ES2228903T3 - Pegilacion de ligandos que mejora la actividad antitumoral y reduce la toxicidad de inmunoconjugados. - Google Patents
Pegilacion de ligandos que mejora la actividad antitumoral y reduce la toxicidad de inmunoconjugados.Info
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Abstract
Una composición que comprende una molécula dirigible unida a una molécula efectora a través de una molécula conectora y una o más moléculas de polietilenglicol (PEG) conjugadas a dicha molécula conectora.
Description
Pegilación de ligandos que mejora la actividad
antitumoral y reduce la toxicidad de inmunoconjugados.
Esta solicitud reivindica el beneficio de las
solicitudes de patente provisional de EE.UU. 60/211.331, presentada
el 9 de junio de 2000, y 60/213.804, presentada el 22 de junio de
2000. Los contenidos de ambas solicitudes se incorporan en la
presente memoria descriptiva por referencia para todo objeto.
No aplicable.
Los inmunoconjugados recombinantes son moléculas
quiméricas en las que una molécula con una función pretendida,
denominada "molécula efectora" está acoplada a una molécula
dirigible dirigida hacia el conjugado, típicamente a una célula que
expresa un receptor determinado o un antígeno reconocido por la
molécula dirigible. Las inmunotoxinas son una forma de
inmunoconjugado en las que una toxina, por lo general fragmentada,
sirve como molécula efectora, y está condensada con una porción Fv
de un anticuerpo o con un ligando que actúa como el resto
dirigible. Se han producido muchas inmunotoxinas recombinantes
diferentes en las que la porción Fv de un anticuerpo frente a un
antígeno relacionado con un tumor está condensado con una forma
mutante de 38 kDa de la exotoxina A de Pseudomonas (PE) con
una deleción de su dominio de unión a la célula (Pastan (1997)
Biochem Biophys. Acta. 24: 1333; Kreitman y col.
(1994) Blood 83:426-434; Kreitman y
col. (1999) Int. J. Cancer 81: 148-155;
Brinkmann y col., (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA
88: 8616-8620; Reiter y col. (1994)
Cancer Res. 54: 2714-2718; Reiter y
col. (1994) J. Biol. Chem. 269:
18327-18331). Cinco de estas inmunotoxinas
recombinantes
(anti-Tac(Fv)-PE38,
B3(Fv)-PE38,
B3(dsFv)-PE38,
RFB4(dsFv)-PE38 y
e23(dsFv)-PE38) se han evaluado recientemente
en estudios en fase III con pacientes con cáncer (Kreitman y
col. (1999) Blood 94:3340-3348;
Pai-Scherf y col. (1999) Clin. Cancer Res. 5:
2311-2315). Todas estas inmunotoxinas han producido
regresiones completas de xenoinjertos de cáncer humano en ratones
desnudos (atímicos) y son relativamente bien toleradas por ratones
y monos.
La inmunotoxina
Anti-Tac(Fv)-PE38 (también
conocida como "LMB-2"), que comprende el
fragmento Fv del anticuerpo monoclonal Tac antihumano acoplado con
la subunidad \alpha del receptor de la IL-2
(también denominado Tac, p55 o CD25) ha producido respuestas
clínicas de importancia en neoplasias malignas hematológicas
(Kreitman y col. (1999) Blood
94:3340-3348). La LMB-2 se
administró a 35 pacientes con neoplasias malignas CD25+ en los que
han fracasado los tratamientos estándar y de rescate. Un paciente
con leucemia de células pilosas (HCL) presentó una remisión
completa, persistente a los 20 meses, y se observaron siete
respuestas parciales en HCL, linfoma cutáneo de células T, leucemia
linfocítica crónica, enfermedad de Hodgkin y leucemia de células T
de adultos. Véase Kreitman y col. (2000) J. Clin. Oncol
18(8): 1622.36.
Sin embargo, la LMB-2 exhibió
efectos secundarios que limitaban la cantidad de inmunotoxina que
podía administrarse a pacientes. Estos efectos secundarios tóxicos
se deben, al menos en parte, a la unión inespecífica de la LMB2 a
los tejidos normales, ya que una toxicidad limitante de la dosis
daña las células hepáticas que no expresan receptores de la
IL-2 (Kreitman y Pastan (1995) Semin. Cancer
Biol. 5: 297-306). También pueden haberse
producido efectos secundarios resultantes de dirigir de forma
específica a las células normales CD25+. Además, en algunos
pacientes tratados con LMB2 se formaron anticuerpos antiPE humanos
y en ocasiones anticuerpos FV antiratón. Esta inmunogenicidad de
inmunotoxinas recombinantes reduce su utilidad terapéutica. Si se
puede evitar la inmunogenicidad y los efectos secundarios, se
podría administrar más inmunotoxina y obtener respuestas mejoradas
en neoplasias malignas humanas. Recientemente se ha descrito una
nueva estrategia diseñada para disminuir los efectos secundarios de
la LMB-2 en la que se introducen mutaciones en la
región estructural de la Fv para reducir su punto isoeléctrico
(Onda y col., (1999) J. Immunol. 163:
6072-6077). Estas inmunotoxinas mutantes son menos
tóxicas para los ratones, lo que permite que se puedan administrar
dosis más elevadas con un incremento sustancial de la actividad
antitumoral. Sin embargo, el daño hepático todavía era la toxicidad
limitante de la dosis y este enfoque no está diseñado para
disminuir la inmunogenicidad.
Estas inmunotoxinas recombinantes (PM: 63.000)
tienen un peso molecular inferior que los conjugados
anticuerpo-toxina convencionales (PM: \sim
190.000). Aunque las moléculas de peso molecular menor tienen una
distribución aumentada en los tumores (así como en varios tejidos
normales como en los riñones y el hígado), también se eliminan de
la circulación más rápido de lo que lo hacen las moléculas más
grandes. En estudios preclínicos se ha mostrado que la actividad
antitumoral aumenta si las inmunotoxinas recombinantes sobreviven
durante más tiempo en la circulación (Pai y col., (1991)
Cancer Res. 51: 2808-2812). Por tanto, un
incremento en el tiempo de residencia en la sangre de las
inmunotoxinas de menor peso debería conducir a un incremento de sus
actividades antitumorales. El resultado neto sería un aumento de su
potencia terapéutica.
Un modo de incrementar la residencia en la sangre
de proteínas consiste en modificarlas con polietilenglicol (PEG).
La modificación química de las proteínas con PEG (PEGilación)
aumenta su tamaño molecular y su impedimento estérico, que dependen
ambas del PEG unido a la proteína. Esto tiene como resultado una
mejora de las semividas plasmáticas y de la estabilidad
proteolítica y una disminución de la inmunogenicidad y la captación
hepática (Chaffee y col. (1992) J. Clin. Invest. 89:
1643-1651; Pyatak y col. (1980) Res.
Commun. Chem. Pathol. Pharmacol. 29: 113-127).
Se ha comunicado que la PEGilación de la interleucina 2 aumenta su
potencia antitumoral in vivo (Katre y col. (1987)
Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 84: 1487-1491) y
la PEGilación de un F(ab)'2 derivado del anticuerpo
monoclonal A7 ha mejorado su localización tumoral (Kitamura y
col. (1990) Biochem. Biophys. Res. Commun. 28:
1387-1394).
Los inventores han comunicado anteriormente que
una toxina quimérica pegilada compuesta por el factor de
crecimiento transformante \alpha y PE mostraba una mejora en su
tiempo de residencia en la sangre y una disminución de su
inmunogenicidad, que tiene como resultado una intensificación in
vivo de la potencia antitumoral y una toxicidad in vivo
reducida (Wang y col., (1993) Cancer Res. 53:
4588-4594). Sin embargo, también descubrieron que la
PEGilación se acompañaba de una pérdida no deseada y significativa
de actividad citotóxica contra las células objetivo. Al contrario
que la PEGilación de enzimas, que actúa sobre sustratos pequeños,
la PEGilación de inmunotoxinas recombinantes puede producir una
disminución de su actividad a causa de la pérdida de unión al
antígeno, de la translocación al citosol o de la actividad de
ribosilación de ADP, porque estas etapas se basan en las
interacciones macromoleculares estorbadas estéricamente con
facilidad por el PEG unido. En la mayoría de los casos, la
PEGilación de proteínas es inespecífica y dirigida a todos los
residuos de lisina en la proteína, algunos de los cuales pueden
estar en o cerca del sitio activo. Para superar este inconveniente,
se intentó la PEGilación específica de sitio de las moléculas PE
mutantes que se sometieron a ingeniería genética para que
contuvieran uno o dos residuos de cisteína en la superficie de la
PE (Benhar y col. (1994) J. Biol. Chem. 269:
1398-133404; Kuan y col. (1994) J. Biol.
Chem. 269: 7610-7616). Para la unión de PEG a
estos residuos se usó química de tiol libre. Se ha probado que este
enfoque no ha tenido éxito y proporciona un bajo rendimiento de
inmunotoxina PEGilada y una pérdida significativa de actividad.
Por tanto, existe una necesidad en la técnica de
inmunotoxinas y otros inmunoconjugados con una toxicidad menor
mientras se conserva si actividad antitumoral.
La presente invención se refiere a la PEGilación
dirigida a sitio de inmunoconjugados, incluidas inmunotoxinas. En
particular, la presente invención proporciona un nuevo enfoque para
modificar con polietilenglicol (PEG) una molécula conectora que une
el resto de toxina al resto dirigible de una inmunotoxina. En
algunos aspectos de la invención, se preparar un mutante de la
inmunotoxina de interés en el que se introducen una o más cisteínas
en un péptido conector que une el anticuerpo a la toxina, y después
el mutante se modifica con PEG-maleimida. La
inmunotoxina PEGilada posee una citotoxicidad específica in
vitro comparable contra las células tumorales, aunque otras
propiedades, incluidas la estabilidad, la semivida plasmática, la
actividad antitumoral, la inmunogenicidad y la toxicidad
inespecífica, mejoran mucho.
En un aspecto, la presente invención está
dirigida a composiciones que comprenden un anticuerpo o fragmento
del mismo que retiene la capacidad de reconocimiento antigénica,
unido a una toxina a través de una molécula conectora, en el que la
molécula conectora comprende una o más moléculas de
polietilenglicol. En una forma de realización, la molécula conectora
es un péptido. En otra forma de realización, la toxina es la
exotoxina de Pseudomonas (PE). En una forma de realización
preferida, la toxina es una porción de la exotoxina de
Pseudomonas que retiene la actividad de ribosilación de ADP,
preferentemente un fragmento de 38 kDa (PE38). En otra forma más de
realización, la porción anticuerpo de la inmunotoxina es un
fragmento Fv monocatenario del anticuerpo monoclonal Tac antihumano.
En formas de realización preferidas, la inmunotoxina es
anti-Tac(Fv)-PE38 (es
decir, LMB-2).
La presente invención además proporciona un
procedimiento para aumentar la actividad antitumoral de una
inmunotoxina que tiene un resto dirigible y un resto de toxina
conectados mediante una molécula conectora, en el que dicho
procedimiento comprende la unión covalente de un polietilenglicol a
dicha molécula conectora. El resto de toxina se puede seleccionar
del grupo compuesto por la exotoxina de Pseudomonas (PE) o
un fragmento o un mutante de la misma que retiene actividad
citotóxica, la toxina diftérica o un fragmento o un mutante de la
misma que retiene actividad citotóxica, ricino, saponina, gelonina,
proteína inactivadota de ribosomas, abrina y las toxinas botulínicas
A-F. En una forma de realización preferida, la
toxina es la exotoxina de Pseudomonas (PE). En una forma de
realización más preferida, la toxina es un fragmento de 38 kDa de
la exotoxina de Pseudomonas (PE38). En otra forma más de
realización, la porción de anticuerpo de la inmunotoxina es un
fragmento Fv monocatenario del anticuerpo monoclonal Tac
antihumano. En formas de realización especialmente preferidas, la
inmunotoxina es un
anti-Tac(Fv)-PE38 (es
decir, LMB-2).
En particular, la invención proporciona
composiciones que comprenden una molécula dirigible unida a una
molécula efectora a través de una molécula conectora, en la que la
molécula conectora comprende una o más moléculas de
polietilenglicol (PEG). La molécula dirigible se puede seleccionar
de un ligando, un anticuerpo y un fragmento de un anticuerpo, en el
que dicho fragmento retiene la capacidad de reconocimiento del
antígeno. El anticuerpo o fragmento del mismo que retiene la
capacidad de reconocimiento del antígeno puede reconocer de forma
específica la subunidad \alpha del receptor de la
IL-2. En algunas formas de realización, la molécula
efectora es una toxina y en formas de realización preferidas es una
exotoxina de Pseudomonas o una porción de la misma que
retiene la capacidad de ribosilación de ADP ("PE"). En una
forma de realización particularmente preferida, la PE es PE38.
En formas de realización preferidas, la molécula
conectora es un péptido. Aunque el péptido puede tener entre
4-100 aminoácidos y preferentemente es más corto
que aproximadamente 50 aminoácidos, en las formas de realización
preferidas la molécula conectora puede ser ASGGPE (ID SEC Nº 1)
mutada mediante mutagénesis específica de sitio para que contenga
una cisteína, como en ASGCGPE (ID SEC Nº 2) y ASGCCGPE (ID SEC Nº
3), o puede ser, por ejemplo, ASCGSGCPE (ID SEC Nº 4),
KASGKKYGCK-KGPE (ID SEC Nº 5), ASCGTTGCPE (ID SEC Nº
8) o KGGGGCAGGPE (ID SEC Nº 6).
La molécula PEG se sustituye con un grupo
reactivo en un residuo aminoacídico de la molécula conectora. La
molécula PEG puede tener un peso molecular de entre 1 y 100 kD, más
preferentemente tiene un peso molecular de entre aproximadamente 3
kD y 50 kD, incluso más preferentemente tiene un peso molecular de
entre aproximadamente 5 kD y aproximadamente 20 kD. En una forma de
realización particularmente preferida, la molécula dirigible es un
anticuerpo anti subunidad \alpha del receptor de la
IL-2 conocido como anti-Tac, en el
que dicha molécula efectora es PE38 y dicha molécula conectora es
ASGCGPE (ID SEC Nº 2).
En un grupo de formas de realización, la
invención proporciona composiciones que comprenden las
composiciones mencionadas anteriormente en un vehículo
farmacéuticamente aceptable.
En otro de formas de realización, la invención
proporciona procedimientos para aumentar la actividad antitumoral
de una inmunotoxina que tiene un resto dirigible y un resto de
toxina conectados mediante una molécula conectora, en el que dicho
procedimiento comprende la unión covalente de una molécula de
polietilenglicol a dicha molécula conectora. Dos o más residuos de
dicha molécula conectora pueden estar conjugados con moléculas de
PEG (es decir, cada residuo se conjuga por separado con una
molécula de PEG que es distinta de la molécula de PEG a la que el
otro residuo está conjugado). La molécula dirigible puede
seleccionarse de un ligando, un anticuerpo y un fragmento de un
anticuerpo en el que dicho fragmento retiene la capacidad de
reconocimiento de antígeno. En algunas formas de realización
preferidas, el anticuerpo o fragmento del mismo reconoce de forma
específica la subunidad \alpha del receptor de la
IL-2. La molécula efectora puede ser una toxina, en
particular, la efectora puede ser una exotoxina de
Pseudomonas (PE) o una porción de la misma que retiene la
capacidad de ribosilación de ADP. En una forma de realización
preferida, la PE es PE38.
La molécula conectora puede ser un péptido. En
particular, la molécula conectora puede ser cualquiera de los
siguientes péptidos, aunque la posición de la cisteína puede
cambiarse si se desea: ASGCGPE (ID SEC Nº 2), ASGCCGPE (ID SEC Nº
3), ASCGSGCPE (ID SEC Nº 4), KASGKKYGCK-KGPE (ID SEC
Nº 5), ASCGTTGCPE (ID SEC Nº 8) y KGGGGCAGGPE (ID SEC Nº 6).
Los inmunoconjugados de la invención de PEGilan
mediante la sustitución de una molécula PEG por un grupo reactivo
en uno o más residuos aminoacídicos de la molécula conectora. La
molécula PEG puede tener un peso molecular (Pm) de entre 1 y 100
kD, típicamente tiene un Pm de entre aproximadamente 3 kD y
aproximadamente 50 kD, y preferentemente tiene un peso molecular de
entre aproximadamente 5 kD y aproximadamente 20 kD.
La molécula efectora puede ser una citotoxina, un
marcador, un radionúclido, un marcador detectable, un fármaco, un
liposoma, un ácido nucleico, un virus recombinante, una
glicoproteína, un ligando y o un anticuerpo. La citotoxina puede
ser la exotoxina A de Pseudomonas o un fragmento o mutante de
la misma que retenga la actividad citotóxica, la toxina diftérica o
un fragmento o mutante de la misma que retenga la actividad
citotóxica, ricino, saponina, gelonina, proteína inactivadora de
ribosomas, abrina o una toxina botulínica A-F.
En una forma de realización preferida, el resto
dirigible es un anticuerpo antiCD35 conocido como antiTac, la
molécula efectora es PE38 y la molécula conectora es ASGCGPE (ID
SEC Nº 2).
