JP2004115529A - 悪性細胞に対する、ｏｎｃタンパク質を含む、免疫毒素 - Google Patents

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Abstract

【課題】　
　所定の表面マーカーを有する細胞を選択的に殺傷する細胞傷害性ＲＮａｓｅ（ｏｎｃタンパク質）免疫毒素（最小の免疫原性であり、そして現在公知の免疫毒素よりも少ない全身毒性を生じる）を提供すること、特に、腫瘍細胞上の特異的マーカーを認識するヒト化抗体に連結されたリボ核酸分解活性を有するタンパク質フラグメントを含む免疫毒素を直接提供すること
【解決手段】　
　Ｂ細胞に特異的な表面マーカーに対する抗体に連結した測定可能なリボ核酸分解活性を有するｏｎｃタンパク質を含む、選択的細胞傷害性試薬。
【選択図】　なし

Description

　関連出願に対する相互参照
　本出願は、１９９７年５月２日に出願された米国特許仮出願第６０／０４６，８９５号の継続出願であり、そして優先権を主張する。
　合衆国後援の研究または開発
　適用されない。
発明の背景
　リシン、ジフテリア毒素、およびＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ毒素のような植物および細菌由来の毒性酵素は、細胞型特異的殺傷試薬を生じるために抗体またはレセプター結合リガンドに結合している（Ｙｏｕｌｅら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　７７：５４８３（１９８０）；Ｇｉｌｌｉｌａｎｄら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　７７：４５３９（１９８０）；Ｋｒｏｌｉｃｋら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　７７：５４１９（１９８０））。細胞認識部分が必ずしも抗体ではないという事実に関係なく、これらに関する毒素は、一般的に免疫毒素として公知である。これらのハイブリッドタンパク質は、抗体または分子のリガンド部分が認識するレセプターまたは細胞表面マーカーを発現する細胞を殺傷する。
　適切な条件下で、特定のレセプターまたは細胞表面マーカーに依存して、毒素はサイトゾルに入り、タンパク質合成機構を不活化し、そして標的細胞の殺傷を引き起こす。免疫毒素は、細胞培養物中および動物モデルで増殖するガン細胞に非常に細胞傷害性であることが示されており、その播種性のため、伝統的な外科手術技術によって処置可能でない血液およびリンパ媒介性悪性腫瘍、ならびに腹膜内腔のような制限された区画における固体腫瘍を処置するためのこれらの試薬の可能性を証明する（Ｇｒｉｆｆｉｎら，ＩＭＭＵＮＯＴＯＸＩＮＳ，ｐ　４３３，Ｂｏｓｔｏｎ／Ｄｏｒｄｒｅｃｈｔ／Ｌａｎｃａｓｔｅｒ，Ｋｌｕｗｅｒ　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ（１９８８）；Ｖｉｔｅｔｔａら，Ｓｃｉｅｎｃｅ　２３８：１０９８（１９８７）；Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄら，Ｊ．Ｎａｔ’ｌ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｉｎｓｔ．８１：１４５５（１９８９）によって総説される）。伝統的化学療法は、いくつかのガン状態の処置に有効であるが、化学療法化合物の全身毒性による望ましくない副作用を示す。
　したがって、ガン治療のための理想的な候補は、患者のガン細胞に選択的に細胞傷害性であるが非ガン細胞に対して無害のままである免疫毒素である。しかし、この型の抗腫瘍治療の利用は、免疫毒素を含む外来タンパク質に対する患者の免疫応答の発現によって妨害されている。マウスモノクローナル抗体（Ｓａｗｌｅｒら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３５：１５３０（１９８５）；Ｓｃｈｒｏｆｆら，Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．４５：８７９（１９８５））および抗毒素抗体に対する免疫応答は、免疫毒素で処置した動物およびヒトの両方で検出されている（Ｒｙｂａｋら，Ｉｍｍｕｎｏｌ．ａｎｄ　Ａｌｌｅｒｇｙ　Ｃｌｉｎｉｃｓ　ｏｆ　Ｎｏｒｔｈ　Ａｍｅｒｉｃａ　１１（２）：３５９（１９９１）；Ｈａｒｋｏｎｅｎら，Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．４７：１３７７（１９８７）；Ｈｅｒｔｌｅｒ，Ａ．ＩＭＭＵＮＯＴＯＸＩＮＳ　ｐ．４７５，Ｋｌｕｗｅｒ　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｂｏｓｔｏｎ／Ｄｏｒｄｒｅｃｈｔ／Ｌａｎｃａｓｔｅｒ（１９８８））。ヒト化技術の進歩は、免疫毒素の抗体部分に関連するいくらかの免疫原性を緩和した（Ｂｉｒｄら，Ｓｃｉｅｎｃｅ　２４２：４２３（１９８８）；Ｈｕｓｔｏｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８５：５８７９（１９８８）；Ｗａｒｄら，Ｎａｔｕｒｅ　３４１：５４４（１９８９）；およびＪｏｎｅｓら，Ｎａｔｕｒｅ　３１４：５２２（１９８６））。しかし、患者の免疫抑制以外の、毒性部分の免疫原性に対抗する解決法は見いだされていない（Ｋｈａｚａｅｌｉら，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ　ｏｆ　ＡＡＣＲ　２９：４１８（１９８８））。したがって、免疫毒素の毒性部分の免疫原性を減少させるが所定の表面マーカーを有する細胞を選択的に殺傷する能力を保持する方法および組成物に対する必要性が継続して存在している。
