ES2248898T3 - Inmunotoxinas que comprenden una proteina onc dirigida contra celulas malignas. - Google Patents
Inmunotoxinas que comprenden una proteina onc dirigida contra celulas malignas.Info
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Abstract
La presente invención se refiere a inmunotoxinas que matan eficazmente células malignas que tienen un marcador de superficie dado y construcciones de ácido nucléico que las codifican. Estos reactivos incluyen una mitad tóxica que se deriva de una proteína Rana pipiens que tiene una actividad ribonucleica unida a una capacidad anticuerpo de unión específica con una célula tumoral determinada.
Description
Inmunotoxinas que comprenden una proteína onc
dirigida contra células malignas.
Esta solicitud es una continuación y reivindica
la prioridad de la solicitud provisional de patente americana U.S.
60/046.895, registrada el 2 de mayo de 1997.
No aplicable.
Las enzimas tóxicas de plantas y bacterias como
la ricina, la toxina diftérica y la toxina de Pseudomonas se
han unido a anticuerpos o ligandos de unión al receptor para
generar reactivos específicos para la eliminación de un tipo celular
(Youle, y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:5483 (1980));
Gilliland, y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4539 (1980);
Krolick, y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:5419 (1980)). A
pesar de que la molécula de reconocimiento celular no siempre es un
anticuerpo, a estas toxinas dirigidas se las conoce en general como
inmunotoxinas. Estas proteínas híbridas eliminan las células que
expresan el receptor o el marcador de membrana celular que es
reconocido por el anticuerpo o porción de ligando de la
molécula.
En condiciones adecuadas, dependiendo del
receptor en particular o del marcador de superficie celular, la
toxina entra en el citosol, inactiva la síntesis proteica y causa
la muerte de la célula diana. Las inmunotoxinas, que han demostrado
ser altamente citotóxicas para las células cancerosas que crecen en
cultivos celulares y en modelos animales, demuestran el potencial
de estos reactivos para tratar los procesos cancerosos de la sangre
y de nódulos linfáticos, ya que debido a su diseminación no son
tratables por las técnicas quirúrgicas tradicionales, así como los
tumores sólidos en compartimentos restringidos como la cavidad
intraperitoneal (revisado en Griffin, y col., IMMUNOTOXINS, p.
433, Boston/Dordrecht/Lancaster, Kluwer Academic Publishers, (1988);
Vitetta, y col., Science 238:1098 (1987); Fitzgerald, y col., J.
Natl. Cancer Inst. 81:1455 (1988)). Las quimioterapias
tradicionales, aunque eficaces en el tratamiento de algunas
condiciones cancerosas, presentan efectos secundarios adversos
debido a la toxicidad sistémica de los compuestos
quimioterapéuticos.
Un candidato ideal para la terapia del cáncer,
sería una inmunotoxina que fuera citotóxica para las células
cancerosas y no para las células no-cancerosas del
paciente. La utilización de este tipo de terapia
anti-tumoral, ha sido bloqueada, sin embargo, por
el desarrollo de respuestas inmunes en los pacientes contra
proteínas foráneas que comprenden las inmunotoxinas. Se han
detectado respuestas inmunes contra los anticuerpos monoclonales
murinos (Sawler, y col., J. Immunol. 135:1530 (1985); Schroff, y
col., Cancer Res. 45:879 (1985)) y anticuerpos
anti-toxina que tanto en animales como en el hombre
tratados con inmunotoxinas (Rybak, y col., Immunol adn Allergy
Clinics of North America 11(2):359 (1991); Harkonen, y col.,
Cancer Res 47:1377 81987); Hertler, A. en IMMUNOTOXINS p. 475,
Kluwer Academic Publishers, Boston/Dordrecht/Lancaster (1988)). Los
avances en las técnicas de humanización han mitigado en parte la
inmunogenicidad asociada con la porción de anticuerpo de las
inmunotoxinas (Bird, y col., Science 242:423 (1988); Huston, y
col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879 (1988); Ward, y col.,
Nature 341:544 (1989); y Jones, y col., Nature 314:522 (1986)).
Sin embargo, no se ha hallado ninguna solución para computar la
inmunogenicidad de la porción tóxica distinta de la de
inmunosupresión de los pacientes (Khazaeli, y col., Proceedings of
AACR 29:418 (1988)). Por ello, continúa existiendo una necesidad de
procedimientos y composiciones que reduzcan la inmunogenicidad de la
porción tóxica de las inmunotoxinas y retengan al mismo tiempo la
capacidad para eliminar selectivamente las células que presenten en
su superficie el marcador.
Los linfomas de células B se hallan dentro del
término genérico de linfomas de no-Hodgkin y pueden
ser un tumor diseminado o un tumor sólido dentro del sistema
linfático. Los anticuerpos murinos humanizados marcados con
radioisótopos que se han generado contra el CD22
(LymphoCide^{TM}), un marcador de superficie de células B
malignas, se halla en la actualidad en ensayos clínicos como un
tratamiento para los linfomas de células B (Immunomedics, Inc.,
Press Release, http://www.immunogenomedic.com/theral.html).
Véase también, Amlot y col., Blood 82:2624-2633
(1993); Sausville, y col., Blood 85:3457-3465
(1995); Grossbard, y col., Blood 81:2263-2271
(1993); Grossbard, y col., Clin. Oncol. 11:726-737
(1993). Hasta la fecha, se han observado algunas respuestas
antitumorales aunque la toxicidad mediada por inmunotoxinas contra
el tejido normal impidió la dosificación a niveles terapéuticos.
Además de CD22, algunos antígenos específicos de células B como el
CD19 y el CD40 son las dianas de inmunotoxinas generadas con
toxinas vegetales como la cadena A de la ricina y las toxinas
bacterianas, como la exotoxina A de Pseudomonas (PE). Uckun,
y col., Blood 79:2201-2214 (1992); Ghetie, y
col., Cancer Res. 51:5876-5880 (1991); Francisco, y
col., Cancer Res. 55:3099-3104 (1995).
La citotoxicidad de la RNasa A hacia las células
tumorales está bien documentada a partir de estudios realizados en
los años 60 y 70. Los trabajos iniciales se resumen en Roth, Cancer
Res. 23:657 (1963). La importancia de estos estudios iniciales está
apoyada por el descubrimiento de que la proteína
anti-tumoral de oocitos de Rana pipiens es
homóloga a la RNasa pancreática bovina (Ardelt, y col., J. Biol.
Chem. 256:245 (1991)). La proteína P-30 (referida
aquí como la proteína onc) se aisló de extractos de embriones
tempranos de Rana pipiens basándose en los efectos
anti-proliferativos/citotóxicos hacia las células
cancerosas in vitro (Darzynkiewicz, y col., Cell Tissue
Kinet. 21.169 (1988); Mikulski, y col., Cell Tissue Kinet. 23:237
(1990)) y en modelos animales (Mikulski, y col., J. Nat. I. Cancer
Inst. 82:151 (1990)). Actualmente, se hallan en desarrollo ensayos
clínicos en humanos en fase III de la proteína onc en pacientes con
diversos tumores sólidos.
El aumento de citotoxicidad específica para las
células diana se logró conjugando la proteína onc y sus homólogos,
p.ej., la RNasa A pancreática bovina, con los anticuerpos contra
marcadores de superficie celular en las células diana. Por ejemplo,
Rybak y col. (Drug Delivery, 1993, 1:3-10)
publicaron el aumento drástico de la citotoxicidad específica
dirigida contra las células de eritroleucemia humanas K562 mediante
inmunoconjugados que comprendían la proteína onc y un anticuerpo
contra el receptor de la transferrina humana. Diversos anticuerpos
de superficie celular, en particular aquellos que se habían
humanizado para minimizar una respuesta inmune deseada en un
paciente, son conocidos en la materia y están disponibles para
generar inmunoconjugados para la práctica de la presente invención.
La patente internacional, WO 96/04925, por ejemplo, describe el
anticuerpo monoclonal LL2 que es de utilidad para la liberación de
citotoxicidad específica en el tratamiento de linfomas de células B
y leucemias.
La presente invención hace referencia a las
inmunotoxinas, que son de utilidad para la eliminación de células B
malignas y otras células malignas y están dirigidas a un marcador
de superficie en las células B, y a las construcciones de ácido
nucleico que codifican las inmunotoxinas. Estos reactivos
comprenden una porción tóxica que se deriva de una proteína de
Rana pipiens con actividad ribonucleolítica unida a un
anticuerpo capaz de unirse específicamente a una célula tumoral
elegida.
Hemos hallado que estas inmunotoxinas
particulares tienen propiedades altamente sorprendentes ya que son
hasta 2000 veces más activas contra las células B malignas que sus
parejas de RNasa humanas o que su propia toxina. Además, tal como se
describirá con mayor detalle más adelante, su utilización cuando se
administran in vivo contra tumores diseminados, resultó en
efectos secundarios mucho más menores. Estas inmunotoxinas
altamente eficaces, pero aparentemente no tóxicas, dirigidas contra
dichas enfermedades ubicuitarias como los linfomas B representan
una opción terapéutica nueva y excitante para los pacientes que
sufren de tales enfermedades.
Es un objetivo de la presente invención
proporcionar inmunotoxinas de RNasa citotóxica (proteína onc) que
eliminan selectivamente las células que presentan un marcador de
superficie. Estas inmunotoxinas son mínimamente inmunogénicas y
generan menos toxicidad sistémica que las inmunotoxinas actualmente
conocidas. En particular, es un objetivo de la presente invención
proporcionar directamente inmunotoxinas que comprendan fragmentos
de proteínas con actividad ribonucleolítica unidos a anticuerpos
humanizados que reconocen marcadores específicos en las células
tumorales.
En otra realización, la presente invención hace
referencia a una composición farmacéutica que comprende una
inmunotoxina de la presente invención y un vehículo
farmacéuticamente aceptable.
En otra realización, la presente invención hace
referencia a un procedimiento de eliminación selectiva de células.
El procedimiento comprende el contacto de las células tumorales a
eliminar con una inmunotoxina selectiva de la presente invención en
condiciones tales que el anticuerpo se une a un marcador de
superficie en la célula tumoral, causando en consecuencia que la
proteína onc destruya la célula.
Otros objetivos y ventajas de la presente
invención serán evidentes a partir de la descripción siguiente de
la invención.
La figura 1 indica que la ONCONASE® es más
citotóxica en las células de linfoma T HUT 102 (que no presentan
el marcador CD22 reconocido por LL2) que la inmunotoxina,
LL2-ONCONASE®.
La Figura 2 demuestra la citotoxicidad superior
de LL2-ONCONASE® en las células del linfoma de
Burkitt cuando se compara con la ONCONASE® sola.
La figura 3 indica que la ONCONASE® conjugada con
los anticuerpos dirigidos contra CD22 es más inhibidora de la
síntesis de proteínas que la EDN conjugada con los anticuerpos
anti-CD22. EDN es una RNasa humana
no-tóxica tal como se describe en el texto.
La figura 4 indica que la ONCONASE® es más
inhibidora de la síntesis de proteínas cuando se conjuga con los
anticuerpos en comparación con la RNasa pancreática humana.
Las figuras 5A y 5B demuestran que la
LL2-ONCONASE® marcada con I^{125} no se degrada
por los lisosomas de las células Daudi tan rápidamente como el
anticuerpo LL2 o la inmunotoxina LL2-EDN. La figura
5A muestra el porcentaje de material de RNasa retenido en las
células y la figura 5B, el porcentaje de material de RNasa degradado
y liberado en el sobrenadante.
La figura 6 muestra que el anticuerpo LL2
disminuye el efecto citotóxico de LL2-ONCONASE®. Se
cree que LL2 compite por la unión con CD22 con
LL2-ONCONASE® y previene la internalización de la
ONCONASE®, reduciendo por ello la citotoxicidad.
La figura 7 es una gráfica de supervivencia que
muestra la protección de los ratones SCID con
LL2-ONCONASE® frente al linfoma de células B. Se
implantaron 5x10^{6} células Daudi intraperitonealmente en los
ratones, y 24 horas más tarde, los ratones se trataron
intravenosamente con 500 \mug del compuesto indicado.
La figura 8 es una gráfica de supervivencia que
muestra la protección completa de los ratones SCID con
LL2-ONCONASE® de una implantación intraperitoneal de
2x10^{6} células Daudi. Los ratones se trataron durante 24 horas
después de la implantación con 500 \mug de los compuestos
indicados; 100 \mug diariamente durante 5 días.
La figura 9 representa una disminución de la
toxicidad de la inmunotoxina LL2-ONCONASE®
comparada con la ONCONASE® sola y la IT-dgRTA
(RFB4-cadena A de la Ricina desglicosilada). Los
fármacos se administraron cada 2 horas, cuatro veces durante 5
días. Las flechas indican los días en que los ratones se hallaron
muertos con cada uno de los tratamientos respectivos, es decir, el
ratón tratado con 30 mg/Kg de ONCONASE® se halló muerto el día 4 y
el ratón tratado con 50 mg/Kg de IT-dgRTA se halló
muerto el día 7.