La figura 1 (A) es una representación esquemática
de la LMB-2 mutante
(anti-Tac(Fv)-PE38) con una
cisteína en la molécula conectora. Las posiciones de los
aminoácidos que atraviesan las secuencias PE están numeradas. La
secuencia de aminoácidos de la molécula conectora (C) de la
LMB-21 mutante
(cys1-LMB-2) cambia de ASGGPE (ID
SEC Nº 1) a ASGCGPE (ID SEC Nº 2). V_{H} se refiere al fragmento
de la cadena pesada del anticuerpo anti-Tac; L
representa el péptido de unión (GGGGS)_{3}(ID SEC
Nº 7); VL se refiere al fragmento de la cadena ligera; C representa
la molécula conectora; II es el dominio II de la PE; Ib es el
dominio Ib de la PE y III es el dominio III de la PE.
(B) La PEGilación específica de sitio a un
residuo de cisteína en la molécula conectora del mutante de
LMB-2, cys1-LMB-2 se
conjuga de forma específica de sitio con PEG a través de la
formación de un enlace tioéter entre un grupo tiol libre en la
molécula conectora del mutante de LMB-2 y la
maleimida en un extremo de la cadena de PEG.
Figura 2 Propiedades de las moléculas
LMB-2
- (A)
- Análisis SDS-PAGE de moléculas LMB-2 PEGiladas. El análisis SDS-PAGE se realizó en condiciones no reductoras. El carril M muestra los pesos moleculares de referencia, que, de arriba abajo son Pm 111.000, 73.000, 47.500, 33.900, 28.800 y 20.500; los carriles 1, 2, 3 y 4 corresponden a LMB-2; cys1-LMB-2; PEG5K-LMB-2 y PEG20K-LMB-2, respectivamente.
- (B)
- Citotoxicidad específica in vitro de varias formas de LMB-2 sobre células ATac4. Varias moléculas de LMB-2 se diluyeron con BSA al 0,2% en DPBS. Las células ATac4 se cultivaron a 2,0x104 células/pocillo en placas de 96 pocillos, 24 horas antes de la adición de LMB-2 (\circ), cys1-LMB-2 (\bullet), PEG5K-LMB-2 (\square), PEG20K-LMB-2 (\sqbullet) y la incubación con ellas a 37ºC durante 24 horas. A continuación se analizaron las células midiendo la inhibición de la incorporación de ^{3}[H]-leucina.
Figura 3. Estabilidad de LMB-2
pegiladas en suero de ratón. La estabilidad de
LMB-2 (\circ),
cys1-LMB-2 (\bullet),
PEG5K-LMB-2 (\square),
PEG20K-LMB-2 (\sqbullet) se
determinó mediante incubación a 10 \mug/ml a 37ºC en suero de
ratón de ratones hembra BALB/c (50 \mul de 40 \mug/ml de
inmunotoxina + 150 \mul de suero de ratón). La cantidad de
inmunotoxina activa que resta tras diferentes tiempos de incubación
se determinó mediante un ensayo de citotoxicidad.
Figura 4. Efectos antitumorales de
LMB-2 pegiladas sobre tumores sólidos de ATac4.
Células ATac4 (2 x 106) se inocularon por vía subcutánea el día 0 en
ratones desnudos. Comenzando el día 4, los ratones se trataron con
inyecciones intravenosas de inmunotoxinas los días 4, 6, 8. Se
trataron grupos de cinco ratones para cada dosis 3 veces al día x 3
a cada nivel de dosis. (A) LMB-2, (B)
cys1-LMB-2, (C)
PEG5K-LMB-2 (D),
PEG20K-LMB-2. Se usaron los
siguientes símbolos: O, diluyente; \square, 0,100 mg/kg,
\sqbullet, 0,050 mg/kg; \Delta, 0,025; \blacktriangle, 0,013
mg/kg; \blacklozenge, 0,006 mg/kg, \bullet, PEG5K 0,5 mg/kg:
\lozenge, PEG20K 0,5 mg/kg.
Figura 5. Farmacocinética de
LMB-2 pegiladas en ratones. A ratones hembra
normales BALB/c se inyectaron por vía intravenosa 2 \mug de
LMB-2 (O),
cys1-LMB-2 (\bullet),
PEG5K-LMB-2 (\square),
PEG20K-LMB-2 (\sqbullet). Se
extrajeron muestras de sangre a diferentes tiempos. El nivel de
inmunotoxina se midió mediante bioensayo en el se incubaron
muestras de suero diluido con células ATac4 y se midió la capacidad
de las muestras de suero para inhibir la síntesis de proteínas.
Para cada inmunotoxina se construyó una curva estándar. Se usaron
grupos de 4 ratones. Los valores son la media \pm DE.
Figura 6. Respuestas IgG en ratones a las
LMB-2 PEGiladas. A ratones en grupos de cinco se
inyectó por vía intraperitoneal LMB-2 (O),
cys1-LMB-2 (\bullet),
PEG5K-LMB-2 (\square) y
PEG20K-LMB-2 (\sqbullet) a una
dosis de 4 \mug/ratón o 40 \mug/ratón en PBS con seroalbúmina
de ratón (MSA) al 0,2%. Dos semanas tras la primera inmunización,
se inmunizó de nuevo a los ratones con el antígeno adecuado. Los
niveles de IgG específico se determinaron mediante ELISA el día
21.
Sorprendentemente, se ha descubierto que la
PEGilación del ligador o porción conectora de una inmunotoxina
aumenta la actividad antitumoral de la inmunotoxina, mientras que
disminuye su toxicidad e inmunogenicidad. Por tanto, la invención
proporciona un avance significativo en la técnica la proporcionar
un medio para incrementar la ventana terapéutica de las
inmunotoxinas. Este resultado no se podía haber predecido porque no
se podía haber sabido si la PEGilación del ligador interferiría o
no en el plegamiento o la actividad de la inmunotoxina y, en
particular, en la función de los restos dirigible o de toxina.
Incluso más sorprendentemente se ha descubierto
que los polietilenglicoles de peso molecular tanto elevado como
bajo se pueden conjugar a la porción de unión de una inmunotoxina
sin producir efectos adversos sobre su actividad. Hasta la fecha,
en la técnica se ha enseñado que la actividad de las proteínas
PEGiladas disminuye cuando aumenta el peso molecular del PEG unido
porque el impedimento estérico debido al PEG unido aumenta cuando
se incrementa la longitud de la cadena de PEG (Tsutsumi y
col. (1996) Br. J. Cancer 74: 1090-1095).
Sin embargo, en los estudios de los inventores se ha demostrado que
una inmunotoxina PEGilada con una forma de 20 kD de PEG tenía casi
la misma actividad que una inmunotoxina similar PEGilada con una
forma de 5kD. Por tanto, la PEGilación del ligador permite que una
inmunotoxina PEGilada con un PEG de cualquier Pm proporcione al
constructo el grado de estabilidad y tiempo de circulación en suero
deseado por cada profesional concreto, sin la pérdida de actividad
que antes se pensaba que estaba asociada con formas de PEG con Pm
más elevados.
Según los resultados obtenidos con esta
inmunotoxina, cabe esperar que las moléculas dirigibles unidas a
las moléculas efectoras distintas a las toxinas, tales como
fármacos y quelatos metálicos, exhibirán asimismo efectos
terapéuticos mejorados.
En formas de realización preferidas, el ligador
al que el PEG se conjuga es un péptido, preferentemente de una
longitud de aproximadamente 3 a aproximadamente 50 aminoácidos,
prefiriéndose de aproximadamente 6 a aproximadamente 20. En la
técnica se conoce una serie de tales péptidos ligadores y son
adecuados para usar en la invención. Convenientemente, el ligador
se puede conjugar a un PEG mediante la incorporación de una
cisteína en el ligador en una posición deseada, lo que permite a un
derivado de PEG tal como PEG maleimida conjugarse mediante química
de tiol. Sin embargo, los sitios reactivos de otros residuos de
aminoácidos pueden utilizarse para conjugar los derivados de PEG
adecuados al ligador, como se explica más adelante. En formas de
realización preferidas, PEG se une a un único residuo aminoacídico
en el ligador; sin embargo, si se desea se pueden PEGilar uno o más
residuos del ligador. Tales constructor deben probarse, por
ejemplo, mediante los ensayos que se indican en los Ejemplos, para
garantizar que tal PEGilación múltiple no afecta de forma adversa al
perfil de actividad de la inmunotoxina (es decir, su tiempo de
circulación en suero, capacidad para unirse y matar células diana,
y similares).
En consecuencia, la presente invención está
dirigida a composiciones en las que un ligador que conecta la
molécula efectora y los restos dirigibles de un inmunoconjugado
está PEGilado. En particular, la presente invención proporciona
composiciones que comprenden inmunotoxinas, en las que el conector
que une el resto dirigible con la toxina está PEGilado de un modo
específico de sitio. La presente invención además está dirigida a
procedimientos para incrementar la actividad antitumoral de una
inmunotoxina, que comprenden unir una o más moléculas de
polietilenglicol al conector que une la toxina con el resto
dirigible.
En particular, la presente invención proporciona
un procedimiento para introducir una mutación en la región
conectora que une el anticuerpo o el fragmento de anticuerpo con la
toxina de interés, típicamente para introducir un residuo de
cisteína. Después, el residuo de cisteína u otro residuo introducido
puede usarse para la PEGilación específica de sitio de la región
conectora. En caso de la introducción de un residuo de cisteína, la
PEGilación puede llevarse a cabo de forma conveniente usando
química de tiol. Las químicas para realizar la PEGilación de
comentan con más detalle más tarde.
En una serie de formas de realización, la toxina
usada en las inmunotoxinas de la invención es la exotoxina A de
Pseudomonas (PE). Típicamente, las moléculas de PE usadas en
tales inmunotoxinas se han modificado para reducir o eliminar la
unión inespecífica y la toxicidad. En una forma de realización
preferida, la toxina es un fragmento truncado citotóxico de 38 kDa
de la exotoxina de Pseudomonas conocido como PE38. En otra
serie de formas de realización, la porción de anticuerpo de la
inmunotoxina es un fragmento Fv monocatenario de un anticuerpo
monoclonal Tac antihumano frente a la subunidad \alpha del
receptor de la IL-2 (también conocido como Tac). En
formas de realización preferida, la inmunotoxina es la
anti-Tac(Fv)-PE38, también
conocido como LMB-2.
Aunque estas son formas de realización
particularmente preferidas, en la técnica se conocen numerosos
antígenos que se expresan en células cancerosas, como también
anticuerpos que se unen de forma específica a esos antígenos
cancerosos. Además, en la técnica también se conocen
inmunoconjugados e inmunotoxinas que emplean estos anticuerpos. La
presente invención contempla específicamente que la estabilidad y
el tiempo de circulación en suero de estos inmunoconjugados e
inmunotoxinas se puede mejorar mediante PEGilación de sus restos
ligadores.
Las unidades, los prefijos y los símbolos se
representan según la forma aceptada por el Sistema Internacional de
Unidades (SI). Los intervalos numéricos incluyen los números que
definen el intervalo. A menos que se indique otra cosa, los ácidos
nucleicos se escriben de izquierda a derecha en orientación 5' a 3';
las secuencias de aminoácidos se escriben de izquierda a derecha,
en orientación de amino a carboxi. Los encabezamientos que se
proporcionan en la presente memoria descriptiva no son limitaciones
de los diversos aspectos o formas de realización de la invención,
que se pueden tener como referencia de la descripción como un todo.
En consecuencia, los términos definidos justo a continuación se
definen con más detalle haciendo referencia a la descripción en su
totalidad.
En el contexto de la presente invención, el
término "anticuerpo" o "fragmento/fragmentos de
anticuerpo" se refiere a anticuerpos monoclonales y
policlonales, un anticuerpo o una inmunoglobulina completos o
cualquier fragmento funcional de una molécula de inmunoglobulina
que se une al antígeno diana y que se define a continuación. Entre
los ejemplos de tales entidades funcionales se incluyen moléculas
completas de anticuerpos, fragmentos de anticuerpos, tales como
Fv,. Fv monocatenario, regiones determinantes de la
complementariedad (CDR), V_{L} (regiones variables de la cadena
ligera), V_{H} (regiones variables de la cadena pesada), Fab,
F(ab)2' y cualquier combinación de estos o cualquier
otra porción funcional de un péptido de inmunoglobulina capaz de
unirse a un antígeno diana (véase, por ejemplo, el Pierce Catalog
and Handbook Manual, 1994-1995 (Pierce Chemical Co.,
Rockford, IL; Kuby, Immunology, 3ª ed., W. H. Freeman & Co.,
Nueva Cork (1997).
Se puede generar un anticuerpo inmunológicamente
activo con un antígeno concreto mediante procedimientos
recombinantes tales como la selección de bibliotecas de anticuerpos
recombinantes en fagos o vectores similares, véase, por ejemplo,
Huse y col., Science 246:
1275-1281 (1989); Ward y col., Nature
341: 544-546 (1989) y Vaughan y col.,
Nature Biotech. 14: 309-314 (1996) o
mediante la inmunización del animal con el antígeno o con el ADN
que codifica el antígeno.
Típicamente, una inmunoglobulina tiene una cadena
ligera y una pesada. Cada cadena ligera y pesada contiene una
región constante y una región variable (las regiones también se
conocen como "dominios"). Las regiones variables de las
cadenas ligera y pesada contienen una región "estructural"
interrumpida por tres regiones hipervariables, también denominadas
"regiones determinantes de la complementariedad" o "CDR".
Se ha definido la extensión de la región estructural y de las CDR
(véase Rabat, E. y col., SECUENCIAS DE PROTEÍNAS DE INTERÉS
INMUNOLÓGICO, Departamento de Salud y Servicios Sociales de EE.UU.
(US Department of Health and Human Services), (1987). Las
secuencias de las regiones estructurales de las diferentes cadenas
ligera o pesada están relativamente conservadas entre especies. La
región estructural de un anticuerpo, es decir las regiones
estructurales combinadas de las cadenas constituyentes ligera y
pesada, sirve para colocar y alinear las CDR en las tres
dimensiones del espacio.
Los anticuerpos existen, por ejemplo, en forma de
inmunoglobulinas intactas o como un número de fragmentos bien
caracterizados producidos por la digestión con diversas peptidasas.
Por tanto, por ejemplo, la pepsina digiere los anticuerpos por
debajo de los puentes disulfuro en la región bisagra para producir
F(ab)'2, un dímero de Fab que en sí mismo es una cadena
ligera unida a V_{H}-C_{H1} a través de un
puente disulfuro. La F(ab)_{2}' puede reducirse en
condiciones suaves para romper el puente disulfuro por la zona
bisagra, convirtiendo de este modo el dímero
F(ab)_{2}' en monómero Fab'. El monómero Fab' es
esencialmente un Fab con parte de la región bisagra (véase,
Fundamental Immunology, 3ª ed., W.E. Paul, ed., Raven Press, N.Y.
(1993). Aunque varios fragmentos de anticuerpo se definen en
términos de la digestión de un anticuerpo intacto, un experto
apreciará que tales fragmentos se pueden sintetizar de novo bien
químicamente o mediante el uso de metodología de ADN recombinante.
Por tanto, el término anticuerpo, como se usa en la presente
memoria descriptiva, también incluye fragmentos de anticuerpo
producidos mediante la modificación de anticuerpos enteros o
aquéllos sintetizados de novo mediante metodologías de ADN
recombinante. Además, en el contexto de la presente invención, el
término "anticuerpo" también incluye todas las formas
sometidas a ingeniería genética tales como anticuerpos quiméricos
(por ejemplo, anticuerpos murinos humanizados), anticuerpos
heteroconjugados (por ejemplo, anticuerpos bioespecíficos) y
fragmentos FV monocatenarios recombinantes (Fvmc), fragmentos Fv
(dsFV) estabilizados mediante puentes disulfuro (por ejemplo,
anticuerpos bioespecíficos) y fragmentos Fv monocatenarios
recombinantes (scFv),estabilizados por puentes disulfuro (véase la
solicitud de patente de EE.UU. nº 08/077.252 o fragmentos pFv
(véase la solicitud de patente provisional de números 60/042.350 y
60/048.848).
El término "anticuerpo monocatenario" se
refiere a un anticuerpo en el que la información genética que
codifica fragmentos funcionales del anticuerpo ser localizan en un
único ADN de longitud contigua. Para una descripción más detallada
de los anticuerpos de cadena única, véase, por ejemplo, Bire y
col., (1988) Science 242:423; y Huston y col.
(1988) Proc Natl Acad. Sci. USA 85: 5879.
"Tac" se refiere a la subunidad \alpha del
receptor de la IL-2. Los anticuerpos que se unen de
forma específica a esta subunidad se denominan anticuerpos
"anti-Tac".
En el contexto de la presente invención,
"proteínas quiméricas" se refiere a proteínas en las que dos o
más moléculas que existen por separado en su estado nativo se unen
para formar una única molécula que tenga la funcionalidad deseada
de todos sus constituyentes.
El término "inmunoconjugado" incluye
referencias a un enlace covalente de una molécula efectora a una
molécula dirigible, bien directamente o a través de una molécula
conectora o ligadora. En el contexto de la presente invención, la
molécula efectora y la molécula dirigible están conectadas a través
de una molécula ligador. En muchas de las formas de realización
preferidas de la invención, la molécula efectora es una toxina; los
inmunoconjugados que incorporan una molécula de toxina se denominan
más específicamente con el término "inmunotoxina".
El término "resto" se usa para hacer
referencia a una porción de una molécula, en la que dicha porción
tiene una funcionalidad pretendida. Por tanto, en un
inmunoconjugado, la porción dirigible puede denominarse "resto
dirigible", y en una inmunotoxina, la molécula de toxina
incorporada puede denominarse "resto toxina".