　Ｂ細胞リンパ腫は、非ホジキンリンパ腫の一般的規定内に属し、そしてリンパ系内の播種性腫瘍または固体腫瘍であり得る。悪性Ｂ細胞における表面マーカーであるＣＤ２２に対して惹起されている放射標識されたヒト化マウス抗体（ＬｙｍｐｈｏＣｉｄｅＴＭ）は、Ｂ細胞リンパ腫についての処置として現在臨床試験中である（Ｉｍｍｕｎｏｍｅｄｉｃｓ，Ｉｎｃ．，Ｐｒｅｓｓ　Ｒｅｌｅａｓｅ，ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｍｍｕｎｏｍｅｄｉｃ．ｃｏｍ／ｔｈｅｒａｌ．ｈｔｍｌ）。Ａｍｌｏｔら，Ｂｌｏｏｄ　８２：２６２４−２６３３（１９９３）；Ｓａｕｓｖｉｌｌｅら，Ｂｌｏｏｄ　８５：３４５７−３４６５（１９９５）；Ｇｒｏｓｓｂａｒｄら，Ｂｌｏｏｄ　８１：２２６３−２２７１（１９９３）；Ｇｒｏｓｓｂａｒｄら，Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．１１：７２６−７３７（１９９３）も参照のこと。これまで、いくつかの抗腫瘍応答が注目されているが、正常組織に対する免疫毒素媒介毒性によって、しばしば治療レベルでの投薬が抑制されている。ＣＤ２２の他に、ＣＤ１９およびＣＤ４０のようないくつかのＢ細胞特異的抗原は、リシンＡ鎖のような植物毒素およびＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ外毒素Ａ（ＰＥ）のような細菌毒素を用いて作製された免疫毒素によって標的化されている。Ｕｃｋｕｎら，Ｂｌｏｏｄ　７９：２２０１−２２１４（１９９２）；Ｇｈｅｔｉｅら，Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．５１：５８７６−５８８０（１９９１）；Ｆｒａｎｃｉｓｃｏら，Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．５５：３０９９−３１０４（１９９５）。
　腫瘍細胞に対するＲＮａｓｅ　Ａの細胞傷害性は、１９６０年代および１９７０年代に行われた研究から十分に文献に示されている。初期の研究は、Ｒｏｔｈ，Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．２３：６５７（１９６３）に総説される。これらの初期の研究の関連は、Ｒａｎａ　ｐｉｐｉｅｎｓの卵母細胞からの抗腫瘍タンパク質が、ウシ膵臓ＲＮａｓｅ　Ａに相同であるという発見によって確認されている（Ａｒｄｅｌｔら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５６：２４５（１９９１））。Ｐ−３０タンパク質（および本明細書でｏｎｃタンパク質といわれる）を、インビトロで（Ｄａｒｚｙｎｋｉｅｗｉｃｚら，Ｃｅｌｌ　Ｔｉｓｓｕｅ　Ｋｉｎｅｔ．２１：１６９（１９８８）；Ｍｉｋｕｌｓｋｉら，Ｃｅｌｌ　Ｔｉｓｓｕｅ　Ｋｉｎｅｔ．２３：２３７（１９９０））および動物モデルで（Ｍｉｋｕｌｓｋｉら，Ｊ．Ｎａｔ’ｌ．Ｃａｎｃｅｒ　Ｉｎｓｔ．８２：１５１（１９９０））ガン細胞に対する抗増殖／細胞傷害性効果に基づいてＲａｎａ　ｐｉｐｅｎｓ初期胚の抽出物から単離した。種々の固体腫瘍を有する患者におけるｏｎｃタンパク質の第ＩＩＩ相ヒト臨床試験は、現在進行中である。
　本発明の目的は、所定の表面マーカーを有する細胞を選択的に殺傷する細胞傷害性ＲＮａｓｅ（ｏｎｃタンパク質）免疫毒素を提供することである。これらの免疫毒素は、最小の免疫原性であり、そして現在公知の免疫毒素よりも少ない全身毒性を生じる。特に、本発明の目的は、腫瘍細胞上の特異的マーカーを認識するヒト化抗体に連結されたリボ核酸分解活性を有するタンパク質フラグメントを含む免疫毒素を直接提供することである。
　１．Ｂ細胞によって発現される表面マーカーに対する抗体に連結した測定可能なリボ核酸分解活性を有するｏｎｃタンパク質を含む、選択的細胞傷害性試薬。
　２．前記ｏｎｃタンパク質が、配列番号１に記載のアミノ酸配列を有する、項目１に記載の試薬。
　３．前記ｏｎｃタンパク質が組換え手段によって産生される、項目１に記載の試薬。
　４．前記ｏｎｃタンパク質が、配列番号３に記載のアミノ酸配列を有する、項目３に記載の試薬。
　５．前記ｏｎｃタンパク質が、配列番号２として同定された核酸分子によってコードされる、項目３に記載の試薬。
　６．前記抗体がモノクローナル抗体である、項目１に記載の試薬。
　７．前記モノクローナル抗体がヒト化される、項目６に記載の試薬。
　８．前記モノクローナル抗体が単鎖抗体である、項目７に記載の試薬。
　９．前記抗体が、Ｂ細胞リンパ腫に特異的である、項目１に記載の試薬。
　１０．前記抗体が、ＲＦＢ４およびＬＬ２からなる群より選択される、項目９に記載の試薬。
　１１．前記表面マーカーがＣＤ２２である、項目１に記載の試薬。
　１２．前記表面マーカーがＣＤ７４である、項目１に記載の試薬。
　１３．前記抗体がＬＬ１である、項目１２に記載の試薬。
　１４．前記ｏｎｃタンパク質が、組換え融合によって前記抗体に結合される、項目１に記載の試薬。
　１５．項目１に記載の試薬をコードする、核酸配列。
　１６．Ｂ細胞によって発現される細胞表面マーカーに対する抗体に連結した測定可能なリボ核酸分解活性を有するｏｎｃタンパク質を含む選択的細胞傷害性試薬を、薬学的に受容可能なキャリアとともに含む、薬学的組成物。
　１７．前記ｏｎｃタンパク質が、配列番号１に記載のアミノ酸配列を有する、項目１６に記載の薬学的組成物。
　１８．前記ｏｎｃタンパク質が組換え手段によって産生される、項目１６に記載の薬学的組成物。
　１９．前記ｏｎｃタンパク質が、配列番号３に記載のアミノ酸配列を有する、項目１８に記載の薬学的組成物。
　２０．前記ｏｎｃタンパク質が、配列番号２として同定された核酸分子によってコードされる、項目１８に記載の薬学的組成物。