La presente invención hace referencia a la
utilización de una proteína RNasa, en particular una RNasa derivada
de Rana pipiens como una molécula tóxica en una inmunotoxina
dirigida contra las células B. Los reactivos inmunotóxicos de la
presente invención comprenden una proteína y un antibiótico que se
une específicamente a un marcador de superficie tumoral elegido. En
los estudios que se detallan más adelante, la proteína onc se
muestra muy superior a otras inmunotoxinas que comprenden
anticuerpos dirigidos contra CD22 o CD47 y una RNasa
no-tóxica humana. Las inmuntoxinas basadas en la
proteína onc son agentes potentes contra las células B malignas,
como los linfomas de células B y las leucemias y otras enfermedades
malignas como los neuroblastomas.
El término "anticuerpo" o
"péptido(s) de anticuerpo(s)" hace referencia a
los anticuerpos mono- y policlonales, una inmunoglobulina entera o
un anticuerpo o cualquier fragmento funcional de una molécula de
inmunoglobulina que se une al antígeno diana y se define más
adelante. Ejemplos de dichas entidades funcionales incluyen las
moléculas de anticuerpo completas, los fragmentos de anticuerpos,
como el Fv, el Fv de cadena sencilla, las regiones determinantes de
la complementariedad (CDRs), VL (región variable de cadena ligera),
VH (región variable de cadena pesada), Fab, F(ab)'s y
cualquier combinación de éstos u otra porción funcional de un
péptido de inmunoglobulina capaz de unirse al antígeno diana.
Los anticuerpos existen, p.ej., como
inmunoglobulinas intactas o como diversos fragmentos bien
caracterizados producidos por digestión con varias peptidasas. Así,
por ejemplo, la pepsina digiere un anticuerpo por debajo de los
enlaces disulfuro en la región bisagra para producir
F(ab')2, un dímero de Fab que el mismo es una cadena unida a
VH-CH mediante un enlace disulfuro. El
F(ab)'2 puede reducirse en condiciones suaves para romper el
enlace disulfuro en la región bisagra, convirtiendo el dímero
F(ab)'2 en un monómero Fab'. El monómero Fab' es
esencialmente un Fab con parte de la región bisagra (véase,
FUNDAMENTAL INMUNOLOGY, 3RD ED., W.E. Paul, ed., Raven Press, N.Y.
(1993)). Mientras que los fragmentos de anticuerpo se definen en
términos de la digestión de un anticuerpo intacto, un experto en la
materia apreciará que dichos fragmentos pueden sintetizarse de
novo bien químicamente o utilizando la metodología del DNA
recombinante. Así, el término anticuerpo, tal como se utiliza aquí,
también incluye fragmentos de anticuerpo producidos por la
modificación de anticuerpos enteros o de los sintetizados de
novo utilizando metodologías del DNA recombinante.
Para esta invención, un anticuerpo, es
"reactivo con" o "se une a" un antígeno si interacciona
con el antígeno. Esta interacción es análoga a una reacción química
en la que los dos reactantes están juntos para formar un producto.
En el caso de la interacción antígeno-anticuerpo,
el producto de la interacción es un complejo
anticuerpo-antígeno. Los antígenos preferidos que se
unen a las inmunoglobulinas de la invención son el marcador de
superficie celular CD22 y el CD74.
El término "especificidad de unión", "se
une específicamente a un anticuerpo" o "inmunoreacciona
específicamente con", cuando hace referencia a una proteína o
carbohidrato, se refiere a una reacción de unión que es determinante
de la presencia de la proteína o carbohidrato en presencia de una
población heterogénea de proteínas y otras moléculas biológicas.
Por ello, en la condiciones diseñadas de un inmunoensayo, los
anticuerpos específicos se unen a una proteína en particular o
carbohidrato y no se unen en una cantidad significativa a otras
proteínas o carbohidratos presentes en la muestra. La unión
específica con un anticuerpo en dichas condiciones puede necesitar
un anticuerpo seleccionado por su especificidad hacia una proteína
determinada o carbohidrato. Por ejemplo, los anticuerpos generados
contra el antígeno CD22 pueden seleccionarse para proporcionar
anticuerpos que inmunoreaccionen específicamente con la proteína
CD22 y no con otras proteínas. Se pueden utilizar muy diversos
formatos para seleccionar anticuerpos inmunoreactivos específicos
para una proteína o carbohidrato determinados. Por ejemplo, se
utilizan de forma rutinaria los inmunoensayos ELISA en fase sólida
para seleccionar anticuerpos que inmunoreaccionan de forma
específica con una proteína o carbohidrato. Véase Harlow &
Lane, ANTIBODIES, A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor
Publication, New York (1988) para una descripción de formatos de
inmunoensayo y condiciones que pueden utilizarse para determinar una
inmunoreactividad específica.
El término "humanizado" hace referencia a un
anticuerpo en el que las regiones constantes tienen al menos el 80%
o más de homología con la inmunoglobulina humana. Además, algunos
de los residuos no humanos, como los residuos aminoacídicos de la
región variable murinos pueden modificarse para contener residuos
aminoacídicos de origen humano.
Los anticuerpos humanizados se han referido como
anticuerpos "reformados". La manipulación de las regiones de
determinantes de la complementariedad (CDR) es una vía para lograr
anticuerpos humanizados. Véase, por ejemplo, Jones y col., Nature
321:522 (1988) y Riechmann, y col., Nature 332:323 (1988),
habiéndose incorporado ambas referencias. Para un artículo de
revisión sobre anticuerpos humanizados, véase Winter &
Milstein, Nature 349:293 (1991), incorporado en las referencias.
Los términos "aislado" o "esencialmente
purificado", cuando se aplican a un ácido nucleico o proteína,
significan que el ácido nucleico o la proteína está esencialmente
libre de otros componentes celulares con los que se asocia en el
estado natural. Preferentemente, en un estado homogéneo, aunque
puede hallarse en una solución seca o acuosa. La pureza o
homogeneidad se determinan típicamente utilizando técnicas de
química analítica como la electroforesis en gel de poliacrilamida o
la cromatografía líquida de alta resolución. Una proteína que es la
especie predominante en una preparación y está esencialmente
purificada.
En particular, un gen aislado que codifica la
proteína onc está separado de las pautas de lectura abiertas que
flanquean el gen y las proteínas codificantes distintas de la
proteína onc. El término "purificado" significa que un ácido
nucleico o proteína proporciona una sola banda en un gel de
electroforesis. En especial, significa que el ácido nucleico o la
proteína es de al menos un 85% pura, más preferentemente de al menos
un 95% pura, y más preferentemente de al menos un 99% pura. El
término "ácido nucleico" hace referencia a un polímero de
desoxiribonucleótidos o ribonucleótidos en una forma de cadena
sencilla o doble, y salvo que se indique lo contrario, abarca
análogos conocidos de nucleótidos naturales que pueden funcionar de
forma similar como nucleótidos naturales.
El término "unido" en el contexto de las
inmunotoxinas de la presente invención abarca la unión de moléculas
(típicamente un anticuerpo y una toxina) mediante la unión
covalente, incluyendo el enlace disulfuro; el enlace de hidrógeno;
el enlace electrostático; la fusión recombinante; y la unión
conformacional, p.ej., antígeno-anticuerpo y las
asociaciones biotina-avidina.
Los términos "actividad ribonucleolítica
cuantificable" o "actividad ribonucleolítica significativa"
hacen referencia a una molécula que tiene un IC_{50} inferior a
40 ng/ml cuando se añade a un ensayo de lisado de reticulocitos en
donde la síntesis proteica se inhibe tal como se cuantifica
mediante la incorporación de metionina [S^{35}] en la proteína
precipitable en ácido. La IC50 es la concentración de proteína
necesaria para inhibir la síntesis de proteína al 50% en el ensayo.
El ensayo del lisado puede realizarse tal como se describe en el
equipo de ensayo del lisado de Promega que está disponible
comercialmente por Promega Corporation, Madison, WI. La actividad
ribonucleolítica utilizando el RNA de alto peso molecular y el tRNA
se determinan a 37ºC tras la formación de nucleótidos solubles en
ácido perclórico, según indican los protocolos publicados (Newton,
D.L., y col., Biochemistry 35:545-553 (1996)). La
actividad ribonucleolítica con poli(A,C) UpG y poliU se
ensaya de acuerdo con DePrisco y col., y Libonatti & Floridi
(DePrisco, R. y col., Biochimica et Biophysica Acta
788:356-363 (1984); Libonati, M. y col., European
J. Biochem. 8:81-87 (1969)). La actividad se analiza
cuantificando el incremento en el tiempo en la absorbancia a 260
nm. Las mezclas de incubación (1 ml de imidazol 10 mM, NaCl 0,1 M,
pH 6,5 o pH 7) contienen el sustrato y cantidades adecuadas de la
solución enzimática a 25ºC. El ensayo de traducción in vitro
(St. Clair, D.K., y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA
84:8330-8334 (1987)) y los ensayos de viabilidad
celular utilizando el
(3-[4,5-dimetiltiazol-2-yl]-2,5-difeniltetrazolium
bromuro; azul de tiazol; MTT) (Mossman, T.J. Immunol. Methods
65:55-63 (1983)) se realizaron tal como se había
descrito previamente (Pearson, J.W., y col. J. Natl. Cancer Inst.
83:1386-1391 (1991)).
El término "ácido nucleico codificante" o
"secuencia de ácido nucleico codificante" hace referencia a un
ácido nucleico que dirige la expresión de una proteína o péptido
específico. Las secuencias de ácido nucleico incluyen las secuencias
de la cadena de DNA que se transcribe a RNA y la secuencia de RNA
que se traduce a proteína. Las secuencias de ácido nucleico
incluyen las secuencias de ácido nucleico de tamaño completo, así
como las secuencias más cortas derivadas de las secuencias de tamaño
completo. Se entenderá que una secuencia de ácido nucleico
determinada incluye los codones degenerados de la secuencia nativa
o secuencias que pueden introducirse para proporcionar la
preferencia de un codón en una célula huésped específica. El ácido
nucleico incluye tanto las cadenas sentido (sentido de
transcripción 5'-3') y las antisentido, bien como
cadenas sencillas individuales o en la forma dúplex.
El término "proteína onc" hace referencia a
una RNasa A derivada de Rana pipiens que se designó
originalmente proteína P30 y se describió en primer lugar por
Darzynkiewicz, y col., Cell Tissue Kinet. 21:169 (1988), como la
proteína que tiene las secuencias de la SEC ID Nº 1. Una
descripción de esta proteína puede hallarse en la patente americana
U.S. 5.559.212. El término "proteína onc nativa" hace
referencia a la proteína en su forma nativa, purificada a partir de
los oocitos de Rana pipiens. El término "proteína onc
recombinante" hace referencia a la proteína producida por métodos
recombinantes. Las realizaciones preferidas de estas proteínas
recombinantes y sus secuencias nucleicas se describen en la
solicitud de patente PCT/US97/02588. Se entenderá que las proteínas
onc también abarcan las modifi-
caciones en las secuencias de ácido nucleico y aminoacídicas pero con una actividad ribonucleolítica cuantificable.
caciones en las secuencias de ácido nucleico y aminoacídicas pero con una actividad ribonucleolítica cuantificable.
Una secuencia aminoacídica "derivada de onc"
incluye una que contenga al menos una cadena de 6 aminoácidos
contiguos e idénticos a una secuencia contigua de 6 aminoácidos
seleccionados a partir del grupo de secuencias que se inician en las
posiciones aminoacídicas 1 (con Glu reemplazando piroGlu), 2, 3, 4,
5,6, 7, 8, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 18, 19, 20, 22, 23, 24, 25, 26,
27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 41, 42, 43, 44, 45, 46,
47, 50, 52, 54, 56, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70,
71, 72, 73, 74, 76, 80, 81, 82, 84, 85, 86, 87, 91, 92, 93, 95, o
96 de la secuencia aminoacídica de onc (SEC ID Nº 1).
El término "composición farmacéutica" hace
referencia a las formulaciones de diversas preparaciones. Las
formulaciones parenterales son conocidas y son preferidas para
utilizar en la invención. Las formulaciones que contienen cantidades
efectivas terapéuticamente de las inmunotoxinas son soluciones
líquidas estériles, suspensiones líquidas o versiones liofilizadas,
y opcionalmente contienen estabilizantes o excipientes. Las
composiciones liofilizadas se reconstituyen con diluyentes
adecuados, p.ej., agua para inyección, solución salina, glicina al
0,3% y similar, a un nivel de aproximadamente 0,01 mg/Kg de peso
corporal de huésped a 10 mg/kg o más.
Típicamente, las composiciones farmacéuticas que
contienen las inmunotoxinas se administran en una dosis efectiva
terapéuticamente en un solo día o durante varios díasmediante
infusión intravenosa diaria.
Las inmunotoxinas de la presente invención pueden
administrarse sistémicamente mediante inyección, más preferentemente
de forma intravenosa, pero también intramuscular, subcutánea,
intratecal, intraperitoneal, en espacios vasculares, o en
articulaciones, p.ej., inyección intraarticular. La dosis dependerá
de las propiedades de las inmunotoxinas utilizadas, p.ej., su
actividad y vida media biológicas, la concentración de la
inmunotoxina en la formulación, el sitio y tasa de dosificación, la
tolerancia clínica del paciente implicado, la magnitud del cáncer
que afecta al paciente y similar, así como de la experiencia del
clínico.