Un "resto terapéutico" es la porción de un
inmunoconjugado que se pretende que actúe como agente
terapéutico.
El término "agente terapéutico" incluye
cualquier número de compuestos que se conocen en la actualidad o
desarrollados más tarde para que actúen como antineoplásicos,
antiinflamatorios, citoquinas, antiinfecciosos, activadores o
inhibidores de enzimas, modificadores alostéricos, antibióticos u
otros agentes administrados para inducir un efecto terapéutico
deseado en un paciente. El agente terapéutico también puede ser una
toxina, donde el agente terapéutico pretendido es, por ejemplo, la
muerte de una célula cancerosa. Además, puede ser, por ejemplo, un
radioisótopo, a menudo un quelato metálico, que se conjuga con el
ligador mediante procedimientos químicos estándar en la técnica.
Un "marcador detectable" significa, con
relación a un inmunoconjugado, una porción del inmunoconjugado que
posee una propiedad que hace que se pueda detectar su presencia.
Por ejemplo, el inmunoconjugado puede estar marcado con un isótopo
radioactivo que permite detectar las células en las que el
inmunoconjugado está presente mediante análisis
inmunohistoquímicos.
Los términos "resto efector" o "molécula
efectora" significan la porción de un inmunoconjugado que se
pretende que tenga un efecto sobre una célula diana por parte del
resto dirigible o identificar la presencia del inmunoconjugado. Por
tanto, el resto efector puede ser, por ejemplo, un resto
terapéutico, una toxina, un marcador radioactivo o un marcador
fluorescente.
Las "inmunotoxinas" son proteínas quiméricas
en las que, típicamente una "toxina" está acoplada,
directamente o a través de un ligador, a un "resto dirigible"
para generar potentes reactivos para matar específicos de tipo
celular. En el contexto de la presente invención, el término
"resto dirigible" se refiere a una porción de una inmunotoxina
que es capaz de dirigir la toxina o el resto tóxico a una célula o
tejido de interés, por lo general mediante su unión específica a su
diana correspondiente (por ejemplo, un receptor en la superficie de
la células). Entre los ejemplos de "moléculas dirigibles" se
incluyen, aunque no se limitan a ellas, ligandos de unión a un
receptor y anticuerpos o fragmentos de anticuerpos que retienen la
capacidad de reconocimiento del antígeno, tales como scFv, adsFv y
Fab, o una F(ab)'_{2}. Por tanto, por ejemplo, cuando el
resto dirigible es un anticuerpo, la inmunotoxina se unirá de forma
específica a células que llevan el epítopo hacia el que está
dirigido el anticuerpo. Como se usa en la presente memoria
descriptiva, los términos "resto dirigible" y "molécula
dirigible" se usan de forma intercambiable.
Típicamente, las "toxinas" son enzimas
citotóxicas, por lo general de plantas y bacterias, e incluyen
abrina, ricino, exotoxina A de Pseudomonas (PE), toxina
diftérica (DT), toxina botulínica y formas mutadas y modificadas de
estas toxinas que retienen propiedades citotóxicas cuando se
dirigen a células de interés. Por ejemplo, la PE y la DT son
compuestos muy tóxicos que típicamente matan a través de toxicidad
hepática. Sin embargo, la PE y la DT se pueden modificar a una
forma para usar en inmunotoxinas mediante la eliminación del
componente dirigible nativo de la toxina (por ejemplo, dominio de la
PE o la cadena B de la DT) y su sustitución con un resto dirigible
diferente, tal como un anticuerpo. Un "resto tóxico" es esa
porción de una inmunotoxina responsable de la citotoxicidad de la
molécula completa.
Las inmunotoxinas actúan como potentes agentes de
muerte celular dirigiendo de forma específica la toxina a las
células que llevan una molécula diana concreta reconocida por el
resto dirigible. Existe una gran cantidad de bibliografía acerca de
las inmunotoxinas, incluidos, por ejemplo, Pastan y col.,
(1992) Ann. Rev. Biochem. 61: 331-354; Youle
y col., (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 5483;
Gilliland y col., (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA
77: 4539; Krolick y col., (1980) Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 77: 5419; Griffin y col., (1988) "Immunotoxins"
pág. 433, Boston/Dordrecht/Lancaster, Kluwer Academia Publishers;
Vitetta y col., (1987) Science 238:1098 y Fitzgerald y
col., (1989) J. Natl. Cancer Inst. 81: 1455.
El resto dirigible y las porciones de toxina de
las inmunotoxinas de la invención están unidos por una molécula
denominada "conectora" o "ligador". Como se usa en la
presente memoria descriptiva, los términos "conectora" y
"ligador" son intercambiables. Típicamente, una molécula
conectora no posee actividad biológica específica distinta a la de
unir las proteínas o mantener alguna distancia mínima u otra
relación espacial entre ellas. Sin embargo, los aminoácidos
constituyentes de una molécula conectora pueden seleccionarse para
que influyan sobre alguna propiedad de la molécula tal como el
plegamiento, la carga neta o la hidrofobicidad de la molécula. El
ligador es capaz de formar enlaces covalentes con el anticuerpo y
con la molécula de toxina.
Los términos "ADN recombinante", "ácido
nucleico recombinante" o "ADN producido de forma
recombinante" se refieren a ADN que se ha aislado de su fuente
nativa o endógena y se ha modificado química o enzimáticamente
mediante la adición, la deleción o la alteración de nucleótidos
adyacentes o internos. Los nucleótidos adyacentes son los
nucleótidos que se encuentran en dirección 3' o 5' de la secuencia
o subsecuencia de nucleótidos descrita, mientras que los nucleótidos
internos son los nucleótidos que están dentro de la secuencia o
subsecuencia descrita.
El término "medio recombinante" se refiere a
las técnicas mediante las que se aíslan proteínas, se identifica la
secuencia de ADNc que codifica la proteína y se inserta en un
vector de expresión. A continuación, el vector se introduce en una
célula y la célula expresa la proteína. El medio recombinante
también abarca la ligadura/unión de ADN codificador o promotor de
diferentes fuentes en un vector para la expresión de una proteína
quimérica, la expresión constitutiva de una proteína o la expresión
inducible de una proteína.
Los términos "proteína recombinante",
"proteína producida de forma recombinante" o "inmunotoxina
producida de forma recombinante" se refieren a un péptido o
proteína producida usando células no nativas que no poseen una copia
endógena de ADN capaz de expresar la proteína. Las células producen
la proteína porque han sido alteradas genéticamente mediante la
introducción de la secuencia adecuada de ácidos nucleicos. La
proteína recombinante no se encontrará asociada con proteínas y
otros componentes subcelulares que normalmente están asociados con
las células que producen la proteína.
Como se usa en la presente memoria descriptiva,
"polipéptido", "péptido" y "proteína" se usan de
forma intercambiable e incluyen las referencias a un polímero de
residuos aminoacídicos. Los términos se aplican a polímeros de
aminoácidos en los que uno o más residuos aminoacídicos es un
análogo químico artificial de un correspondiente aminoácido
natural, así como a polímeros de aminoácidos naturales. Los
términos también se aplican a polímeros que contienen sustituciones
conservadoras de aminoácidos de forma que la proteína permanezca
funcional.
El término "residuo" o "residuo
aminoacídico" o "aminoácido" incluye las referencias a un
aminoácido que se incorpora en una proteína, polipéptido o péptido
(colectivamente "péptido"). El aminoácido puede ser un
aminoácido natural y, a menos que se limite de otro modo, puede
abarcar análogos conocidos de aminoácidos naturales que pueden
funcionar de un modo similar al de los aminoácidos naturales.
Los aminoácidos y análogos a los que se hace
referencia en la presente memoria descriptiva se describen mediante
designaciones breves como se ilustra en la Tabla A
continuación:
Una "sustitución conservadora", cuando
describe una proteína se refiere a un cambio en la composición de
aminoácidos de la proteína que no altera de forma sustancial la
actividad de la proteína. Por tanto, "variaciones modificadas de
modo conservador" de una secuencia de aminoácidos concreta se
refiere a sustituciones aminoacídicas de los aminoácidos que no son
cruciales para la actividad de la proteína o la sustitución de
aminoácidos con otros aminoácidos que tienen proteínas similares
(por ejemplo, ácidos, básicos, con carga positiva o negativa,
polares o apolares, etc.), de modo que incluso sustituciones de
aminoácidos cruciales no alteran la actividad de forma sustancial.
En la técnica se conocen bien las tablas de sustituciones
conservadoras que proporcionan aminoácidos de funcionalidad
similar. Cada uno de los siguientes seis grupos de la Tabla B
contiene aminoácidos que son sustituciones conservadoras unos de
otros:
| 1) | Alanina (A), serina (S), treonina (T); |
| 2) | Ácido aspártico (D), ácido glutámico (E); |
| 3) | Asparagina (N), glutamina (Q); |
| 4) | Arginina (R), lisina (K); |
| 5) | Isoleucina (I), leucina (L), metionina (M), valina (V); y |
| 6) | Fenilalanina (F), tirosina (Y), triptófano (W). |
| Véase también Creighton, PROTEINS, W. H. Freeman and Company, Nueva Cork (1984). |
Los términos "sustancialmente similar" en el
contexto de un péptido indica que un péptido comprende una
secuencia con al menos un 90%, preferentemente al menos un 95%, de
identidad de secuencia con la secuencia de referencia en una ventana
de comparación de 10-20 aminoácidos. El porcentaje
de identidad de secuencia se determina mediante la comparación de
dos secuencias alineadas de forma óptima en una ventana de
comparación, en la que la porción de la secuencia polinucleotídica
en la ventana de comparación puede comprender adiciones o
deleciones (es decir, huecos) en comparación con la secuencia de
referencia (que no comprende adiciones o deleciones) para el
alineamiento óptimo de las dos secuencias. El porcentaje se calcula
mediante la determinación del número de posiciones en los que la
base del ácido nucleico o el residuo aminoacídico idéntico se
produce en ambas secuencias, para dar el número de posiciones
iguales coincidentes, la división del número de posiciones iguales
por el número total de posiciones en la ventana de comparación y la
multiplicación del resultado por 100 para dar el porcentaje de
identidad de secuencia.
La expresión "puente disulfuro" o "puente
disulfuro cisteína-cisteína" se refiere a una
interacción covalente entre dos cisteínas en la que los átomos de
azufre de las cisteínas se oxidan para formar un puente disulfuro.
La energía de enlace media de un puente disulfuro es de
aproximadamente 60 kcal/mol en comparación con 1-2
kcal/mol de la de un enlace de hidrógeno. En el contexto de esta
invención, las cisteínas que forman el puente disulfuro se
encuentran dentro de las regiones estructurales del anticuerpo de
cadena sencilla y sirven para estabilizar la conformación del
anticuerpo.
Los términos "conjugar", "unir",
"enlazar" o "ligar" se refieren a convertir dos
polipéptidos en una molécula polipeptídica contigua. En el contexto
de la presente invención, los términos incluyen referencias a la
unión de un resto anticuerpo a una molécula de toxina. El enlace se
puede hacer por medios químicos o recombinantes. "Medio
químico" se refiere a una reacción entre el resto anticuerpo y
el resto de toxina de modo que se forme un enlace covalente entre
las dos moléculas para formar una molécula. Más particularmente, en
el contexto de la invención, "medio químico" se refiere a
reacciones por las que una molécula ligadora, por lo general un
péptido corto, se une de forma covalente por un extremo a una
molécula dirigible y por el otro extremo a una molécula de
toxina.
Las inmunotoxinas de la invención comprenden un
resto dirigible y un resto de toxina conectados mediante una
molécula ligadora. En la técnica se conocen varios ligadores y
comparten las propiedades de ser no reactivos en condiciones
fisiológicas y de no interferir en la actividad de los restos
dirigible o de toxina. Cuando el anticuerpo y la molécula de toxina
son polipéptidos, los ligadores pueden estar unidos a los
aminoácidos constituyentes a través de sus grupos laterales (por
ejemplo, a través de un puente disulfuro a la cisteína). Sin
embargo, en formas de realización preferidas, los ligadores se
unirán a los grupos amino y carboxilo del carbono alfa de los
aminoácidos terminales.
En formas de realización preferidas, el ligador
es un péptido y, preferentemente, tiene una longitud de 1 a 150
residuos, más preferentemente una longitud de 3 a 100 residuos e
incluso más preferentemente una longitud de 3 a 50 residuos o
menos. En formas de realización incluso más preferidas, el ligador
tiene una longitud de aproximadamente 4 a aproximadamente 20
residuos de aminoácidos y en algunas formas de realización
particularmente preferidas tiene una longitud de aproximadamente 6
a aproximadamente 17 residuos y en otras la longitud es de
aproximadamente 6 a 10 residuos. Las moléculas de peso molecular
mayor tienden a tener una menor penetración en el tumor y la porción
ligadora no debería ser tan larga que reduzca en más de un 50%, o
más preferentemente en más de un 25%, la capacidad de la
inmunotoxina para penetrar en un tumor, en comparación con una
inmunotoxina que tenga los mismos restos dirigible y de toxina pero
un ligador de 10 residuos aminoacídicos o menos. En la técnica se
conocen bien los ensayos para determinar la penetración en el tumor
de las inmunotoxinas, y pueden realizarse, por ejemplo, mediante
marcaje radioactivo de la inmunotoxina, la introducción de la
inmunotoxina en un animal que tenga un tumor sólido (como un ratón
desnudo en las que se han introducido células de un tumor sólido
humano) y después la sección y autor radiografía del tumor para
determinar la distancia en el interior del tumor a la que ha
penetrado la inmunotoxina.
En formas de realización especialmente
preferidas, los ligadores son péptidos de una longitud de
aproximadamente 4 a aproximadamente 20 residuos aminoacídicos. En
general se puede usar cualquier péptido de esta longitud siempre que
no interfiera en el plegamiento adecuado o la actividad del resto
dirigible o del resto de toxina de la inmunotoxina. El efecto del
ligador sobre la actividad de estos restos se puede determinar con
facilidad mediante el ensayo de la unión del resto dirigible a su
diana y el análisis de la citotoxicidad del resto tóxico sobre las
células hacia las que está dirigido el resto dirigible. Una
disminución en la afinidad de unión del resto dirigible en más del
25% o una reducción de la citotoxicidad del resto de toxina en más
del 25%, o ambos, indican que el péptido ligador particular probado
no es adecuado. En la técnica se conocen ensayos para determinar
las capacidades de unión de numerosos anticuerpos y ligandos. Por
ejemplo, la afinidad de unión de un ligando empleado como molécula
dirigible de la inmunotoxina puede analizarse mediante la medición
de la capacidad de la molécula dirigible para desplazar un ligando
nativo de su sustrato diana. Esto puede conseguirse marcando el
ligando nativo y después incubando las células que llevan el
receptor diana con una cantidad fija del ligando marcado y varias
concentraciones de la inmunotoxina que contiene el ligando. La
cantidad de ligando nativo unido se puede determinar mediante la
detección de la cantidad de marcador unido a la célula diana. El
ligando nativo no marcado se puede usar como control.
Un experto reconocerá que la selección de la
célula diana se determina con el ligando concreto. El particular
marcador se selecciona de forma que interfiera mínimamente en la
unión del ligando nativo marcado. Los expertos en la técnica
conocen bien marcadores adecuados, entre los que se incluyen, aunque
no se limitan a ellos, marcadores radioactivos (por ejemplo,
^{125}I, ^{32}P), marcadores fluorescentes (por ejemplo,
fluoresceína o rodamina) y marcadores enzimáticos (por ejemplo,
peroxidasa de rábano). La citotoxicidad se puede determinar
mediante ensayos estándar, tales como los que se enseñan en los
siguientes ejemplos. El péptido puede mutarse mediante mutagénesis
específica de sitio para introducir un residuo con un grupo
funcional adecuado para reaccionar con el PEG en el ligador en
cualquier punto deseado, o para sustituir un residuo con tal grupo
funcional para cualquiera de los residuos aminoacídicos previamente
presentes en el ligador. La química de los grupos funcionales para
conjugar PEG con los residuos aminoacídicos se conoce bien y se
enseña en, por ejemplo, referencias tales como Hermanson,
Bioconjugate Techniques, Academic Press San Diego, CA (1996),
capítulo 15, y en Zalipsky y col., "Succinimidyl
Carbonates of Polyethylene Glycol," en Dunn y Ottenbrite, eds.,
Polymeric Drugs and Drug Delivery Systems, American Chemical
Society, Washington, D.C. (1991).
Particularmente se prefieren cisteínas para
introducir o sustituir en un ligador, ya que las cisteínas permiten
la fácil conjugación de un derivado de PEG mediante química de
tiol, como se ilustra en los Ejemplos. Si se desea, se pueden
añadir dos o más cisteínas al ligador. La química de tiol se conoce
bien y se enseña en referencias tales como Hermanson, supra,
y Zalipsky, supra.
Una molécula ligadora preferida para la
mutagénesis para que contenga una cisteína es ASGGPE (ID SEC Nº 1).