　２１．前記ｏｎｃタンパク質が、組換え手段によって前記抗体に結合される、項目１６に記載の薬学的組成物。
　２２．前記抗体がモノクローナル抗体である、項目１６に記載の薬学的組成物。
　２３．前記モノクローナル抗体がヒト化される、項目２２に記載の薬学的組成物。
　２４．前記モノクローナル抗体が単鎖抗体である、項目２３に記載の薬学的組成物。
　２５．前記抗体が、Ｂ細胞リンパ腫上に存在する表面マーカーに対する、項目１６に記載の薬学的組成物。
　２６．前記抗体が、ＲＦＢ４、ＬＬ１、およびＬＬ２からなる群より選択される、項目２５に記載の薬学的組成物。
　２７．Ｂ細胞上の細胞表面マーカーに対する抗体に連結した測定可能なリボ核酸分解活性を有するｏｎｃタンパク質を含む選択的細胞傷害性試薬と、殺傷させるべき細胞とを接触させる工程を包含する、悪性Ｂ細胞を殺傷する方法。
　２８．前記ｏｎｃタンパク質が、配列番号１に記載のアミノ酸配列を有する、項目２７に記載の方法。
　２９．前記ｏｎｃタンパク質が組換え手段によって産生される、項目２７に記載の方法。
　３０．前記ｏｎｃタンパク質が、配列番号３に記載のアミノ酸配列を有する、項目２９に記載の方法。
　３１．前記ｏｎｃタンパク質が、配列番号２として同定された核酸分子によってコードされる、項目２９に記載の方法。
　３２．前記細胞表面マーカーがＣＤ２２である、項目２７に記載の方法。
　３３．ＣＤ７４に対する抗体に連結した測定可能なリボ核酸分解活性を有するｏｎｃタンパク質を含む選択的細胞傷害性試薬と、殺傷させるべき細胞とを接触させる工程を包含する、ＣＤ７４細胞表面マーカーを有する悪性細胞を殺傷する方法。
　３４．前記殺傷させるべき細胞が、神経芽細胞腫、黒色腫、および骨髄腫からなる群より選択される、項目３３に記載の方法。
　発明の要旨
　本発明は、悪性Ｂ細胞および他の悪性細胞を殺傷するために有用である免疫毒素に関し、そしてＢ細胞上の表面マーカーおよび免疫毒素をコードする核酸構築物に関する。これらの試薬は、選択された腫瘍細胞との特異的結合を可能にする抗体に連結されたリボ核酸分解（ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｌｙｔｉｃ）活性を有するＲａｎａ　ｐｉｐｉｅｎｓタンパク質に由来する毒性部分を含む。
　発明者らは、これらの特定の免疫毒素が、ヒトＲＮａｓｅ相対物よりもまたは毒素自体よりも悪性Ｂ細胞に対して２０００倍以上まで活性である、非常に驚くべき特性を有することを見いだした。さらに、以下により詳細に記載されるように、播種性腫瘍に対してインビボで投与された場合、それらの使用は、劇的に低下した副作用を生じた。これらの非常に効果的であるが、見かけ上非毒性の、Ｂ細胞リンパ腫のような遍在性疾患に対する免疫毒素は、このような疾患にかかっている患者に対する新たなかつ刺激的な治療選択を提示する。
　他の実施態様では、本発明は、本発明の免疫毒素および薬学的に受容可能なキャリアを含む薬学的組成物に関する。
　さらなる実施態様では、本発明は、細胞を選択的に殺傷する方法に関する。この方法は、モノクローナル抗体が、腫瘍細胞上の表面マーカーに結合し、それによって毒性ｏｎｃタンパク質に細胞を殺傷させるような条件下で、本発明の選択的免疫毒素と、殺傷されるべき腫瘍細胞とを接触させる工程を包含する。
　本発明の種々の他の目的および利点は、本発明の以下の説明から明らかである。
　本発明により、所定の表面マーカーを有する細胞を選択的に殺傷する細胞傷害性ＲＮａｓｅ（ｏｎｃタンパク質）免疫毒素が提供される。これらの免疫毒素は、最小の免疫原性であり、そして現在公知の免疫毒素よりも少ない全身毒性を生じる。特に、本発明により、腫瘍細胞上の特異的マーカーを認識するヒト化抗体に連結されたリボ核酸分解活性を有するタンパク質フラグメントを含む免疫毒素が直接提供される。
　発明の詳細な説明
　本発明は、ＲＮａｓｅタンパク質、特にＢ細胞に対し指向された免疫毒素における毒性部分としてＲａｎａ　ｐｉｐｅｎｓに由来するＲＮａｓｅの使用に関する。本発明の免疫毒素試薬は、タンパク質および選択された腫瘍細胞表面マーカーに特異的に結合する抗体を含む。以下に詳述した研究では、ｏｎｃタンパク質は、ＣＤ２２またはＣＤ７４に対する抗体およびヒト非毒性ＲＮａｓｅを含む他の免疫毒素よりもはるかに優れていることが示される。ｏｎｃタンパク質に基づく免疫毒素は、Ｂ細胞リンパ腫および白血病のような悪性Ｂ細胞、ならびに神経芽細胞腫のような他の悪性腫瘍に対する強力な薬剤である。
　定義
　用語「抗体」または「抗体ペプチド」とは、ポリクローナルおよびモノクローナル抗体、標的抗原に結合する免疫グロブリン分子の全体の免疫グロブリンまたは抗体もしくは任意の機能的フラグメントをいい、以下により詳細に定義される。このような機能的実体の例には、完全な抗体分子、Ｆｖ、一本鎖Ｆｖ、相補性決定領域（ＣＤＲ）、ＶＬ（軽鎖可変領域）、ＶＨ（重鎖可変領域）、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ）２’のような抗体フラグメント、およびそれらの任意の組み合わせ、あるいは標的抗原に結合し得る免疫グロブリンペプチドの任意の他の機能的部分が挙げられる。
　抗体は、例えば、完全なままの免疫グロブリンとして、または種々のペプチダーゼでの切断によって産生される多数の十分に特徴づけられたフラグメントとして存在する。したがって、例えば、ペプシンは、ヒンジ領域におけるジスルフィド結合下で抗体を切断して、Ｆ（ａｂ）２’を産生し、これはそれ自体がジスルフィド結合によってＶＨ−ＣＨ１に連結された軽鎖であるＦａｂのダイマーである。Ｆ（ａｂ）２’は、ヒンジ領域においてジスルフィド結合を破壊する穏和な条件下で還元され得、それによってＦ（ａｂ）２’ダイマーをＦａｂ’モノマーに変換する。Ｆａｂ’モノマーは、本質的にヒンジ領域の一部を有するＦａｂである（ＦＵＮＤＡＭＥＮＴＡＬ　ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ，第３版，Ｗ．Ｅ．Ｐａｕｌ編，Ｒａｖｅｎ　Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．（１９９３）を参照のこと）。種々の抗体フラグメントは、完全なままの抗体の切断によって定義されるが、当業者は、このようなフラグメントが、化学的にまたは組換えＤＮＡ方法論のいずれかを利用して、新規に合成され得ることを理解する。したがって、本明細書で使用される場合、用語抗体はまた、抗体全体の改変によって産生されるか、または組換えＤＮＡ方法論を使用して新規に合成されるフラグメントのいずれかの抗体フラグメントを含む。
