミノ酸リンカー配列には、 （ａ）ａｌａ−ａｌａ−ａｌａ、 （ｂ）ａｌａ−ａｌａ−ａｌａ−ａｌａ、 （ｃ）ａｌａ−ａｌａ−ａｌａ−ａｌａ−ａｌａ、 （ｄ）ｇｌｙ−ｇｌｙ、 （ｅ）ｇｌｙ−ｇｌｙ−ｇｌｙ、 （ｆ）ｇｌｙ−ｇｌｙ−ｇｌｙ−ｇｌｙ−ｇｌｙ、 （ｇ）ｇｌｙ−ｇｌｙ−ｇｌｙ−ｇｌｙ−ｇｌｙ−ｇｌｙ−ｇｌｙ、 （ｈ）ｇｌｙ−ｐｒｏ−ｇｌｙ、 （ｉ）ｇｌｙ−ｇｌｙ−ｐｒｏ−ｇｌｙ−ｇｌｙ、 （ｊ）ｖａｌ、 （ｋ）ｓｅｒ−ｇｌｙ−ｇｌｙ−ｇｌｙ−ｇｌｙ−ｇｌｙ−ｇｌｙ−ｇｌｙ−
ｇｌｙ、 （ｌ）ｇｌｙ−ｇｌｙ−ｓｅｒ−ｇｌｙ−ｓｅｒ−ｇｌｙ−ａｌａ−ｇｌｙ−
ｓｅｒ−ｇｌｙ−ｓｅｒ−ｇｌｙ−ｇｌｙ−ｇｌｙ−ｓｅｒ−ｇｌｙ−ｓｅｒ−
ｇｌｙ−ｇｌｙ、 （ｍ）化学部分、ならびに （ｎ）小項目（ａ）〜（ｍ）のいずれかの組合せ などがあるが、これらに限定されるものではない。

【００５２】 ＯＰＧの変異体、断片および誘導体も本発明によって提供され、修飾アミノ酸
残基の特定の位置を除き、Ｆｃ分子について前述した通りである。ＯＰＧの変異
体、断片および誘導体は、ＰＣＴ ＷＯ９７／２３６１４（引用によって本明細
書に含まれる）に記載されている。

【００５３】 好ましい実施態様では、ＯＰＧ融合蛋白のＯＰＧ部分は、カルボキシ末端切断
形のＯＰＧである。カルボキシ末端切断形のＯＰＧは、図２に示した位置１８６
〜４０１から１以上のアミノ酸が欠失している。例えば、ＯＰＧ切断部は、アミ
ノ酸配列２２−Ｘ（Ｘは１８５〜４００（両端を含む）のいずれかからの残基で
ある）を有する。別の実施態様ではＯＰＧ切断部は、アミノ酸配列２２−Ｘ（Ｘ
は１８５〜２７８（両端を含む）もしくは１８５〜２９３（両端を含む）または
別の形態として１９４〜２７８（両端を含む）もしくは１９４〜２９３（両端を
含む）のいずれかからの残基である）を有する。本明細書に記載のＯＰＧ切断ポ
リペプチドを有する融合蛋白は、直接またはスペーサーもしくはリンカー分子を
介してＯＰＧと異種のペプチド部分もしくはポリペプチド部分とを結合させたも
のを含むものであり、その場合にスペーサーやリンカーは１以上のアミノ酸残基
を有していても良い。本明細書に記載のＯＰＧ切断形の変異体および誘導体も本
発明に含まれる。

【００５４】 本発明の好ましい融合蛋白には、ＯＰＧ部分が２２−Ｘ（Ｘは、図２（配列番
号２）に示した番号割り付けを用いて位置１９４〜２０１（両端を含む）からの
いずれかの残基である）を有するものを含む。そのような融合蛋白の例としては
、 ＯＰＧ［２２−１９４］−Ｆｃ（図３および配列番号３）、 ＯＰＧ［２２−２０１］−Ｆｃ（図４および配列番号４）、 ＯＰＧ［２２−１９４］−ＦｃΔＣ（図５および配列番号５）、 ＯＰＧ［２２−２０１］−ＦｃΔＣ（図６および配列番号６）、 ＯＰＧ［２２−１９４］−ＦｃＧ_１０（図７および配列番号７）、 ＦｃΔＣ−ＯＰＧ［２２−１９４］（図８および配列番号８） などがある。

【００５５】 好ましいポリペプチドでは、「Ｆｃ」という用語は図１に示したヒトＩｇＧ_１ の配列を指し；「ｆｃΔＣ」という用語は、アミノ酸残基１〜５（両端含む）を
持たない図１に示した配列（配列番号１）を指し；「ＦｃＧ_１０」という用語は
、アミノ酸残基１〜９（両端含む）を持たずｓｅｒ−（ｇｌｙ）_８リンカーを有
するＦｃ部分を指す。

【００５６】 核酸分子 本発明のＯＰＧ融合蛋白またはそれの変異体、断片もしくは誘導体をコードす
る核酸分子が本発明によって提供される。本発明の核酸分子は、当業者には公知
の組換えＤＮＡ法によって製造することができる（突然変異誘発法の説明につい
ては、例えばSambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Col
d Springs Harbor Laboratory Press, Cold Springs Harbor, N.Y. (1989)およ
びAusubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Wiley and Sons
, N.Y. (1994)参照）。エンゲルスら報告の方法（Engels et al., Angew. Chem.
Intl. Ed., 28, 716-734 (1989)）を用いる化学合成を用いて、そのような変異
体を製造することもできる。当業者に公知の他の核酸分子製造法も使用可能であ
る。

【００５７】 ある種の実施態様では、上記で定義の保存的アミノ酸置換を有するＯＰＧ融合
蛋白変異体をコードする。例えば、保存的アミノ酸置換は、ＯＰＧおよび／また
は融合蛋白のＦｃ部分で行う。１以上のＮ−連結またはＯ−連結糖付加部位の付
加および／または欠失を有するかあるいは上記のＦｃもしくはＯＰＧポリペプチ
ド断片を有するＦｃまたはＯＰＧ変異体も提供される。本発明の核酸分子は本明
細書に記載のＦｃおよび／またはＯＰＧの変異体、断片および融合ポリペプチド
のいかなる組合せもコードすることができる。

【００５８】 別の実施態様では本発明の核酸は、所定の宿主細胞でのＯＰＧ融合ポリペプチ
ドの最適発現のために変更を加えたコドンを含む。特定のコドン変更は、ＯＰＧ
融合ポリペプチドおよび発現のために選択される宿主細胞によって決まる。その
ような「コドン最適化」は、例えば所定の宿主細胞でかなり発現される遺伝子で
用いるのに好ましいコドンを選択するなどの各種方法によって行うことができる
。高度に発現される細菌遺伝子のコドン優先性についての「Ｅｃｏｈｉｇｈ．Ｃ
ｏｄ」などのコドン頻度表を組み込んだコンピュータアルゴリズムを用いること
ができ、それはウィスコンシン大学のソフトウェア（the University of Wiscon
sin Package Version 9.0, Genetics Computer Group, Madison, WI）によって
提供される。他の有用なコドン頻度表には、「Ｃｅｌｅｇａｎｓ＿ｈｉｇｈ．ｃ
ｏｄ」、「Ｃｅｌｅｇａｎｓ＿ｌｏｗ．ｃｏｄ」、「Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ＿ｈ
ｉｇｈ．ｃｏｄ」、「Ｈｕｍａｎ＿ｈｉｇｈ．ｃｏｄ」、「Ｍａｉｚｅ＿ｈｉｇ
ｈ．ｃｏｄ」および「Ｙｅａｓｔ＿ｈｉｇｈ．ｃｏｄ」などがある。

【００５９】 ベクターおよび宿主細胞 ＯＰＧ融合ポリペプチドをコードする核酸分子は、標準的な連結法を用いて適
切な発現ベクター中に挿入する。ベクターは代表的には、使用される特定の宿主
細胞で機能するよう選択される（すなわち、ベクターが宿主細胞の機構に適合し
ていて、遺伝子の増幅および／または遺伝子の発現が起こり得る）。ＯＰＧ蛋白
をコードする核酸分子は、原核、酵母、昆虫（バキュロウイルス系）および／ま
たは真核の宿主細胞で増幅／発現され得る。宿主細胞の選択は一部には、ＯＰＧ
蛋白を翻訳後に修飾すべきか否か（例：糖付加および／またはリン酸化）によっ
て決まる。そうであれば、酵母、昆虫または哺乳動物の宿主細胞が好ましい。

【００６０】 代表的には、いずれかの宿主細胞で用いられる発現ベクターは、プラスミド維
持ならびに外来ヌクレオチド配列のクローニングおよび発現のための配列を有す
る。ある種の実施態様において「フランキング配列」と総称されるそのような配
列には代表的には、プロモーター、１以上のエンハンサー配列、複製起点、転写
終止配列、供与体および受容体スプライス部位を有する完全イントロン配列、分
泌のためのリーダー配列、リボソーム結合部位、ポリアデニル化配列、発現すべ
きポリペプチドをコードする核酸を挿入するためのボリリンカー領域ならびに選
択可能なマーカー要素のような１以上のヌクレオチドなどがある。

【００６１】 フランキング配列は、同種（すなわち、宿主細胞と同じ動物種および／または
株から）、異種（すなわち、宿主細胞の動物種や株とは異なる動物種から）、ハ
イブリッド（すなわち、複数起源からのフランキング配列の組合せ）、あるいは
通常はＯＰＧおよび／またはＦｃ蛋白発現を調節する機能を有する合成または自
然の配列であることができる。フランキング配列の起源はそれ自体、フランキン
グ配列が宿主細胞の機構で機能性であってそれによって活性化され得る限りにお
いて、原核生物もしくは真核生物、脊椎動物もしくは無脊椎動物あるいは植物で
あることができる。

【００６２】 リーダー配列またはシグナル配列を用いて、宿主細胞からのＯＰＧ融合ポリペ
プチドを配向させることができる。シグナル配列は最も一般的には、ＯＰＧ融合
ポリペプチドコード領域の５’末端に直接配置される。多くの信号配列が確認さ
れており、選択された宿主細胞で機能性であるものを、ＯＰＧ融合蛋白をコード
する核酸配列と併用することができる。例えば信号配列は、ＯＰＧもしくはＦｃ
遺伝子またはｃＤＮＡに対して同種（天然）または異種であることができる。さ
らに信号配列は、上記の方法を用いて化学的に合成することができる。ほとんど
の場合、シグナル配列の存在を介した宿主細胞からのＯＰＧポリペプチドの分泌
によって、融合ポリペプチドからシグナルペプチドが取り除かれる。