La inmunotoxina de la presente invención puede
administrarse en solución. El pH de la solución debería hallarse en
el rango de pH 5 a 9,5, preferentemente de 6,5 a 7,5. Las
inmunotoxinas o derivados de lo mismo deberían estar en una solución
con un tampón aceptable farmacéuticamente como el fosfato, Tris
(hidroximetil) aminometano-HCl o el citrato y
similares. Las concentraciones de tampón deberían hallarse en el
intervalo de 1 a 100 nM. La solución de inmunoglobulina puede
también contener una sal, como el cloruro sódico o el cloruro
potásico a una concentración de 50 a 150 mM. Una cantidad efectiva
de un agente estabilizante como la albúmina, una globulina, un
detergente, una gelatina, una protamina o una sal de protamina
también puede incluirse y añadirse a una solución que contenga la
inmunotoxina o a la composición a partir de la cual se prepara la
solución. La administración sistémica de la inmunotoxina se realiza
típicamente cada dos o tres días o una vez por semana si una forma
humanizada del anticuerpo que se utiliza. Alternativamente, se
utiliza la administración diaria. Generalmente, la administración
puede ser mediante inyección intramuscular o infusión
intravascular.
La administración también puede ser intranasal o
por vías no parenterales. La inmunotoxina también puede
administrarse mediante microsferas, liposomas u otros sistemas de
liberación de micropartículas colocados en tejidos determinados
incluyendo la sangre.
La inmunotoxina también puede administrarse
mediante aerosol para lograr la liberación localizada en los
pulmones. Esto se logra preparando un aerosol acuoso, preparación
liposomal conteniendo partículas sólidas o derivados de lo mismo. Se
puede utilizar una suspensión no acuosa (p.ej., propelente de
fluorocarbono). Los nebulizadores sónicos se utilizan
preferentemente en aerosoles. Estos nebulizadores minimizan la
exposición del anticuerpo o derivados de lo mismo a posibles fuerzas
de rotura, lo que resultaría en la degradación de la
inmunotoxina.
Generalmente, un aerosol acuoso se genera
formulando una solución acuosa o suspensión de la inmunotoxina junto
con vehículos y estabilizadores aceptables farmacéuticamente. Los
vehículos y estabilizadores variarán dependiendo de los
requerimientos para cada inmunotoxina en particular, pero
típicamente incluyen tensoactivos no iónicos
(TWEEN-20 u 80®, PLURONIC-F128 o
-67®, o polietilén glicol), las proteínas inocuas como la albúmina
sérica, o los ésteres del sorbitán, el ácido oleico, la lecitina,
los aminoácidos como la glicina, los tampones, las sales, los
azúcares o los alcoholes de azúcares. Las formulaciones serán
estériles. Los aerosoles se preparan a partir de soluciones
isotónicas.
Los términos "DNA recombinante", "ácido
nucleico recombinante" o "DNA producido de forma
recombinante", hacen referencia al DNA que se ha aislado a
partir de su fuente nativa o endógena y se modifica bien
químicamente o enzimáticamente mediante adición, deleción o
alteración de nucleótidos internos flanqueantes naturales. Los
nucleótidos flanqueantes son aquellos nucleótidos que se hallan
cadena abajo o arriba de la secuencia descrita o subsecuencia de
nucleótidos, mientras que los nucleótidos internos son los propios
nucleótidos que se hallan en la secuencia o subsecuencia
descrita.
El término "medios recombinantes" hace
referencia a las técnicas en las que se aíslan las proteína, se
identifica la secuencia del cDNA codificante de la proteína y se
inserta en un vector de expresión. El vector se introduce en una
célula y la célula expresa la proteína. Los medios recombinantes
también abarcan la ligación del DNA codificante o del promotor de
fuentes diferentes en un vector para la expresión de una proteína de
fusión, la expresión constitutiva de una proteína, o la expresión
inducible de una proteína.
Los términos "proteína recombinante",
"proteína producida de forma recombinante" o "inmunotoxina
producida de forma recombinante" hacen referencia a un péptido o
proteína producida utilizando células no nativas que no tienen una
copia endógena del DNA capaz de expresar la proteína. Las células
producen la proteína porque se han alterado genéticamente mediante
introducción de la secuencia de ácido nucleico adecuado. La
proteína recombinante no se hallará en asociación con proteínas y
otros componentes subcelulares asociados normalmente con las
células productoras de la proteína.
El término "reactivo citotóxico selectivo"
hace referencia a un compuesto que cuando se añade a una población
de células diferentes, p.ej., dentro de un organismo, elimina un
tipo celular en la población basándose en algunas características de
la célula, es decir, un ligando de superficie o marcador con el que
el reactivo citotóxico se une y luego se internaliza.
El término "anticuerpo de cadena sencilla"
hace referencia a un anticuerpo en donde la información genética
que codifica los fragmentos funcionales del anticuerpo se
localizanen una sola secuencia contigua de DNA. Para una
descripción de anticuerpos de cadena sencilla, véase Bire y col.,
Science 242:423 (1988) y Huston, y col., Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 85:5879 (1988).
El término "marcador de superficie" hace
referencia a una proteína, carbohidrato, o glicoproteína presente
en la superficie de una célula. Los diferentes tipos de células
expresan diferentes marcadores de superficie celular y en
consecuencia es posible identificar las células por la presencia de
un marcador de superficie celular. Por ejemplo, las células B
malignas sobreexpresan CD22. Por ello, la unión de un anticuerpo que
reconozca CD22 identifica la célula como una célula B. El CD74,
descrito más adelante, es un ejemplo de marcador de superficie
celular que se halla en las células y un grupo seleccionado de
células malignas.
Entre las diversas utilizaciones de las
inmunotoxinas de la presente invención se incluyen diversas
enfermedades causadas por células humanas específicas que pueden
eliminarse por la acción tóxica de la proteína. Una aplicación
preferida de los inmunoconjugados de la invención es el tratamiento
de células B malignas que expresan CD22. Ejemplo de enfermedades
malignas de células B incluyen la leucemia linfocítica aguada
(ALL), la leucemia linfocítica B crónica (B-CLL), la
leucemia mielógena crónica, el linfoma de Burkitt, los linformas
asociados al SIDA y los foliculares y las leucemias de células
velludas. Las inmunotoxinas descritas aquí que se dirigen contra
CD74 son de utilidad para la inhibición y tratamiento del melanoma,
neuroblastoma y células de mieloma.
Los reactivos citotóxicos preferidos de esta
invención son al menos 100 veces, preferentemente de al menos 500
veces y más preferentemente de al menos 1000 veces más citotóxicos
contra las células diana con un marcador de célula B en comparación
con el mismo anticuerpo unido a EDN, una RNasa no tóxica humana.
Los anticuerpos hacen referencia a polipéptidos
esencialmente codificados por un gen de inmunoglobulina o genes de
inmunoglobulina, o fragmentos de lo mismo, que específicamente se
unen y reconocen un analito (antígeno). Los genes de inmunoglobulina
reconocidos incluyen la región constante de los genes kappa, lambda,
alfa, delta, epsilon y mu, así como un gran número de genes de la
región variable de inmuglobulina. Las cadenas ligeras se clasifican
como kappa y lambda. Las cadenas se clasifican como gamma, mu, alfa,
delta o epsilon, que a su vez definen las clases de inmuglobulinas,
IgG, IgM, IgA, IgD e IgE, respectivamente.
Un ejemplo de unidad estructural de
inmunoglobulina (anticuerpo) comprende un tetrámero. Cada tetrámero
está compuesto de dos pares idénticos de cadenas polipeptídicas,
teniendo cada par una cadena "ligera" (aproximadamente 25 KD) y
una "pesada" (aproximadamente 50-70 KD). El
extremo N-terminal de cada cadena define una región
variable de aproximadamente 100 a 110 o más aminoácidos responsables
del reconocimiento del antígeno. Los términos de cadena ligera
variable (VL) y cadena pesada variable (VH) hacen referencia a
estas cadenas ligera y pesada respectivamente.
Diversos procedimientos para la producción de
anticuerpos monoclonales son conocidos en la materia. Véase, p.ej.,
Goding, MONOCLONAL ANTIBODIES: PRINCIPLES AND PRACTICE, Academic
Press, 2ª edición (1986); y Harlow & Lane. Un anticuerpo
monoclonal dirigido contra, o reactivo con las células B, se
obtiene utilizando combinaciones de inmunógenos para inmunizar
ratones y el cribado posterior de los sobrenadantes de los
hibridomas contra las células que expresan el antígeno deseado, o
mediante ensayo de cribado diseñado específicamente para anticuerpos
monocolonales dirigidos contra el antígeno de interés. Las líneas
celulares de utilidad para el cribado de anticuerpos de esta
invención están disponibles o bien es posible obtenerlas. Dichas
células incluyen las líneas celulares de linfoma de Burkitt Daudi,
CA-46 y Raji.
El CD22, un antígeno de célula B de linaje
restringido y perteneciente a la superfamilia de las IgG, se expresa
en la superficie de muchos tipos de células B, incluyendo pero sin
limitarse a, las células de la leucemia linfocítica aguda
(B-ALL), del linfoma B crónico
(C-CLL), del linfoma B como el Burkitt, a los
linfomas asociados con el SIDA y a los foliculares y las leucemias
de células vellosas, así como los linfocitos B normales y maduros.
El CD22 no se expresa en etapas tempranas del desarrollo de la
célula B, ni tampoco se halla en la superficie de las células madre
o de las células plasmáticas en estadio terminal. Vaickus y col.,
Crit. Rev. Oncol. Hematol. 11:267-297 (1991).
Adicionalmente, no se detectó antígeno desnudo en el suero humano
normal ni en el suero de pacientes con CLL. Ll. y col., Cell
Immunol. 118.85-99 (1989).
El CD74, también conocido como la cadena
invariante asociada a la clase II MHC (II), se halló en células B,
macrófagos, y otras células positivas para la Clase II MHC. Además
de las células B malignas citadas anteriormente, el CD74 también se
halla en las células de neuroblastoma, melanoma y mieloma.
La producción de anticuerpos monoclonales
dirigidos contra, p.ej., células B se logra mediante: 1)
inmunización con células B humanas seguido del cribado de los
hibridomas resultantes por su reactividad contra una línea celular
no-humana transfectada con antígenos de células B
construidos de forma similar a la descrita en Nishomura, y col.,
Eur. J. Immunol. 18:747 (1988), que se ha incorporado aquí como
referencia; 2) inmunización con una línea celular no humana
(preferentemente autóloga al animal a inmunizar) transfectada con
antígenos de células B humanas mediante cribado de los hibridomas
resultantes por su reactividad contra una línea de células B
humanas; 3) inmunización con líneas celulares humanas o no humanas
que expresan antígenos de células B seguido por el cribado de los
hibridomas resultantes por su capacidad para bloquear la reactividad
de los anticuerpos monoclonales anti-células B con
una línea de células B humanas; 4) inmunización con líneas
celulares humanas o no humanas que expresan antígenos de células B
humanos seguido por el cribado de los hibridomas resultantes por su
reactividad con los antígenos de células B nativos purificados o
recombinantes; y 5) inmunización con un derivado recombinante de
antígenos de células B seguido por el cribado de los hibridomas
resultantes por su reactividad contra una línea de células B
humanas. Después de examinar esta descripción, los expertos en la
materia podrán utilizar otros procedimientos para la generación de
anticuerpos que pueden utilizarse en esta inven-
ción.
ción.
Las metodologías del DNA recombinante se utilizan
para sintetizar los anticuerpos preferidos de la presente
invención. Por ejemplo, un fragmento del anticuerpo preferido de
una inmunotoxina para utilizar en humanos es un "anticuerpo
humanizado" contra un antígeno de célula B que contiene regiones
determinantes de la complementariedad murinas (CDRs) combinadas con
las regiones de entramado de la región variable humana y las
regiones constantes humanas.
Las técnicas de humanización son bien conocidas
en la materia. Véase, por ejemplo, la solicitud de patente
internacional WO 87/02671; la patente americana U.S. 4.816.567; la
patente europea EP 0173494; Jones y col., Nature 321:522 (1986); y
Verhoeyen y col., Science 239:1534 (1988). La manipulación de las
CDR es una forma de lograr anticuerpos humanizados. Véase, por
ejemplo, Jones y col., Nature 321:522 (1988) y Riechmann, y col.,
Nature 332:323 (1988). Para un artículo de revisión sobre los
anticuerpos humanizados concernientes véase Winter y Milstein,
Nature 349:293 (1991).
Los fragmentos de anticuerpo de la presente
invención, además de estar humanizados, son anticuerpos de cadena
sencilla. En un aspecto de la presente invención, los anticuerpos
de cadena sencilla se clonaron a partir de líneas celulares de
hibridomas.