　本発明については、抗体は、抗原と相互作用するならば、抗原「と反応性である」かまたは抗原「に結合する」。この相互作用は、２つのリアクタントが一緒になって産物を形成する化学反応に類似する。抗体−抗原相互作用の場合には、相互作用の産物は、抗体−抗原複合体である。本発明の免疫グロブリンに結合する好ましい抗原は、ＣＤ２２およびＣＤ７４細胞表面マーカーである。
　用語「結合特異性」、「抗体に特異的に結合する」、または「特異的に免疫反応性である」とは、タンパク質または炭水化物をいう場合、タンパク質および他の生物学的薬剤の異種集団の存在下でタンパク質または炭水化物の存在の決定因子である結合反応をいう。したがって、指示されたイムノアッセイ条件下で、特定された抗体は、特定のタンパク質または炭水化物に結合し、そして試料に存在する他のタンパク質または炭水化物に有意な量で結合しない。このような条件下で抗体への特異的結合は、特定のタンパク質または炭水化物に対するその特異性について選択された抗体を必要とし得る。例えば、ＣＤ２２抗原に対して惹起された抗体は、ＣＤ２２タンパク質と特異的に免疫反応性でありそして他のタンパク質と免疫反応性でない抗体を提供するために選択され得る。種々のイムノアッセイ形式は、特定のタンパク質または炭水化物と特異的に免疫反応性の抗体を選択するために使用され得る。例えば、固相ＥＬＩＳＡイムノアッセイは、タンパク質または炭水化物と特異的に免疫反応性の抗体を選択するために日常的に使用される。特異的免疫反応性を決定するために使用され得るイムノアッセイ形式および条件の説明については、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ，ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ，Ａ　ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ　ＭＡＮＵＡＬ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ（１９８８）を参照のこと。
　用語「ヒト化」とは、定常領域が、ヒト免疫グロブリンに対して少なくとも約８０％以上の相同性を有する抗体をいう。さらに、マウスのような非ヒト可変領域アミノ酸残基のいくつかは、ヒト起源のアミノ酸残基を含むように改変され得る。
　ヒト化抗体は、「新形態を備えた」抗体といわれている。相補性決定領域（ＣＤＲ）の操作は、ヒト化抗体を達成する１つの方法である。例えば、Ｊｏｎｅｓら，Ｎａｔｕｒｅ　３２１：５２２（１９８８）およびＲｉｅｃｈｍａｎｎら，Ｎａｔｕｒｅ　３３２：３２３（１９８８）を参照のこと、両方とも参考として本明細書に援用される。ヒト化抗体に関する総説文献については、ＷｉｎｔｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ　３４９：２９３（１９９１）を参照のこと、これは参考として本明細書に援用される。
　用語「単離された」または「実質的に精製された」とは、核酸またはタンパク質に適用される場合、核酸またはタンパク質が、天然の状態で結合される他の細胞成分を本質的に含まないことを示す。好ましくは、均質であるが、乾燥または水溶液のいずれかであり得る。純度および均質性は、代表的には、ポリアクリルアミドゲル電気泳動または高速液体クロマトグラフィーのような分析化学技術を使用して決定される。調製物に存在する優勢な種であるタンパク質が、実質的に精製される。
　特に、単離されたｏｎｃタンパク質遺伝子は、その遺伝子に隣接しそしてｏｎｃタンパク質以外のタンパク質をコードするオープンリーディングフレームから分離される。用語「精製された」とは、核酸またはタンパク質が、電気泳動ゲルにおいて本質的に１つのバンドを生じることを示す。特に、核酸またはタンパク質が、少なくとも８５％純粋、より好ましくは少なくとも９５％純粋、および最も好ましくは少なくとも９９％純粋であることを意味する。用語「核酸」とは、一本鎖または二本鎖のいずれかの形態のデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドポリマーをいい、そして他に限定されない限り、天然に存在するヌクレオチドと類似の方法で機能し得る天然のヌクレオチドの公知のアナログを包含する。
　本発明の免疫毒素の文脈において用語「連結される」とは、ジスルフィド結合；水素結合；静電結合；組換え融合；およびコンホメーション結合（例えば、抗体−抗原およびビオチン−アビジン結合）を含む共有結合による部分（代表的には抗体および毒素）の連結を包含する。