【００６３】 シグナル配列はベクターの構成要素であることができるか、あるいはベクター
に挿入されるＯＰＧ ＤＮＡの一部であることができる。例えばＯＰＧ ＤＮＡ
は、分子の翻訳後処理によって成熟蛋白を形成する際に開裂する蛋白のアミノ末
端の信号配列をコードする（図２参照）。自然シグナル配列を有するＯＰＧヌク
レオチドならびに自然シグナル配列が欠失して異種シグナル配列に置き換わって
いるＯＰＧヌクレオチドは、本発明の範囲に含まれる。選択される異種シグナル
配列は、宿主細胞によって認識および処理（すなわち、シグナルペプチダーゼに
よる開裂）されるものでなければならない。１実施態様では、異種シグナル配列
は、ＷＯ９７／２３６１４に記載のＯＰＧシグナル配列である。自然ＯＰＧシグ
ナル配列を認識・処理しない原核宿主細胞の場合、シグナル配列は、例えばアル
カリホスファターゼ、ペニシリナーゼまたは耐熱性エンテロトキシンＩＩリーダ
ーの群から選択される原核シグナル配列によって置換する。酵母分泌の場合、自
然ＯＰＧシグナル配列は、酵母インベルターゼ、α因子または酸ホスファターゼ
リーダーによって置換しても良い。哺乳動物細胞発現では自然シグナル配列で十
分である。ただし、他の哺乳動物シグナル配列が好適な場合もある。

【００６４】 本発明を実施する上で好ましいベクターは、細菌、昆虫および哺乳動物宿主細
胞と適合性のものである。そのようなベクターには特に、ｐＣＲＩＩ、ｐＣＲ３
およびｐｃＤＮＡ３．１（Invitrogen Company, San Diego, CA）、ｐＢＳＩＩ
（Stratagene Company, La Jolla, CA）、ｐＥＴ１５ｂ（Novagen, Madison, WI
）、ｐＧＥＸ（Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ）、ｐＥＧＦＰ−Ｎ２（Clo
netech, Palo Alto, CA）、ｐＥＴＬ（BlueBacII；Invitrogen）、ｐＤＳＲα２
（ＰＣＴ公開番号ＷＯ９０／１４３６３）およびｐＦａｓｔＢａｃＤｕａｌ（Gi
bco/BRL, Grand Island, NY）などがある。

【００６５】 別の可能なベクターには、コスミド類、プラスミド類または変性ウィルス類な
どがあるが、それらに限定されるものではなく、そのベクター系は選択される宿
主細胞と適合性がなければならない。そのようなベクターには、ブルースクリプ
ト（Bluescript）プラスミド誘導体（高コピー数ＣｏｌＥ１に基づくファージミ
ド（phagemid）、Stratagene Cloning Systems Inc., La Jolla CA）、Ｔａｑ増
幅ＰＣＲ産生物をクローニングするためのＰＣＲクローニングプラスミド類（例
：ＴＯＰＯ（登録商標）ＴＡクローニングキット、ＰＣＲ２．１プラスミド誘導
体、Invitrogen, Carlsbad, CA）ならびにバキュロウィルス発現系などの哺乳動
物、酵母またはウィルスのベクター（ｐＢａｃＰＡＫプラスミド誘導体、Clonet
ech, Palo Alto, CA）などのプラスミドがあるが、それらに限定されるものでは
ない。組換え分子は、トランスフォーメーション、トランスフェクション、感染
、エレクトロポレーションその他の公知の技術を用いて宿主細胞に導入すること
ができる。ベクターを構築し、ＯＰＧ融合ポリペプチドをコードする核酸分子を
ベクターの適切な部位に挿入した後、完成したベクターを好適な宿主細胞に挿入
して、増幅および／またはポリペプチド発現を行うことができる。

【００６６】 宿主細胞は、原核宿主細胞（大腸菌など）または真核宿主細胞（酵母細胞、昆
虫細胞または脊椎動物細胞）であることができる。適切な条件下で培養すると宿
主細胞はＯＰＧポリペプチドを合成し、それを次に培地から回収することができ
るか（宿主細胞がそれを培地中に分泌する場合）、それを産生する宿主細胞から
直接回収することができる（分泌されない場合）。適切な宿主細胞の選択は、所
望の発現レベル、糖付加やリン酸化のように活性化に望ましかったり必要なポリ
ペプチド修飾、ならびに生理活性分子への折り畳みの容易さなどの各種要素によ
って決まる。

【００６７】 好適な宿主細胞または細胞系は、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）
（ＡＴＣＣ＃ＣＣＬ６１およびUrlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77 , 4216-4220 (1980)）、ヒト胎児腎臓（ＨＥＫ）２９３もしくは２９３Ｔ細胞（
ＡＴＣＣ＃ＣＲＬ１５７３）または３Ｔ３細胞（ＡＴＣＣ＃ＣＲＬ１６５８）な
どの哺乳動物細胞であることができる。好適な哺乳動物宿主細胞の選択ならびに
トランスフォーメーション、培養、増幅、スクリーニングおよび生成物の製造・
精製の方法は当業界では公知である。他の好適な哺乳動物細胞系には、サルＣＯ
Ｓ−１およびＣＯＳ−７細胞系（ＡＴＣＣ＃ＣＲＬ１６５１）およびＣＶ−１細
胞系（ＡＴＣＣ＃ＣＣＬ７０）がある。哺乳動物宿主細胞のさらに別の例として
は、形質転換細胞系を含めた霊長類細胞系および齧歯類細胞系などがある。通常
の二倍体細胞、一次組織のin vitro培養から誘導される細胞株ならびに一次外植
片も好適である。候補となる細胞は、選択遺伝子が遺伝子型的に欠落しているこ
とができるか、あるいは優性作用性の選択遺伝子を有することができる。他の好
適な哺乳動物細胞系には、マウス神経芽細胞腫Ｎ２Ａ細胞、ＨｅＬａ、マウスＬ
−９２９細胞、スイス由来の３Ｔ３系、Ｂａｌｂ−ｃもしくはＮＩＨマウス、Ｂ
ＨＫもしくはＨａＫハムスター細胞系などがあるが、それらに限定されるもので
はない。それらの細胞系はそれぞれ、当業者には公知であって利用可能である。

【００６８】 本発明に好適な宿主細胞として同様に有用なものには細菌細胞がある。例えば
、各種大腸菌株（例：ＨＢ１０１、ＤＨ５ａ、ＤＨ１０およびＭＣ１０６１）は
バイオテクノロジーの分野で宿主細胞として公知である。枯草菌、シュードモナ
ス菌、他のバチルス菌、ストレプトミセス菌などの各種菌株もこの方法では用い
ることができる。

【００６９】 当業者には公知の多くの酵母細胞株も、本発明のポリペプチド類発現のための
宿主細胞として利用可能である。好ましい酵母細胞には例えば、Saccharomyces
cerivisaeなどがある。

【００７０】 さらに所望に応じて、本発明の方法で昆虫細胞系を利用することができる。そ
のような系は、文献に記載されている（例えば、Kitts et al., Biotechniques,
14, 810-817 (1993); Lucklow, Curr. Opin. Biotechnol., 4, 564-572 (1993)
; Lucklow et al., J. Virol., 67, 4566-4579 (1993)）。好ましい昆虫細胞は
Ｓｆ−９およびＨｉ５（Invitrogen, Carlsbad, CA）である。

【００７１】 ＯＰＧポリペプチド用の発現ベクターの特定の宿主細胞へのトランスフォーメ
ーションまたはトランスフェクションは、塩化カルシウム、エレクトロポレーシ
ョン、微量注入、リポフェクションまたはＤＥＡＥ−デキストラン法のような方
法などの公知の方法によって行うことができる。選択される方法は部分的に、使
用する宿主細胞の種類によって決まる。それらの方法および他の好適な方法は当
業者には公知であり、例えばサムブルックらの報告（Sambrook et al., supra）
に記載されている。

【００７２】 ポリペプチド産生 トランスフォーメーションまたはトランスフェクションによってＯＰＧ融合ポ
リペプチドをコードする発現ベクターを有する宿主細胞は、当業者には公知の標
準的な培地を用いて培養することができる。培地は通常、細胞の成長および生存
に必要な全ての栄養素を含む。大腸菌細胞の培養に好適な培地は例えば、ルリア
（Luria）肉汁（ＬＢ）および／またはテリフィック（Terrific）肉汁（ＴＢ）
である。真核細胞の培養に好適な培地は、ＲＰＭＩ１６４０、ＭＥＭ、ＤＭＥＭ
であり、これらのいずれにも培養する特定の細胞系での必要に応じて血清および
／または成長因子を補給することができる。昆虫培養に好適な培地は、必要に応
じてイーストレート（yeastolate）、ラクトアルブミン加水分解物質および／ま
たはウシ胎仔血清を補給したグレース培地（Grace’s medium）（Gibco Life Te
chnologies, Gaithersburg, MD）である。

【００７３】 代表的には、トランスフェクション細胞または形質転換細胞の選択的成長に有
用な抗生物質その他の化合物を培地に補給剤として加える。使用する化合物は、
宿主細胞がトランスフォーメーションされるプラスミド上に存在する選択可能な
マーカー要素によって指示される。例えば選択可能マーカー要素がカナマイシン
耐性である場合、培地に加える化合物はカナマイシンであり、選択可能マーカー
要素がアンピリシン耐性である場合、培地に加える化合物はアンピリシンである
。

【００７４】 宿主細胞が産生するＯＰＧ融合ポリペプチドの量は、当業界で公知の標準的な
方法を用いて評価することができる。そのような方法には、ウェスタンブロット
分析、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動、非変性ゲル電気泳動、ＨＰＬ
Ｃ分離、免疫沈殿および／またはＤＮＡ結合ゲルシフトアッセイのような活性ア
ッセイなどがあるが、それらに限定されるものではない。

【００７５】 標識を設けずにＯＰＧ融合ポリペプチドを得て、抗体が使用できない場合、他
の公知の精製手順を用いることができる。そのような方法には、イオン交換クロ
マトグラフィー、分子ふるいクロマトグラフィー、ＨＰＬＣ、自然ゲル電気泳動
とゲル溶出の併用、ならびに分取等電点電気泳動（「アイソプライム（Isoprime
）」装置／方法、Hoefer Scientific）などがあるが、これらに限定されるもの
ではない。場合によっては、２以上のこれら技術を併用して、純度を高めること
ができる。