En formas de realización preferidas, el péptido ligador se
selecciona de los siguientes péptidos, que figuran según el código
estándar de una sola letra: ASGCGPE (ID SEC Nº 2), ASGCCGPE (ID SEC
Nº 3), ASCGSGCPE (ID SEC Nº 4), ASCGTTGCPE (ID SEC Nº 8),
KASGKKYGCK-KGPE (ID SEC Nº 5) y KGGGGCAGGPE (ID SEC
Nº 6), siendo los primeros tres de la lista los más preferidos y el
primero de la lista el más preferido. Aunque se prefieren los
péptidos concretos comentados, las cisteínas se pueden colocar en
otras posiciones en el ligador. Por ejemplo, el péptido preferido
ASGGPE (ID SEC Nº 1) podría tener las cisteínas introducidas del
siguiente modo: CASGGPE (ID SEC Nº 9), ACSGGPE (ID SEC Nº 10),
ASCGGPE (ID SEC Nº 11), ASGGCPE (ID SEC Nº 12), ASGGPCE (ID SEC Nº
13) y ASGGPEC (ID SEC Nº 14). En el ligador se puede introducir más
de una cisteína, de forma que se puede PEGilar más de un residuo
del ligador. Los constructos que emplean estos ligadores se pueden
someter a pruebas para determinar su actividad mediante ensayos
estándar, como los que se exponen en los ejemplos, para confirmar
que la PEGilación no interfiere en la actividad deseada del
inmunoconjugado.
En los inmunoconjugados de la invención, la
molécula ligadora está PEGilada. En general, cualquier residuo del
ligador se puede PEGilar, aunque generalmente es preferible la
PEGilación de un residuo distinto al primer y último residuos del
ligador (es decir, los residuos unidos de forma covalente
directamente a los restos dirigible y efector), ya que es más
probable que la PEGilación de estos residuos interfieran en el
plegamiento o la actividad de los restos dirigible y efector. Sin
embargo, si se desea, estos residuos se pueden PEGilar y se puede
probar el inmunoconjugado resultante para determinar su actividad
dirigible y efectora, por ejemplo mediante los ensayos de toxicidad
de las inmunotoxinas que se ilustran en los Ejemplos.
En la técnica se conocen varios procedimientos
para PEGilar moléculas. Típicamente, tales procedimientos emplean
PEG derivatizados que permiten el acoplamiento del PEG a proteínas
en las condiciones de reacción deseadas. Se conocen numerosos de
tales PEG derivatizados, tales como: ésteres
N-hidroxisuccinimida (NHS) de ácidos PEG
carboxílicos, monometoxi-PEG2-NHS,
succinimidiléter de PEG carboximetilado (SCM-PEG),
derivados de benzotriazol carbonato de PEG, éteres de glicidilo de
PEG, carbonatos de PEG p-nitrofenilo
(PEG-NCP, tales como metoxi
PEG-NPC), aldehídos de PEG,
PEG-ortopiridildisulfuro y PEG carbonildiimidazol
activados. Uno de los derivados de PEG más convenientes para
bioconjugación es PEG-tiol. El
PEG-maleimida se prefiere particularmente para usar
en la conjugación de PEG con ligadores peptídicos en las
inmunotoxinas de la invención. Todos los derivados de PEG de la
lista están comercialmente disponibles a varios pesos moleculares.
Véase, por ejemplo, Catalog, Polyethylene Glycol and Derivatives,
2000 (Shearwater Polymers, Inc., Huntsville, AL). Este catálogo
también contiene una descripción de la química de la conjugación de
cada derivado y referencias a la bibliografía acerca de los
protocolos para tales conjugaciones. Si se desea, muchos de los
anteriores derivados están disponibles en forma
monometoxi-PEG (mPEG) monofuncional. LA PEGilación
de moléculas tales como los ligadores peptídicos de los
inmunoconjugados de la presente memoria descriptiva se comentan más
en, por ejemplo, Hermanson, Bioconjugate Techniques, Academic Press
San Diego, CA (1991), capítulo 15 y en Zalipsky y col.,
"Succinimidyl Carbonates of Polyethylene Glycol", en Dunn y
Ottenbrite, eds., Polymeric Drugs and Drug Delivery Systems,
American Chemical Society, Washington, D.C. (1991).
De forma conveniente, el PEG se puede unir a una
posición escogida en el ligador mediante mutagénesis específica de
sitio. Por ejemplo, el ligador se puede someter a técnicas de
ingeniería genética para que tenga un residuo de cisteína en la
posición deseada, para facilitar la unión del PEG. Un ejemplo de
procedimiento para unir el PEG a un ligador mediante química de tiol
a una cisteína introducida en un ligador mediante ingeniería
genética se expone en los Ejemplos. Sin embargo, se pueden usar
otras técnicas químicas de conjugación. Por ejemplo, aunque en los
ejemplos se usó PEG-maleimida, la
PEG-vinilsulfona y el
PEG-ortopiridildisulfuro son PEG activados que se
pueden unir a residuos de cisteína, el primero mediante un enlace
tioéter y el último mediante un puente disulfuro.
Aunque la conjugación a residuos de cisteína es
un procedimiento conveniente por el cual se pueden PEGilar los
ligadores, si se desea también se pueden usar otros residuos. La
reactividad de las cadenas laterales de los residuos de aminoácidos
se conoce bien, véase, por ejemplo, Feeney y col., "Chemical
Modification of Proteins: An Overview", en Feeney y Whitaker,
eds. Modification of Proteins, American Chemical Society,
Washington D.C. (1982) en la Tabla 1. Por ejemplo, se puede usar
anhídrido acético para reaccionar con grupos NH_{2} y SH, pero no
con grupos COOH, S-S o -SCH_{3}, mientras que el
peróxido de hidrógeno se puede usar para reaccionar con grupos -SH y
-SCH_{3}, pero no con NH_{2}. Las reacciones se pueden llevar a
cabo en las condiciones adecuadas para la conjugación a un residuo
deseado en el ligador mediante técnicas químicas que explotan las
reactividades establecidas.
Cuando el ligador se prepara mediante química
sintética en lugar de con medios recombinantes se pueden explotar
químicas adicionales. Por ejemplo, se puede añadir un residuo de
lisina al ligador mediante la formación del enlace peptídico usando
el grupo epsilon-amino en lugar del habitual grupo
\alpha-amino. El grupo
\alpha-amino libre de tal lisina se desprotona a
un pH inferior al del grupo epsilon-amino libre de
las lisinas de la inmunotoxina que están unidas por el grupo
\alpha-amino. Mediante el control del pH de las
condiciones de reacción, la lisina con el grupo
\alpha-amino libre puede reaccionar con PEG sin
PEGilar también otras lisinas en el ligador o, si la PEGilación se
lleva a cabo después de la incorporación del ligador en la
inmunotoxina, con otras lisinas de la inmunotoxina.
En general, el peso molecular (Pm) del PEG
añadido al ligador debería variar desde varios cientos de dalton a
aproximadamente 100 kD. Se pueden usar PEG de Pm mayor, aunque
puede tener como resultado alguna pérdida de rendimiento de la
proteína PEGilada. Asimismo se debe vigilar la pureza de las
moléculas más grandes de PEG, ya que puede ser difícil obtener PEG
de Pm mayor de una pureza tan elevada como la que se puede obtener
con los PEG de Pm menor. Es preferible usar PEG con una pureza de
al menor 85%, y más preferentemente con una pureza de al menos 90%,
una pureza de 95% o mayor. Los PEG de Pm mayor también pueden
exhibir características diferentes en términos de unión a la célula
diana, translocación (cuando la molécula efectora se internalizará)
y, en el caso de inmunotoxina con base de PE, en términos de
ribosilación de ADP por la toxina. Estas características pueden
variar para los diferentes tipos de tumores (tumores hematológicos
frente a carcinomas); se pueden probar con facilidad mediante
ensayos estándar, tales como los que se exponen en los ejemplos.
Preferentemente, el Pm del PEG debería variar de
aproximadamente 1 kD a aproximadamente 30 kD e incluso más
preferentemente de aproximadamente 3 kD a aproximadamente 30 kD. En
formas de realización particularmente preferidas, el PM variará de
o aproximadamente 5 kD a aproximadamente 20 kD. Varios derivados de
PEG están comercialmente disponibles a estos PM. Por ejemplo, el
monometiléter de PEG se puede obtener de Shearwater Polymers, Inc. A
Pm de 1 kD, 2 kD, 3 kD, 5 kD, 10 kD, 12 kD y 20 kD, mientras que
varias formas de propionato de succinimidilo de PEG están
disponibles a Pm de 2, kD, 3.400 D, 5 kD y 20 kD. Como se ha
mencionado antes, también se pueden usar PEG de Pm más elevados,
aunque se prefieren los PEG de hasta 30 kD de Pm simplemente porque
se dispone de ellos con más facilidad. Como también se ha
mencionado, es posible que los PEG de Pm significativamente
superior, por ejemplo los PEG con un Pm por encima de 100 kD, sean
tan grandes que interfieran hasta cierto punto en la penetración en
el tumor u en toros aspectos de la actividad antitumoral,
farmacocinética y otras propiedades de las moléculas. Sin embargo,
estos problemas se deben sopesar con el tiempo de residencia más
prolongado que tiene el inmunoconjugado PEGilado en el tejido
diana. Cualquier PEG concreto se puede probar mediante los ensayos
que se exponen en los Ejemplos y otros ensayos conocidos en la
técnica para determinar si un inmunoconjugado que incorpora un PEG
tiene un perfil de actividad menos deseable que el del mismo
inmunoconjugado con jugado con un PEG de menor Pm.
Como debe quedar claro a partir de la anterior
descripción, el PEG se añade al ligador como sustituyente en la
cadena lateral reactiva de un residuo aminoacídico del ligador.; el
PEG no se incorpora como parte interna del polímero ligador. Las
moléculas de PEG se pueden conjugar con más de un aminoácido del
ligador, especialmente en los ligadores de 20 aminoácidos o más. En
general es deseable tener algo de distancia a lo largo de la
longitud de la molécula ligadora entre los residuos a los que el
PEG está unido; un espaciamiento de cinco residuos suele ser
aceptable. Por lo general no es deseable PEGilar más de cuatro
residuos de un ligador sencillo.
Deberán realizarse pruebas sobre los
inmunoconjugados con OPEG conjugados a más de dos residuos (por
ejemplo, mediante los ensayos que se exponen a continuación) para
confirmar que retienen una actividad satisfactoria. En general, si
el inmunoconjugado pierde más del 25% de su actividad en comparación
con un inmunoconjugado similar con sólo un residuo ligador
conjugado con una molécula de PEG (por ejemplo, si una inmunotoxina
pierde más del 25% de su actividad antitumoral), el número de
residuos del inmunoconjugado conjugado al PEG debería
reducirse.
Los inmunoconjugados incluyen, aunque no se
limita a ellos, moléculas en las que hay un enlace covalente entre
un agente terapéutico y un anticuerpo. Un agente terapéutico es un
agente con una actividad biológica concreta dirigida contra una
molécula diana particular o una célula que lleva una molécula diana.
Un experto en la técnica apreciará que los agentes terapéuticos
pueden incluir diversos fármacos tales como vinblastina,
daunomicina y similares, citotoxinas tales como exotoxina de
Pseudomonas o la toxina diftérica, nativas o modificadas,
agentes de encapsulación (por ejemplo, liposomas) que ellos mismos
contienen composiciones farmacéuticas, agentes radioactivos tales
como ^{125}I, ^{32}P, ^{14}C, ^{3}H y ^{35}S y otros
marcadores, restos diana y ligandos.
La elección de un agente terapéutico concreto
depende de la molécula o célula diana concreta y del efecto que se
desea provocar. Por tanto, por ejemplo, el agente terapéutico puede
ser una citotoxina que se usa para producir la muerte de una célula
diana concreta. Por el contrario, cuando se desea simplemente
provocar una respuesta no letal, el agente terapéutico se puede
conjugar con un agente farmacológico no letal o un liposoma que
contenga un agente farmacológico no letal.
Con los agentes terapéuticos y anticuerpos que se
proporcionan en la presente memoria descriptiva, un experto puede
construir con facilidad una variedad de clones que contengan ácidos
nucleicos funcionalmente equivalentes, tales como ácidos nucleicos
que difieren en la secuencia pero que codifican la misma molécula
efectora (ME) o secuencia de anticuerpo. Por tanto, la presente
invención proporciona ácidos nucleicos que codifican anticuerpos y
conjugados y proteínas de fusión de los mismos.
Las secuencias de ácidos nucleicos que codifican
inmunoconjugados de la presente invención se pueden preparar
mediante cualquier procedimiento adecuado, incluidos, por ejemplo,
la clonación de secuencias adecuadas o mediante síntesis química
directa a través de procedimientos tales como el procedimiento del
fosfotriéster de Narang y col., Meth. Enzymol.
68: 90-99 (1979); el procedimiento del
fosfodiéster de Borwn y col., Meth. Enzymol. 68:
109-151 (1979); el procedimiento de
dietilfosforoamidita de Beaucage y col., Tetra. Lett.
22: 1859-1862 (1981); el procedimiento de
triéster de fosforoamidita en fase sólida descrito por de Beaucage
y Caruthers., Tetra. Letts. 22(20):
1859-1862 (1981), por ejemplo, usando un
sintetizador automáticos como se describe en, por ejemplo,
Needham-VanDevanter y col., Nucl. Acids
Res. 12: 6159-6168 (1984); y el
procedimiento en soporte sólido de la patente de EE.UU. nº
4.458.066. La síntesis química produce un oligonucleótido
monocatenario. Este puede convertirse en ADN bicatenario mediante
hibridación con una secuencia complementaria o mediante
polimerización con una ADN polimerasa usando la cadena sencilla
como molde. Un experto reconocerá que aunque la síntesis química de
ADN está limitada a las secuencias de aproximadamente 100 bases, se
pueden obtener secuencias más largas mediante la unión de
secuencias más cortas.
En una forma de realización preferida, las
secuencias de ácidos nucleicos que codifican inmunoconjugados se
preparan mediante técnicas de clonación. En Sambrook y col.,
MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL (2ª ED.), volúmenes
1-3, Cold Spring Harbor Laboratory (1989), Berger y
Kimmel (eds.), GUIDE TO MOLECULAR CLONING TECHNIQUES, Academic
Press, Inc., San Diego, CA (1987)) o Ausubel, y col. (eds.),
CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, Greene Publishing y
Wiley-Interscience, NY (1987) se encuentran ejemplos
de técnicas de clonación y de secuenciación adecuadas, y bastantes
instrucciones como para dirigir a expertos a través de muchos
ejercicios de clonación. La información del producto suministrada
por los fabricantes de los reactivos biológicos y equipo
experimental también proporcionan información útil. Tales
fabricantes incluyen SIGMA Chemical Company (San Luis, MO), R&D
Systems (Mineápolis, MN), Pharmacia LKB Biotechnology (Piscataway,
NJ), CLONTECH Laboratories, Inc. (Palo Alto, CA); Chem Genes Corp.,
Aldrich Chemical Company (Milwakee, WI), Glen Research, Inc., GIBCO
BRL Life Technologies, Inc. (Gaithersberg, MD); Fluka
Chemica-Biochemika Analytika (Fluka Chemie AG,
Buchs, Suiza); Invitrogen, San Diego, CA y Applied Biosystems
(Foster City, CA), así como muchas otras fuentes comerciales
conocidas para el experto.
Los ácidos nucleicos que codifican la proteína
nativa ME, los péptidos ligadores o los anticuerpos se `pueden
modificar para formar ME, péptidos ligadores, anticuerpos o
inmunoconjugados en los que el resto dirigible está unido mediante
el ligador a la ME. La modificación mediante mutagénesis dirigida a
sitio se conoce bien en la técnica. Los ácidos nucleicos que
codifican la proteína ME o los anticuerpos se pueden amplificar
mediante procedimientos in vitro. Entre los procedimientos
de amplificación se incluyen la reacción en cadena de la polimerasa
(PCR), la reacción en cadena de la ligasa (LCR), el sistema de
amplificación según la transcripción (TAS), el sistema de
replicación de secuencia autosostenido (3SR). Los expertos
conocerán bien una amplia variedad de procedimientos de clonación,
células huésped y metodologías de amplificación in
vitro.
En una forma de realización preferida, los
inmunoconjugados se preparan mediante la inserción de ADNc que
codifica un anticuerpo anti-TacscFv en un vector que
comprende al ADNc que codifica la ME y ADNc que codifica un
ligador. La inserción se realiza de forma que el scFv, el ligador y
la SE ME lean en un marco de lectura, que estén en un polipéptido
continuo que contiene una región Fv funcional, el ligador y una
región ME funcional.
Una vez que se han aislado y clonado los ácidos
nucleicos que codifican una ME, un anticuerpo o un inmunoconjugado
de la presente invención, se puede expresar la proteína deseada en
una célula sometida a ingeniería recombinante tal como bacterias,
células vegetales, levaduras, células de insectos y células de
mamíferos. Cabe esperar que los expertos en la técnica conozcan los
numerosos sistemas de expresión disponibles para la expresión de
proteínas, incluidas E. coli, otros huéspedes bacterianos,
levaduras y varias células eucarióticas superiores tales como las
líneas celulares COS, CHO, HeLa y de mieloma. Brevemente, la
expresión de ácidos nucleicos naturales o sintéticos que codifican
proteínas de la invención aisladas se conseguirá típicamente
mediante la unión operable del ADN o ADNc con un promotor (que es
constitutivo o inducible), seguido por la incorporación en un
casete de expresión. Los casetes pueden ser adecuados para la
replicación y la integración en células eucariotas o procariotas.