　用語「測定可能なリボ核酸分解活性」または「顕著なリボ核酸分解活性」とは、タンパク質合成が、［３５Ｓ］メチオニンの酸沈殿可能なタンパク質への組込みによって測定される場合に阻害される、ウサギ網状赤血球溶解物アッセイに添加される場合４０ｎｇ／ｍＬ以下のＩＣ５０を有する分子をいう。ＩＣ５０は、アッセイでタンパク質合成を５０％阻害するために必要なタンパク質の濃度である。溶解物アッセイは、Ｐｒｏｍｅｇａ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩから市販されるＰｒｏｍｅｇａ溶解物アッセイキットで記載のように行われ得る。高分子量ＲＮＡおよびｔＲＮＡを使用するリボ核酸分解活性は、刊行されたプロトコルに従って過塩素酸可溶性ヌクレオチドの形成によって３７℃で決定される（Ｎｅｗｔｏｎ，Ｄ．Ｌ．ら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　３５：５４５−５５３（１９９６））。ポリ（Ａ，Ｃ）ＵｐＧおよびポリＵでは、リボ核酸分解活性は、ＤｅｐｒｉｓｃｏらならびにＬｉｂｏｎａｔｉおよびＦｌｏｒｉｄｉ（Ｄｅｐｒｉｓｃｏ，Ｒ．ら，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ　Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ　Ａｃｔａ　７８８：３５６−３６３（１９８４）；Ｌｉｂｏｎａｔｉ，Ｍ．ら，Ｅｕｒｏｐｅａｎ　Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．８：８１−８７（１９６９））に従ってアッセイされる。活性は、２６０ｎｍでの吸光度における経時的な増加を測定することによってアッセイされる。インキュベーション混合物（１ｍＬの１０ｍＭイミダゾール、０．１Ｍ　ＮａＣｌ、ｐＨ　６．５またはｐＨ　７）は、２５℃で基質および適切な量の酵素溶液を含む。インビトロ翻訳アッセイ（Ｓｔ．Ｃｌａｉｒ，Ｄ．Ｋ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８４：８３３０−８３３４（１９８７））および（３−［４，５−ジメチルチアゾール−２−イル］−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド；チアゾリルブルー；ＭＴＴ）を使用する細胞生存性アッセイ（Ｍｏｓｓｍａｎ，Ｔ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ　６５：５５−６３（１９８３））は、既に記載されたように行われる（Ｐｅａｒｓｏｎ，Ｊ．Ｗ．ら，Ｊ．Ｎａｔ’ｌ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｉｎｓｔ．８３：１３８６−１３９１（１９９１））。
　用語「をコードする核酸」または「をコードする核酸配列」とは、特定のタンパク質またはペプチドの発現を指示する核酸をいう。核酸配列は、ＲＮＡに転写されるＤＮＡ鎖配列およびタンパク質に翻訳されるＲＮＡ配列の両方を含む。核酸配列は、全長核酸配列ならびに全長配列に由来するより短い配列の両方を含む。特定の核酸配列が、特異的宿主細胞でコドン選択を提供するために導入され得る天然のままの配列の縮重コドンを含むことが理解される。核酸は、個々の一本鎖または二重鎖形態のいずれかとしてセンスおよびアンチセンス鎖の両方を含む。
　用語「ｏｎｃタンパク質」とは、初めはＰ−３０タンパク質と命名されそして最初にＤａｒｚｙｎｋｉｅｗｉｃｚら，Ｃｅｌｌ　Ｔｉｓｓｕｅ　Ｋｉｎｅｔ．２１：１６９（１９８８）に記載された、配列番号１に記載される配列を有するタンパク質のような、Ｒａｎａ　ｐｉｐｉｅｎｓに由来するＲＮａｓｅ　Ａをいう。このタンパク質の記載は、米国特許第５，５５９，２１２号に見いだされ得る。
　用語「天然のｏｎｃタンパク質」とは、Ｒａｎａ　ｐｉｐｉｅｎｓ卵母細胞から精製された、天然の形態のタンパク質をいう。用語「組換えｏｎｃタンパク質」とは、組換え手段によって産生されたタンパク質をいう。これらの組換えタンパク質およびその核酸配列の好ましい実施態様は、ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ９７／０２５８８号に記載される。ｏｎｃタンパク質はまた、核酸およびアミノ酸配列の両方の改変を含むが、測定可能なリボ核分解活性を有することが理解される。
　「ｏｎｃ由来の」アミノ酸配列には、ｏｎｃアミノ酸配列のアミノ酸位置１（ＧｌｕにｐｙｒｏＧｌｕを置換する）、２、３、４、５、６、７、８、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１８、１９、２０、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、５０、５２、５４、５６、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７６、８０、８１、８２、８４、８５、８６、８７、９１、９２、９３、９５、または９６の配列（配列番号１）で始まる配列の群から選択される６つのアミノ酸の連続する配列に同一の６つの連続するアミノ酸の少なくとも１つのストリングを含むものが含まれる。
　用語「薬学的組成物」とは、種々の調製物の処方物をいう。非経口処方物が公知であり、そして本発明での使用に好ましい。免疫毒素の治療的有効量を含む処方物は、滅菌液体溶液、液体懸濁液、または凍結乾燥された型のいずれかであり、そして必要に応じて安定化剤または賦形剤を含む。凍結乾燥した組成物は、適切な希釈剤、例えば、注射用水、生理食塩水、０．３％グリシンなどで、約０．０１ｍｇ／ｋｇ宿主体重から１０ｍｇ／ｋｇ以上までのレベルで、再構成される。
　代表的には、免疫毒素を含む薬学的組成物は、１日のみまたは毎日の静脈内注入によって数日間のいずれかで治療的有効量で投与される。
　本発明の免疫毒素は、注射によって、最も好ましくは静脈内に、しかしまた、筋肉内に、皮下に、莢膜内に、腹腔内に、血管腔に、または関節に、例えば、関節内注射によって、全身投与され得る。用量は、用いられる免疫毒素の特性、例えば、医師の技術範囲内で公知である、その活性および生物学的半減期、処方物中の免疫毒素の濃度、投与部位および速度、関連する患者の臨床的耐容性、患者を苦しめるガンの程度などに依存する。