Las regiones Fv de anticuerpos monoclonales se
clonaron utilizando la misma estrategia general. De forma
característica, se realizó una transcripción inversa de los RNA
poli(A)+ extraídos de células de hibridomas utilizando
hexámeros aleatorios como cebadores. Los dominios VH y VL se
amplificaron separadamente por dos reacciones de la polimerasa en
cadena (PCR). Las secuencias de cadena pesada se amplificaron
utilizando cebadores 5' diseñados de acuerdo con las secuencias
proteicas amino-terminales de las cadenas pesadas,
y los 3' de acuerdo con las secuencias de la región constante de la
inmunoglobulina consenso (Kabat, y col., SEQUENCES OF PROTEINS OF
IMMUNOLOGICAL INTEREST, 5ª edición, Departamento de Salud y
Servicios Sociales de U.S., Servicio de Salud Pública, Institutos
Nacionales de la Salud, Bethesda, MD (1991). Las regiones Fv de
cadena ligera se amplificaron utilizando cebadores 5' diseñados de
acuerdo con las secuencias proteicas
amino-terminales de las cadenas ligeras y en
combinación con el cebador C-kappa. El experto en la
materia reconocerá que es posible utilizar otros cebadores
adecuados.
Los productos de PCR crudos se subclonaron en
vectores de clonaje adecuados, conocidos en la materia y disponibles
comercialmente. Se identificaron los clones que contenían el
inserto de DNA de tamaño correcto, por ejemplo, mediante
electroforesis en gel de agarosa. La secuencia nucleotídica de las
regiones codificantes de cadena ligera o pesada se determinaron a
partir del DNA plasmídico de doble cadena utilizando cebadores de
secuenciación adyacentes al sitio de clonaje. Los equipos
disponibles comercialmente (p.ej., el equipo de Sequenase®, United
States Biochemical Corp., Cleveland, OH) se utilizaron para
facilitar la secuenciación del DNA.
El experto en la materia apreciará que,
utilizando la información de la secuencia provista para las
regiones Fv, los ácidos nucleicos de estas secuencias se obtienen
utilizando varios procedimientos bien conocidos en la materia. Así,
el DNA que codifica las regiones Fv se puede preparar mediante el
procedimiento adecuado, incluyendo, por ejemplo, las técnicas de
amplificación como la reacción en cadena de la ligasa (LCR) (véase,
Wu & Wallace, Genomics 4:560 (1989), Landegren, y col., Science
241:1077 (1988) y Barringer, y col., Gene 89:117 (1990)), la
amplificación transcripcional (véase Kwoh y col., Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 86:1173 (1989)) y la replicación de la propia
secuencia (véase Guatelli y col., Proc Natl Acad Sci USA, 87: 1874
(1990), el clonaje y la restricción de las secuencias adecuadas o
la síntesis química dirigida por procedimientos como el
procedimiento del fosfotriéster de Narang, y col., Meth. Enzymol.
68:90 (1979); el procedimiento del fosfodiéster de Brown, y col.,
Meth. Enzymol. 68:109 (1979); el procedimiento del dietil
fosforamidita de Beaucage y col., Tetra. Lett. 22:1859 (1981); y el
procedimiento de soporte sólido de la patente americana U.S.
4.458.066.
Las secuencias de ácido nucleico que codifican
los anticuerpos de cadena sencilla se identifican mediante técnicas
bien conocidas en la materia (véase, Sambrook y col.) En resumen,
los productos de DNA descritos anteriormente se separan en un gel de
electroforesis. Los contenidos del gel se transfieren a una membrana
adecuada (p, ej., Hybond-N®, Amersham) y se
hibridan a una sonda adecuada en condiciones astringentes. La sonda
debe comprender una secuencia de ácido nucleico de un fragmento
incluido en la secuencia deseada.
Si la secuencia de DNA se sintetiza químicamente,
se generará un oligonucleótido de cadena sencilla. Éste se puede
convertir en un DNA de doble cadena mediante hibridación con una
secuencia complementaria, o mediante polimerización con una DNA
polimerasa utilizando la cadena sencilla como molde. Aunque es
posible sintetizar químicamente toda una región Fv de cadena
sencilla, es preferible sintetizar secuencias más cortas
(aproximadamente de 100 a 150 bases) que posteriormente se ligan
juntas.
Alternativamente, las subsecuencias pueden
clonarse y luego cortarse utilizando enzimas de restricción
adecuadas. Los fragmentos pueden ligarse a continuación para
producir la secuencia de DNA deseada.
Una vez obtenidos los DNA de las cadena variables
ligera y pesada Fv, es posible ligar juntas las secuencias, bien
directamente o a través de una secuencia de DNA que codifica un
engarce peptídico, utilizando técnicas bien conocidas por los
expertos en la materia. Así, la secuencia completa codifica el
dominio Fv en la forma de un anticuerpo de cadena sencilla.
Alternativamente, los anticuerpos dirigidos
contra las células B, por ejemplo, están disponibles comercialmente
por los proveedores de reactivos inmunológicos (por ejemplo,
AncellCorp., Bayport, MN (RFB4); Becton Dickinson, San Jose, CA; The
Binding Site, Inc., San Diego, CA; CalTag Laboratories, South San
Francisco, CA; Boehringer Mannheim Biochemicals, Indianapolis, IN;
Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ; y Zymed, Foster City, CA). El
RFB4 es un anticuerpo preferido de esta invención que ha sido
sorprendentemente eficaz en comparación con otros anticuerpos. Este
anticuerpo se ha caracterizado y descrito en una solicitud de
patente, registrada el 19 de marzo de 1998, por FitzGerald y col.,
"Recombinant RFB4 immunotoxins exhibit potent cytotoxic activity
for CD22 bearing cells and tumors", así como en Mansfield y
col., Bioconj. Chem. 7:557 (1996); Mansfield, y col., Biochem.
Soc. Trans. 25:709 (1997); y Mansfield y col., Blood 90:2020
(1997); todas incorporadas como referencias en esta
descripción.
Esta solicitud describe un nuevo uso de la
proteína onc de Rana pipiens. La proteína de onc de Rana
pipiens es una proteína esencialmente pura derivada de los
huevos y/o de embriones de Rana pipiens con un peso molecular
de aproximadamente 12.000 daltons mediante espectrometría de masas,
y un punto isoeléctrico de entre 9,5 y 10,5. También se ejemplifica
por un producto a veces referido aquí por el nombre de ONCONASE®,
disponible de Alfacell Corporation, Bloomfield, NJ.
Preferentemente para esta invención, las
proteínas onc son proteínas que tienen la secuencia aminoacídica de
la SEC ID nº 1.
La proteína onc utilizada en la presente
invención es única comparada con otras RNasas utilizadas en la
construcción de inmunotoxinas porque es un miembro monomérico de la
familia de la RNasa pancreática y es tóxica para ciertas células
cancerosas sin un ligando internalizante (véase la patente americana
5.559.212). Sin embargo, es un descubrimiento de la presente
invención que, cuando se conjuga con un anticuerpo dirigido a una
célula B, la citotoxicidad de la proteína onc aumenta dramáticamente
hasta 2000 veces. A pesar de esta citotoxicidad en las células
cancerosas, se espera que la toxicidad e inmunogenicidad del
paciente sea inferior debido a la eficiencia de esta inmunotoxina
determinada y a su pequeño tamaño.
Se entenderá por los expertos en la materia que
la SEC ID Nº 1 puede alterarse, siempre que no se afecten de forma
importante las ventajas funcionales de la secuencia aquí
proporcionada. Por ejemplo, se considera que la glicina y la
alanina son típicamente intercambiables al igual que el ácido
aspártico y glutámico por asparraguina y glutamina. Cualquiera de
estas modificaciones que mantengan las ventajas funcionales de la
secuencia están incluidas en la secuencia descrita en la SEC ID
Nº1.
Un ejemplo de proteína onc recombinante descrita
y reivindicada aquí se define en la SEC ID Nº 3. Las proteínas onc
recombinantes de la presente invención tienen una actividad
ribonucleolítica cuantificable, comparable a la de la proteína onc
nativa. Sin embargo, un experto en la materia reconocerá que muchas
de las variaciones distintas de secuencias onc codificarán proteínas
onc con aproximadamente la misma actividad ribonucleolítica
cuantificable que la proteína onc nativa.
Para una descripción de proteínas onc
recombinantes, las variantes de proteínas onc y las técnicas para
sintetizar proteínas onc recombinantes, véase la solicitud de
patente americana US 97/02588 que se ha incorporado aquí como una
referencia.
\newpage
\global\parskip0.880000\baselineskip
La molécula tóxica y el anticuerpo pueden
conjugarse mediante medios químicos o recombinantes (véase, Ryback y
col., Tumor Targeting 1:141 (1995)). Las modificaciones químicas
incluyen, por ejemplo, la derivación con el propósito de unir las
moléculas unas con otras, bien directamente o con un compuesto de
unión, por procedimientos que son bien conocidos en la materia de
química de proteínas. En la presente realización preferida de
conjugación química, los medios de unión de la molécula tóxica y la
molécula de reconocimiento comprenden un reactivo de acoplamiento
heterobifuncional que contribuye últimamente a la formación de un
enlace disulfuro intermolecular entre las dos porciones. Otros tipos
de reactivos de acoplamiento que se utilizan para la presente
invención se describen, por ejemplo, en la patente americana U.S.
4.54.985. Alternativamente, se puede formar un puente disulfuro
intermolecular entre las cisteínas de cada molécula, el cual sucede
de forma natural o se inserta mediante ingeniería genética. Los
medios de unión de las moléculas pueden también utilizar uniones
tioéter entre reactivos de unión heterobifuncionales o reactivos de
unión hidrolizables por un pH bajo específico o por engarces que se
corten por proteasas específicas u otras uniones químicas
hidrolizables o no. Los medios de las moléculas de unión de
inmunotoxinas también pueden comprender un enlace peptídico que se
forma entre moléculas que se sintetizan separadamente mediante
métodos químicos o recombinantes de síntesis peptídica estándar.
Las posibles modificaciones químicas de las
moléculas proteicas de la presente invención también incluyen la
derivación con polietilén glicol (PEG) para prolongar el tiempo de
permanencia en el sistema circulatorio y reducir la inmunogenicidad,
de acuerdo con procedimientos bien conocidos (véase por ejemplo,
Lisi y col., Applied Biochem. 4:19 (1982); Beauchamp, y col.,
Anal. Biochem. 131.25 (1982); y Goodson, y col., Biol/Technology
8:343 (1990)).
Las modificaciones posibles de ingeniería
genética de las proteínas de las inmunotoxinas incluyen la
combinación de los dominios funcionales relevantes de cada uno en
una proteína biosintética multi-funcional de cadena
sencilla expresada a partir de un gen derivado mediante técnicas
del DNA recombinante. (Véase, por ejemplo, la patente internacional
WO/88/09344). Además, pueden utilizarse técnicas del DNA
recombinante para unir la proteína onc recombinante y el anticuerpo.
Según ello, la inmunotoxina puede comprender una proteína fusionada
iniciándose en un extremo de la proteína onc y finalizando con el
anticuerpo.
Los procedimientos de producción de proteínas de
fusión recombinantes son bien conocidos por los expertos en la
materia. Así, por ejemplo, Chaudhary, y col., Nature 339:394
(1989); Batra, y col., J. Biol. Chem. 265:15198 (1990); Bata y
col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:8545 (1989); Chaudhary y col.,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:1066 (1990), incorporadas como
referencias, describen la preparación de diversas proteínas de
fusión anticuerpo de cadena sencilla-toxina.
En general, la producción de proteínas de fusión
implica la preparación por separado de las cadenas ligera y pesada
de Fv y del DNA que codifica la proteína onc a utilizar. Las dos
secuencias se combinan en un plásmido u otro vector para formar una
construcción que codifica la proteína de fusión deseada. Una
aproximación más simple implica la inserción del DNA que codifica
la región Fv particular en una construcción que codifique la
proteína onc deseada.
Así, por ejemplo, el DNA que codifica
inmunotoxinas de proteína onc/anticuerpo de cadena sencilla
anti-célula B se preparan más fácilmente mediante
inserción del DNA que codifica las cadenas de anticuerpo VH y VL
(región Fv) en las construcciones que ya contienen el DNA que
codifica la proteína onc deseada o vice versa. La secuencia de DNA
que codifica la región Fv se inserta en la construcción utilizando
técnicas bien conocidas por los expertos en la materia.
Las células de mamífero se han utilizado para
expresar y secretar moléculas híbridas como las
citocinas-anticuerpos (Hoogenboom, y col., Biochem.
Biphys. Acta 1096:345(1991), Hoogenboom, y col., Mol.
Immunol. 28:1027 (1991)) y anticuerpo-enzima
(Casadei, y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2047 (1990);
Williams y col., Gene 43:319 (1986)). En parte, la inmunogenicidad
de las proteínas foráneas es debida a los patrones de glicosilación
incorrectos presentes en proteínas recombinantes. En consecuencia,
se prefieren las líneas celulares eucariotas a las células
procariotas ya que las proteínas expresadas están glicosiladas. Se
prefieren en particular las líneas celulares derivadas de humanos
en las que se incorpora un ácido siálico como el glicósido terminal.
Las líneas celulares como las de CHO y BHK, así como la línea de
fibroblastos HEK-293 humana se han utilizado para
expresar proteínas humanas recombinantes.