【００７６】 ＯＰＧ融合ポリペプチドが細胞内で産生される場合、当業者には公知の標準的
な方法を用いて、宿主細胞から細胞内材料（グラム陰性菌の封入体など）を抽出
することができる。例えば宿主細胞を溶解して、フレンチプレス、ホモジナイゼ
ーションおよび／または超音波処理とそれに続く遠心によって、ペリプラズム／
細胞質の内容物を放出させることができる。

【００７７】 ＯＰＧ融合ポリペプチドが細胞質ゾルに封入体を形成している場合、その封入
体は多くの場合、内側および／または外側細胞膜に結合することができ、従って
遠心後には主としてペレット物の状態で認められる。そのペレット物を極端なｐ
Ｈで処理するか、あるいはアルカリ性ｐＨでジチオスレイトールまたは酸性ｐＨ
でトリスカルボキシエチルホスフィンなどの還元剤存在下に、界面活性剤、グア
ニジン、グアニジン誘導体、尿素もしくは尿素誘導体などのカオトロピック剤で
処理することで、封入体を放出、破壊および可溶化することができる。そうして
可溶型となったＯＰＧ融合ポリペプチドを、ゲル電気泳動、免疫沈殿などを用い
て分析することができる。ＯＰＧポリペプチドを単離することが望ましい場合、
以下に記載のものならびにマーストンらの報告（Marston et al., Meth. Enz., 182 , 264-275 (1990)）に記載のものなどの標準的な方法を用いて単離を行うこ
とができる。

【００７８】 場合によっては、ＯＰＧ融合ポリペプチドは、単離した時点では生理活性では
ないことがある。ポリペプチドをそれの三次構造に「再折畳み」または変換し、
ジスルフィド連結を形成する各種方法を用いて、生理活性を回復させることがで
きる。そのような方法には、可溶化ポリペプチドを特定濃度のカオトロピック剤
存在下に通常７を超えるｐＨに曝露する方法などがある。カオトロピック剤の選
択は、封入体可溶化で用いる選択肢と全く同様であるが、通常カオトロピック剤
は低濃度で用い、必ずしも可溶化で用いるカオトロピック剤と同一ではない。ほ
とんどの場合、再折畳み／酸化溶液はまた、還元剤あるいは所定の比率での還元
剤とそれの酸化型を含有して、特定の酸化還元電位を生じることで、蛋白のシス
テイン架橋形成時にジスルフィドシャッフリング（shuffling）が生じ得る。一
般に用いられる酸化還元対の一部には、システイン／シスタミン、グルタチオン
（ＧＳＨ）／ジチオビスＧＨＳ、塩化第二銅、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）／
ジチアンＤＴＴ、ならびに２−メルカプトエタノール（βＭＥ）／ジチオ−β（
ＭＥ）などがある。多くの場合、共溶媒を用いることができるか、あるいは再折
り畳みの効率を高めるために共溶媒が必要な場合があり、それに関して使用され
る比較的一般的な試薬には、グリセリン、各種分子量のポリエチレングリコール
、アルギニンなどがある。

【００７９】 誘導体 本発明のＯＰＧ融合蛋白ならびにそれの変異体および断片は、１以上の化学部
分を付加させることで誘導体化される。例として、ＯＰＧおよびＦｃポリペプチ
ドの融合体を、ＯＰＧ部分またはＦｃ部分あるいはその両方で誘導体化すること
ができる。これらの化学修飾誘導体はさらに、以下に説明する動脈、腹腔内、筋
肉、皮下、静脈、経口、経鼻、肺、局所その他の投与経路用に製剤することがで
きる。生理活性蛋白の化学修飾は、治療薬蛋白の安定性および循環時間の増加な
らびに免疫原性の低下など、ある種の環境下で新たな利点を提供することが認め
られている（米国特許４１７９３３７号参照。総覧については、Abuchowski et
al., Enzymes and Drugs, J. S. Holcerberg and J. Roberts, eds. pp.367-383
(1981); Francis et al., supra参照）。

【００８０】 そのような誘導体化に好適な化学部分は、各種水溶性ポリマーから選択するこ
とができる。当業者であれば、ポリマー／蛋白結合体を治療に用いるか否か、そ
うであれば所望の用量、循環時間、蛋白分解への耐性ならびにその他の考慮事項
のような検討事項に基づいて所望のポリマーを選択することができる。本発明の
蛋白では、誘導体化の有効性は、所望の形で誘導体を投与し（すなわち、浸透ポ
ンプあるいは好ましくは注射もしくは注入によって、あるいは例えば経口投与、
肺投与もしくは経鼻投与用にさらに製剤して）、本明細書に記載の方法に従って
生理効果を観察することで確認することができる。

【００８１】 水溶性ポリマーは、例えばポリエチレングリコール、エチレングリコール／プ
ロピレングリコールの共重合体、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、
ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ−１，３−ジオキソラン、
ポリ−１，３，６−トリオキソラン、エチレン／無水マレイン酸共重合体、ポリ
アミノ酸類（単独重合体またはランダム共重合体）、ならびにデキストランまた
はポリ（ｎ−ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、プロピレングリコー
ル単独重合体類、ポリプロピレンオキサイド／エチレンオキサイド共重合体類、
ポリオキシエチル化ポリオール類、ならびにポリビニルアルコールからなる群か
ら選択することができる。ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドは、水
でのそれの安定性のために製造において有利な場合がある。さらに、コハク酸塩
およびスチレンも用いることができる。さらに、ポリアミノ酸類は、血清アルブ
ミン（ヒト血清アルブミンなど）またはリジン類などの他のポリアミノ酸類から
なる群から選択することができる。

【００８２】 ポリマーはいかなる分子量のものでも良く、分岐または未分岐であることがで
きる。ポリエチレングリコールの場合、好ましい分子量は、取り扱いおよび製造
を容易にするため約２ｋＤａ〜約１００ｋＤａである（「約」という用語は、ポ
リエチレングリコールの製造で、一部の分子が記載の分子量より大きいか、場合
によってはそれより小さいことを示している）。

【００８３】 ＯＰＧ融合ポリペプチドにそのように結合したポリマー分子の数は変動し得る
もので、当業者であれば機能に対する効果を確認することができる。モノ誘導体
化を行うことができるか、あるいは同一または異なる化学部分でジ、トリ、テト
ラまたはいくつかの誘導体化の組合せを行うことができる（例：異なる分子量の
ポリエチレングリコールなどのポリマー）。ポリマー分子の蛋白（またはペプチ
ド）分子に対する割合は、反応混合物中のそれらの濃度と同様に変動し得る。概
して至適な比率（過剰な未反応蛋白またはポリマーがない反応効率に関して）を
、所望の誘導体化程度（例：モノ、ジ、トリなど）、選択するポリマーの分子量
、ポリマーが分岐であるか未分岐であるか、反応条件などの要素によって決定す
る。

【００８４】 化学部分は、蛋白の機能または抗原領域に対する効果を考慮して、ＯＰＧ融合
蛋白に結合させなければならない。当業者には利用可能な多くの結合方法がある
（引用によって本明細書に含まれるＥＰ０４０１３８４（ＰＥＧのＧ−ＣＳＦへ
の結合）；Malik et al., Exp. Hematol. 20, 1028-1035 (1992)（トレシル（tr
esyl）クロライドを用いるＧＭ−ＣＳＦのペギル化（pegylation）を報告）。例
えばポリエチレングリコールは、遊離アミノ基（例：リジン、アルギニンまたは
Ｎ末端アミノ酸残基）または遊離カルボキシル基（例：アスパラギン酸、グルタ
ミン酸およびＣ末端アミノ酸残基）を有するアミノ酸残基を介して共有結合的に
結合することができる。遊離スルフヒドリル基を有するアミノ酸残基（例：シス
テイン）も用いることができる。治療上好ましいのは、Ｎ末端またはリジン基で
の結合などのアミノ基での結合である。受容体結合に重要な残基での結合は、受
容体結合が望ましい場合には回避しなければならない。

【００８５】 具体的にＮ末端で化学修飾されたＯＰＧ融合蛋白が必要な場合がある。化学部
分の例としてポリエチレングリコールを用いると、遊離アミノ酸でポリペプチド
を誘導体化し、Ｎ末端でペギル化されたものをペギル化蛋白分子の群から分離す
ることで、実質的にＮ末端でペギル化されたＯＰＧ融合ポリペプチドを得ること
ができる。別法として、特定蛋白での誘導体化に利用可能な各種１級アミノ基の
反応性差（リジンとＮ末端）を利用する還元的アルキル化によって、選択的Ｎ末
端化学修飾を行うことができる。適切な反応条件下で、含カルボニル基ポリマー
によるＮ末端での蛋白の実質的に選択的な誘導体化を行う。１個の反応性アルデ
ヒドを有するポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドを用いることができ
る。

【００８６】 Ｎ末端でモノペギル化された誘導体は、治療薬製造を容易にする上で好ましい
。生成物の特性決定がジ、トリその他の複数ペギル化生成物と比較して簡単にな
ることから、Ｎ末端ペギル化によって同種生成物が確実に得られる。Ｎ末端生成
物取得に上記還元的アルキル化法を用いることが、商業的製造を容易にする上で
好ましい。

【００８７】 ポリペプチドの用途 本発明の融合ポリペプチドは、骨量喪失の予防および／または治療；構造的に
健全な骨の無秩序な骨による交替の予防および／または治療；あるいは骨への転
移の予防で用いられる。骨喪失は、原発性骨粗鬆症、内分泌性骨粗鬆症（甲状腺
機能亢進症、上皮小体機能亢進症、クッシング症候群および先端肥大症）、遺伝
型および先天型の骨粗鬆症（骨形成不全症、ホモシスチン尿症、メンケス症候群
およびライリー−デイ症候群）ならびに四肢の固定化による骨粗鬆症などの骨粗
鬆症；成人および青少年における骨のページェット病（変形性骨炎）；骨損失に
つながる骨髄炎すなわち骨における感染病変；固形癌（乳癌、肺癌および腎臓癌
）および血液癌（多発性脊髄炎、リンパ腫および白血病）、特発性高カルシウム
血症ならびに甲状腺機能亢進症および腎機能障害に関連する高カルシウム血症か
ら生じる高カルシウム血症；手術後オステオペニア、ステロイド投与によって誘
発されるオステオペニア、小腸および大腸の障害ならびに慢性の肝臓疾患および
腎臓疾患に関連するオステオペニア；外傷に関連する骨壊死すなわち骨細胞死ま
たはゴーシェ病、鎌状赤血球貧血、全身性紅斑性狼瘡および他の状態に関連する
非外傷性壊死；慢性関節リウマチによる骨損失；歯周骨損失；骨関節炎；補綴具
の緩み；ならびに溶骨性転移などの各種状態で発症する。構造的に健全な骨の無
秩序な構造的に不完全な骨による交替が、成人および青少年での骨のページェッ
ト病（変形性骨炎）；上皮小体機能亢進症、線維性骨異形成症などの先天性骨障
害、骨硬化性骨転移において認められる。