　本発明の免疫毒素は、溶液中で投与され得る。溶液のｐＨは、ｐＨ　５〜９．５、好ましくはｐＨ　６．５〜７．５の範囲であるべきである。免疫毒素またはその誘導体は、リン酸塩、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン−ＨＣｌ、またはクエン酸塩などのような適切な薬学的に受容可能な緩衝液を有する溶液中にあるべきである。緩衝液濃度は、１〜１００ｍＭの範囲であるべきである。免疫グロブリンの溶液はまた、５０〜１５０ｍＭの濃度で、塩化ナトリウムまたは塩化カリウムのような塩を含み得る。アルブミン、グロブリン、デタージェント、ゼラチン、プロタミン、またはプロタミンの塩のような安定化剤の有効量はまた、免疫毒素を含む溶液にまたは溶液が調製される組成物に含まれ得、そして添加され得る。免疫毒素の全身投与は、代表的には、抗体のヒト化形態が使用されるならば、２〜３日後とまたは週に１回行われる。あるいは、毎日の投与が有用である。通常、投与は、筋肉内注射または血管内注入のいずれかによる。
　投与はまた、鼻内または他の経口投与経路によるものであり得る。免疫毒素はまた、血液を含むある組織に配置された、マイクロスフェア、リポソーム、または他のマイクロパーティクル送達システムによって投与され得る。
　免疫毒素はまた、肺への局在化送達を達成するためにエアロゾルによって投与され得る。これは、免疫毒素またはその誘導体を含む水性エアロゾル、リポソーム調製物、または固体粒子を調製することによって達成される。非水性（例えば、フルオロカーボン噴射剤）懸濁液が使用され得る。好ましくは、超音波噴霧器が、エアロゾルの調製に使用される。超音波噴霧器は、免疫毒素の分解を生じ得る剪断に、抗体またはその誘導体を曝露することを最小にする。
　通常、水性エアロゾルは、従来の薬学的に受容可能なキャリアおよび安定化剤とともに免疫毒素の水性溶液または懸濁液を処方することによって製造される。キャリアおよび安定化剤は、特定の免疫毒素についての必要条件に依存して変化するが、代表的には、非イオン性界面活性剤（ＴＷＥＥＮ−２０または−８０（登録商標）、ＰＬＵＲＯＮＩＣ−Ｆ１２８または−６７（登録商標）、あるいはポリエチレングリコール）、血清アルブミンのような無害のタンパク質、またはソルビタンエステル、オレイン酸、レシチン、グリシンのようなアミノ酸、緩衝剤、塩、糖、または糖アルコールが含まれる。処方物は滅菌される。エアロゾルは、一般的に、等張溶液から調製される。
　用語「組換えＤＮＡ」、「組換え核酸」、または「組換え的に産生したＤＮＡ」とは、天然のまたは内因性供給源から単離され、そして天然に存在する隣接または内部ヌクレオチドを付加、欠失、または変化させることによって、化学的または酵素的のいずれかで改変されたＤＮＡをいう。隣接するヌクレオチドは、ヌクレオチドの記載された配列またはサブ配列の上流または下流のいずれかにあるヌクレオチドであるが、内部ヌクレオチドは、記載された配列またはサブ配列内に存在するヌクレオチドである。
　用語「組換え手段」とは、タンパク質が単離され、タンパク質をコードするｃＤＮＡ配列が同定され、そして発現ベクター中に挿入される技術をいう。次いで、ベクターは、細胞に導入され、そして細胞はタンパク質を発現する。組換え手段はまた、融合タンパク質の発現、タンパク質の構成的発現、またはタンパク質の誘導性発現のための１つのベクターへの、種々の供給源からのコードまたはプロモーターＤＮＡの連結を包含する。
　用語「組換えタンパク質」、「組換え的に産生されたタンパク質」、または「組換え的に産生された免疫毒素」とは、タンパク質を発現し得るＤＮＡの内因性コピーを有さない非天然細胞を使用して産生されるペプチドまたはタンパク質をいう。細胞は、適切な核酸配列の導入によって遺伝学的に変化されているので、タンパク質を産生する。組換えタンパク質は、タンパク質を産生する細胞と正常に結合するタンパク質および他の細胞下成分との結合で見いだされない。
　用語「選択的細胞傷害性試薬」とは、例えば、生物内の、異なる細胞の集団に添加される場合、細胞のいくつかの物理学的特徴に基づいて、すなわち、細胞傷害性試薬が結合し、次いでインターナリゼーションされる表面リガンドまたはマーカーに基づいて、集団中の細胞の１つのタイプを殺傷する化合物をいう。
　用語「単鎖抗体」とは、抗体の機能的フラグメントをコードする遺伝情報が、ＤＮＡの単一の連続する長さに位置する抗体をいう。単鎖抗体の完全な説明については、Ｂｉｒｅら，Ｓｃｉｅｎｃｅ　２４２：４２３（１９８８）およびＨｕｓｔｏｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８５：５８７９（１９８８）を参照のこと。
　用語「表面マーカー」とは、細胞の表面に存在するタンパク質、炭水化物、または糖タンパク質をいう。細胞の異なるタイプは、異なる細胞表面マーカーを発現し、したがって細胞は、細胞表面マーカーの存在によって同定され得る。例えば、悪性Ｂ細胞は、ＣＤ２２を過剰発現する。したがって、ＣＤ２２を認識する抗体の結合は、その細胞をＢ細胞として同定する。以下に記載のＣＤ７４は、Ｂ細胞上で見られる細胞表面マーカーおよび他の悪性細胞の選択群の例である。
　本発明の免疫毒素の種々の使用には、タンパク質の毒性作用によって排除され得る特異的ヒト細胞によって引き起こされる種々の疾患症状が含まれる。本発明の免疫結合体についての１つの好ましい適用は、ＣＤ２２を発現する悪性Ｂ細胞の処置である。Ｂ細胞の代表的悪性疾患には、急性リンパ性白血球（ＡＬＬ）、慢性Ｂリンパ性白血病（Ｂ−ＣＬＬ）、慢性骨髄性白血病、バーキットリンパ腫、ＡＩＤＳ−関連リンパ腫、および濾胞性リンパ腫、ならびに毛状細胞白血病が挙げられる。ＣＤ７４に対する本明細書に記載の免疫毒素は、黒色腫、神経芽細胞腫、および骨髄腫細胞の阻害および処置に有用である。