Los casetes de expresión típicos contienen terminadores de la
transcripción y de la traducción, secuencias de iniciación y
promotores útiles para la regulación de la expresión de ADN
codificador de la proteína. Ara obtener un nivel elevado de
expresión de un gen clonado, es deseable construir casetes de
expresión que contengan, como mínimo, un promotor fuerte para
dirigir la transcripción, un sitio de un ión a ribosoma para la
iniciación de la traducción y un terminador de la
transcripción/traducción. Para E. coli, esto incluye un
promotor tal como los promotores T7, trp, lac o lambda, un sitio de
unión a ribosoma y preferentemente una señal de la terminación de la
transcripción. Para células eucariotas, las secuencias control
pueden incluir un promotor y preferentemente un intensificador
derivado de los genes de inmunoglobulina, SV40, citomegalovirus, y
una secuencia de poliadenilación, y puede incluir secuencias de
acepción y donación de sitios de corte y empalme. Los casetes de la
invención pueden transferirse al interior de una célula
seleccionada mediante procedimientos bien conocidos tales como
transformación con cloruro cálcico o electroporación para E.
coli y tratamiento con fosfato cálcico, electroporación o
lipofección para células de mamífero. Las células transformadas con
los casetes se pueden seleccionar con resistencias a antibióticos
conferidas por los genes contenidos en los casetes, tales como los
genes amp, gpt, neo e hyg.
Un experto reconocerá que se pueden realizar
modificaciones a un ácido nucleico que codifica un polipéptido de
la presente invención (ed decir, anticuerpo
anti-Tac, PE o un inmunoconjugado formado a partir
de su combinación) sin disminuir su actividad biológica. Se puede
realizar algunas modificaciones para facilitar la clonación, la
expresión o la incorporación de la molécula dirigible en una
proteína de fusión. Tales modificaciones son bien conocidas para los
expertos en la técnica e incluyen, por ejemplo, codones de
terminación, una metionina añadida en el extremo amino para
proporcionar un sitio de iniciación, aminoácidos adicionales
colocados en cualquiera de los extremos para crea sitios de
restricción localizados de forma conveniente, o aminoácidos
adicionales (tales como poliHis) para ayudar en las etapas de
purificación.
Además de los procedimientos recombinantes, los
inmunoconjugados, la ME y los anticuerpos u otros ligandos también
se pueden construir del todo o en parte mediante síntesis peptídica
estándar. La síntesis en fase sólida de los polipéptidos de la
presente invención de longitud menor de 50 aminoácidos puede
llevarse a cabo mediante la unión del aminoácido del extremo C de la
secuencia a un soporte insoluble, seguido por la adición secuencial
de los aminoácidos restantes en la secuencia. En Barany &
Merrifield, THE PEPTIDES ANALYSIS, SYNTHESIS, BIOLOGY. VOL. 2:
SPECIAL METHODS IN PEPTIDE SYNTHESIS, PARTE A. Páginas
3-284; Merrifield y col., J. Am. Chem.
Soc. 85: 2149-2156 (1963) y Stewart y
col., SOLID PHASE PEPTIDE SYNTHESIS, 2ª ED., Pierce Chem. Co.,
Rockford, III (1984) se describen técnicas de síntesis en fase
sólida. Las proteínas de una longitud mayor se pueden sintetizar
mediante condensación de los extremos amino y carbonilo de los
fragmentos más cortos. Los expertos conocen procedimientos para
formar enlaces peptídicos mediante activación de un extremo
carbonilo (por ejemplo, mediante el uso del reactivo de acoplamiento
N,N'-diciclohexilcarbodiimida).
Una vez que se han expresado, los
inmunoconjugados recombinantes, los anticuerpos, las moléculas
efectoras y las moléculas ligadoras de la presente invención se
pueden purificar según procedimientos estándar en la técnica,
incluidos precipitación en sulfato amónico, columnas de afinidad,
cromatografía en columna y similares (véase, en general, R. Scopes,
PROTEIN PURIFICATION, Springer-Verlag, NY (1982)).
Se prefieren las composiciones sustancialmente puras de al menos
una homogeneidad de aproximadamente 90-95% y es más
preferible una homogeneidad del 98 al 99% o más para usos
farmacéuticos. Una vez purificados, parcialmente o hasta la
homogeneidad, según se desee, si se van a usar terapéuticamente,
los polipéptidos deberán estar sustancialmente libres de
endotoxina.
Se han descrito procedimientos para la expresión
de anticuerpos monocatenarios y/o que se repliegan hasta una forma
activa adecuada, incluidos anticuerpos monocatenarios, de bacterias
tales como E. coli, y se conocen bien y son aplicables a los
anticuerpos de esta invención. Véase, Buchner y col.,
Anal. Biochem. 205: 263-270 (1992);
Pluckthun, Biotechnology 9: 545 (1991); Huse y
col., Science 246: 1275 (1989) y Ward y col.,
Nature 341: 544 (1989), todas ellas incorporadas en la
presente memoria descriptiva como referencia.
A menudos se aíslan de cuerpos de inclusión
proteínas heterólogas funcionales de E. coli o de otras
bacterias y requieren solubilización con desnaturalizantes fuertes
y el posterior replegamiento. Durante la etapa de solubilización,
como se conoce bien en la técnica, debe estar presente un agente
reductor para separar los puentes disulfuro. Un tampón de ejemplo
con un agente reductor es: Tris 0,1M pH 8, guanidina 6M, EDTA 2 mM,
DTE (ditioeritritol) 0,3M. Se puede producir reoxidación de los
puentes disulfuro en presencia de reactivos tiol de bajo peso
molecular en forma reducida y oxidada, como se describe en Saxena
y col., Biochemistry 9: 5015-5021
(1970), incorporado en la presente memoria descriptiva como
referencia, y especialmente cono se describe en Buchner y col.,
supra.
La renaturalización se lleva a cabo típicamente
mediante dilución (por ejemplo a 100) de la proteína
desnaturalizada y reducida en tampón de replegamiento. Un tampón de
ejemplo es Tris 0,1M, pH 8,0, L-arginina 0,5M,
glutation oxidado 8 mM (GSSG) y EDTA 2 mM.
Como una modificación del protocolo de
purificación de anticuerpos bicatenarios, las regiones de las
cadenas ligera y pesada se solubilizan por separado y se reducen y
después se combinan en la solución de replegamiento. Un rendimiento
preferido se obtiene cuando estas dos proteínas se mezclan en una
proporción molar tal que se produce un exceso molar no superior a
cinco veces una de las proteínas sobre la otra. Es deseable añadir
a la solución de replegamiento un exceso del glutation oxidado o de
otros compuestos oxidantes de bajo peso molecular tras completa la
reacción redox.
En un aspecto de la invención, los
inmunoconjugados son inmunotoxinas. Entre los ejemplos de toxinas
se incluyen, ricino, abrina, toxina diftérica y subunidades de la
misma, saponina, gelonina, proteína inactivadora de ribosomas, así
como las toxinas botulínica A a F. Estas toxinas están disponibles
con facilidad en fuentes comerciales (por ejemplo, Sigma Chemical
Company, San Luis, MO). La toxina diftérica se aísla de
Corynebacterium diphteriae. El ricino es la lectina RCA60 de
Ricinus communis (judía de ricino). El término también hace
referencia a variantes tóxicas del mismo, tales como las que se
describen en las patentes de EE.UU. nº 5.079.163 y 4.689.401.
Ricinus communis agglutinin (RCA) se produce en dos formas
designadas RCA_{60} y RCA_{120} según sus pesos moleculares de
aproximadamente 65 y 120 kD, respectivamente. (Nicholson &
Blaustein, J. Biochem. Biophys. Acta 266: 543 (1972)). La
cadena A es responsable de la inhibición de la síntesis de
proteínas y de la muerte celular. La cadena B une el ricino a
residuos de galactosa de la superficie celular y facilita el
transporte de la cadena A en el citosol (Olsnes y col.,
Nature 249: 627-631 (1974) y la patente de
EE.UU. nº 3.060.165).
La abrina incluye lectinas óxicas de Abrus
precatorius. Los principios tóxicos, abrina a, b, c y d tienen
un peso molecular de aproximadamente 63 y 67 kD y están compuestos
por dos cadenas polipeptídicas, A y B, unidas por puentes
disulfuro. La cadena A inhibe la síntesis de proteínas; la cadena B
(Abrina b) se une a los residuos de D.-galactosa (véase Funatsu
y col., Agr. Biol. Chem. 52: 1095 (1988) y Olsnes,
Methods Enzymol. 50: 330-335 (1978)).
En formas de realización preferidas de la
presente invención, la toxina es exotoxina (PE) de
Pseudomonas. El término "exotoxina de
Pseudomonas", como se usa en la presente memoria
descriptiva, se refiere a una PE nativa de longitud completa
(natural) o a una PE que se ha modificado. Tales modificaciones
pueden incluir, aunque no se limitan a ellas, la eliminación de un
dominio Ia, varias deleciones de aminoácidos en los dominios Ib, II
y III, sustituciones puntuales de aminoácidos y la adición de una o
más secuencias en el extremo carbonilo, tales como KDEL (ID SEC Nº
17) y REDL (ID SEC Nº 16). Véase, por ejemplo, Siegall y col.,
J. Biol. Chem. 264: 14256-14261 (1989). En una
forma de realización preferida, el fragmento citotóxico de la PE
retiene al menor un 50%, preferentemente un 75%, más
preferentemente al menos un 90% y más preferentemente un 95% de la
citotoxicidad de la PE nativa. En formas de realización
particularmente preferidas, el fragmento citotóxico es más tóxico
que la PE nativa.
La exotoxina A de Pseudomonas nativa (PE)
es una proteína monomérica extremadamente activa (peso molécula de
66 kD) secretada por Pseudomonas aeruginosa, que inhibe la
síntesis de proteínas en células eucarióticas., LA secuencia de la
PE nativa se proporciona en la patente de EE.UU. de asignación
común nº 5.602.095, que se incorpora en la presente memoria
descriptiva como referencia. El procedimiento de acción es la
inactivación de la ribosilación del ADP del factor de elongación 2
(EF-2). La exotoxina contiene tres dominios
estructurales que actúan en concierto para producir citotoxicidad.
El dominio Ia (aminoácidos 1-252) media la unión
celular. El dominio II (aminoácidos 253-364) es
responsable de la translocación en el citosol y el dominio III
(aminoácidos 400-613) media la ribosilación del ADP
del factor de elongación 2. La función del dominio Ib (aminoácidos
365-399) todavía no está definida, aunque gran parte
de él, los aminoácidos 365 a 380, se pueden delecionar sin que se
produzca ninguna pérdida de citotoxicidad. Véase Siegal y col.,
(1989), supra.
La PE empleada en la presente invención incluye
la secuencia nativa, los fragmentos citotóxicos de la secuencia
nativa y las variantes de la PE nativa modificadas de forma
conservadora y sus fragmentos citotóxicos. Los fragmentos
citotóxicos de la PE incluyen aquéllos que son citotóxicos con o sin
la posterior proteolisis u otro procesamiento en la célula diana
(por ejemplo, una proteína o preproteína). Los fragmentos
citotóxicos de la PE incluyen PE40, PE38 y PE35.
En formas de realización preferidas, la PE se ha
modificado para reducir o eliminar la unión celular inespecífica,
con frecuencia mediante la deleción del dominio Ia, como se enseña
en la patente de EE.UU. nº 4.892.827, aunque esto también se puede
conseguir, por ejemplo, mediante la mutación de ciertos residuos
del dominio Ia. Por ejemplo, la patente de EE.UU. nº 5.512.658
describe que una PE mutada en el que está presente el dominio Ia
pero en la que los residuos básicos del dominio Ia en las
posiciones 57, 246, 247 y 249 se sustituyen con residuos ácidos
(ácido glutámico o "E") exhiben una citotoxicidad inespecífica
muy disminuida. Esta forma mutante de la PE en ocasiones se
denomina PE4E.
La PE40E es un derivado truncado de la PE como se
ha descrito antes en la técnica. Véase Pai y col. Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 88: 3358-62 (1991) y Kondo y
col., J. Biol. Chem. 263: 9470-9475 (1988). La
PE 35 es un fragmentocarboxi terminal de 35 kD de la PE en el que
los residuos aminoacídicos 1-279 se han delecionado
y la molécula comienza con una metionina en la posición 280 seguida
por los aminoácidos 281-364 y
381-613 de la PE nativa. La PE35 y la PE40 se
describen, por ejemplo, en las patentes de EE.UU. nº 5.602.095 y
4.892.827.
En las formas de realización más preferidas, el
fragmento citotóxico es PE38. La PE38 es una proproteína PE
truncada compuesta por los aminoácidos 253-364 y
381-613 que se activa a su forma citotóxica tras el
procesamiento en una célula (véase, por ejemplo, la patente de
EE.UU. nº 5.608.039 y Pastan y col., Biochim. Biophys. Acta
1333: C1-C6 (1997)).
Como se ha indicado anteriormente, parte o todo
el dominio Ib puede delecionarse y las posiciones restantes se
pueden unir con un ligador o directamente mediante un enlace
peptídico. Parte de la porción amino del dominio II puede
delecionarse. El extremo C puede contener la secuencia nativa de los
residuos 609-613 (REDLK) (ID SEC Nº 15) o puede
contener una variación de la que se ha descubierto que mantiene la
capacidad del constructo para su translocación en el citosol, tal
como REDL (ID SEC Nº 16) o KDEL (ID SEC Nº 17) y repeticiones de
estas secuencias. Véase, por ejemplo, las patentes de EE.UU.
5.854.044; 5.821.238 y 5.602.095 y WO 99/51643. Aunque en formas de
realización preferidas, la PE es PE4E, PE40 o PE38, en las
inmunotoxinas de la presente invención se puede usar cualquier
forma de PE en la que la citotoxicidad inespecífica se haya
eliminado o reducido hasta niveles en los que no se produce
toxicidad significativa contra células que no son diana, siempre
que permanezca capaz de translocar y ribosilar el
EF-2 en una célula diana.
Las variantes de PE modificadas de modo
conservador o fragmentos citotóxicos de las mismas tienen una
similitud de secuencia de al menos un 80%, preferentemente una
similitud de secuencia de al menos un 85%, más preferentemente una
similitud de secuencia de al menos un 90% y más preferentemente una
similitud de secuencia de al menos un 95% a nivel de los
aminoácidos, con la PE de interés, tal como PE38.
El término "variantes modificadas de modo
conservador" se aplica a secuencias de aminoácidos y de ácidos
nucleicos. Con relación a secuencias de ácidos nucleicos concretas,
las variantes modificadas de modo conservador se refieren a las
secuencias de ácidos nucleicos que codifican secuencias
aminoacídicas idénticas o esencialmente idénticas, o, si el ácido
nucleico no codifica una secuencia de aminoácidos, a secuencias de
ácidos nucleicos esencialmente idénticas. A causa de la
degeneración del código genético, un gran número de ácidos nucleicos
funcionalmente idénticos codifican cualquier polipéptido dado. Por
ejemplo, los codones GCA, GCC, GCG y GCU codifican el aminoácido
alanina. Por tanto, en cada posición en la un codón especifique
alanina, el codón se puede alterar a cualquiera de los codones
correspondientes descritos si que se altere el polipéptido
codificado. Tales variaciones de ácidos nucleicos son "variaciones
silentes", que son una especie e variaciones modificadas de modo
conservador. Cada secuencia de ácido nucleico en la presente
memoria descriptiva que codifica un polipéptido también describe
cada posible variación silente del ácido nucleico. Un experto
reconocerá que cada codón en un ácido nucleico (a excepción de AUG,
que por lo general es el único codón para metionina) se puede
modificar para dar una molécula funcionalmente idéntica. En
consecuencia, cada variación silente de un ácido nucleico que
codifica un polipéptido está implícita en cada secuencia
descrita.
Con relación a las secuencias de aminoácidos, un
experto reconocerá que sustituciones, deleciones o adiciones
individuales en una secuencia de ácido nucleico, peptídica,
polipeptídica o proteica que altera, añade o deleciona un único
aminoácido o un pequeño porcentaje de aminoácidos en la secuencia
codificada en una "variante modificada de modo conservador", en
la que la alteración tiene como resultado la sustitución de un
aminoácido con un aminoácido químicamente similar.
Las exotoxinas de Pseudomonas que se
emplean en la invención se pueden analizar para determinar el nivel
deseado de citotoxicidad mediante ensayos bien conocidos para los
expertos en la técnica. En la técnica se conocen bien los ejemplos
de ensayos de toxicidad. Por tanto, los fragmentos citotóxicos de la
PE y las variantes modificadas de modo conservador de tales
fragmentos se pueden analizar con facilidad para determinar la
citotoxicidad. Un gran número de moléculas de PE candidatas se
pueden analizar de forma simultánea para determinar la
citotoxicidad mediante procedimientos conocidos en la técnica. Por
ejemplo, subgrupos de las moléculas candidatas se pueden analizar
para determinar la citotoxicidad. Los subgrupos con reacciones
positivas de las moléculas candidatas se pueden subdividir de forma
continua y volver a analizar hasta que se identifiquen el o los
fragmentos citotóxicos deseados. Tales procedimientos permiten una
rápida selección de muchos fragmentos citotóxicos o variantes
conservadoras de PE.
El resto tóxico y el anticuerpo se pueden
conjugar por medios químicos o recombinantes (véase, Rybak y col.,
(1995) Tumor Targeting 1:141). En las inmunotoxinas de la
invención, los restos dirigibles y de toxina se conectan a través
de una molécula ligadora, que por lo general es un péptido corto.