Otras modificaciones de ingeniería genética de
las moléculas proteicas de las inmunotoxinas de la presente
invención incluyen deleciones de dominios no necesariamente
funcionales para reducir el tamaño de la proteína o para modificar
otros parámetros que faciliten la producción o la utilidad, como por
ejemplo los cambios de secuencia que afectan la solubilidad (p.ej.,
cisteína a serina) o los sitios de glicosilación. Un experto en la
materia apreciará que muchas modificaciones conocidas químicas y
genéticas de las proteínas pueden aplicarse de forma ventajosa a
cualquier proteína que, al igual que el reactivo citotóxico
presente, se pretenda administrar por vía parenteral.
Las inmunotoxinas preferidas de la presente
invención son proteínas de fusión que contienen como molécula
tóxica una proteína que tiene la secuencia aminoacídica de SEC ID
Nº:1, y un anticuerpo humanizado que se une a un marcador de
superficie celular específico en la célula de interés (más
preferentemente contra las células B). La construcción de esta
unión genética única de la proteína de fusión entre la proteína onc
y el anticuerpo elimina la heterogeneidad de los conjugados de
anticuerpo/proteína onc unidos químicamente. Esto, se cree que
puede contribuir a aumentar la potencia y disminuir la
inmunogenicidad de la inmunoxina.
\global\parskip0.990000\baselineskip
La invención incluye las construcciones de ácido
nucleico que codifican proteínas nuevas descritas aquí. Una
construcción de ácido nucleico es una construcción tal que, cuando
se incorpora en un vector adecuado, es capaz de replicarse en un
huésped. Las construcciones pueden unirse a otras secuencias
capaces de afectar la expresión de la construcción, como los
promotores e intensificadores.
La inmunotoxina de la presente invención puede
utilizarse para eliminar selectivamente las células tumorales. Este
procedimiento se basa en la selección adecuada de un anticuerpo que
se une a los marcadores de superficie celular hallados específica o
predominantemente en dicho tipo celular que se ha de eliminar
selectivamente. Por ejemplo, la inmunotoxina de la presente
invención incluye las que comprenden un anticuerpo que se une a un
marcador de superficie de célula tumoral específico, muchos de los
cuales son bien conocidos en la materia. En la realización preferida
para una aplicación humana, el anticuerpo es una proteína de cadena
sencilla humana, o una forma modificada de lo mismo, que
preferentemente se une a las células B, y es indicativo de su
malignidad.
La presente invención también hace referencia a
una composición farmacéutica que comprende inmunotoxinas de la misma
invención en un vehículo farmacéuticamente aceptable. En
aplicaciones terapéuticas, las composiciones se administran a un
paciente que sufre de una enfermedad, en una cantidad suficiente
para curar o al menos parar parcialmente la enfermedad y sus
complicaciones. Una cantidad adecuada para lograr dicho objetivo se
define como una dosis efectiva terapéuticamente. Las cantidades
efectivas para dicho uso dependerán de la gravedad de la enfermedad
y del estado general de la salud del paciente.
Ventajosamente, la composición farmacéutica es
adecuada para la administración parenteral. Las inmunotoxinas de la
presente invención pueden administrarse mediante diversos
procedimientos con distintos propósitos, por ejemplo, para el
tratamiento de tumores en diversas partes del cuerpo, de acuerdo con
los procedimientos conocidos en la materia para otras
inmunotoxinas. (Véase, por ejemplo, Rybak y col., Human Cancer
Immunology, en IMMUNOLOGY AND ALLERGY CLINICS OF AMERICA, W. B.
Saunders, 1990, y las referencias allí citadas). Según ello, la
presente invención también hace referencia a composiciones
farmacéuticas que comprenden una inmunotoxina de la presente
invención y un vehículo aceptable farmacéuticamente, en particular
aquellas composiciones que son adecuadas para los procedimientos de
administración anteriores.
Las administraciones únicas o múltiples de las
composiciones pueden administrarse dependiendo de la dosificación y
frecuencia según la tolerancia y necesidad de cada paciente.En
cualquier caso, la composición debería proporcionar una cantidad
suficiente de proteínas de la presente invención para tratar
efectivamente al paciente.
Preferentemente, las composiciones para la
administración comprenderán una solución de la proteína de fusión
que comprende el anticuerpo de cadena sencilla y la proteína onc
disuelta en un vehículo farmacéuticamente aceptable,
preferentemente unvehículo acuoso. Se pueden utilizar diversos
vehículos acuosos, p.ej., un tampón salino. Estas soluciones son
estériles y generalmente están libres de materiales no deseables.
Estas composiciones pueden esterilizarse mediante técnicas de
esterilización convencionales y bien conocidas en la materia. Las
composiciones pueden contener sustancias aceptables
farmacéuticamente como las requeridas en las condiciones
fisiológicas como el ajuste de pH y agentes tamponantes, los
agentes de ajuste de toxicidad y similares, por ejemplo, el acetato
sódico, el cloruro sódico, el cloruro potásico, el cloruro cálcico,
el lactato sódico y similares. La concentración de la proteína de
fusión en estas formulaciones puede variar ampliamente y se
seleccionará en principio según los volúmenes del líquido, la
viscosidad, el peso corporal y otras características, de acuerdo
con el modo particular de administración seleccionada y de las
necesidades del paciente.
Así, una composición farmacéutica típica para la
administración intravenosa sería de 0,01 a 100 mg por paciente y
día. Las dosificaciones desde 0,1 a 1000 mg por paciente y día
pueden utilizarse, en particular cuando el fármaco se administra a
un sitio determinado y no a la circulación sanguínea, como en un
tumor o un órgano en el que reside el tumor. Los procedimientos
actuales para la preparación de composiciones administrables
parenteralmente son conocidos y serán evidentes a los expertos en la
materia, y se describen con mayor detalle en las publicaciones como
REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCE, 15ª Edición, Mack Publishing
Co., Easton, PA (1980).
Además, la presente invención hace referencia a
un procedimiento de eliminación selectiva de células utilizando una
inmunotoxina selectiva de la invención que tiene un anticuerpo
específico para una diana en la superficie de las células a eliminar
en las condiciones que permiten la unión del anticuerpo. La unión
del anticuerpo al marcador de superficie en una célula causa que la
proteína onc del reactivo elimine selectivamente la célula. Este
procedimiento de la presente invención puede utilizarse para la
separación celular in vitro mediante eliminación selectiva de
los tipos celulares no deseados, por ejemplo, en la médula ósea
antes del trasplante a un paciente que sufre ablación de la médula
por irradiación.
En los siguientes ejemplos no limitantes, la
presente invención se ejemplifica por una inmunotoxina en la que la
molécula tóxica es la ONCONASE® y los anticuerpos reconocen células
tumorales, en particular, células B.
Las técnicas que describen el aislamiento de los
oocitos de Rana pipiens, la fertilización in vitro de
los huevos, y el aislamiento y purificación de una proteína onc
nativa de embriones de rana se detallan en las patentes americanas
U.S. 5.539.212 y 5.728.805, que se han incorporado aquí como
referencias.
La producción de la proteína onc recombinante se
realizó tal como se describe en la patente americana US 97/02588. La
actividad ribonucleolítica se determinó utilizando RNA y tRNA de
alto peso molecular según los protocolos publicados, Newton, y
col., J. Neurosci. 14:538 (1994) a 37ºC tras la formación de
nucleótidos solubles en ácido perclórico (véase, Newton, y col.,
Biochem. 35:545 (1996)). Se ensayó la actividad ribonucleasa con
poli(A,C), UpG y poliU espectrofotométricamente de acuerdo
con Libonati y col., Biochem. et Biophys. Acta 788:356 (1984) y
Libonati y Floridi, Eur. J. Biochem. 8:81 (1969). En resumen, la
actividad se ensayó cuantificando el aumento de la absorbancia a 260
nm. Las mezclas de incubación contenían el sustrato y cantidades
adecuadas de Solución enzimática a 25ºC (1 ml de imidazol 1 mM,
NaCl 0,1 M, pH 6,5 o pH 7). El ensayo de traducción in vitro
(St. Clair, y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:8330 (1987)), y
los ensayos de viabilidad celular (Pearson y col., J. Natl. Cancer
Inst. 83:1386 (1991)), utilizando el procedimiento del MTT de
Mossman se realizaron tal como se describió anterior-
mente.
mente.
La proteína onc nativa descrita anteriormente ha
sido bien caracterizado químicamente. Para ser tan funcional como la
nativa, se cree que la proteína onc recombinante debería tener las
características químicas y estructurales descritasmás abajo.
La proteína onc nativa se purificó a homogeneidad
(tal como se estableció mediante tests estándares utilizados para
el ensayo de homogeneidad de proteínas). Mediante electroforesis,
el peso molecular de la proteína onc nativa se determinó a
aproximadamente 14.500 daltons. El cálculo del peso molecular de
acuerdo con la secuencia aminoacídica (véase, infra) indicó que el
peso molecular de la proteína onc nativa debería ser de 11.000
daltons. Sin embargo, ya que iones metálicos podrían estar unidos a
la proteína a pesar de todos los esfuerzos por eliminarlos, y
porque diferentes isótopos podrían estar implicados, el peso
molecular de la proteína onc nativa fue de 12.430 daltons, tal como
se determinó mediante espectroscopía de masas, en vista de la
discrepancia, el peso molecular del fármaco determinado por
espectrometría de masas se consideró de aproximadamente 12.000
daltons. El punto isoeléctrico (pI) de la proteína onc nativa se
halló entre 9,5 y 10,5, tal como se determinó mediante
isoelectroenfoque. El grupo amino terminal de la proteína onc se
bloqueó y se halló que estaba libre de carbohidratos (según se
determinó por procedimientos antrone y orcinol).
La Tabla 1 indica la composición aminoacídica de
la proteína onc nativa.
\vskip1.000000\baselineskip
| Análisis aminoacídico de la proteína onc nativa | |
| Residuo aminoacídico | % mol (hidrólisis de 24 h ácida) |
| Ácido aspártico/asparraguina | |
| Treonina | (nota 1) |
| Serina | |
| Ácido glutámico/Glutamina | |
| Prolina | |
| Glicina |
| Residuo aminoacídico | % mol (hidrólisis de 24 h ácida) |
| Alanina | |
| Cisteína/2 | (nota 1) |
| Valina | |
| Metionina | (nota 1) |
| Isoleucina | (nota 2) |
| Leucina | |
| Tirosina | |
| Fenilalanina | |
| Histidina | |
| Lisina | |
| Arginina | |
| Triptófano | No determinado (nota 3) |
| Total aproximado | 99,97% |
| \begin{minipage}[t]{145mm} Nota 1: La treonina, la cisteína/2 y la metionina están parcialmente destruidas durante la hidrólisis, por lo que este valor es parcialmente incorrecto.\end{minipage} | |
| \begin{minipage}[t]{145mm} Nota 2: El triptófano no se pudo detectar en la hidrólisis ácida de proteínas porque se destruyó y en consecuencia el valor no está determinado. Sin embargo, el análisis del espectro ultravioleta demostró la presencia de un residuo triptófano por molécula.\end{minipage} | |
| Composición aminoacídica (calculado a partir de la secuencia aminoacídica) | |
| Aminoácido | Aprox. % de residuos (por molécula |
| de proteína ONC NATIVA) | |
| Ácido aspártico | |
| Asparraguina | |
| Treonina | |
| Serina | |
| Ácido glutámico | |
| Ácido piroglutámico | |
| Glutamina | |
| Prolina | |
| Glicina |
| Aminoácido | Aprox. % de residuos (por molécula |
| de proteína ONC NATIVA) | |
| Alanina | |
| Cisteína/2 | |
| Valina | |
| Metionina | |
| Isoleucina | |
| Leucina | |
| Tirosina | |
| Fenilalanina | |
| Histidina | |
| Lisina | |
| Arginina | |
| Triptófano | |
| Total aproximado | 104 |
\vskip1.000000\baselineskip
La proteína onc nativa se ha secuenciado. El
extremo N-terminal de la proteína nativa es el ácido
piroglutámico (<Glu). Este se ha derivado del ácido glutámico, a
quien se le ha desprovisto del grupo amino libre necesario para la
secuenciación directa y en consecuencia bloquea el extremo
N-terminal de la proteína. El grupo
amino-terminal de la molécula se ha alterado para
facilitar la producción recombinante de la molécula tal como se
indica en la patente americana US 97/02588. La secuencia
aminoacídica preferida de la RNasa citotóxica se muestra en
la
SEC ID Nº:1.
SEC ID Nº:1.
La ONCONASE® (anteriormente denominada
p-30) se proporcionó por AlfacellCorp. como una
proteína liofilizada y se disolvió en tampón fosfato salino (PBS).
Las soluciones salinas de al menos 1 mg/ml se guardaron congeladas a
-20ºC hasta que las diluciones se prepararon para los ensayos.
Todos los otros reactivos se obtuvieron de fuentes descritas con
anterioridad (Rybak y col., J. Biol. Chem. 266:2102 (1991);
Newton, y col., J. Biol. Chem. 267:19572 (1992); Mikulski, y col.,
Cell Tissue Kinet, 23:237 (1990)), incorporadas aquí como
referencias.
El LL2 es un anticuerpo murino monoclonal que
reconoce y se une específicamente a CD22 en las células B humanas.