【００８８】 本発明の１実施態様では、本発明のＯＰＧ融合ポリペプチドは、活性上昇およ
び循環半減期延長によって、骨損失の治療、特には悪性腫瘍または転移腫瘍によ
って引き起こされる骨の溶骨破壊によって生じる骨損失の治療に有利に用いられ
る。本発明のＯＰＧポリペプチドを用いて、乳癌、前立腺癌、甲状腺癌、腎臓癌
、肺癌、食道癌、直腸癌、膀胱癌、子宮頸癌、卵巣癌および肝臓癌ならびに消化
管の癌を治療することができる。多発性骨髄腫などのある種の血液癌ならびにホ
ジキン病などのリンパ腫に関連する骨損失も含まれる。

【００８９】 本発明のＯＰＧ融合ポリペプチドは、単独であるいは他の治療薬との併用で、
特には他の癌治療薬との併用で投与することができる。そのような薬剤には、放
射線療法や化学療法などがある。化学療法では、アントラサイクリン類、タキソ
ール、タモキシフェン、ドキソルビシン、５−フルオロウラシルならびに当業者
に公知の他の薬剤のうちの１以上の投与を行うと考えられる。１実施態様では、
癌治療薬は黄体形成ホルモン放出ホルモン（ＬＨＲＨ）拮抗薬、好ましくはペプ
チド拮抗薬である。より好ましくはＬＨＲＨ拮抗薬は、 Ａ−Ｂ−Ｃ−Ｄ−Ｅ−Ｆ−Ｇ−Ｈ−Ｉ−Ｊ という構造を有するデカペプチドまたはそれの医薬的に許容される塩である。

【００９０】 上記構造において、 Ａはｐｙｒｏ−ｇｌｕ、Ａｃ−Ｄ−Ｎａｌ、Ａｃ−Ｄ−Ｑａｌ、Ａｃ−Ｓａｒ
またはＡｃ−Ｄ−Ｐａｌであり； ＢはＨｉｓまたは４−Ｃｌ−Ｄ−Ｐｈｅであり； ＣはＴｒｐ、Ｄ−Ｐａｌ、Ｄ−Ｎａｌ、Ｌ−Ｎａｌ−Ｄ−Ｐａｌ（Ｎ−Ｏ）ま
たはＤ−Ｔｒｐであり； ＤはＳｅｒであり； ＥはＮ−Ｍｅ−Ａｌａ、Ｔｙｒ、Ｎ−Ｍｅ−Ｔｙｒ、Ｓｅｒ、Ｌｙｓ（ｉＰｒ
）、４−Ｃｌ−Ｐｈｅ、Ｈｉｓ、Ａｓｎ、Ｍｅｔ、Ａｌａ、ＡｒｇまたはＩｌｅ
であり； Ｆは

【００９１】

【化２】 であり（式中、ＲおよびＸは独立にＨおよびアルキルであり；Ｙは小さい極性部
分を有する）； ＧはＬｅｕまたはＴｒｐであり； ＨはＬｙｓ（ｉＰｒ）、Ｇｌｎ、ＭｅｔまたはＡｒｇであり； ＩはＰｒｏであり； ＪはＧｌｙ−ＮＨ_２またはＤ−Ａｌａ−ＮＨ_２である。

【００９２】 別の実施態様においてＬＨＲＨ拮抗薬は、 Ｎ−Ａｃ−Ｄ−Ｎａｌ−４−Ｃｌ−Ｐｈｅ−Ｄ−Ｐａｌ−Ｓｅｒ−Ｎ−Ｍｅ−
Ｔｙｒ−Ｄ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ（ｉＰｒ）−Ｐｒｏ−Ｄ−Ａｌａ−ＮＨ_２ を有する。

【００９３】 標準的な略称および慣例を本明細書では用い、以下の非標準的な残基および部
分は下記のように略する。

【００９４】 Ｎａｌ：３−（２−ナフチル）アラニニル； ４−Ｃｌ−Ｐｈｅ：（４’−クロロフェニル）アラニニル； Ｐａｌ：３−（３’−ピリジル）アラニニル； Ｐａｌ（Ｎ−Ｏ）：３−（３’−ピリジン−Ｎ−オキサイド）アラニニル； ｉＰｒ−Ｌｙｓ：Ｎ−ε−２−プロピル−リジニル； Ｑａｌ：３−（２’−キノリニル）アラニニル。

【００９５】 別の形のＬＨＲＨ拮抗薬デカペプチドも本発明に含まれる。そのようなデカペ
プチドは米国特許５８４３９０１号（引用によって本明細書に含まれる）に記載
されている。

【００９６】 さらには、マウス抗体、マウス−ヒトキメラ抗体、ＣＤＲ−移植抗体、ヒト化
効果または完全ヒト抗体などの治療抗体あるいは抗体ライブラリーのスクリーニ
ングによって選択されるものなどの合成抗体も含まれる。そのような抗体の例と
しては、細胞表面蛋白Ｈｅｒ２、ＣＤＣ２０、ＣＤＣ３３、腫瘍細胞上に存在す
るムチン様糖蛋白および上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）に結合し、場合によっ
てそれらの蛋白を示す腫瘍細胞に対する細胞増殖抑制効果および／または細胞毒
性効果を誘発するものなどがある。そのような抗体の例としては、乳癌治療のた
めのヘルセプチン（HERCEPTIN）および非ホジキンリンパ腫の治療のためのリツ
キサン（RITUXAN）などがある。ＴＮＦ関連ポリペプチドＴＲＡＩＬなどの腫瘍
細胞において選択的にアポトーシスを誘発するポリペプチドも癌治療薬として含
まれる。ＯＰＧ融合蛋白は、癌治療薬投与の前、同時または後に投与することが
できる。ＯＰＧ融合蛋白は予防的に投与して、転移癌による骨損失の発症を予防
または緩和することができるか、あるいは転移による既存の骨損失状態の治療用
に投与することができる。

【００９７】 本発明のＯＰＧ融合ポリペプチドを用いて、多発性骨髄腫に関連する骨損失を
予防および／または治療したり、あるいはその疾患自体を予防および／または治
療することができる。多発性骨髄腫はＢ細胞由来腫瘍であって、重大な罹患およ
び死亡につながる。最も顕著な一般的臨床発現は、局所領域での破骨細胞活性化
亢進による限局性骨損失である。骨髄腫患者の大半（約９５％）が通常、放射能
分析によって肉眼観察される破壊性骨病変を示し、極度の難治性骨格痛を患って
いる。骨髄腫患者は、自然にまたは軽微な怪我によって起こる関与する骨の病的
骨折を特に起こしやすい。骨髄腫時に起こる骨格病変は、骨折につながるだけで
なく、特に脊柱での変形および場合によっては神経圧迫も起こす。患者によって
は、血清カルシウムの病的増加（高カルシウム血症）が起こり、疾患治療時に重
大な問題が生じる場合がある。ＯＰＧを患者に投与して、骨吸収とカルシウム放
出を阻害することで、骨折および脊柱変形のリスクを低下させることができる。

【００９８】 骨髄腫細胞は骨破壊に直接関与しないが、代わりに破骨細胞の分化と活性化を
生じる細胞外シグナルを出す。次に破骨細胞が、特に活性化されると、身体のあ
らゆる細胞種の中で最も高レベルの強力なサイトカインＩＬ−６を産生する。Ｉ
Ｌ−６はＢ細胞成長因子であり、in vitroでのマウスおよびヒトの両方の骨髄腫
成長に必要である。ＴＮＦ関連蛋白ＯＰＧリガンド（ＯＰＧＬ）は、破骨細胞の
分化および活性化誘発の原因となっている（ＷＯ９８／４６７５１参照）。骨髄
腫細胞が、破骨細胞に対するその因子を直接または間接的に産生することで、骨
髄空間に入っている骨髄腫細胞周囲での局所骨溶解が生じ得る。次に、骨髄腫細
胞に隣接する正常な破骨細胞がＩＬ−６を産生して、腫瘍細胞の局所的拡大が生
じる。骨髄腫細胞はクローン的に拡大し、不適切な骨吸収によって生じつつある
骨空間を占有する。

【００９９】 齧歯類でのＯＰＧ投与が破骨細胞群の急速な死を引き起こすことが認められて
いる。破骨細胞の減少は、破骨細胞によるＩＬ−６産生増加を解消し、海綿骨内
での骨髄腫細胞の成長・生存に影響すると考えられる。そこで骨髄腫患者におけ
るＯＰＧ投与は、骨の過剰吸収を遮断すると考えられるだけでなく、腫瘍自体の
拡大と生存にも影響すると考えられる。Ｂ細胞は、破骨細胞の分化・活性化受容
体すなわちＯＤＡＲと称されるＯＰＧＬの受容体を発現することが知られている
。骨髄腫細胞もＯＤＡＲを発現し、さらにはＯＰＧＬを産生することができる。
ＯＰＧＬおよびＯＤＡＲの両方の同一細胞群での発現によって、骨髄腫細胞の生
存に影響を与えるオートクリン刺激が生じ得る。そうして、ＯＰＧ治療は腫瘍細
胞生存に直接影響することから、骨髄腫患者で認められる腫瘍の負担を低減また
は排除することができると考えられる。

【０１００】 医薬組成物 本発明は、ＯＰＧ融合蛋白ならびにそれの変異体、断片および誘導体を含む医
薬組成物をも提供する。そのような医薬組成物は、注射での投与用あるいは経口
投与、肺投与、経鼻投与、経皮投与その他の投与形態用が考えられる。本発明で
は、医薬的に許容される希釈剤、保存剤、可溶化剤、乳化剤、補助剤および／ま
たは担体とともに有効量のＯＰＧ融合蛋白を含む医薬組成物が想到される。有効
または医薬的に有効な量のＯＰＧ融合蛋白とは、本明細書に記載のアッセイおよ
び手順によって測定される骨損失の速度および／または程度を低下させるだけの
量である。