Entre las modificaciones químicas se incluyen, por ejemplo,
derivatización con el propósito de unir los restos al ligador,
mediante procedimientos bien conocidos en la técnica de la química
proteica. Los medios adecuados para unir el resto tóxico y el resto
de reconocimiento al ligador comprende un reactivo de acoplamiento
heterobifuncional que en último término contribuye a la formación
de un puente disulfuro intermolecular entre los restos y el ligador.
Otros tipos de reactivos de acoplamiento que son útiles en esta
capacidad apara la presente invención se describen, por ejemplo, en
la patente de EE.UU. nº 4.545.985. Como alternativa, un puente
disulfuro intermolecular puede formarse de forma conveniente entre
las cisteínas de cada resto que se producen de forma natural o que
se insertan mediante ingeniería genética. Los medios para unir los
restos pueden también usar enlaces tioéter entre reactivos de
sobrecruzamiento heterobifuncionales o ligadores específicos
escindibles a pH bajo o ligadores escindibles por proteasas
específicas u otros enlaces químicos escindibles o no escindibles.
Los medios para unir restos de unión de las inmunotoxinas también
pueden comprender un enlace peptidilo formado entre restos que se
sintetizan por separado mediante procedimientos químicos de
síntesis peptídica estándar o medios recombinantes.
Posibles modificaciones mediante ingeniería
genética de las diferentes proteínas o porciones de las
inmunotoxinas incluyen la combinación de los dominios funcionales
relevantes de cada uno en una proteína sintética multifuncional de
cadena sencilla que se expresa de un único gen derivado de técnicas
de ADN recombinante (véase, por ejemplo, la solicitud de PCT
publicada WO/88/09344). Además, las técnicas de ADN recombinante se
pueden usar para unir la toxina recombinante y el anticuerpo al
ligador. En consecuencia, la inmunotoxina puede comprender una
proteína condensada que comienza en un extremo con la toxina y
termina en el otro extremo con el anticuerpo.
Los procedimientos para producir proteínas de
fusión recombinantes son bien conocidos para el experto en la
técnica. Por tanto, por ejemplo, en Chaudhary y col., (1989)
Nature 339:394; Batra y col., (1990) J. Biol.
Chem. 265: 15198; Batra y col., (1989) Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 87: 1066 se describe la preparación de varias
proteínas de fusión anticuerpo-toxina de cadena
sencilla.
En general, la producción de proteínas de fusión
de inmunotoxinas implica la preparación por separado a ADN que
codifica el anticuerpo, el fragmento de anticuerpo (por ejemplo, la
Fv de las cadenas pesada y ligera) o el ligando, el ADN que
codifica el ligador y el ADN que codifica la toxina que se va a
usar. A continuación, las secuencias se combinan en un plásmido u
otro vector para formar un constructo que codifica la proteína
quimérica concreta deseada. Un enfoque más simple implica la
inserción del ADN que codifica el fragmento de anticuerpo concreto
(por ejemplo, la región Fv) o el ligando en un constructo que ya
codifica la toxina deseada y el ligador.
Por tanto, por ejemplo, el ADN que codifica
inmunotoxinas anticuerpo anti-Tac/toxina se prepara
con más facilidad mediante la inserción del ADN que codifica las
cadenas V_{H} y V_{L} del anticuerpo (región Fv) en constructos
que ya contienen ADN que codifica la toxina y el ligador deseados, o
al contrario. La secuencia de ADN que codifica la región Fv se
inserta en el constructo usando técnicas bien conocidas para el
experto en la técnica.
Se han usado células de mamífero para expresar y
secretar moléculas híbridas tales como
anticuerpo-citoquinas (Hoogenboom y col.,
(1991) Biochem. Biophys. Acta 1096: 345; Hoogenboom y
col., (1991) Mol. Immunol. 28:1027) y
anticuerpo-enzima (Casadei y col., (1990)
Proc. Natl. Acd. Sci. USA. 87: 2047; Williams y col.,
(1986) Gene 43: 319). En parte, la inmunogenicidad de las
proteínas extrañas se debe a patrones de glucosilación incorrecta
presentes en las proteínas recombinantes. Por tanto, se prefieren
líneas de células eucarióticas en lugar de procarióticas, ya que las
proteínas expresadas están glicosiladas. Particularmente preferidas
son las líneas celulares derivadas de seres humanos ya que estas
células incorporan un ácido siálico como glucósido terminal. Se han
usado líneas celulares tales cono las de hámster CHO y BHK, así
como la línea de fibroblastos humanos HEK-293 para
expresar proteínas humanas recombinantes.
Otras modificaciones realizadas por ingeniería
genética de los restos proteicos de las inmunotoxinas de esta
invención incluyen deleciones de dominios funcionalmente
innecesarios para reducir el tamaño de la proteína o para modificar
otros parámetros que facilitan la producción o la utilidad, tales
como cambios de secuencia que afecten a la solubilidad (por ejemplo
cisteína por serina) o a los sitios de glicosilación. Un experto en
la técnica apreciará que muchas modificaciones genéticas y químicas
adicionales bien conocidas de las proteínas pueden aplicarse de
forma ventajosa a cualquier proteína.
Inmunotoxinas preferidas de la presente invención
son proteínas quiméricas que contienen como resto tóxico una
exotoxina de Pseudomonas (PE) modificada para reducir o
eliminar la unión celular inespecífica. En una forma de realización
particularmente preferida, el resto tóxico es una forma truncada de
la PE con un Pm de 38 Kd (PE38) que tiene una deleción en su dominio
de unión a la célula unido a través de un péptido corto a un
fragmento Fv del anticuerpo monoclonal Tac antihumano que se une a
la subunidad \alpha del receptor de IL-2. La
construcción de este enlace único de la proteína de fusión entre la
toxina y el anticuerpo elimina la heterogeneidad de los conjugados
proteico anticuerpo/toxina químicamente unidos. Se cree que esto
puede contribuir al aumento de la potencia y la disminución de la
inmunogenicidad de la inmunotoxina. En formas de realización
especialmente preferidas, la porción Fv del anticuerpo antiTac está
unida a la PE38 a través de un péptido conector que tiene la
secuencia ASGGPE.
La invención incluye constructos de ácido
nucleico que codifican las nuevas proteínas descritas en la
presente. Un constructo de ácido nucleico es uno que, cuando se
incorpora en un vector adecuado, es capaz de replicarse en un
huésped. Los constructos pueden unirse a otras secuencias capaces de
afectar a la expresión del constructo, tales como promotores e
intensificadores.
Las inmunotoxinas de la presente invención se
pueden usar para la inhibición selectiva o la muerte de células
hacia las que las inmunotoxinas están dirigidas por la molécula
dirigible mediante el contacto de las células con la inmunotoxina.
Este procedimiento se basa de la selección adecuada de un
anticuerpo o un ligando que se une a marcadores en la superficie de
la célula que se encuentran específica o predominantemente en el
tipo de células que se va a matar de forma selectiva. Por ejemplo,
las inmunotoxinas de esta invención incluyen aquéllas que
comprenden un anticuerpo que se une a la subunidad \alpha del
receptor de IL-2 (CD25). En una forma de realización
preferida, las inmunotoxinas de la invención se usan para matar o
inhibir el crecimiento de células CD25+ de neoplasias malignas
hematológicas, incluidas, por ejemplo, la leucemia de células
pilosas (HCL), el linfoma cutáneo de células T, la leucemia
linfocítica crónica, la enfermedad de Hodgkin y la leucemia de
células T de adultos. Las inmunotoxinas se pueden añadir, por
ejemplo, a cultivos celulares para purgar el cultivo de células de
neoplasias malignas CD25+ o para inhibir el crecimiento de tales
células en el cultivo. Las inmunotoxinas también se pueden usar
in vivo para inhibir el crecimiento de células malignas en un
organismo.
Además de las inmunotoxinas, la presente
invención proporciona otros inmunoconjugados con una estabilidad
mayor y una inmunogenicidad menor que las disponibles
anteriormente. Por tanto, un anticuerpo puede unirse a través de un
ligador a un agente terapéutico o a un marcador que se va a liberar
directamente en las células que llevan el antígeno reconocido
específicamente por el anticuerpo. Entre los agentes terapéuticos
se incluyen compuestos tales como ácidos nucleicos, proteínas,
péptidos, aminoácidos o derivados, glicoproteínas, radioisótopos,
lípidos, hidratos de carbono o virus recombinantes. Restos
diagnósticos y terapéuticos de ácido nucleico incluyen ácidos
nucleicos antisentido, oligonucleótidos derivatizados para
sobrecruzamiento covalente con ADN mono o bicatenario y
oligonucleótidos formadores de triplex.
Como alternativa, la molécula unida a un
anticuerpo u otro resto dirigible puede estar en un sistema de
encapsulación como un liposoma o una micela que contenga una
composición terapéutica tal como un fármaco, un ácido nucleico (por
ejemplo, un ácido nucleico antisentido) u otro resto terapéutico
que preferentemente se protege de la exposición directa al sistema
circulatorio. Los expertos en la técnica conocen bien los medios
para preparar liposomas unidos a anticuerpos. Véase, por ejemplo,
la patente de EE.UU. n1 4.957.735 y Connor y col., Pharm.
Ther. 28: 341-365 (1985).
Los anticuerpos u otros ligandos opcionalmente
pueden unirse de forma covalente o no covalente a un marcador
detectable. Los marcadores detectables adecuados para tal uso
incluyen cualquier composición detectable por medios
espectroscópicos, fotoquímicos, bioquímicos, inmunoquímicos,
eléctricos, ópticos o químicos. Entre los marcadores útiles en la
presente invención se incluyen perlas magnéticas (por ejemplo,
DYNABEADS), pigmentos fluorescentes (por ejemplo, isotiocianato de
fluoresceína, rojo Texas, rodamina, proteína verde fluorescente y
similares), marcadores radiactivos (por ejemplo, ^{3}H,
^{125}I, ^{35}S, ^{14}C o ^{32}P), enzimas (por ejemplo,
peroxidasa de rábano, fosfatasa alcalina y otras de uso habitual en
un ELISA) y marcadores colorimétricos tales como oro coloidal o
cristal coloreado o perlas plásticas (por ejemplo, poliestireno,
polipropileno, látex, etc.). los quelatos metálicos se pueden unir
a los anticuerpos o a otros restos dirigibles mediante
procedimientos bien conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo,
Robert B. y col., Cancer Res., 56: 47584765 (1996). Por
ejemplo, se han desarrollado anticuerpos biespecíficos que se
pueden unir a tumores y a quelatos metálicos (Stickney D., y
col., Cancer. Res. 51 (24): 6650-5 (1991);
Rouvier, R. y col., Horm. Res. 47 (4-6):
163-167 (1997). Estos quelatos pueden contener
isótopos radiactivos tales como 111Indio, para visualizar o matar
las células. Las técnicas conocidas en la técnica se pueden aplicar
a la presente invención mediante, por ejemplo, el uso como molécula
ligadora de un anticuerpo biespecífico para el quelato y para el
resto dirigible del inmunoconjugado. En este caso, el anticuerpo
biespecífico se puede someter a ingeniería genética para
Pegilación, por ejemplo mediante la introducción por ingeniería
genética de una cisteína expuesta en la superficie de la región
estructural del anticuerpo.
Los expertos en la técnica conocen bien los
medios para detectar tales marcadores. Por tanto, por ejemplo, se
pueden detectar marcadores radiactivos usando películas
fotográficas o contadores de centelleo, los marcadores
fluorescentes pueden detectarse con un fotodetector que detecte la
iluminación emitida. Los marcadores enzimáticos típicamente se
detectan proporcionando a la enzima el sustrato y mediante la
detección del producto de reacción producido por la acción de la
enzima sobre el sustrato, y los marcadores colorimétricos se
detentan simplemente visualizando el marcador coloreado.
En una forma de realización no recombinante de la
invención, las moléculas efectoras, por ejemplo restos
terapéuticos, diagnósticos o de detección, se unen a la molécula
dirigible a través de una molécula ligadora usando cualquier número
de medios conocidos para los expertos en la técnica. Se pueden usar
medios de unión covalente o no covalente.
El procedimiento para la unión de una molécula
efectora a un ligador variará según la estructura química de la ME.
Los polipéptidos típicamente contienen una variedad de grupos
funcionales, por ejemplo grupos de ácido carboxílico (COOH), amina
libre (-NH2) o sulfhidrilo (-SH), que están disponibles para la
reacción con un grupo funcional adecuado en un péptido.
Como alternativa, el anticuerpo se derivatiza
para exponer o unir grupos funcionales reactivos adicionales. La
derivatización puede implicar la unión de cualquier número de
moléculas tales como las disponibles en Pierce Chemical Company,
Rockford, Illinois, para permitir que se produzcan tales
conjugaciones.
En algunas circunstancias es deseable liberar la
molécula efectora de la molécula dirigible cuando el
inmunoconjugado ha alcanzado su sitio diana. Por tanto, en estas
circunstancias, los inmunoconjugados comprenderán enlaces
escindibles en las proximidades del sitio diana. La escisión del
ligador para liberar la molécula efectora de la molécula ligadora
puede estimularse mediante actividad enzimática o condiciones a las
que el inmunoconjugado está sujeto dentro de la célula diana o en
la proximidad del sitio diana. Cuando el sitio diana es un tumor se
puede usar un ligador que sea escindible en las condiciones
existentes en el sitio del tumor (por ejemplo, cuando está expuesto
a enzimas asociadas a un tumor o un pH ácido).
En vista del gran número de procedimientos que se
han publicado para unir una variedad de compuestos de
radiodiagnóstico, compuestos radioterapéuticos, fármacos, toxinas y
otros agentes a anticuerpos, un experto en la técnica será capaz de
determinar un procedimiento adecuado para unir un agente dado a un
anticuerpo u otro polipéptido.
La presente invención también se refiere a
composiciones que comprenden los inmunoconjugados de la presente
invención en un vehículo farmacéuticamente aceptable. En
aplicaciones terapéuticas, las composiciones se administran a un
paciente que padece una enfermedad en una cantidad suficiente como
para retrasar el progreso de la enfermedad y sus complicaciones o
para detener parcial o completamente la enfermedad o sus
complicaciones. Una cantidad adecuada para alcanzar uno o más de
estos objetivos se define como una dosis terapéuticamente eficaz.
Las cantidades eficaces para tales usos dependerán de la gravedad de
la enfermedad y del estado general de la salud del paciente.
Los inmunoconjugados de la presente invención
pueden administrarse por varios medios adecuados para propósitos
diferentes. Por ejemplo, se pueden usar inmunotoxinas de la
invención para contactar con tumores en varias partes del cuerpo,
según procedimientos conocidos en la técnica para otras
inmunotoxinas (véase, por ejemplo, Rybak y col., (1990) Human
Cancer Immunology, en "Immunology and Allergy Clinics of
America", W. B. Saunders y las referencias citadas en la misma).
Las inmunotoxinas pueden administrase por vía sistémica mediante
inyección, preferentemente intravenosa, aunque también
intramuscular, subcutánea, intratecal, intraperitoneal, en los
espacios vasculares o en las articulaciones, por ejemplo inyección
intraarticular.
De acuerdo con esto, la presente invención
también se refiere a composiciones farmacéuticas que comprenden un
inmunoconjugado de la presente invención y un vehículo
farmacéuticamente aceptable, particularmente las composiciones que
son adecuadas para las vías de administración mencionadas
anteriormente. La dosis dependerá de las propiedades del
inmunoconjugado empleado, por ejemplo su actividad y su semivida
biológica, la concentración del inmunoconjugado en la formulación,
el sitio y velocidad de dosificación, la tolerancia clínica del
paciente implicado y similares, así como de la pericia del
médico.
Pueden administrarse dosis únicas o múltiples de
las composiciones dependiendo de la dosificación y frecuencia
requeridas y toleradas por el paciente. Por ejemplo, con relación a
la administración de inmunotoxinas, la composición debería
proporcionar una cantidad suficiente de las inmunotoxinas de la
invención para producir el retraso o la detención del progreso de la
enfermedad o de sus complicaciones.
Las composiciones para administración pueden
comprender una solución del inmunoconjugado, tal como una
inmunotoxina, en un vehículo farmacéuticamente aceptable,
preferentemente un vehículo acuoso. Se puede usar una variedad de
vehículos acuosos, por ejemplo suero salino tamponado y similares.
Estas soluciones son estériles y generalmente están libres de
materia no deseada. Estas composiciones pueden esterilizarse
mediante técnicas de esterilización convencionales bien conocidas
en la técnica. Las composiciones pueden contener sustancias
auxiliares farmacéutica mente aceptables como se requiera para
aproximarse a las condiciones fisiológicas tales como agentes de
ajuste de pH y de tamponamiento, agentes para ajustar la toxicidad
y similares, tales como acetato sódico, cloruro sódico, cloruro
potásico, cloruro cálcico, lactato sódico y similares. El pH de la
solución está, preferentemente, en el intervalo de pH 5 a 9,5, y
preferentemente es de 6,5 a 7,5. Típicamente, los inmunoconjugados
o derivados de los mismos están en una solución con un tampón
adecuado farmacéuticamente aceptable tale como fosfato,
tris(hidroximetil)aminometano-HCl o
citrato y similares. Las concentraciones del tampón deberían estar
en el intervalo de 1 a 100 mM. La solución del inmunoconjugado
también puede contener una sal, tal como cloruro sódico o cloruro
potásico en una concentración de 50 a 150 mM. También se puede
incluir una cantidad eficaz de un agente estabilizante tal como
albúmina, una globulina, un detergente, una gelatina, una protamina
o una sal de protamina y puede añadirse a una solución que contenga
el inmunoconjugado o a la composición a partir de la cual se
prepara la solución. Típicamente, la administración sistémica del
inmunoconjugado se realiza dos o tres días o una vez a la semana.