El anticuerpo LL2 se proporcionó por Immunomedics, Inc. (Moris
Plans, NJ). El RFB4 es también un anticuerpo monoclonal murino que
se une al CD22. Este anticuerpo está disponible de muchas fuentes,
incluyendo Acell Corp.
Se crecieron tres líneas de linfoma de Burkitt
(Daudi (ATCC CCL 213), CA 46 (ATCC CRL 1648), y Raji (ATCC CCL86))
en medio RPMI 1640 con suero fetal al 10% (FCS), glutamina 2 mM,
piruvato sódico 1 mM y gentamicina 10 \mug/ml. También se creció
una línea celular de linfoma de células T cutánea, HUT 102 (ATCC TIB
162) en medio RPMI suplementado. Todas las células se incubaron a
37ºC en atmósfera humidificada al 5% de CO_{2}.
Los conjugados unidos a disulfuro se prepararon
tal como se describe en Newton y col., J. Biol. Chem. 267:19572
(1992), con las siguientes modificaciones. El anticuerpo (12,5
nmol) se incubó con 250 nmol de 2-iminotiolano y 2,5
mM de 5,5'ditiobis(ácido 2-nitrobenzoico) (DTNB) en
borato sódico 100 mM, pH 8,5 a temperatura ambiente durante 1 hora
a un volumen final <0,5 ml. La mezcla de reacción se aplicó a una
columna de PD-10® (Pharmacia Biotech, Piscataway,
NJ) equilibrada con tampón A (NaPO4 0,1 M, pH 7,4 que contenía NaCl
0,1 M).
SPDP-ONCONASE® modificada
(0,9-1,2 mol de A-succinimidil 3
(2-piriditio) propionato (SDP)/mol ONCO-
NASE® se preparó tal como se describe (Newton y col., (1992) supra). La SPDP-ONCONASE® modificada (340 nM) se redujo durante 1 h a temperatura ambiente con ditiotreitol (DTT) a una concentración final de 2 mM y se filtró en gel en una columna de PD-10® equilibrada con tampón A para eliminar el exceso de DTT. La ONCONASE® modificada se añadió al anticuerpo modificado y la reacción se incubó a temperatura ambiente. La ONCONASE® fue de al menos un exceso molar de 10 veces el anticuerpo.
NASE® se preparó tal como se describe (Newton y col., (1992) supra). La SPDP-ONCONASE® modificada (340 nM) se redujo durante 1 h a temperatura ambiente con ditiotreitol (DTT) a una concentración final de 2 mM y se filtró en gel en una columna de PD-10® equilibrada con tampón A para eliminar el exceso de DTT. La ONCONASE® modificada se añadió al anticuerpo modificado y la reacción se incubó a temperatura ambiente. La ONCONASE® fue de al menos un exceso molar de 10 veces el anticuerpo.
Los conjugados unidos a tioeter se prepararon de
acuerdo con Rybak y col., Drug Delivery 1:3 (1993) y Newton y
col., Int. J. Oncology 8:1095 (1996) utilizando
M-maleimidobenzoil-N-hidroxisuccinimida
ester (MBS). En resumen, el anticuerpo LL2 (2 mg) se incubó con un
exceso molar de 5 veces de MBS (solución madre, 30 mM en DMF)
durante 10 min a temperatura ambiente. Los contenidos de la reacción
se aplicaron a una columna de PD-10® equilibrada
con tampón A. Las fracciones del pico (1,5 ml) se agruparon. La
SPDP-ONCONASE® modificada se dializó contra acetato
sódico 0,1 M, pH 4,5, que contenía NaCl 0,1 M, seguido de la
incubación con DTT 25 mM (concentración final) durante 30 min a
temperatura ambiente. Los contenidos de la reacción se aplicaron a
una columna de PD-10® equilibrada con tampón A y las
fracciones de los picos se agruparon y añadieron al anticuerpo MBS.
La reacción se incubó a temperatura ambiente durante la noche. La
ONCONASE® estuvo presente en un exceso molar \geq 10 veces el
anticuerpo. Los conjugados se separaron de ONCONASE® no reaccionada
mediante filtración en gel en una columna de HPLC
TSK-3000® (Toso-Haas).
La cantidad de proteína presente en la
preparación se determinó mediante espectroscopía UV según la ley de
Beer [A = \epsilon(conc.)] con los siguientes coeficientes
de extinción a 277 nm: ONCONASE®, \epsilon(1%)=7,3; e
inmunotoxinas, \epsilon (1%) = 10.
Los moles del conjugado de ONCONASE® conjugada
con el anticuerpo se determinaron en electroforesis en gel de las
inmunotoxinas reducidas junto con los estándares de ONCONASE® y el
anticuerpo. El gel se analizó utilizando Image (software de dominio
público del NIH).
El análisis de las inmunotoxinas de ONCONASE® por
electroforesis en gel de poliacrilamida en condiciones reductoras
demostró que las proteínas componentes se regeneraron después de la
reducción. En condiciones no reductoras, los conjugados de
anticuerpos consistieron en múltiples formas de diversos pesos
moleculares. La reactividad de los grupos de unión en la reacción
de intercambio de tiol-disulfuro puede explicar la
heterogeneidad del conjugado. Las inmunotoxinas contenían
1-2 moles de ONCONASE®/mol de anticuerpo. Por el
contrario, las inmunotoxinas purificadas no contenían cantidades
significativas de anticuerpo libre, según el análisis por
electroforesis en gel, presuntamente porque un exceso molar \geq10
veces de ONCONASE® produjo esencialmente únicamente inmunotoxina y
no anticuerpo libre.
Las inmunotoxinas de
RFB4-ONCONASE® se prepararon tal como se describió
anteriormente. Dado que RFB4 reconoce CD22, las inmunotoxinas que
contienen RFB4 son también citotóxicas para las células B malignas.
Así, los experimentos descritos más adelante pueden también
realizarse con RFB4-ONCONASE®.
La síntesis de proteínas se cuantificó tal como
se describe en Rybak y col., J. Biol. Chem. 266:2102 (1991). El
mismo protocolo se utilizó para cuantificar la síntesis de RNA,
excepto que durante el crecimiento de las células se añadió un pulso
de 3 \mul de Uridina[H^{3}]. El número de células se
determinó mediante contaje directo con un hemocitómetro. Una
alícuota de células se incubó durante 5 minutos con un volumen
igual de Trypan Blue al 0,5%, colorante de exclusión, y se estimaron
las células viables. El ensayo colorimétrio MTT (Mossman, T. J.
Immunol. Methods 65:55 (1983)) se realizó tal como se describe en
Mikulski y col., (Cell Tissue Kinet, 23:237 (1990)).
El IC50 para la inhibición de la síntesis de
proteínas en las células del linfoma de Burkitt por las
inmunotoxinas de ONCONASE® se presenta en la Tabla 4.
| Inhibición de la síntesis de proteínas por las inmunotoxinas de ONCONASE® | ||
| Línea celular | IC50 | |
| ONCONASE® | LL2-ONCONASE® | |
| Daudi | ||
| CA46 | ||
| Raji | ||
| HUT 102 |
Las concentraciones de la inmunotoxina que
inhibieron la síntesis de proteínas al 505 en las células B al cabo
de 24 h estuvieron en el rango picomolar comparado con el rango
nanomolar para la inmunotoxina LL2-ONCONASE® pero
fueron menos sensibles con la ONCONASE® no conjugada con las líneas
celulares B. Véase la Figura 1.
Como puede verse en la Figura 2, la ONCONASE®
sola no fue citotóxica para las células de linfoma B al cabo de 24
horas comparada con la ONCONASE® conjugada con el anticuerpo LL2.
Por ello, la ONCONASE® conjugada con anticuerpos capaces de
internalizarse fue más potente que la ONCONASE® no conjugada.
Además de ser más eficaz que la ONCONASE® sola,
las Figuras 3 y 4 demuestran que las inmunotoxinas de ONCONASE®
fueron mucho más eficaces que las inmunotoxinas en las que la
molécula tóxica fue una RNasa no tóxica humana, la neurotoxina
derivada de eosinófilos (EDN) (Figura 3) o una RNasa pancreática
humana (Figura 4).
En la Figura 5, los anticuerpos LL2 o LL1 se
conjugaron con EDN tal como se describió anteriormente y se analizó
en las células del linfoma de Burkitt, Daudi o CA. Se cree que las
inmunotoxinas LL1 y LL2 se liberan a los lisosomas si la
inmunotoxina se degrada en moléculas de anticuerpo y RNasa. Los
niveles de RNasa dejan los lisosomas y entran en el citosol donde
interfieren con la actividad ribosomal. De los resultados mostrados
en la Figura 5, se postuló que la ONCONASE® es aproximadamente 2.000
veces más activa que el EDN porque la ONCONASE® no se inactiva por
degradación lisosomal. En consecuencia, la proteína que entra en el
citosol es una citotoxina intacta.
En la Figura 4, se comparó la
LL2-ONCONASE® con la LL2-RNasa
pancreática. De nuevo, a concentraciones de aproximadamente 1 nM, la
LL2-ONCONASE® bloqueó completamente la síntesis de
proteínas. A la misma concentración, sólo aproximadamente el 75% de
síntesis proteica se ha bloqueado por adición de
LL2-RNasa pancreática.
Para analizar la hipótesis de que la ONCONASE® no
se era degradada por los lisosomas, produciéndose un aumento de la
inhibición de la síntesis proteica y de la citotoxicidad, se
añadieron las inmunotoxinas-LL2 maracadas con
I^{125} a las células Daudi. Como se puede ver en la Figura 5,
después de un período de tiempo, las células tratadas con
LL2-ONCONASE® contenían más proteína marcada con
I^{125} en sus lisados, indicando que la inmunotoxina se degradó
a una velocidad más lenta que la LL2-EDN y
LL2-sola. Por ello, parece ser que la ONCONASE® no
se degradó en los lisosomas.
Para analizar la hipótesis de que CD22 media la
toxicidad de las inmunotoxinas de ONCONASE® mediante unión de la
porción de anticuerpo de la proteína híbrida, las inmunotoxinas se
analizaron en presencia de un exceso de anticuerpo LL2 (Fig. 4). La
citotoxicidad observada en las células Daudi al cabo de 24 horas en
presencia de inmunotoxinas ONCONASE® se invirtió por una cantidad
equimolar de LL2. Estos resultados muestran que CD22 puede mediar la
citotoxicidad de la ONCONASE® de las células del linfoma de
Burkitt.
Para analizar el efecto de la
LL2-ONCONASE® in vivo, se implantaron células
Daudi en ratones SCID. Un día más tarde, los ratones se trataron con
ONCONASE® y LL2-ONCONASE®, exotoxina
LL2-Pseudomonas e inmunotoxinas
LL2-doxorubicina.
Como puede verse en la Tabla 5, la
LL2-ONCONASE® no causó efectos secundarios
citotóxicos (muerte) en los ratones. Como comparación, los ratones
se trataron con LL2 conjugada con un mutante del dominio II de la
exotoxina de Pseudomonas. Como puede verse, la inmunotoxina fue
letal. Por ello, parece ser que la ONCONASE como la molécula tóxica
de una inmunotoxina no es tóxica para el animal tratado y en
consecuencia podría ser tolerada mejor como fármaco terapéutico.
| Citotoxicidad in vivo de las inmunotoxinas LL2-ONCONASE | ||
| Toxicidad en ratones | ||
| Programa de Dosis | Dosis total (\mug) | Muertes/total |
| LL2-PE38KDEL* | ||
| 80 \mug i.p. x 1 | 80 | 2/2 |
| 35 \mug i.p. QD x 1 | 140 | 2/2 |
| LL2-ONCONASE | ||
| 100 \mug i.p. x 1 | 100 | 0/3 |
| 100 \mug i.p. QOD x 5 | 0/3 | |
| 100 \mug i.p. QDx5 | 0/3 | |
| 500 \mug i.p. x 1 | 0/3 | |
| * Kreitman, y col., Cancer Res. 53:819 (1993) | ||
| QD = diariamente | ||
| QOD = cada día distinto |
\vskip1.000000\baselineskip
La Tabla 6 muestra los efectos de la
LL2-ONCONASE® y la LL2-doxorubicina
en los ratones SCID implantados von células Daudi. Se implantaron
los ratones con 5x10 células Daudi intravenosamente. Después de 24
horas, el tratamiento se inició con 5 dosis iguales diarias. La
inmunotoxina doxorubicina se inyectó intravenosamente y la
inmunotoxina ONCONASE® se inyectó intraperitonealmente. Como puede
verse, por el peso, casi la mitad de la cantidad de
LL2-ONCONASE® aumentó considerablemente la
supervivencia de los ratones comparado con la doxorubicina, un
reactivo quimioterapéutico sistémico.