【０１０１】 本発明の医薬組成物は、各種緩衝剤含有量（例：Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、酢酸塩、
リン酸塩）、ｐＨおよびイオン強度の希釈剤；界面活性剤および可溶化剤（例：
Ｔｗｅｅｎ８０、ポリソルベート８０）、酸化防止剤（例：アスコルビン酸、メ
タ重亜硫酸ナトリウム）、保存剤（例：チメルソール（Thimersol）、ベンジル
アルコール）および増量物質（例：乳糖、マニトール）などの添加剤；材料を取
り込んでポリ酢酸、ポリグリコール酸などのポリマー化合物の粒子状製剤または
リポソームとしたものを含む。ヒアルロン酸も使用でき、それは循環における持
続期間を延長する効果を有する場合がある。そのような組成物は、本発明の蛋白
および誘導体の物理的状態、安定性、in vivoでの放出速度、in vivoでのクリア
ランス速度に影響を与え得る（例えば、レミングトン（Remington）の著作（Pha
rmaceutical Sciences, 18th Ed. (1990, Mack Publishing Co., Easton, PA 1
8042) pp.1435-1712；引用によって本明細書に含まれる）参照）。組成物は、液
体剤型で製剤することができたり、あるいは凍結乾燥製剤のような乾燥粉末で製
剤することができる。経皮製剤のように、埋め込み徐放製剤も想到される。

【０１０２】 本発明においては、レミングトンの著作（Pharmaceutical Sciences, 18th Ed
. 1990 (Mack Publishing Co., Easton, PA 18042)）８９章（引用によって本
明細書に含まれる）に記載されている経口固体製剤が想到される。固体製剤には
、錠剤、カプセル、丸薬、トローチもしくはロゼンジ剤、カシェ剤またはペレッ
トなどがある。さらには、リポソームまたはプロテイノイド封入を用いて、本発
明の組成物を製剤することもできる（例えば、米国特許４９２５６７３号に報告
のプロテイノイドミクロスフィア）。リポソーム封入を用いることができ、リポ
ソームは各種ポリマーで誘導体化することができる（例：米国特許５０１３５５
６号）。治療薬に可能な固体製剤の説明はマーシャルの著作（Marshall, K. In:
Modern Pharmaceutics Edited by G. S. Banker and C. T. Rhodes Chapterr 1
0, 1979；引用によって本明細書に含まれる）に記載されている。概して製剤に
は、ＯＰＧ融合蛋白またはそれの変異体、断片もしくは誘導体、ならびに胃環境
に対する保護および腸での生理活性物質の放出を可能とする不活性成分を含む。

【０１０３】 適宜にＯＰＧ融合蛋白を化学修飾して、得られる誘導体の経口投与を効果的に
することができる。想到される化学修飾には、蛋白（またはペプチド）分子自体
への１以上の部分の結合であって、その部分によって（ａ）蛋白分解の阻害なら
びに（ｂ）胃または腸からの血液流中への取り込みが可能となるものなどがある
。蛋白の全体的安定性および身体での循環時間の延長も望ましい。そのような部
分の例としては、ポリエチレングリコール、エチレングリコールとプロピレング
リコールの共重合体、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニル
アルコール、ポリビニルピロリドンおよびポリプロリンなどがある（Abuchowski
and Davis, Soluble Polymer-Enzyme Adducts, In: ”Enzymes as Drugs”, Ho
cenberg and Roberts, eds., Wiley-Interscience, New York, NY, (1981), pp.
367-383; Newmark et al., J. Appl. Biochem. 4: 185-189 (1982)）。使用可能
と考えられる他のポリマーには、ポリ−１，３−ジオキソランおよびポリ−１，
３，６−チオキソカン（tioxocane）がある。上記で示した医薬用途には、ポリ
エチレングリコール部分が好ましい。

【０１０４】 経口投与後の胃での分解に対する耐性を得るには、少なくともｐＨ５．０まで
不浸透性のコーティングが必須である。経口製剤の腸溶コーティングとして使用
される比較的一般的な不活性成分の例としては、酢酸トリメリト酸セルロース（
ＣＡＴ）、フタル酸ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣＰ）、ＨＰ
ＭＣＰ５０、ＨＰＭＣＰ５５、酢酸フタル酸ポリビニル（ＰＶＡＰ）、ユードラ
ジット（Eudragit）Ｌ３０Ｄ、アクアテリック（Aquateric）、酢酸フタル酸セ
ルロース（ＣＡＰ）、ユードラジットＬ、ユードラジットＳおよびシェラックが
ある。これらのコーティングは、混合フィルムとして用いることができる。

【０１０５】 ＯＰＧ融合蛋白は、粒径約１ｍｍの顆粒またはペレットの形の微小な多粒子と
して製剤に含有させることができる。カプセル投与用の材料の製剤は、粉剤、軽
く圧縮した詰め物または錠剤であっても良いと考えられる。

【０１０６】 本発明の医薬組成物は、炭水化物、特にはマニトール、α−乳糖、無水乳糖、
セルロース、ショ糖、修飾デキストランおよびデンプンなどの希釈剤を含む。あ
る種の無機塩も充填剤として用いることができ、それにはトリリン酸カルシウム
、炭酸マグネシウムおよび塩化ナトリウムなどがある。一部の市販希釈剤には、
ファスト−フロ（Fast-Flo）、エンデックス（Emdex）、ＳＴＡ−Ｒｘ１５００
、エンコンプレス（Emcompress）およびアビセル（Avicell）がある。

【０１０７】 固体製剤には崩壊剤を含有させることができる。崩壊剤として用いられる材料
には、デンプンに基づいた市販の崩壊剤であるエクスプロタブ（Explotab）など
のデンプンなどがあるが、それに限定されるものではない。デンプングリコール
酸ナトリウム、アンバーライト、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ウル
トラミロペクチン（ultramylopectin）、アルギン酸ナトリウム、ゼラチン、橙
皮、酸性カルボキシメチルセルロース、天然スポンジおよびベントナイトはいず
れも使用可能である。別の形の崩壊剤は、不溶性カチオン交換樹脂である。粉末
ガムを崩壊剤および結合剤として用いることができ、それには寒天、カラヤガム
またはトラガカントガムなどの粉末ガムなどがあり得る。アルギン酸およびそれ
のナトリウム塩も崩壊剤として有用である。

【０１０８】 結合剤を用いて硬錠剤を形成することができ、それにはアカシア、トラガカン
ト、デンプンおよびゼラチンなどの天然物からの材料などがある。他のものには
メチルセルロース（ＭＣ）、エチルセルロース（ＥＣ）およびカルボキシメチル
セルロース（ＣＭＣ）などがある。ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）およびヒド
ロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）はいずれも、アルコール溶液で用
いて治療薬を顆粒とすることができると考えられる。

【０１０９】 製剤に添加することができる滑沢剤には、マグネシウム塩およびカルシウム塩
を含むステアリン酸、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、液体パラフィ
ン、植物油およびロウなどがあるが、これらに限定されるものではない。可溶性
潤滑剤も用いることができ、それにはラウリル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸マ
グネシウム、各種分子量のポリエチレングリコール、カーボワックス（Carbowax
）４０００および６０００などがある。

【０１１０】 製剤時の薬剤の流動特性を改善し、圧縮時の再配列を補助する滑剤を加えるこ
とができると考えられる。滑剤には、デンプン、タルク、焼成シリカおよび水和
シリコアルミナート（silicoaluminate）などがあり得る。

【０１１１】 ＯＰＧ融合蛋白組成物の溶解を助けるため、界面活性剤を湿潤剤として加える
ことができると考えられる。界面活性剤には、ラウリル硫酸ナトリウム、スルホ
コハク酸ジオクチルナトリウムおよびスルホン酸ジオクチルナトリウムなどのア
ニオン系界面活性剤があり得る。カチオン系洗剤を用いることができると考えら
れ、それには塩化ベンザルコニウムまたは塩化ベンゼトニウムなどがあり得る。
界面活性剤として製剤に含有させることができると考えられる可能なノニオン系
洗剤を挙げると、ラウロマクロゴール（Lauromacrogol）４００，ポリオキシル
（polyoxyl）４０ステアレート、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油１０、５０お
よび６０，モノステアリン酸グリセリン、ポリソルベート４０、６０、６５およ
び８０、ショ糖脂肪酸エステル、メチルセルロースおよびカルボキシメチルセル
ロースがある。これらの界面活性剤は、単独または各種比率での混合物として蛋
白または誘導体の製剤中に存在させることができると考えられる。

【０１１２】 蛋白の取り込みを促進し得る添加剤には例えば、オレイン酸、リノール酸およ
びリノレン酸などの脂肪酸がある。

【０１１３】 徐放製剤が望ましい場合がある。ＯＰＧ融合蛋白は、ガム類など、拡散または
浸出の機構による放出を可能とする不活性基質に組み入れることができる。徐々
に分解する基質も製剤に組み入れることができ、例えばアルギン酸類、多糖類な
どがある。この治療薬の別の徐放製剤は、オロス（Oros）治療薬系（Alza Corp.
）に基づいた方法である。すなわち、薬剤を半透過性膜に封入し、その膜によっ
て水が進入して、浸透圧効果によって１個の小さい開口から薬剤を押し出すこと
ができる。一部の腸溶コーティングも徐放効果を有する。

【０１１４】 他のコーティングを製剤に用いることができる。例えばフィルムコート錠は、
２つの異なる群からの材料を含むことができる。第１の群には、メチルセルロー
ス、エチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、メチルヒドロキシエチル
セルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロ
ース、カルボキシ−メチルセルロースナトリウム、プロビドン（providone）お
よびポリエチレングリコール類などの非腸溶材料などがある。第２の群は、通常
はフタル酸エステル類である腸溶材料からなる。混合材料を用いて、至適なフィ
ルムコーティングを得ることができると考えられる。フィルムコーティングは、
パンコーターまたは流動床で、あるいは圧縮コーティングによって行うことがで
きる。