Como alternativa, la administración diaria es útil. Normalmente, la
administración se realiza mediante inyección intramuscular o
infusión intravascular.
Para la administración intavenosa, las
composiciones farmacéuticas típicas son de aproximadamente 0,01 a
100 mg por día por paciente. Se pueden usar dosis de 0,1 hasta de
aproximadamente 1000 mg por paciente al día, en particular cuando
el fármaco se administra en un sitio apartado y no en la circulación
sanguínea, como dentro de un tumor o de un órgano en el que el
tumor reside. Los procedimientos reales para preparar composiciones
administrables por vía parenteral serán conocidos o evidentes para
los expertos en la técnica y se describen con más detalle e
publicaciones tales como Remingtons Pharmaceutical Science, 15 ed.,
Mack Publishing Co., Easton, Pa, (1980).
La administración también puede ser intranasal o
por otras vías no parenterales. Asimismo, el inmunoconjugado se
puede administra mediante microesferas, liposomas u otros sistemas
de liberación microparticulados colocados en ciertos tejidos,
incluida la sangre.
El inmunoconjugado también se puede administra
mediante aerosol para conseguir una liberación localizada a los
pulmones. Estos se consigue mediante la preparación de un aerosol
acuoso que contenga una preparación liposómica o partículas sólidas
o derivados de los mismos. Se podría usar una suspensión no acuosa
(por ejemplo un propelente fluorocarbonado). Preferentemente, en la
preparación de los aerosoles se usan nebulizadores sónicos. Los
nebulizadores sónicos minimizan la exposición del anticuerpo o sus
derivados a fuerzas de cizalladura, lo que puede tener como
resultado la degradación del inmunoconjugado.
Por lo general, un aerosol acuoso se prepara
mediante la formulación de una solución o una suspensión acuosa del
inmunoconjugado junto con vehículos y estabilizantes convencionales
farmacéuticamente aceptables. Los vehículos y estabilizantes
variarán en función de los requerimientos del inmunoconjugado
concreto, aunque típicamente incluyen tensioactivos no iónicos
(TWEEN-20 ó 80®, PLURONIC-F128 ó
67® o polietilenglicol), proteínas inocuas como seroalbúmina, o
ésteres de sorbitano, ácido oleico, lecitina, aminoácidos tales como
glicina, tampones, sales, azúcares o alcoholes dulces. Las
formulaciones serán estériles. Los aerosoles se prepararán,
generalmente, a partir de soluciones isotónicas.
Además, la presente invención se refiere a un
procedimiento para matar células de forma selectiva usando una
inmunotoxina selectiva de la presente invención que tenga ligando o
un anticuerpo específico de una diana en la superficie de las
células que se van a matar en condiciones que permitan la unión del
ligando o el anticuerpo. La unión del ligando o el anticuerpo al
marcador de la superficie de una célula causa que la toxina (por
ejemplo, PE o PE38) mate de forma selectiva a la célula. Este
procedimiento de la presente invención puede usarse para la
separación celular in vitro al matar de forma selectiva tipos
de células no deseados, por ejemplo, en la médula ósea antes del
transplante a un paciente que se va a someter a ablación medular
por radiación.
El compuesto
metoxi-polietilenglicol-maleimida
(PEG-maleimida, Pm: 5.000 ó 20.000) se obtuvo de
Fluka o Shearwater Polymer. Otros reactivos y disolventes se
obtuvieron de fuentes estándar.
Para la propagación de los plásmidos se usó E.
coli DH5\alpha (eficiencia MAX) de Bethesda Research
Laboratories (Gaithesburg, MD). Se usó E. coli CJ236
(Bio-Rad) para la preparación de ADN de fagemido de
cadena sencilla que contiene uracilo, para su uso como molde para
la mutagénesis dirigida a oligodesoxinucleótidos. E. coli
BL21 (\lambdaDE3), que lleva el gen de la ARN polimerasa T7 bajo
el control de un promotor inducible en un profago \lambda, se usó
como huésped para la expresión de inmunotoxinas recombinantes. El
plásmido pRK79 codifica
anti-Tac(Fv)-PE38 (Kreitmanm
y col., (1994), supra).
La mutagénesis de LMB-2 se
realizó mediante el procedimiento de Kunkel (Kunkel y col.,
(1991) Methods Enzymol. 204: 125-139) con
algunas modificaciones como se ha descrito previamente (Onda y
col., (1999), supra). Las mutaciones en el plásmido se
confirmaron mediante secuenciación del ADN.
Los componentes de LMB-2
(LMB-2 nativa) y
cyst1-LMB-2 se produjeron en E.
coli BL21 (\lambdaDE3), que contienen los correspondientes
plásmidos de expresión (pRK79 o pRK79 mutante) como ya se ha
descrito (Onda y col., (1999), supra).
Un procedimiento típico para la preparación de
LMB-2 PEGilada es el siguiente:
LMB-2 con un grupo tiol libre en suero salino
tamponado con fosfato se dejó reaccionar con un exceso molar de 30
veces PEG-maleimida 5 kDa o 20 kDa (PEG5K o PEG20K)
a 25ºC durante 12 horas. La mezcla de reacción se diluyó con 20
volúmenes de Tampón A (Tris-HCl 20 mM, EDTA 1 mM, pH
7,5) y después se cargó directamente en una columna de
Q-sefarosa que previamente se había equilibrado con
tampón A. La columna se lavó con Tampón B (NaCl 1M en Tampón A). Las
fracciones adecuadas de la columna de Q-sefarosa
(Amersham Pharmacia Biotech. Piscataway, NJ) con las
LMB-2 PEGiladas se recogieron y se diluyeron con 5
volúmenes de Tampón A, para separar de forma aproximada la
LMB-2 PEGilada del compuestos cys-1
LMB-2 sin modificar. La columna se lavó con 10
volúmenes de Tampón A, después se eluyó con un gradiente de NaCl
(0-1 M) en tampón A. Después de concentrar las
fracciones mono-Q adecuadas con Centricon
YM-10 (AMCON, Beverly, MA). Las
LAMB-2 PEGiladas se separaron en TRSK G3000SW, que
se equilibró y se eluyó con suero salino tamponado con fosfato. Las
LAMB-2 PEGiladas obtenidas de sometieron a
SDS-PLATE y se observó que eran extremadamente
puras.
El contenido en grupos sulfhidrilos libres se
determinó mediante el procedimiento DTNB (Riddles y col., (1979)
Anal. Biocem. J. 94: 75-81.
El contenido en PEG se analizó mediante una
modificación del procedimiento de Childs (Childs (1975) Microchem
J. 29 (190-192). Como estándar se usó PEG5K o PEG20
K.
La citotoxicidad específica de las
cys-1-LMB, el LMB-2
PEGilada nativos se midió mediante la inhibición en el ensayo de
células ATac-4 (Kreitman y col., (1994),
supra.
La estabilidad de LMB-2,
cys-1-LMB-2 y
LMB-2 PEGilada se determinó mediante su incubación
a una concentración final de 10 \mug/ml a 37ºC en suero de ratón.
La cantidad de inmunotoxina activa restante después de los
diferentes tiempos de incubación se determinó mediante un ensayo de
citotoxicidad con ATac4.
A grupos de cuatro, cinco o siete ratones BALB/c
hembra (de 6-7 semanas de edad; aproximadamente 20
g de peso) se les inyectó por vía intavenosa 200 \mul de dosis
crecientes de LMB-2,
cys-1-LMB-2 y
LMB-2 PEGilada. Como diluyente se usó PBS con BSA
al 0,2%. La DL50 es la dosis calculada de inmunotoxina recombinante
que mata al 50% de los animales.
Las actividades antitumorales de las
inmunotoxinas se determinaron en ratones con tumores Atac4. Se
inocularon células ATac-4 (2 x 10^{6}) por vía
subcutánea el día 0 en ratones desnudos (Ncr un/un atímicos; 7
semanas de edad; aproximadamente 20 g de peso). Comenzando el día
4, los ratones se trataron con inyecciones intravenosas de
inmunotoxinas. Como diluyente se usó PBS con BSA al 0,2% y como
controles se usaron 10 \mug/ratón de PEG5K o PEG20K. EL
tratamiento se administró los días 4, 6, 8. Cada grupo de
tratamiento estaba compuesto por cinco ratones. Los tumores se
midieron con un compás cada 2 días y el volumen del tumor se
calculó usando la fórmula: volumen del tumor (en mm^{3})=
longitud x (anchura)2 x 0,4.
Ratones BALB/c hembra normales (de
6-7 semanas de edad; aproximadamente 20 g de peso)
se les inyectó por vía intavenosa 2 \mug de varias inmunotoxinas.
Se extrajeron muestras de sangre a diferentes tiempos. El nivel de
inmunotoxina recombinante se midió en un bioensayo en el muestras
de suero diluidas se incubaron con células ATac-4 y
se midió la capacidad de las muestras de suero para inhibir la
síntesis de proteínas. Los datos se analizaron mediante un programa
de ajuste de curva exponencial RSTRIP (versión 5, Software MicroMath
Scientific).
Ratones BALB/c hembra (de 6-7
semanas de edad; aproximadamente 20 g de peso) en grupos de cinco
se inmunizaron i.p. con LMB-2,
cys-1-LMB-2 y
LMB-2 PEGilada a dosis de 4 \mug/ratón o 40
\mug/ratón en PBS con seroalbúmina de ratón al 0,2% (MSA). Dos
semanas después de la primera inmunización, se inmunizó a los
ratones de nuevo con el antígeno adecuado. Se recogieron muestras de
sangre cada 7 días tras la primera inmunización. Los niveles de IgG
específica en suero se determinaron mediante ensayo de
inmunoabsorción ligada a enzimas (ELISA) con un anticuerpo IGG
antiratón de cabra conjugado con fosfatasa alcalina (ALP) y fosfato
de p-nitrofenilo como sustrato. Las placas se
revistieron con LMB-2.
En LMB-2, la porción Fv del
anticuerpo anti-Tac está unida a PE38 mediante un
conector peptídico (ASGGPE (ID SEC Nº 1)). Para prevenir la pérdida
de las funciones de unión al antígeno, translocación y ribosilación
de ADP de las LMB-2 que son necesarias para su
actividad citotóxica específica contra las células tumorales CD25+,
se preparó una forma mutante de LMB-2 con una
cisteína en el péptido (ASGCGPE (ID SEC Nº 2)) que conecta la
porción Fv con PE38 (Figura 1A). La cisteína se usó para la
Pegilación específica de sitio usando técnicas químicas de tiol
libre. Como se muestra en la figura 2, las moléculas de
LMB-2 PEGiladas se observaron en una única banda en
el SDS-PAGE cuando eluyeron de la columna TSK de
exclusión por tamaño como un único pico. La figura 2 y la tabla 1
muestran que la citotoxicidad específica in vitro de la
cys-1-LMB-2 contra
las células Atac-4 (línea celular CD25+) fue similar
a la de la LMB-2 nativa. Como se esperaba, cada
molécula de
cys-1-LMB-2 contenía
un grupo tiol libre, mientras que la LMB-2 nativa
no. El rendimiento de
cys-1-LMB-2
altamente purificada preparada a partir de cuerpos de inclusión fue
\sim7,0%, que es el mismo que el de la LMB-2
nativa (7,3%).
La
cys-1-LMB-2
purificada con un grupo tiol libre en el conector se modificó de
forma específica de sitio con PEG5K o
PEG20K-maleimida mediante la formación de un enlace
tioéter (figura 1B). Tras la purificación, ambos tipos de
LMB-2 PEGilada tenían actividades citotóxicas
similares y estas eran las mimas que la de la LMB-2
nativa sin modificar y mutante (figura 2 y tabla 1). Tras la
PEGilación específica de sitio de la
cys-1-LMB-2, la
LMB-2 PEGilada no tenía un grupo tiol libre y en su
lugar contenía aproximadamente 1 mol de PEG/mol de proteína.
Las estabilidades de varias moléculas de
LMB-2 se valoraron mediante su incubación en suero
de ratón a 37ºC durante varios periodos de tiempo (figura 3). Tanto
la LMB-2 nativa como la mutante fueron relativamente
estables durante 1 hora y después sus actividades citotóxicas
disminuyeron de forma dependiente del tiempo. En contraste con
esto, las LMB-2 PEGiladas fueron estables. Después
de 24 horas, las LMB-2 PEG5K y PEG20K retuvieron
aproximadamente el 40% y el 50% de sus actividades iniciales.
Para los estudios de toxicidad se inyectaron
varias dosis diferentes de cada tipo de inmunotoxina por vía
intravenosa en ratones BLAB/c. Casi todas las muertes se produjeron
durante los 4 días posteriores al tratamiento. La tabla 2 indica el
número de ratones muertos y el número total de ratones inyectados
registrados 14 días después del tratamiento. Se encontró que la DL50
de LMB-2 nativa y mutante era de aproximadamente
0,5 mg/kg, como se muestra en la tabla 1. Por el contrario, las
LMB-2 PEGiladas eran bien tolerada; las DL50 de las
LMB-2 PEG5K y PEG20K fueron de aproximadamente 3,0
mg/kg.
Para valorar las actividades antitumorales, se
inocularon células ATac-4 por vía subcutánea el
día 0 en ratones desnudos. El tratamiento se comenzó el día 4,
cuando los tumores medían aproximadamente 100 mm3. Los animales se
trataron por vía intravenosa con tres dosis administradas los días
4, 6 y 8. Los grupos control recibieron vehículo (PBS con BSA al
0,2%) o 10 \mug de PEG5K o de PEG20K. Las LMB-2
nativa y mutante inhibieron el crecimiento tumoral de un modo
dependiente de la dosis (Figura 4). Las actividades antitumorales de
ambas LMB-2 sin PEGilar fueron similares. La dosis
requerida para mantener el volumen tumoral medio durante 6 días al
nivel de la 1ª inyección fue 0,025 mg/kg x 3 para
LMB-2 y
cys-1-LMB-2 y de
0,006 mg/kg x 3 para las LMB-2 PEG5K y PEG20K. Las
regresiones completas, que se definieron como la desaparición del
tumor sin que se produzca un nuevo crecimiento después de 50 días o
más, se observaron en 2 de 5 ratones o de 1 de 5 ratones a la dosis
de 0,1 mg/kg x 3 de LMB-2nativa o de
LMB-2 mutante respectivamente. A la dosis de 0,2
mg/kg x 3, uno de cada cinco ratones que habían recibido
LMB-2 nativa mutante murió a causa de toxicidad
durante el periodo de tratamiento, pero en los restantes cuatro
ratones se observaron regresiones completas. Las actividades
antitumorales de ambos tipos de LMB-2 PEGiladas
estaban marcadamente aumentadas. Las regresiones completas se
observaron en 1 de 5 ratones o en 2 de 5 ratones a la dosis de 0,025
mg/kg x 3 de LMB-2 PEG5K o PEG20K, respectivamente.
A la dosis de 0,05 mg/kg x 3, las LMB-2 PEGiladas
causaron regresiones completas de duración superior a 50 días.
Cuando se administraron solas, las PEG5K y PEG20K (10 \mug/ratón)
no tenían actividad antitumoral. En general, se requirió
aproximadamente 4 veces la dosis para producir cambios comparables
en el volumen del tumor cuando se usó cualquiera de las
LMB-2 PEGiladas.
A ratones BALB/c se les inyectó por vía
intavenosa una única dosis de 2 \mug de cada forma de
LMB-2. Se extrajeron muestras de sangre a diferentes
tiempos tras la inyección y se analizaron para determinar los
niveles de inmunotoxina en las células ATac-4. Como
se muestra en la figura 5, los perfiles de la concentración en
suero de las LMB-2 nativas y mutantes mostraron una
curva de eliminación biexponencial. Las semividas en plasma de las
LMB-2 sin modificar fueron de aproximadamente 13
minutos (tabla 3). En contraste con esto, los perfiles de la
concentración en suero de las LMB-2 PEGiladas
mostraron curvas de eliminación monoexponencial. La semivida en
plasma de la LMB-2 PEG5K se multiplicó
aproximadamente por cinco y la de la LMB-2 PEG20K se
multiplicó aproximadamente por 8. El área de debajo de la curva y
el tiempo de residencia media de ambas LMB-2
PEGiladas también aumentó de forma sustancial.
Para valorar la inmunogenicidad, ratones BALB/c
se inmunizaron i.p. con cada forma de LMB-2 a dosis
de 4 \mug/ratón o 40 \mug/ratón los días 0 y 14.
Las muestras de suero se recogieron el día 21
después de la primera inmunización y los niveles de anticuerpo IGG
antiLMB-2 de ratón se determinaron mediante ELISA
con una LMB-2 nativa como antígeno de revestimiento.
Como se muestra el la figura 6, las LMB-2 nativa y
mutante no pudieron administrarse a causa de toxicidad para los
ratones. En contraste con esto, se encontró que la inmunogenicidad
de ambas LMB-2 PEGiladas era mucho menor. Se usó
LMB-2 nativa para detectar la respuesta de
anticuerpos en este estudio, aunque se obtuvieron resultados muy
similares cuando se usaron LMB-2 mutante o
LMB-2 PEGilada para revestir las placas.