　本発明の好ましい細胞傷害性試薬は、ヒト非毒性ＲＮＡｓｅのＥＤＮに連結した同じ抗体から構成される比較試薬よりも、Ｂ細胞マーカーを有する標的細胞に対して少なくとも１００倍、好ましくは少なくとも５００倍、および最も好ましくは少なくとも１０００倍を上まわる細胞傷害性である。
　Ａ．細胞表面マーカーに対する抗体
　抗体とは、アナライト（抗原）を特異的に結合しそして認識する、免疫グロブリン遺伝子またはそのフラグメントによって実質的にコードされるポリペプチドをいう。認識された免疫グロブリン遺伝子には、カッパー、ラムダ、アルファ、ガンマ、デルタ、イプシロン、およびミュー定常領域遺伝子、ならびに無数の免疫グロブリン可変領域遺伝子が挙げられる。軽鎖は、カッパーまたはラムダのいずれかとして分類される。重鎖は、ガンマ、ミュー、アルファ、デルタ、またはイプシロンとして分類され、これらは順に、それぞれ、免疫グロブリンクラスＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、およびＩｇＥを定義する。
　例示的な免疫グロブリン（抗体）構造ユニットは、テトラマーを含む。各テトラマーは、ポリペプチド鎖の２つの同一の対から構成され、各対は、１つの「軽」鎖（約２５ｋＤ）および１つの「重」鎖（約５０〜７０ｋＤ）を有する。各鎖のＮ−末端は、主として抗原認識を担う約１００〜１１０以上のアミノ酸の可変領域を定義する。用語可変軽鎖（ＶＬ）およ可変重鎖（ＶＨ）とは、それぞれこれらの軽鎖および重鎖をいう。
　モノクローナル抗体を産生するための種々の方法は、当該技術分野で公知である。例えば、Ｇｏｄｉｎｇ，ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ　ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ；　ＰＲＩＮＣＩＰＬＥＳ　ＡＮＤ　ＰＲＡＣＴＩＣＥ，Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ，第２版（１９８６）；ならびにＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅを参照のこと。ヒトＢ細胞に対するまたはこれと反応性であるモノクローナル抗体は、マウスを免疫するための免疫原の組み合わせを使用しそして所望の抗原を発現する細胞に対するハイブリドーマ上清をスクリーニングすることによって、あるいは目的の抗原に対するモノクローナル抗体に特異的であるように設計されたスクリーニングアッセイによって、得られる。本発明の抗体についてスクリーニングするために有用な細胞株は、容易に入手可能または得られる。このような細胞には、バーキットリンパ腫細胞株Ｄａｕｄｉ、ＣＡ−４６、およびＲａｊｉが挙げられる。
　ＣＤ２２は、Ｉｇスーパーファミリーに属する系統制限されたＢ細胞抗原であり、これは、急性リンパ性白血病（Ｂ−ＡＬＬ）、慢性Ｂリンパ性細胞（Ｂ−ＣＬＬ）、バーキットリンパ腫のようなＢリンパ腫細胞、ＡＩＤＳ−関連リンパ腫、および濾胞性リンパ腫、ならびに毛様細胞白血病を含むがこれらに限定されない多くのタイプの悪性Ｂ細胞の表面上で、ならびに正常成熟Ｂリンパ球上で発現される。ＣＤ２２は、Ｂ細胞発生の初期段階で発現されず、幹細胞または末期段階の血漿細胞の表面上でも見いだされない。Ｖａｉｃｋｕｓら，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｏｎｃｏｌ／Ｈｅｍａｔｏｌ．１１：２６７−２９７（１９９１）。さらに、脱落した抗原は、正常ヒト血清またはＣＬＬの患者からの血清で検出されない。Ｌｉら，Ｃｅｌｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１８：８５−９９（１９８９）。
　ＣＤ７４は、ＭＨＣクラスＩＩ関連不変鎖（Ｉｉ）としても公知であり、これは、Ｂ細胞、マクロファージ、単球、および他のＭＨＣクラスＩＩ陽性細胞で見いだされる。上記に列挙した悪性Ｂ細胞の他に、ＣＤ７４はまた、神経芽細胞腫、黒色腫、および骨髄腫細胞で見いだされる。
　例えば、Ｂ細胞に対するモノクローナル抗体の産生は、以下によって達成される：１）ヒトＢ細胞での免疫処置、次いでＮｉｓｈｉｍｕｒａら，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８：７４７（１９８８）（参考として本明細書に援用される）に記載されるのと同様の方法で構築されるヒトＢ細胞抗原でトランスフェクトされた非ヒト細胞株に対する反応性についての、得られるハイブリドーマのスクリーニング；２）ヒトＢ細胞抗原でトランスフェクトした（好ましくは免疫処置されるべき動物に自己由来の）非ヒト細胞株での免疫処置、次いでヒトＢ細胞株に対する反応性についての、得られるハイブリドーマのスクリーニング；３）ヒトＢ細胞抗原を発現するヒトまたは非ヒト細胞株での免疫処置、次いでヒトＢ細胞株との現存する抗Ｂ細胞モノクローナル抗体の反応性をブロックする能力についての、得られるハイブリドーマのスクリーニング；４）ヒトＢ細胞抗原を発現するヒトまたは非ヒト細胞株での免疫処置、次いで精製された天然のまたは組換えＢ細胞抗原との反応性についての、得られるハイブリドーマのスクリーニング；および５）ヒトＢ細胞抗原の組換え誘導体での免疫処置、次いでヒトＢ細胞株に対する反応性についての、得られるハイブリドーマのスクリーニング。この開示の総説について、当業者は、本発明で使用され得る抗体を惹起する他の方法を理解する。
　組換えＤＮＡ方法論は、本発明の好ましい抗体を合成するために使用される。例えば、ヒトにおける使用についての免疫毒素の好ましい抗体部分は、ヒト可変領域フレームワークおよびヒト定常領域と組み合わされたマウス相補性決定領域（ＣＤＲ）のみを含むＢ細胞抗原に対する「ヒト化」抗体である。