\vskip1.000000\baselineskip
| Tratamiento en los ratones SCID con linfoma diseminado de Daudi | ||
| Inmunotoxina | Dosis total | % de ratones con supervivencia |
| aumentada respecto al | ||
| anticuerpo solo | ||
| LL2-doxorubicina | 9000 \mug | 0 |
| LL2-ONCONASE® | 500 \mug | 40% |
En los ratones implantados intravenosamente con
5x10^{6} células de linfoma B de Daudi, la
LL2-ONCONASE® inyectada intraperitonealmente
demostró que prolongaba las vidas de los ratones en comparación con
los ratones tratados con tampón fosfato salino (PBS) o con el
anticuerpo monoclonal LL2 solo. La Figura 7 muestra que todos los
animales tratados con PBS desarrollaron un linfoma de células B
severo y se sacrificaron el día 35. Todos los animales tratados con
LL2 se sacrificaron el día 37 debido al linfoma. Por otra parte,
todos los animales tratados con la inmunotoxina sobrevivieron al día
37. El último animal tratado con la inmunotoxina se sacrificó el
día 46.
La Figura 8 muestra que los ratones SCID
implantados peritonealmente con 2x10^{6} células Daudi y luego
tratados con 500 \mug de LL2-ONCONASE®
intraperitonealmente, 100 \mug por dosis diaria, sobrevivieron
durante más de 100 días. La cohorte de animales tratados con PBS y
los tratados con LL2 y ONCONASE® no conjugadas mostraron alguna
indicación de enfermedad en dicho intervalo de tiempo. El tiempo
medio de supervivencia para el grupo control con PBS fue de 71
días, para el grupo LL2 + ONCONASE®, el tiempo medio de
supervivencia fue de 80 días y para los ratones tratados con
LL2-ONCONASE® de 112 días.
Por último, la Figura 9 indica que
LL2-ONCONASE® es menos tóxica que la ONCONASE® sola
o la RFB4-cadena A de la ricina desglicosilada.
Comparada con una dosis letal de 30 mg/Kg de ONCONASE®, el ratón
tratado con 300 mg/Kg de LL2-ONCONASE® no sólo
sobrevivió sino que ganó peso durante el curso del experimento. La
RFB4, cuando se conjugó con un fragmento de exotoxina de
Pseudomonas, tenía un LD_{50} de 1 mg/Kg en un modelo murino en
donde la inmunotoxina se administró únicamente una vez al día
(Mansfield y col., Bioconj. Chem. 7.557 (1996)).
Estos resultados in vivo indican que la
LL2-ONCONASE® es una toxina de células B superior a
la ONCONASE® sola, LL2 sola y las inmunotoxinas de
LL2-exotoxina de Pseudomonas y
LL2-doxorubicina. Los estudios de toxicidad muestran
que la LL2-ONCONASE® se tolera bien con pocos, sino
ninguno, efectos secundarios.
Todas las publicaciones, incluyendo las patentes
y las solicitudes de patentes, mencionadas aquí anteriormente se han
incorporado como referencias.
La presente invención se ha descrito en ciertos
aspectos con el propósito de facilitar su comprensión. Será
evidente a partir de estos ejemplos que pueden realizarse diversas
combinaciones en la forma y detalle sin desviarse del ámbito de la
invención.
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(Secuencia pasa a página
siguiente)
Claims (21)
1. Reactivo citotóxico selectivo que comprende
una proteína onc que tiene actividad ribonucleolítica cuantificable
y unida a un anticuerpo dirigido contra un marcador específico de
una célula B.
2. Reactivo de acuerdo con la reivindicación 1,
en donde la proteína onc tiene la secuencia aminoacídica de la SEC
ID NO:1.
3. Reactivo de acuerdo con la reivindicación 1,
en donde la proteína onc se produce mediante medios
recombinantes.
4. Reactivo de acuerdo con la reivindicación 3,
en donde la proteína onc tiene la secuencia aminoacídica SEC ID
NO:3.
5. Reactivo de acuerdo con la reivindicación 3,
en donde la proteína onc está codificada por la molécula de ácido
nucleico identificada como la SEC ID NO:2.
6. Reactivo de acuerdo con la reivindicación 1,
en donde el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.
7. Reactivo de acuerdo con la reivindicación 6,
en donde el anticuerpo monoclonal está humanizado.
8. Reactivo de acuerdo con la reivindicación 7,
en donde el anticuerpo monoclonal es un anticuerpo de cadena
sencilla.
9. Reactivo de acuerdo con la reivindicación 7,
en donde el anticuerpo es específico para linfomas de células
B.
10. Reactivo de acuerdo con la reivindicación 9,
en donde el anticuerpo es el RFB4.
11. Reactivo de acuerdo con la reivindicación 9,
en donde el anticuerpo es el LL2.
12. Reactivo de acuerdo con la reivindicación 1,
en donde el marcador de superficie celular es el CD22.
13. Reactivo de acuerdo con la reivindicación 1,
en donde el marcador de superficie celular es el CD74.
14. Reactivo de acuerdo con la reivindicación 13,
en donde el anticuerpo es el LL1.
15. Reactivo de acuerdo con la reivindicación 1,
en donde la proteína onc está conjugada con el anticuerpo mediante
fusión recombinante.
16. Secuencia de ácido nucleico que codifica el
reactivo de la reivindicación 1.
17. Composición farmacéutica que comprende el
reactivo citotóxico selectivo de cualquiera de las reivindicaciones
1 a 11 o de la reivindicación 15 junto con un vehículo
farmacéuticamente aceptable.
18. Composición farmacéutica de acuerdo con la
reivindicación 17 y la reivindicación 9, en donde el anticuerpo es
el LL1.
19. Reactivo citotóxico de acuerdo con cualquiera
de las reivindicaciones 1 a 15 o la reivindicación 12 para utilizar
en un procedimiento de eliminación de células B malignas.
20. Reactivo citotóxico recombinante y selectivo
que comprende una proteína onc que tiene una actividad
ribonucleolítica cuantificable unida a un anticuerpo dirigido
contra CD74, para utilizar en un procedimiento de eliminación de
células malignas que expresan el marcador de superficie celular
CD74.
21. Reactivo citotóxico de acuerdo con la
reivindicación 20, en donde las células a eliminar se seleccionan
del grupo que consiste en neuroblastoma, melanoma y mieloma.
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Families Citing this family (93)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6653104B2 (en) * | 1996-10-17 | 2003-11-25 | Immunomedics, Inc. | Immunotoxins, comprising an internalizing antibody, directed against malignant and normal cells |
| US6306393B1 (en) * | 1997-03-24 | 2001-10-23 | Immunomedics, Inc. | Immunotherapy of B-cell malignancies using anti-CD22 antibodies |
| DE69833876T2 (de) * | 1997-11-10 | 2007-05-24 | Cytimmune Sciences, Inc. | Zusammensetzungen und verfahren für die gezielte abgabe von faktoren |
| DE69925817T2 (de) * | 1998-03-11 | 2006-05-18 | Immunomedics, Inc. | Rekombinante onconase und fusionsproteine davon |
| CA2324646A1 (en) * | 1998-03-27 | 1999-10-07 | The Government Of The United States Of America As Represented By The Sec Retary Of The Department Of Health And Human Services | Recombinant anti-tumor rnase |
| EP1277838A1 (en) * | 1998-03-27 | 2003-01-22 | THE GOVERNMENT OF THE UNITED STATES OF AMERICA as represented by the SECRETARY OF THE DEPARTMENT OF HEALTH AND HUMAN SERVICES | Recombinant anti-tumor RNASE |
| US6869604B1 (en) | 1998-03-27 | 2005-03-22 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services | Recombinant anti-tumor RNAse |
| US8383081B2 (en) * | 1999-05-10 | 2013-02-26 | Immunomedics, Inc. | Anti-CD74 immunoconjugates and methods of use |
| US8119101B2 (en) | 1999-05-10 | 2012-02-21 | The Ohio State University | Anti-CD74 immunoconjugates and methods of use |
| US7829064B2 (en) | 1999-05-10 | 2010-11-09 | Immunomedics, Inc. | Anti-CD74 immunoconjugates and methods |
| EP1194167B1 (en) * | 1999-06-09 | 2009-08-19 | Immunomedics, Inc. | Immunotherapy of autoimmune disorders using antibodies which target b-cells |
| DE60236921D1 (de) * | 2001-03-29 | 2010-08-19 | Cytokine Pharmasciences Inc | Verfahren und zusammensetzungen zur verwendung von mhc-klasse ii-invariante-kette-polypeptid als rezeptor für makrophagenwanderung-hemmfaktor |
| MXPA03010747A (es) | 2001-05-25 | 2004-03-02 | Human Genome Sciences Inc | Anticuerpos que se unen inmunoespecificamente a receptores de ligando inductor de apoptosis relacionado con factor de necrosis tumoral. |
| US7053188B2 (en) | 2002-02-22 | 2006-05-30 | Purdue Research Foundation | Monoclonal antibodies specific for neoplasia-specific NADH:disulfide reductase |
| US7591994B2 (en) | 2002-12-13 | 2009-09-22 | Immunomedics, Inc. | Camptothecin-binding moiety conjugates |
| US8877901B2 (en) | 2002-12-13 | 2014-11-04 | Immunomedics, Inc. | Camptothecin-binding moiety conjugates |
| AU2012216518B2 (en) * | 2002-03-01 | 2014-12-18 | Immunomedics, Inc. | Internalizing Anti-CD74 Antibodies and Methods of Use |
| US9770517B2 (en) | 2002-03-01 | 2017-09-26 | Immunomedics, Inc. | Anti-Trop-2 antibody-drug conjugates and uses thereof |
| CN1649902B (zh) | 2002-03-01 | 2011-04-13 | 免疫医疗公司 | 内在化抗-cd74抗体和使用方法 |
| US8361464B2 (en) | 2002-03-01 | 2013-01-29 | Immunomedics, Inc. | Anthracycline-Antibody Conjugates for Cancer Therapy |
| AU2015201433B2 (en) * | 2002-03-01 | 2017-01-12 | Immunomedics, Inc. | Internalizing anti-cd74 antibodies and methods of use |
| US20160279239A1 (en) | 2011-05-02 | 2016-09-29 | Immunomedics, Inc. | Subcutaneous administration of anti-cd74 antibody for systemic lupus erythematosus and autoimmune disease |
| EP1551453A4 (en) * | 2002-06-17 | 2007-04-25 | Us Gov Health & Human Serv | SPECIFICITY GRAFTING OF A MICE RESPONSE TO A HUMAN FRAME |
| US7072359B2 (en) | 2002-07-09 | 2006-07-04 | Qualcomm, Inc. | Short message conversion between different formats for wireless communication systems |
| AU2003251901A1 (en) * | 2002-07-18 | 2004-02-09 | Tranxenogen, Inc. | High throughput production of antibodies to genomic-derived proteins |
| US8420086B2 (en) | 2002-12-13 | 2013-04-16 | Immunomedics, Inc. | Camptothecin conjugates of anti-CD22 antibodies for treatment of B cell diseases |
| EP1572242B1 (en) | 2002-12-13 | 2014-04-16 | Immunomedics, Inc. | Immunoconjugates with an intracellularly-cleavable linkage |
| US7402385B2 (en) | 2003-02-11 | 2008-07-22 | Albert Einstein College Of Medicine Of Yeshiva University | Radiolabeled antibodies for treatment of tumors |
| WO2005069994A2 (en) * | 2004-01-22 | 2005-08-04 | Immunomedics, Inc. | Folate conjugates and complexes |
| US8883160B2 (en) * | 2004-02-13 | 2014-11-11 | Ibc Pharmaceuticals, Inc. | Dock-and-lock (DNL) complexes for therapeutic and diagnostic use |
| AU2005214361B2 (en) * | 2004-02-13 | 2011-03-24 | Immunomedics, Inc. | Fusion proteins containing recombinant cytotoxic RNAses |
| US9550838B2 (en) | 2004-02-13 | 2017-01-24 | Ibc Pharmaceuticals, Inc. | Dock-and-lock (DNL) complexes for therapeutic and diagnostic use |
| US8470315B2 (en) | 2004-04-13 | 2013-06-25 | Quintessence Biosciences, Inc. | Non-natural ribonuclease conjugates as cytotoxic agents |
| US9707302B2 (en) | 2013-07-23 | 2017-07-18 | Immunomedics, Inc. | Combining anti-HLA-DR or anti-Trop-2 antibodies with microtubule inhibitors, PARP inhibitors, bruton kinase inhibitors or phosphoinositide 3-kinase inhibitors significantly improves therapeutic outcome in cancer |