La PEGilación específica de sitio de inmunotoxina
LMB-2 recombinantes aumenta su estabilidad, el
tiempo de residencia en sangre y la actividad antitumoral, mientras
que disminuye la toxicidad inespecífica y la inmunogenicidad. En
general, la ventana terapéutica se multiplica por más de 20. Estos
resultados tienen implicaciones clínicas importantes para el sudo
de inmunotoxinas en pacientes.
En un estudio clínico recientemente completado se
administró LMB-2 a 35 pacientes y se mostró
actividad antitumoral frente a una variedad de neoplasias malignas.
Se observó una respuesta completa en un paciente con leucemia de
células pilosas (HCL) de una duración de más de 22 meses. En este
estudio se han observado varias toxicidades diferentes. Estas
incluían elevaciones de las transaminasas a causa del daño
hepático, ganancia de peso, hipotensión y fiebre. Los efectos
secundarios tóxicos de las inmunotoxinas recombinantes fueron de dos
tipos. Un tipo se debe al objetivo específico de células normales
que expresan el mismo antígeno que las células tumorales. Para
superar esta toxicidad, puede ser necesario para descubrir un
antígeno diana que no se expresa en células normales. La
identificación de nuevos antígeno está en marcha mediante el
análisis del análisis de la base de datos del marcador de la
secuencia expresada (Vasmatzis y col., (1998) Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 6: 300-304). El otro tipo de
toxicidad se produce a causa de absorción y captación inespecífica
sin definir por parte de células normales negativas para CD25. En el
estudio en fase I con LMB-2 y en estudios de
toxicidad de LMB-2 con ratones cuyos CD25 no
reaccionan con LMB-2 o con monos cuyos CD25 sí
reaccionan, se observó daño hepático con frecuencia, puesto de
manifiesto por la elevación de los niveles de transaminasas en
sangre (Kreitman y col., (1999), supra; Kreitman y
Pastan (1995), supra). Si este tipo de toxicidad se pudiera
reducir, debería ser posible aumentar la dosis de inmunotoxina
usada para tratar a los pacientes y obtener respuestas clínicas
sustanciales y más frecuentes. Un enfoque para la reducción de la
toxicidad inespecífica consiste en restringir la distribución de la
sangre a los tejidos normales mediante un incremento de su tiempo de
residencia en la sangre. Además, la prolongación de la semivida
plasmática puede conducir a un aumento de la eficacia antitumoral
(Onda y col., (1999), supra). LA PEGilación es un
medio de incrementar la residencia en sangre de la
LMB-2 y de intensificar su potencia terapéutica.
La PEGilación de proteínas aumenta sus semividas
plasmáticas mediante la reducción de la proteolisis y la
restricción de la distribución tisular, tal como la filtración
glomerular en el riñón y la captación hepática (Pai y col.,
(1991) Cancer Res. 51: 2808-2812; Chaffee
y col., (1992) J. Clin. Invest. 89:
1643-1651; Yabe y col. (1999) J. Pharmacol. Exp.
Ther. 289: 1176-1184; Pyatak y col. (1980)
Res. Commun. Chem. Pathol. Pharmacol. 29:
113-127; Katre y col. (1987) Proc. Natl.
Acad. Sci. USA. 84: 1487-1491; Kitamura y
col. (1990) Biochem. Biophys. Res. Commun. 28:
1387-1394; Wang y col., (1993) Cancer
Res. 53: 4588-4594; Benhar y col. (1994)
J. Biol. Chem. 269: 13398-133404; Kuan y
col. (1994) J. Biol. Chem. 269:
7610-7616). Este efecto se atribuye al mayor tamaño
molecular y al impedimento estérico que resulta de la unión de PEG
a proteínas. En la mayoría de los casos, la aplicación de la
PEGilación se ha limitado a las enzimas cuyos sustratos son
moléculas muy pequeñas, tal como la adenosina desaminasa (ADA) y la
superóxido dismutasa (SOD), porque la cadena de PEG unida puede
inhibir de forma estérica la unión ligando-receptor
y antígeno-anticuerpo, que se basan en las
interacciones macromoleculares (Benhar y col. (1994),
supra; Kuan y col. (1994), supra). Además, la
PEGilación normalmente se produce en los residuos de lisina,
algunos de los cuales pueden estar en o cerca del sitio activo de
la proteína y esta modificación de lisina por PEG es aleatoria y
difícil de controlar (Tsutsumi y col. (1995) Br. J.
Cancer 71: 963-968). Las inmunotoxinas
recombinantes tienen tres funciones importantes (Pastan (1997),
supra; Kreitman y col. (1994), supra; Kreitman
y col. (1999), supra; Brinkman y col.
(1991), supra; Reiter y col. (1994),
supra; Reiter y col. (1994), supra). Estas son la
unión al antígeno, la translocación y la ribosilación de ADP del
EF2. Las tres implican interacciones macromoleculares. EL dominio
de unión al antígeno y el dominio de fosforilación de ADP contienen
residuos de lisina. Para evadir la interferencia con las
interacciones macromoleculares se preparó un mutante
LMB-2 con un residuo de cisteína en el conector no
funcional entre los restos Fv y PE de la LMB-2 y se
usó el tiol de la cisteína para la PEGilación específica de sitio
(Figura 1).
La citotoxicidad específica in vitro de la
cys1-LMB-2 que contiene el residuo
de cisteína adicional contra las células tumorales CD25+
(Atac-4) es aproximadamente la misma que la de la
LMB-2 original (figura 2 y tabla 1). La
cys1-LMB-2 se PEGiló de forma
específica mediante la formación de un enlace tioéter entre el
grupo tiol libre en la región conectora y un grupo en el extremo
maleimida de PEG. Las LMB-2 PEG5K y PEG20K
producidas retenían la actividad citotóxica completa cuando se
comparaban con las LMB-2 nativa sin modificar y
mutante (figura 2 y tabla 1). Este es en parte porque la
LMB-2 se procesa en el interior de la célula en dos
fragmentos mediante una escisión proteolítica entre los aminoácidos
279 y 280 PE. El PEG permanece con la porción Fv, mientras que la
mayor parte de la toxina (aa 280 a 613) se transporta hacia el
retículo endoplasmático, desde donde se transloca al citosol y mata
a la célula. Normalmente, la actividad de las proteínas PEGiladas
disminuye cuando aumenta el peso molecular del PEG unido porque el
impedimento estérico debido al PEG unido aumenta al aumentar la
longitud de la cadena de PEG (Tsutsumi y col. (1996) Br.
J. Cancer 74: 1090-1095). Sin embargo, en este
caso, la LMB-2-PEG20K tenía casi la
misma actividad que la LMB-2-PEG5K.
Esto puede deberse a la relativamente larga distancia entre el
sitio de unión del PEG en el conector y los sitios activos de la
LMB-2. La estabilidad de las LMB-2
PEGiladas a 37ºC en suero de ratón que contiene proteasas y otras
actividades de inactivación se intensificó en comparación con las
LMB-2 nativa sin modificar y mutante (figura 3). El
PEG puede proteger estéricamente a la LMB-2 del
ataque proteolítico o disociación de las cadenas V_{H} y V_{L},
lo que conduce a la agregación y a que el PEG20K sea más eficaz que
el PEG5K.
Ambos tipos de LMB-2 PEGiladas
mostraron una actividad antitumoral 3-4 veces mayor
que las ÑMB-2nativa sin modificar y mutante. Además,
su toxicidad en ratones se dividió aproximadamente por 6 (Figura 4,
tablas 1 y 2). En consecuencia, la PEGilación condujo e un
incremento de 20 veces la eficaz terapéutica. LA PEGilación de
MB-2 aumento de forma eficaz su tiempo de
residencia en sangre y la UAC, a causa de un incremento del tamaño
molecular y de la estabilidad (figura 5). Las semividas plasmáticas
fueron 5 veces más prolongadas con la
LMB-2-PEG5K y 8 veces mayores con la
LMB-2-PEG20K que con las
LMB-2 sin modificar. Es probable que el incremento
de las actividades citotóxicas se deba al aumento de la semivida
plasmática, lo que permite la entrada de más inmunotoxina en el
tiempo de recambio a través de los capilares con fugas que a menudo
se encuentras en los tumores. Se sabe bien que el transporte de las
proteínas PEGiladas desde la sangre a los tejidos normales es
limitado y que la absorción y captación celular inespecífica de las
moléculas PEGiladas están reducidas (Chaffee y col., (1992)
J. Clin. Invest. 89: 1643-1651; Illum y col.
(1987) Biomaterials. 8: 113-117; Woodle y
Lasic (1992) Biochem. Biophys. Acta 14:
171-199). Por tanto, la disminución de la toxicidad
de la LMB-2 puede deberse, al menos en parte, a su
distribución reducida desde la sangre a los tejidos normales, como
el hígado, debido a su incremento del tamaño molecular (Chaffee
y col., (1992), supra). Es más, la unión y captación
inespecíficas de LMB-2 por las células normales
puede suprimirse por la Pegilación, que protege las interacciones
iónicas. Asimismo, también se ha encontrado que las
LMB-2 PEGiladas tienen una inmunogenicidad
disminuida que podría deberse a una reducción de la degradación por
las células presentadoras de antígeno tales como macrófagos, lo que
protege algunos epítopos de péptidos tras la degradación. (Wang y
col., (1993) Cancer Res. 53: 4588-4594) o la
prevención de la unión a receptores en las células B). Además, como
se ha mencionado antes, el transporte de LMB-2
PEGiladas desde la sangre a los tejidos inmunológicos tal como el
bazo, la médula ósea y el tejido linfoide, puede esta limitado y la
unión y captación inespecíficas de las proteínas PEGiladas por las
células presentadoras de antígeno puede estar reducida. Estudios
detallados acerca de la distribución tisular y la unión celular
serán útiles para clarificar estos aspectos.
En resumen, la PEGilación específica de sitio de
LMB-2 mejora mucho su potencia terapéutica como
agente antitumoral en ratones al incrementar su semivida en plasma
y disminuir su toxicidad inespecífica. El enfoque usado con la
LBM-2 debería ser aplicable a otras inmunotoxinas
recombinantes y a otros inmunoconjugados y aumentar su actividad en
pacientes.
Claims (29)
1. Una composición que comprende una molécula
dirigible unida a una molécula efectora a través de una molécula
conectora y una o más moléculas de polietilenglicol (PEG)
conjugadas a dicha molécula conectora.
2. La composición según la reivindicación 1, en
la que dicha molécula dirigible se selecciona de un ligando, un
anticuerpo y un fragmento de un anticuerpo, en el que el fragmento
retiene la capacidad de reconocimiento antigénico.
3. La composición según la reivindicación 2, en
la que dicho anticuerpo o fragmento del mismo reconoce
específicamente Tac.
4. La composición según la reivindicación 1, en
la que dicha molécula efectora se selecciona del grupo constituido
por una citotoxina, un marcador, un radionúclido, un marcador
detectable, un fármaco, un liposoma, un ácido nucleico, un virus
recombinante, una glicoproteína, un ligando y un anticuerpo.
5. La composición según la reivindicación 4, en
la que dicha citotoxina se selecciona del grupo constituido por
exotoxina de Pseudomonas (PE) o un fragmento o mutante de la
misma que retiene la actividad citotóxica, la toxina diftérica o un
fragmento o un mutante de la misma que retiene actividad
citotóxica, ricino, saponina, gelonina, proteína inactivadota de
ribosomas, abrina y toxina botulínica A-F.
6. La composición según la reivindicación 5, en
la que dicha PE es PE38.
7. La composición según la reivindicación 1, en
la que dicha molécula conectora es un péptido.
8. La composición según la reivindicación 7, en
la que dicha molécula conectora se selecciona del grupo constituido
por ASGCGPE (ID SEC Nº 2), ASGCCGPE (ID SEC Nº 3), ASCGSGCPE (ID
SEC Nº 4), KASGKKYGCK-KGPE (ID SEC Nº 5), ASCGTTGCPE
(ID SEC Nº 8) y KGGGCAGGPE (ID SEC Nº 6).
9. La composición según la reivindicación 1, en
la que dicha molécula PEG se sustituye por un grupo reactivo o un
residuo aminoacídico de dicha molécula conectora.
10. La composición según la reivindicación 9, en
la que dicha molécula PEG tiene un peso molecular entre 1 y 100
kD.
11. La composición según la reivindicación 9, en
la que dicha molécula PEG tiene un peso molecular de entre
aproximadamente 3 kD y aproximadamente 50 kD.
12. La composición según la reivindicación 9, en
la que dicha molécula PEG tiene un peso molecular de entre
aproximadamente 5 kD y aproximadamente 20 kD.
13. La composición según la reivindicación 1, en
la que dicha molécula dirigible es un anticuerpo frente a la
subunidad \alpha del receptor de la IL-2 conocido
como anti-Tac, en el que dicha molécula efectora es
PE38 y dicha molécula conectora es ASGCGPE (ID SEC Nº 2).
14. Una composición que comprende una composición
de la reivindicación 1 en un vehículo farmacéuticamente
aceptable.
15. Una composición que comprende una composición
de la reivindicación 13 en un vehículo farmacéuticamente
aceptable.
16. Un procedimiento de incrementar la actividad
antitumoral de una inmunotoxina que tiene un resto dirigible y un
resto de toxina conectados mediante una molécula conectora,
comprendiendo dicho procedimiento la unión covalente de una
molécula de polietilenglicol ("PEG") a dicha molécula
conectora.
17. Un procedimiento de la reivindicación 16, en
el que dos o más residuos aminoacídicos de dicha molécula conectora
están unidos a PEG.
18. Un procedimiento de la reivindicación 16, en
el que dicha molécula dirigible se selecciona de un ligando, un
anticuerpo y un fragmento de un anticuerpo, en el que dicho
fragmento retiene la capacidad de reconocimiento del antígeno.
19. El procedimiento de la reivindicación 18, en
el que dicho anticuerpo reconoce específicamente Tac.
20. El procedimiento de la reivindicación 18, en
el que dicha molécula efectora se selecciona del grupo constituido
por una citotoxina, un marcador, un radionúclido, un marcador
detectable, un fármaco, un liposoma, un ácido nucleico, un virus
recombinante, una glicoproteína, un ligando y un anticuerpo.
21. El procedimiento de la reivindicación 20, en
el que dicha citotoxina se selecciona del grupo constituido por
exotoxina de Pseudomonas (PE) o un fragmento o mutante de la
misma que retiene la actividad citotóxica, la toxina diftérica o un
fragmento o un mutante de la misma que retiene actividad
citotóxica, ricino, saponina, gelonina, proteína inactivadota de
ribosomas, abrina y toxina botulínica A-F.
22. El procedimiento de la reivindicación 21, en
el que dicha PE es PE38.
23. El procedimiento de la reivindicación 18, en
el que dicha molécula conectora es un péptido.
24. El procedimiento de la reivindicación 23, en
el que dicha molécula conectora se selecciona del grupo constituido
por ASGCGPE (ID SEC Nº 2), ASGCCGPE (ID SEC Nº 3), ASCGSGCPE (ID
SEC Nº 4), KASGKKYGCK-KGPE (ID SEC Nº 5), ASCGTTGCPE
(ID SEC Nº 8) y KGGGCAGGPE (ID SEC Nº 6).
25. El procedimiento de la reivindicación 18, en
el que en la que dicha molécula PEG se sustituye por un grupo
reactivo o un residuo aminoacídico de dicha molécula conectora.
26. El procedimiento de la reivindicación 18, en
el que dicha molécula PEG tiene un peso molecular entre 1 y 100
kD.
27. El procedimiento de la reivindicación 26, en
el que dicha molécula PEG tiene un peso molecular de entre
aproximadamente 3 kD y aproximadamente 50 kD.
28. El procedimiento de la reivindicación 26, en
el que dicha molécula PEG tiene un peso molecular de entre
aproximadamente 5 kD y aproximadamente 20 kD.
29. El procedimiento de la reivindicación 26, en
el que dicha molécula dirigible es un anticuerpo que reconoce de
forma específica la subunidad \alpha del receptor de la
IL-2, dicha molécula efectora es PE38 y dicha
molécula conectora es ASGCGPE (ID SEC Nº 2).
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| PL1639011T3 (pl) * | 2003-06-30 | 2009-05-29 | Domantis Ltd | Pegilowane przeciwciała jednodomenowe (dAb) |
| MX2007000387A (es) * | 2004-07-16 | 2007-03-28 | Micromet Ag | Polipeptidos de expresion mejorada. |
| US7935804B2 (en) | 2006-03-01 | 2011-05-03 | Aduro Biotech | Engineered Listeria and methods of use thereof |
| WO2007103225A2 (en) | 2006-03-01 | 2007-09-13 | Anza Therapeutics, Inc. | Engineered listeria and methods of use thereof |
| JP2010535484A (ja) * | 2007-08-08 | 2010-11-25 | ノボザイムス バイオファーマ デーコー アクティーゼルスカブ | トランスフェリン変異体と複合体 |
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| WO2012072815A1 (en) * | 2010-12-03 | 2012-06-07 | Adamed Sp. Z O.O. | Anticancer fusion protein |
| CA2880765C (en) * | 2012-08-23 | 2023-01-10 | Stemcell Technologies Inc. | Compositions and methods for rapid and reversible biomolecular labeling |
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