【０１１５】 本発明では、ＯＰＧポリペプチドまたは融合蛋白の肺への送達も想到される。
蛋白は吸入中に哺乳動物の肺に送達され、肺上皮層を通過して血流に入る（他の
報告には、Adjei et al., Pharmaceutical Research 7: 565-569 (1990)；Adjei
et al., International Journal of Pharmaceutics 63: 135-144 (1990)（酢酸
ロイプロリド）；Braquet et al., Journal of Cardiovascular Pharmacology 1 3 (suppl.5): s 143-146 (1989)（エンドテリン−１）; Hubbard et al., Annal
s of Internal Medicine 3: 206-212 (1989)（α１−抗トリプシン）；Smith et
al., J. Clin. Invest. 84: 1145-1146 (1989)（α１−プロテイナーゼ）；Osw
ein et al., ”Aerosolization of Proteins”, Proceedings of Symposium on
Respiratory Drug Delivery II, Keystone, Colorado, March, 1990（組換えヒ
ト成長ホルモン）；Debs et al., The Journal of Immunology 140: 3482-3488
(1988)（インターフェロンαおよび腫瘍壊死因子α）および米国特許５２８４６
５６号（顆粒細胞コロニー刺激因子）などがある）。

【０１１６】 本発明の実施においては、いずれも当業者であれば熟知しているネブライザー
、定量噴霧吸入器および粉末吸入器などの（これらに限定されるものではない）
治療薬の肺送達用の広範囲の機器使用が想到される。本発明の実施に好適な市販
機器の一部の具体例としては、ウルトラベント（Ultravent）ネブライザー（製
造者：Mallinckrodt, Inc., St. Louis, Missouri）、エイコーン（Acorn）ＩＩ
ネブライザー（製造者：Marquest Medical Products, Englewood, Colorado）、
ベントリン（Ventolin）定量噴霧吸入器（製造者：Glaxo Inc., Research Trian
gle Park, North Carolina）およびスピンヘイラー（Spinhaler）粉末吸入器（
製造者：Fisons Corp., Bedford, Massachusetts）などがある。

【０１１７】 そのような装置はいずれも、ＯＰＧ蛋白またはそれの変異体、断片もしくは誘
導体の投薬に好適な製剤の使用を必要とする。代表的には各製剤は、使用する機
器の種類特有であり、治療に有用な希釈剤、補助剤および／または担体以外に、
適切な噴射剤材料を使用することができる。

【０１１８】 ＯＰＧ融合蛋白は最も有利には、遠位肺に最も効果的に投与するためには、平
均粒径１０μｍ（すなわちミクロン）未満、最も好ましくは０．５〜５μｍを有
する粒子で製剤しなければならない。

【０１１９】 担体には、トレハロース、マニトール、キシリトール、ショ糖、乳糖およびソ
ルビトールなどの炭水化物などがある。製剤用の他の成分には、ＤＰＰＣ、ＤＯ
ＰＥ、ＤＳＰＣおよびＤＯＰＣなどがあり得る。天然または合成界面活性を使用
することができる。ポリエチレングリコールを用いることができる（それの蛋白
もしくは類縁体の誘導体化での使用とは別でも）。シクロデキストランなどのデ
キストランを用いることができる。胆汁酸塩および他の関連促進剤を用いること
ができる。セルロースおよびセルロース誘導体を用いることができる。緩衝剤製
剤での使用のように、アミノ酸を用いることができる。リポソーム、マイクロカ
プセルもしくはミクロスフィア、包接錯体その他の種類の担体の使用も想到され
る。

【０１２０】 ＯＰＧ融合蛋白の経鼻投与も想到される。経鼻投与することで、薬剤を肺に堆
積させる必要なく、治療薬を鼻に投与した後に、蛋白を血流に直接送ることがで
きる。経鼻投与用製剤には、デキストランまたはシクロデキストランを含むもの
などがある。他の粘膜を通過する輸送を介した投与も想到される。

【０１２１】 用量 本発明のＯＰＧ融合ポリペプチドを治療上有効な量で投与して、転移骨疾患に
関連する骨損失を予防および／または治療する。「治療上有効量」のＯＰＧ融合
ポリペプチドとは、骨量の損失を低減する量である。骨量は、単一光子吸光分析
（ＳＰＡ）、二重光子吸光分析（ＤＰＡ）、二重エネルギーＸ線吸光分析（ＤＥ
ＸＡ）、定量的コンピュータ断層撮影（ＱＣＴ）および超音波検査法などの各種
の公知法によって測定される（Johnston et al., Primer on the Metabolic Bon
e Disease and Disorders of Mineral Metabolism, 2nd ed., M. J. Favrus, ed
. Raven Press pp.237-146）参照）。当業者であれば、これらの方法を用いて、
ＯＰＧ融合ポリペプチドの治療上有効量を求めることができる。治療上有効量は
、血清オステオカルシン、血清アルカリホスファターゼ、血清プロコラーゲンＩ
伸長ペプチド、コラーゲンの尿もしくは血清Ｃ−末端もしくはＮ−末端テロペプ
チド、尿カルシウム、ヒドロキシプロリンならびに尿ピリジノリンおよびデオキ
シピリジノリンなどの骨代謝の生化学的マーカーにおける変化を測定することに
よっても求めることができる。上記の生化学的マーカーのレベル低下が、骨吸収
が低下して骨損失が低減していることを示すと一般に認められている。別法とし
て、ＯＰＧ融合ポリペプチドの治療上有効量は、骨強度の上昇、詳細には骨の捻
れ（捻転）強度上昇を測定することで求めることもできる。

【０１２２】 概してＯＰＧ融合ポリペプチドの治療上有効量は、約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約１
０ｍｇ／ｋｇ、好ましくは約１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇである。ＯＰＧ融
合ポリペプチドの半減期延長および特に免疫グロブリンＦｃ領域へのＯＰＧの融
合によって、未修飾のＯＰＧポリペプチドの場合より投与回数が減る。投与回数
は、約１回／月、あるいは１回／２ヶ月または１回／３ヶ月とすることができる
。正確な用量および投与回数は、製剤、投与経路、治療される状態などのいくつ
かの要素によって決まり、熟練者であれば容易に決定できることは当業者には明
らかであろう。

【０１２３】 投与されたＯＰＧ融合蛋白の量は、融合蛋白についての診断アッセイを用いて
求めることができる。そのような診断アッセイは、抗体がＯＰＧ融合蛋白に特異
的に結合するが、内因性で自然に循環するＯＰＧや天然抗体のＦｃ領域などのや
はり自然に循環し得るＯＰＧに融合した異種蛋白の形のものには結合しない抗体
サンドイッチアッセイのような抗体アッセイの形であることができる。ＯＰＧ融
合蛋白レベル測定のための抗体に基づくアッセイは、当業者には公知である各種
形式で行うことができる。

【０１２４】 以下の実施例は本発明をさらに詳細に説明するために提供したものであって、
本発明の範囲を限定するものと解釈すべきではない。

【０１２５】 実施例１：ＯＰＧ融合ポリペプチドの構築および発現 相当するＯＰＧ融合ポリペプチドを製造するのに使用されるＯＰＧ［１−１９
４］−Ｆｃ、ＯＰＧ［１−２０１］−Ｆｃ、ＯＰＧ［１−１９４］−ＦｃΔＣ、
ＯＰＧ［１−２０１］−ＦｃΔＣ、ＯＰＧ［１−１９４］−ＦｃＧ_１０およびｍ
ｅｔＦｃΔＣ−ＯＰＧ［２２−１９４］をコードするプラスミド類は、ＷＯ９７
／２３６１４および同時係属中の米国特許出願＿＿号（１９９９年９月＿日出願
）（これらはいずれも引用によって本明細書に含まれる）に記載の方法に従って
構築される。ポリペプチド配列は、それぞれ図３〜８に示してある。

【０１２６】 哺乳動物および細菌の宿主細胞でのＯＰＧ融合ポリペプチドの発現は、ＷＯ９
７／２３６１４に記載の方法に従って行った。

【０１２７】 実施例２：溶解性骨疾患についての乳癌モデルでのＯＰＧ活性 ７〜８週齢の雌Ｂａｌｂ／ｃｎｕ／ｎｕマウスに、左心室を介して全身循環に
ヒトＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳癌細胞（１．０×１０^５個／マウス；ＡＴＣＣ寄託
番号ＨＴＢ−２６）を直接注射した。腫瘍接種直後から毎週３回で４週間にわた
って、マウスに静脈注射によって、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）またはｍｅ
ｔＦｃΔＣ−ＯＰＧ［２２−１９４］（２５ｍｇ／ｋｇ）のいずれかを投与した
。レントゲン写真から、病変／マウスの数を評価した。下記の方法に従って、腫
瘍病巣の有無について、骨、心臓、肺、肝臓、腎臓、副腎、卵巣、脳、膵臓およ
び脾臓を組織学的に評価した。

【０１２８】 図９に示したように、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞の接種から４週間後に、長骨
においてレントゲン写真病変が認められる。接種時点から開始して２５ｍｇ／ｋ
ｇの用量で毎週３回ｍｅｔＦｃΔＣ−ＯＰＧ［２２−１９４］を静脈投与するこ
とで、関連する骨破壊は完全に阻害されている（６．２±０．８個に対し０．０
±０．０個の病変／マウス、ｐ＜０．００１）。

【０１２９】 実施例３：溶解性骨疾患についてのマウス腺癌モデルにおけるＯＰＧ活性 ７〜８週齢の雌ＣＤＦ１マウスに、左心室を介して全身循環にマウスＣ２６−
ＤＣＴ腺癌細胞（国立癌研究所の腫瘍貯蔵所（Tumor Repository）から入手；１
．０×１０^５個／マウス）を直接注射した。腫瘍接種直後から３日に１回で９日
間にわたって、マウスに静脈注射によって、ＰＢＳまたはｍｅｔＦｃΔＣ−ＯＰ
Ｇ［２２−１９４］（２５ｍｇ／ｋｇ）のいずれかを投与した。１０日目にマウ
スのレントゲン写真を撮り、組織をサンプリングして組織学的評価を行った。

【０１３０】 図９に示したように、Ｃ２６−ＤＣＴ細胞の心臓内接種から１０日後にレント
ゲン写真病変が明らかに認められ（３，１±０．６個の病変／マウス）、Ｆｃｄ
Ｃ−ＯＰＧ［２２−１９４］の静脈注射によって骨破壊が阻害されている。