| US20160355591A1 (en) | 2011-05-02 | 2016-12-08 | Immunomedics, Inc. | Subcutaneous anti-hla-dr monoclonal antibody for treatment of hematologic malignancies |
| US10058621B2 (en) | 2015-06-25 | 2018-08-28 | Immunomedics, Inc. | Combination therapy with anti-HLA-DR antibodies and kinase inhibitors in hematopoietic cancers |
| SI2567976T1 (sl) | 2005-03-23 | 2017-11-30 | Genmab A/S | Protitelesa usmerjena proti cd38 za zdravljenje multiplega mieloma |
| US8349332B2 (en) | 2005-04-06 | 2013-01-08 | Ibc Pharmaceuticals, Inc. | Multiple signaling pathways induced by hexavalent, monospecific and bispecific antibodies for enhanced toxicity to B-cell lymphomas and other diseases |
| US8475794B2 (en) | 2005-04-06 | 2013-07-02 | Ibc Pharmaceuticals, Inc. | Combination therapy with anti-CD74 antibodies provides enhanced toxicity to malignancies, Autoimmune disease and other diseases |
| ATE509033T1 (de) * | 2006-03-20 | 2011-05-15 | Univ California | Manipulierte anti-prostatastammzellenantigen (psca)-antikörper für krebs-targeting |
| US8840882B2 (en) * | 2006-06-23 | 2014-09-23 | Quintessence Biosciences, Inc. | Modified ribonucleases |
| US8298801B2 (en) | 2006-07-17 | 2012-10-30 | Quintessence Biosciences, Inc. | Methods and compositions for the treatment of cancer |
| JP2008111824A (ja) * | 2006-09-01 | 2008-05-15 | Nox Technologies Inc | 腫瘍特異的ｔＮＯＸアイソフォーム及び方法 |
| JP5476122B2 (ja) | 2006-09-26 | 2014-04-23 | ゲンマブ エー／エス | Ｃｄ３８発現腫瘍の併用処置法 |
| US8940298B2 (en) | 2007-09-04 | 2015-01-27 | The Regents Of The University Of California | High affinity anti-prostate stem cell antigen (PSCA) antibodies for cancer targeting and detection |
| EP2205271B1 (en) * | 2007-10-08 | 2014-05-21 | Quintessence Biosciences, Inc. | Compositions and methods for ribonuclease-based therapies |
| EP2334695B1 (en) | 2008-10-01 | 2015-12-23 | Quintessence Biosciences, Inc. | Therapeutic ribonucleases |
| EP3470087A1 (en) | 2009-02-13 | 2019-04-17 | Immunomedics, Inc. | Lyophilised compositions of immunoconjugates with an intracellularly-cleavable linkage |
| CA2774260C (en) | 2009-09-16 | 2018-10-09 | Immunomedics, Inc. | Class i anti-cea antibodies and uses thereof |
| CA2782194C (en) | 2009-12-02 | 2018-01-16 | Immunomedics, Inc. | Combination of radiolabelled antibodies (rait) and antibody-drug conjugates (adc) for treatment of pancreatic cancer |
| EP2523680A4 (en) * | 2010-01-11 | 2013-06-19 | Ct Molecular Med & Immunology | REINFORCED CYTOTOXICITY OF ANTIBODIES TO CD74 AND HLA-DR WITH INTERFERON GAMMA |
| JP6093696B2 (ja) | 2010-06-09 | 2017-03-08 | ゲンマブ エー／エス | ヒトｃｄ３８に対する抗体 |
| US9623117B2 (en) * | 2011-04-04 | 2017-04-18 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Method for selective targeting and entry of bacterial toxins to cells |
| WO2012151199A1 (en) | 2011-05-02 | 2012-11-08 | Immunomedics, Inc. | Ultrafiltration concentration of allotype selected antibodies for small-volume administration |
| AU2012320597C1 (en) | 2011-10-07 | 2015-10-15 | Baxalta GmbH | oxMIF as a diagnostic marker |
| CA2853138A1 (en) | 2011-12-05 | 2013-06-13 | Immunomedics, Inc. | Therapeutic use of anti-cd22 antibodies for inducing trogocytosis |
| US9757458B2 (en) | 2011-12-05 | 2017-09-12 | Immunomedics, Inc. | Crosslinking of CD22 by epratuzumab triggers BCR signaling and caspase-dependent apoptosis in hematopoietic cancer cells |
| CN104582717B (zh) | 2012-07-19 | 2018-03-13 | 雷德伍德生物科技股份有限公司 | 对cd22有特异性的抗体及其使用方法 |
| CA2874864C (en) | 2012-08-14 | 2023-02-21 | Ibc Pharmaceuticals, Inc. | T-cell redirecting bispecific antibodies for treatment of disease |
| US10413539B2 (en) | 2012-12-13 | 2019-09-17 | Immunomedics, Inc. | Therapy for metastatic urothelial cancer with the antibody-drug conjugate, sacituzumab govitecan (IMMU-132) |
| US10137196B2 (en) | 2012-12-13 | 2018-11-27 | Immunomedics, Inc. | Dosages of immunoconjugates of antibodies and SN-38 for improved efficacy and decreased toxicity |
| KR20230078823A (ko) | 2012-12-13 | 2023-06-02 | 이뮤노메딕스, 인코오포레이티드 | 개선된 효능 및 감소된 독성을 위한 항체 및 sn-38의 면역컨쥬게이트의 투약 |
| US9931417B2 (en) | 2012-12-13 | 2018-04-03 | Immunomedics, Inc. | Antibody-SN-38 immunoconjugates with a CL2A linker |
| US10206918B2 (en) | 2012-12-13 | 2019-02-19 | Immunomedics, Inc. | Efficacy of anti-HLA-DR antiboddy drug conjugate IMMU-140 (hL243-CL2A-SN-38) in HLA-DR positive cancers |
| US9492566B2 (en) | 2012-12-13 | 2016-11-15 | Immunomedics, Inc. | Antibody-drug conjugates and uses thereof |
| ES2819573T3 (es) | 2012-12-13 | 2021-04-16 | Immunomedics Inc | Método para producir inmunoconjugados de anticuerpo-SN-38 con un enlazador CL2A |
| US10744129B2 (en) | 2012-12-13 | 2020-08-18 | Immunomedics, Inc. | Therapy of small-cell lung cancer (SCLC) with a topoisomerase-I inhibiting antibody-drug conjugate (ADC) targeting Trop-2 |
| US8877202B2 (en) | 2013-02-07 | 2014-11-04 | Immunomedics, Inc. | Pro-drug form (P2PDOX) of the highly potent 2-pyrrolinodoxorubicin conjugated to antibodies for targeted therapy of cancer |
| CA2915960A1 (en) | 2013-06-17 | 2014-12-24 | Asana Biosciences, Llc | 5t4-targeted immunofusion molecule and methods |
| US11253606B2 (en) | 2013-07-23 | 2022-02-22 | Immunomedics, Inc. | Combining anti-HLA-DR or anti-Trop-2 antibodies with microtubule inhibitors, PARP inhibitors, Bruton kinase inhibitors or phosphoinositide 3-kinase inhibitors significantly improves therapeutic outcome in cancer |
| AU2015219495B2 (en) | 2014-02-21 | 2019-11-21 | Ibc Pharmaceuticals, Inc. | Disease therapy by inducing immune response to Trop-2 expressing cells |
| US9139649B2 (en) | 2014-02-25 | 2015-09-22 | Immunomedics, Inc. | Humanized anti-CD22 antibody |
| US9603927B2 (en) | 2014-02-28 | 2017-03-28 | Janssen Biotech, Inc. | Combination therapies with anti-CD38 antibodies |
| US9732154B2 (en) | 2014-02-28 | 2017-08-15 | Janssen Biotech, Inc. | Anti-CD38 antibodies for treatment of acute lymphoblastic leukemia |
| US9580495B2 (en) | 2014-06-24 | 2017-02-28 | Immunomedics, Inc. | Anti-histone therapy for vascular necrosis in severe glomerulonephritis |
| CR20170086A (es) | 2014-09-09 | 2017-05-22 | Janssen Biotech Inc | Terapias de combinación con anticuerpos anti-cd38 |
| WO2016057398A1 (en) | 2014-10-07 | 2016-04-14 | Immunomedics, Inc. | Neoadjuvant use of antibody-drug conjugates |
| CA2969717A1 (en) | 2014-12-04 | 2016-06-09 | Janssen Biotech, Inc. | Anti-cd38 antibodies for treatment of acute myeloid leukemia |
| CA2981543A1 (en) | 2015-04-22 | 2016-10-27 | Immunomedics, Inc. | Isolation, detection, diagnosis and/or characterization of circulating trop-2-positive cancer cells |
| CN108136218B (zh) | 2015-05-20 | 2022-12-13 | 詹森生物科技公司 | 用于治疗轻链淀粉样变性及其它cd38阳性血液恶性肿瘤的抗cd38抗体 |
| JP6816038B2 (ja) | 2015-06-22 | 2021-01-20 | ヤンセン バイオテツク，インコーポレーテツド | 抗ｃｄ３８抗体及びサバイビン阻害剤による血液悪性疾患の併用療法 |
| US20170044265A1 (en) | 2015-06-24 | 2017-02-16 | Janssen Biotech, Inc. | Immune Modulation and Treatment of Solid Tumors with Antibodies that Specifically Bind CD38 |
| JP6980980B2 (ja) | 2015-06-25 | 2021-12-15 | イミューノメディクス、インコーポレイテッドImmunomedics, Inc. | 抗ｈｌａ‐ｄｒまたは抗ｔｒｏｐ‐２抗体と微小管阻害剤、ｐａｒｐ阻害剤、ブルトンキナーゼ阻害剤またはホスホイノシチド３‐キナーゼ阻害剤との併用は癌の治療効果を有意に改善する |
| US10195175B2 (en) | 2015-06-25 | 2019-02-05 | Immunomedics, Inc. | Synergistic effect of anti-Trop-2 antibody-drug conjugate in combination therapy for triple-negative breast cancer when used with microtubule inhibitors or PARP inhibitors |
| EP3316885B1 (en) | 2015-07-01 | 2021-06-23 | Immunomedics, Inc. | Antibody-sn-38 immunoconjugates with a cl2a linker |
| US10781261B2 (en) | 2015-11-03 | 2020-09-22 | Janssen Biotech, Inc. | Subcutaneous formulations of anti-CD38 antibodies and their uses |
| MA53356B1 (fr) | 2015-11-03 | 2022-05-31 | Janssen Biotech Inc | Formulations sous-cutanées d'anticorps anti-cd38 et leurs utilisations |
| CA3011372A1 (en) | 2016-02-10 | 2017-08-17 | Immunomedics, Inc. | Combination of abcg2 inhibitors with sacituzumab govitecan (immu-132) overcomes resistance to sn-38 in trop-2 expressing cancers |
| AU2017257254B2 (en) | 2016-04-27 | 2022-02-24 | Immunomedics, Inc. | Efficacy of anti-Trop-2-SN-38 antibody drug conjugates for therapy of tumors relapsed/refractory to checkpoint inhibitors |
| RU2758234C2 (ru) | 2017-03-27 | 2021-10-26 | Иммьюномедикс, Инк. | ЛЕЧЕНИЕ ТРИЖДЫ НЕГАТИВНОГО РАКА МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ, ХАРАКТЕРИЗУЮЩЕГОСЯ ЭКСПРЕССИЕЙ Trop-2, С ПОМОЩЬЮ САЦИТУЗУМАБА ГОВИТЕКАНА И ИНГИБИТОРА Rad51 |
| US10799597B2 (en) | 2017-04-03 | 2020-10-13 | Immunomedics, Inc. | Subcutaneous administration of antibody-drug conjugates for cancer therapy |
| CA3079242A1 (en) | 2017-10-31 | 2019-05-09 | Janssen Biotech, Inc. | Methods of treating high risk multiple myeloma |
| WO2022239720A1 (ja) | 2021-05-10 | 2022-11-17 | 公益財団法人川崎市産業振興財団 | 抗原への結合親和性を低減させた抗体 |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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| JPS63501765A (ja) | 1985-11-01 | 1988-07-21 | インタ−ナショナル、ジェネティック、エンジニアリング インコ−ポレ−テッド | 抗体遺伝子のモジュ−ル組立体、それにより産生された抗体及び用途 |
| ATE243754T1 (de) | 1987-05-21 | 2003-07-15 | Micromet Ag | Multifunktionelle proteine mit vorbestimmter zielsetzung |
| US5559212A (en) | 1988-04-06 | 1996-09-24 | Alfacell Corporation | Frog embryo and egg-derived tumor cell anti-proliferation protein |
| US5728805A (en) | 1988-04-06 | 1998-03-17 | Alfacell Corp. | Pharmaceuticals and method for making them |
| US5840840A (en) * | 1990-04-17 | 1998-11-24 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Selective RNase cytotoxic reagents |
| US5686072A (en) * | 1992-06-17 | 1997-11-11 | Board Of Regents, The University Of Texas | Epitope-specific monoclonal antibodies and immunotoxins and uses thereof |
| AU3272695A (en) * | 1994-08-12 | 1996-03-07 | Immunomedics Inc. | Immunoconjugates and humanized antibodies specific for b-cell lymphoma and leukemia cells |
| US5874704A (en) | 1995-06-30 | 1999-02-23 | Lam Research Corporation | Low inductance large area coil for an inductively coupled plasma source |
| IL125771A0 (en) * | 1996-02-21 | 1999-04-11 | Us Gov Health & Human Serv | Recombinant ribonuclease proteins |
| US6649392B1 (en) * | 1996-04-04 | 2003-11-18 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Mutant form of a cytotoxic ribonucleolytic protein which allows production by recombinant methods |
| JP3417514B2 (ja) * | 1996-04-09 | 2003-06-16 | 株式会社日立製作所 | 液晶表示装置 |
| DE69719529T2 (de) * | 1996-10-17 | 2003-12-11 | Immunomedics Inc | Nichtantigenes toxinkonjugat und fusionsprotein eines internalisierendes rezeptorsystems |
| US6653104B2 (en) * | 1996-10-17 | 2003-11-25 | Immunomedics, Inc. | Immunotoxins, comprising an internalizing antibody, directed against malignant and normal cells |
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