【０１３１】 別の試験で、上記と同様にＣ２６−ＤＣＴ細胞をマウスに接種し、３日に１回
で９日間にわたり３、１、０．３または０．１ｍｇ／ｋｇの用量でＰＢＳまたは
ｍｅｔＦｃ−ＯＰＧ［２２−１９４］のいずれかを静脈注射によって投与した。
１０日目にマウスのレントゲン撮影を行った。レントゲン写真を評価し、組織を
下記の方法に従って処理した。ｍｅｔＦｃΔＣ−ＯＰＧ［２２−１９４］の静脈
投与によって、レントゲン写真病変は用量依存的に減少した（図１０） 実施例４：高カルシウム血症についてのマウス腺癌モデルでのＯＰＧ活性 １０〜１２週齢の雄Ｂａｌｂ／ｃ×ＤＢＡ／２（ＣＤＦ１）マウスを購入した
（Harlan Sprague Dawley (San Diego, CA)またはCharles River (Wilmington,
MA)から）。

【０１３２】 Ｎ−ニトロソ−Ｎ−メチルウレタン（ＮＭＵ）の繰り返し直腸内点滴によって
最初に雌Ｂａｌｂ／ｃマウスで誘発したＣ−２６腫瘍（Corbett et al., Cancer
Res. 35, 2434-2439 (1975)）を、組織断片の形で国立癌研究所の腫瘍貯蔵所か
ら入手した。その断片を物理的に破砕し、標準的な組織培養条件（３７℃、５〜
６％ＣＯ_２）下で培養したところ、それによって付着細胞系が生じ、それは継続
的に繁殖させて次にそのまま凍結させることができた。in vitroでの細胞の継代
に用いた培地は、１０％ＦＣＳ、１×ｐｅｎ−ｓｔｒｅｐ／グルタミンおよび１
×非必須アミノ酸を含むＤＭＥＭである。共通のストックからの個別の冷凍細胞
バイアルを、全ての実験の開始に用いた。最初に培地で再生した後、細胞をトリ
プシン処理して回収し、次に添加物を含まないＤＭＥＭで数回にわたって洗浄・
再懸濁して細胞２．５×１０^６個／ｍＬとした。動物には、右脇腹の剃毛領域全
体に０．２ｃｃ（細胞０．５×１０^６個）を皮下注射した（ＳＱ）。その条件下
では腫瘍発達は、小さい変動性で非常に安定していることが認められた。

【０１３３】 投与は、８日目（予防試験）または血中イオン化カルシウムレベルが＞１．６
０ｍｍｏｌ／Ｌのレベルに達した時点（治療試験）で開始した。投与は、予防試
験では８日間、治療試験では４日間続けた。予防試験では、ｍｅｔＦｃΔＣ−Ｏ
ＰＧ［２２−１９４］を、脇腹での皮下注射としてＰＢＳ媒体で１日１回投与し
た。治療試験では、ｍｅｔＦｃΔＣ−ＯＰＧ［２２−１９４］を、ＰＢＳ媒体で
の単回静脈注射として投与した。いずれの試験でも、正常対照動物および腫瘍を
有する対照動物に同様のＰＢＳ注射を行った。

【０１３４】 試験の期間中、マウスを１日１回秤量し（投与の際）、予防試験では２日に１
回（その日の薬剤投与の前）または治療試験では１日１回、血中イオン化カルシ
ウムレベルをモニタリングした。眼窩後方で採血を行い、血中イオン化カルシウ
ム／ｐＨ分析装置（Chiron Diagnostics #634, Norwood, MA）を用いて血中カル
シウム測定を行った。

【０１３５】 組織学的評価 試験の最後に各動物からの片足（大腿骨と脛骨をつながった状態で）を回収し
た。骨をリン酸緩衝亜鉛ホルマリンで固定し、ギ酸中で石灰質除去し、パラフィ
ンに包埋した。遠位大腿骨および近位脛骨の中央領域から切片を取り、反応させ
て酒石酸耐性酸性ホスファターゼ活性（ＴＲＡＰ）を示すようにし、ヘマトキシ
リンで対比染色した。この染色法では、破骨細胞は赤に染色され、他の種類の細
胞、骨および軟骨は各種青色陰影に染色される。

【０１３６】 オステオメジャー（Osteomeasure）骨分析プログラム（Osteometrics Inc., D
ecatur, GA）を用いて、近位脛骨成長板に対してちょうど遠位の領域（一次スポ
ンギオサ（spongiosa））および最初の測定領域に対して２ｍｍ離れた脛骨の皮
質軸領域で測定を行った。測定に脛骨の２つの離れた領域を用いることで、骨吸
収における腫瘍誘発増加の正確な測定を行うことができるようにした。測定領域
は、いずれの場所でも１ｍｍ×１ｍｍの正方形領域からなり、最初の領域におけ
る成長板を含まないようにした。測定したパラメータは、破骨細胞の数と活性表
面ならびに骨表面であった。結果は、破骨細胞数（ＯｃＮ）、破骨細胞周囲長（
活性破骨細胞表面）（ＯｃＰｍ）、骨周囲長（骨表面）（Ｂｐｍ）として記録し
た。測定において破骨細胞を検討するため、ＴＲＡＰを陽性とし、骨表面に接触
した状態としなければならなかった。活性破骨細胞表面は、骨表面と直接接触し
ている破骨細胞部分であった。いずれの測定も、顕微鏡に取り付けたカメラルシ
ダを利用して、デジタイジングプラテン（digitizing platen）上で断面画像を
トレースすることで行った。

【０１３７】 結果 ＯＰＧ投与によって、体重損失に対するＣ−２６腺癌の効果が緩和された。１
日１回２．５ｍｇ／ｋｇのＯＰＧ投与を受けたマウスは平均で５．２ｇの体重を
失ったが、未投与の腫瘍を有する動物は平均で６．２ｇを失った。腫瘍を有する
マウスにはＰＢＳで３．４７±０．７２％の腫瘍があったが、それに対してＯＰ
Ｇ２．５ｍｇ／ｋｇ投与マウスでは３．４２±０．８２％であった。重量はＰＢ
Ｓで０．７５±０．１４ｇであり、ＯＰＧ２．５で０．７９±０．１６ｇである
。

【０１３８】 Ｃ−２６腫瘍誘発性血中イオン化カルシウムレベル上昇のＯＰＧによる予防お よび回復 腫瘍移植から９日目に投与を開始したところＯＰＧは、腫瘍が誘発する全血中
イオン化カルシウムレベル上昇を用量依存的に阻害した（図１１Ａ参照）。ＯＰ
Ｇ投与開始に先だって、腫瘍を有するマウスでは全血中イオン化カルシウムレベ
ルがわずかに上昇していた（１．３４±０．０６ｍｍｏｌ／Ｌと１．２５±０．
０２ｍｍｏｌ／Ｌ）。媒体投与群では、そのレベルは実験期間を通じて上昇を続
け、１３日目と１５日目に最大レベル１．８４±０．１２ｍｍｏｌ／Ｌとなり、
１６日目までにわずかに低下した。ＯＰＧ投与群は、投与期間を通じて全血中イ
オン化カルシウムレベルのこの上昇について用量依存的阻害を示し、２．５ｍｇ
／ｋｇ群ではイオン化カルシウムレベルは１．３８±０．０６ｍｍｏｌ／Ｌの最
大に達した。このカルシウムレベルは、腫瘍のない対照動物で認められたものと
比較して、わずかではあるが有意に高いものであった。ＯＰＧ投与は、腫瘍のな
いマウスではカルシウムレベルに影響を与えなかった。

【０１３９】 投与に先だってマウスをそのまま高カリウム血症とさせた場合、５．０ｍｇ／
ｋｇのＯＰＧ単回投与によってカルシウムレベルは急速に低下し、１２時間まで
に有意な低下が明らかであって、投与２４時間以内に正常カルシウム血状態とな
った（図１１Ｂ）。実験のそれ以降の期間では、ＯＰＧによってカルシウムレベ
ルは正常範囲に維持された。

【０１４０】 破骨細胞に覆われた骨表面および破骨細胞数におけるＣ−２６腫瘍誘発増加の ＯＰＧによる予防および回復 Ｃ２６腫瘍のある高カリウム血症マウスでは、破骨細胞に覆われた骨表面およ
び破骨細胞数に顕著な上昇があった。高カリウム血症発症の前後における２．５
ｍｇ／ｋｇの用量でのＯＰＧ投与によって、破骨細胞はほぼ完全に消失した。骨
吸収量の指標である破骨細胞表面測定値は、腫瘍のない対照での値３．９１±１
．１０％と比較して、腫瘍を有する動物では有意に上昇して８．９５±２．１０
％であった。高カリウム血症発症以前に１日１回２．５ｍｇ／ｋｇの用量でＯＰ
Ｇを投与したところ、上記の測定値は用量依存的に低下して０．１３±０．０７
％となり、それは腫瘍を持たない対照動物の場合より有意に低い値である。

【０１４１】 骨表面１ｍｍ当たりの破骨細胞数も、腫瘍を持たない対照の場合の２．００±
０．５２／ｍｍと比較して腫瘍を有する動物では上昇して４．４１±１．０３／
ｍｍとなった。２．５ｍｇ／ｋｇの用量でＯＰＧを１日１回投与することで、１
ｍｍ当たりの破骨細胞数が用量依存的に低下して０．１２±０．０６／ｍｍとな
り、それは腫瘍のない動物の場合より有意に低いものである。

【０１４２】 破骨細胞の大きさおよび数のＯＰＧ投与による用量依存的低下 骨表面測定値のパーセントとしての破骨細胞表面ならびに骨表面１ｍｍ当たり
の破骨細胞数はいずれも、腫瘍を持たない動物での３．６６±１．０１％および
破骨細胞１．８３±０．５４個／ｍｍという値を比較して、腫瘍を有する対照動
物では有意に上昇して、それぞれ８．９５±１．６４％および破骨細胞４．１２
±０．７２個／ｍｍであった。ＯＰＧを１日１回２．５ｍｇ／ｋｇで投与するこ
とで、これらの値は正常範囲より低くなり、１．２６±０．９３％および破骨細
胞０．７３±０．５５個／ｍｍとなった。

【０１４３】 以上、好ましい実施態様によって本発明を説明したが、当業者であれば変更お
よび修正が行われることは明らかであろう。従って、添付の特許請求の範囲は、
特許請求されている本発明の範囲内に含まれるそのような全ての均等な変更を包
含する。

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１】 ヒトＩｇＧγ１のヒンジ領域、ＣＨ２領域およびＣＨ３領域のアミノ酸配列を
示す図である。

【図２Ａ】 ヒトＯＰＧのアミノ酸配列を示す図である［１−４０１］。

【図２Ｂ】 ヒトＯＰＧのアミノ酸配列を示す図である［１−４０１］。

【図３Ａ】 ＯＰＧ［２２−１９４］−Ｆｃのアミノ酸配列を示す図である。

【図３Ｂ】 ＯＰＧ［２２−１９４］−Ｆｃのアミノ酸配列を示す図である。

【図４Ａ】 ＯＰＧ［２２−２０１］−Ｆｃのアミノ酸配列を示す図である。

【図４Ｂ】 ＯＰＧ［２２−２０１］−Ｆｃのアミノ酸配列を示す図である。

【図５Ａ】 ＯＰＧ［２２−１９４］−ＦｃΔＣのアミノ酸配列を示す図である。

【図５Ｂ】 ＯＰＧ［２２−１９４］−ＦｃΔＣのアミノ酸配列を示す図である。

【図６Ａ】 ＯＰＧ［２２−２０１］−ＦｃΔＣのアミノ酸配列を示す図である。

【図６Ｂ】 ＯＰＧ［２２−２０１］−ＦｃΔＣのアミノ酸配列を示す図である。

【図７Ａ】 ＯＰＧ［２２−１９４］−ＦｃＧ_１０のアミノ酸配列を示す図である。

【図７Ｂ】 ＯＰＧ［２２−１９４］−ＦｃＧ_１０のアミノ酸配列を示す図である。

【図８Ａ】 ｍｅｔＦｃΔＣ−ＯＰＧ［２２−１９４］のアミノ酸配列を示す図である。

【図８Ｂ】 ｍｅｔＦｃΔＣ−ＯＰＧ［２２−１９４］のアミノ酸配列を示す図である。

【図９Ａ】 骨への腫瘍転移のＣ２６−ＤＣＴモデルおよびＭＤＡ−ＭＢ−２３１モデルに
おける溶骨性骨破壊の予防を示す図である。

【図９Ｂ】 骨への腫瘍転移のＣ２６−ＤＣＴモデルおよびＭＤＡ−ＭＢ−２３１モデルに
おける溶骨性骨破壊の予防を示す図である。

【図９Ｃ】 骨への腫瘍転移のＣ２６−ＤＣＴモデルおよびＭＤＡ−ＭＢ−２３１モデルに
おける溶骨性骨破壊の予防を示す図である。

【図９Ｄ】 骨への腫瘍転移のＣ２６−ＤＣＴモデルおよびＭＤＡ−ＭＢ−２３１モデルに
おける溶骨性骨破壊の予防を示す図である。

【図１０】 Ｃ２６−ＤＣＴ細胞を接種したマウスでＸ線写真的に明らかな溶骨性病巣の数
におけるｍｅｔＦｃΔＣ−ＯＰＧ［２２−１９４］用量依存性低下を示す図であ
る。

【図１１Ａ】 マウスＣ２６−ＤＣＴ腫瘍モデルでの悪性腫瘍に関連する高カルシウム血症の
予防および回復を示す図である。

【図１１Ｂ】 マウスＣ２６−ＤＣＴ腫瘍モデルでの悪性腫瘍に関連する高カルシウム血症の
予防および回復を示す図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 39/395 Ａ６１Ｋ 39/395 Ｔ 45/00 45/00 Ａ６１Ｐ 35/00 Ａ６１Ｐ 35/00 35/04 35/04 Ｃ０７Ｋ 14/705 ＺＮＡ // Ｃ０７Ｋ 14/705 ＺＮＡ Ａ６１Ｋ 37/02 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ， ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ， ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＢＺ，Ｃ Ａ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ， ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，Ｋ Ｅ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ， ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，Ｒ Ｕ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ， ＺＡ，ＺＷ Ｆターム(参考） 4C084 AA02 AA17 DB09 DC50 NA14 ZB261 ZB351 ZC031 4C085 AA13 AA14 AA16 CC03 CC04 4C086 AA01 AA02 BC02 BC43 EA10 MA01 MA04 NA14 ZB26 ZB33 ZC03 4C206 AA01 AA02 MA01 MA04 MA10 NA14 ZB26 ZB33 ZC03 4H045 AA30 BA10 BA16 BA41 CA40 DA50 EA28 FA72 FA73 FA74

Claims (22)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 哺乳動物における溶解性骨疾患の予防または治療方法におい
   て、治療上有効量のＯＰＧポリペプチドを投与する段階を有することを特徴とす
   る方法。
2. 【請求項２】 骨への癌の転移を予防する方法において、治療上有効量のＯ
   ＰＧポリペプチドを投与する段階を有することを特徴とする方法。
3. 【請求項３】 骨硬化性骨転移の予防方法において、治療上有効量のＯＰＧ
   ポリペプチドを投与する段階を有することを特徴とする方法。
4. 【請求項４】 治療上有効量の癌治療薬を投与する段階をさらに有する請求
   項１、２または３に記載の方法。
5. 【請求項５】 前記ＯＰＧポリペプチドが図２に示したアミノ酸配列（配列
   番号２）または該配列の切断ポリペプチドを有する、請求項１、２、３または４
   に記載の方法。
6. 【請求項６】 前記ＯＰＧポリペプチドが図２（配列番号２）に示したアミ
   ノ酸残基１８６〜４０１の一部または全体のカルボキシ末端切断を有する、請求
   項４に記載の方法。
7. 【請求項７】 前記ＯＰＧポリペプチドが図２（配列番号２）に示したアミ
   ノ酸残基２２〜１９４（両端を含む）を有する、請求項４に記載の方法。
8. 【請求項８】 前記ＯＰＧポリペプチドがＯＰＧ融合ポリペプチドである、
   請求項５、６または７に記載の方法。
9. 【請求項９】 前記ＯＰＧ融合ポリペプチドが、ＯＰＧポリペプチドのＮ末
   端またはＣ末端へのＦｃ領域の融合を有する、請求項８に記載の方法。
10. 【請求項１０】 前記ＯＰＧ融合ポリペプチドが、図２（配列番号２）のア
    ミノ酸残基２２〜１９４に融合したＦｃ領域を有する、請求項９に記載の方法。
11. 【請求項１１】 前記ＯＰＧ融合ポリペプチドが、図５または図８（配列番
    号５または８）に示したアミノ酸配列からなる、請求項１０に記載の方法。
12. 【請求項１２】 前記ＯＰＧポリペプチドを、癌治療薬投与の前、同時また
    は後に投与する、請求項１、２または３に記載の方法。
13. 【請求項１３】 溶解性骨疾患が骨に転移した癌とともに生じる、請求項１
    または３に記載の方法。
14. 【請求項１４】 前記癌が、乳癌、前立腺癌、甲状腺癌、腎臓癌、肺癌、食
    道癌、直腸癌、膀胱癌、子宮頸癌、卵巣癌、肝臓癌、消化管の癌、多発性骨髄腫
    およびリンパ腫からなる群から選択される、請求項１３に記載の方法。
15. 【請求項１５】 前記癌治療薬が、放射線療法、化学療法、抗体または非抗
    体ポリペプチドからなる群から選択される、請求項１、２または３に記載の方法
    。
16. 【請求項１６】 化学療法がアントラサイクリン類、タキソール、タモキシ
    フェン、ドキソルビシンおよび５−フルオロウラシルを含む、請求項１５に記載
    の方法。
17. 【請求項１７】 前記抗体が、腫瘍細胞表面にあるＨｅｒ２、ＣＤＣ２０、
    ＣＤＣ３３、ムチン様糖蛋白または上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）に結合する
    、請求項１５に記載の方法。
18. 【請求項１８】 前記癌治療薬が、黄体形成ホルモン放出ホルモン（ＬＨＲ
    Ｈ）拮抗薬を含む、請求項１５に記載の方法。
19. 【請求項１９】 前記ＬＨＲＨ拮抗薬が、下記構造を有するものまたは該物
    質の医薬的に許容される塩である、請求項１８に記載の方法。 Ａ−Ｂ−Ｃ−Ｄ−Ｅ−Ｆ−Ｇ−Ｈ−Ｉ−Ｊ ［上記構造において、 Ａはｐｙｒｏ−ｇｌｕ、Ａｃ−Ｄ−Ｎａｌ、Ａｃ−Ｄ−Ｑａｌ、Ａｃ−Ｓａｒ
    またはＡｃ−Ｄ−Ｐａｌであり； ＢはＨｉｓまたは４−Ｃｌ−Ｄ−Ｐｈｅであり； ＣはＴｒｐ、Ｄ−Ｐａｌ、Ｄ−Ｎａｌ、Ｌ−Ｎａｌ−Ｄ−Ｐａｌ（Ｎ−Ｏ）ま
    たはＤ−Ｔｒｐであり； ＤはＳｅｒであり； ＥはＮ−Ｍｅ−Ａｌａ、Ｔｙｒ、Ｎ−Ｍｅ−Ｔｙｒ、Ｓｅｒ、Ｌｙｓ（ｉＰｒ
    ）、４−Ｃｌ−Ｐｈｅ、Ｈｉｓ、Ａｓｎ、Ｍｅｔ、Ａｌａ、ＡｒｇまたはＩｌｅ
    であり； Ｆは 【化１】 であり（式中、ＲおよびＸは独立にＨおよびアルキルであり；Ｙは小さい極性部
    分を有する）； ＧはＬｅｕまたはＴｒｐであり； ＨはＬｙｓ（ｉＰｒ）、Ｇｌｎ、ＭｅｔまたはＡｒｇであり； ＩはＰｒｏであり； ＪはＧｌｙ−ＮＨ_２またはＤ−Ａｌａ−ＮＨ_２である。］
20. 【請求項２０】 前記ＬＨＲＨ拮抗薬がペプチド：Ｎ−Ａｃ−Ｄ−Ｎａｌ−
    ４−Ｃｌ−Ｐｈｅ−Ｄ−Ｐａｌ−Ｓｅｒ−Ｎ−Ｍｅ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ａｓｎ−Ｌｅ
    ｕ−Ｌｙｓ（ｉＰｒ）−Ｐｒｏ−Ｄ−Ａｌａ−ＮＨ_２を有する、請求項１８に記
    載の方法。
21. 【請求項２１】 ＯＰＧポリペプチドまたはＯＰＧ融合ポリペプチドの前記
    治療上有効量が０．１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇである、請求項１、２、３ま
    たは８に記載の方法。
22. 【請求項２２】 多発性骨髄腫の予防または治療方法において、治療上有効
    量のＯＰＧポリペプチドを投与する段階を有することを特徴とする方法。