　ヒト化技術は、当該技術分野で周知である。例えば、ＰＣＴ出願公開番号ＷＯ　８７／０２６７１；米国特許第４，８１６，５６７号；ＥＰ特許出願０１７３４９４；Ｊｏｎｅｓら，Ｎａｔｕｒｅ　３２１：５２２（１９８６）；およびＶｅｒｈｏｅｙｅｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ　２３９：１５３４（１９８８）を参照のこと。ＣＤＲの操作は、ヒト化抗体を達成する方法である。例えば、Ｊｏｎｅｓら，Ｎａｔｕｒｅ　３２１：５２２（１９８８）およびＲｉｅｃｈｍａｎｎら，Ｎａｔｕｒｅ　３３２：３２３（１９８８）を参照のこと。ヒト化抗体に関する総説文献については、ＷｉｎｔｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ　３４９：２９３（１９９１）を参照のこと。
　ヒト化の他に、本発明の抗体部分は、単鎖抗体である。本発明の１つの局面では、単鎖抗体は、親ハイブリドーマ細胞株からクローニングされる。
　モノクローナル抗体のＦｖ領域は、同じ一般的ストラテジーを使用してクローニングされる。代表的には、例えば、ハイブリドーマ細胞から抽出されるポリ（Ａ）＋ＲＮＡは、プライマーとしてランダムヘキサマーを使用して逆転写される。ＶＨおよびＶＬドメインは、２つのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって別々に増幅される。重鎖配列は、重鎖のアミノ末端タンパク質配列に従って設計される５’末端プライマー、およびコンセンサス免疫グロブリン定常領域配列に従った３’末端プライマーを使用して増幅される（Ｋａｂａｔら，ＳＥＱＵＥＮＣＥＳ　ＯＦ　ＰＲＯＴＥＩＮＳ　ＯＦ　ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＩＣＡＬ　ＩＮＴＥＲＥＳＴ，第５版，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｈｅａｌｔｈ　ａｎｄ　Ｈｕｍａｎ　Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，Ｐｕｂｌｉｃ　Ｈｅａｌｔｈ　Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ　ｏｆ　Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ（１９９１））。軽鎖Ｆｖ領域は、軽鎖のアミノ末端タンパク質配列に従って設計された５’末端プライマーおよびプライマーＣ−カッパとの組み合わせで使用して増幅される。当業者は、使用され得る他の適切なプライマーを認識する。
　粗ＰＣＲ産物は、当業者に周知であり市販の適切なクローニングベクターにサブクローニングされる。正確なサイズのＤＮＡインサートを含むクローンは、例えば、アガロースゲル電気泳動で同定される。次いで、重鎖または軽鎖コード領域のヌクレオチド配列は、クローニング部位に隣接した配列決定プライマーを使用して二本鎖プラスミドＤＮＡから決定される。市販のキット（例えば、Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ（登録商標）キット，Ｕｎｉｔｅｄ　Ｓｔａｔｅｓ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｒｐ．，Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，ＯＨ）を使用して、ＤＮＡを配列決定することを容易にする。
　当業者は、Ｆｖ領域について提供される配列情報を利用して、これらの配列をコードする核酸が、当業者に周知の多くの方法を使用して得られることを理解する。したがって、Ｆｖ領域をコードするＤＮＡは、任意の適切な方法によって調製され、この方法には、例えば、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）（ＷｕおよびＷａｌｌａｃｅ，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ　４：５６０（１９８９）、Ｌａｎｄｅｇｒｅｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ　２４１：１０７７（１９８８）、およびＢａｒｒｉｎｇｅｒら，Ｇｅｎｅ　８９：１１７（１９９０）を参照のこと）、転写増幅（Ｋｗｏｈら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８６：１１７３（１９８９）を参照のこと）、自己持続配列複製（Ｇｕａｔｅｌｌｉら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８７：１８７４（１９９０）を参照のこと）のような増幅技術、適切な配列のクローニングおよび制限、またはＮａｒａｎｇら，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．６８：９０（１９７９）のホスホトリエステル方法；Ｂｒｏｗｎら，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．６８：１０９（１９７９）のホスホジエステル方法；Ｂｅａｕｃａｇｅら，Ｔｅｔｒａ．Ｌｅｔｔ．２２：１８５９（１９８１）のジエチルホスホロアミダイト方法；および米国特許第４，４５８，０６６号の固体支持体方法のような方法による直接的化学合成が挙げられる。
　単鎖抗体をコードする核酸配列は、当該技術分野で周知の技術によって同定される（Ｓａｍｂｒｏｏｋらを参照のこと）。簡単にいえば、上記のＤＮＡ産物は、電気泳動ゲル上で分離される。ゲルの内容物は、適切なメンブラン（例えば、Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ（登録商標），Ａｍｅｒｓｈａｍ）にトランスファーされ、そしてストリンジェント条件下で適切なプローブとハイブリダイズされる。プローブは、所望の配列内に埋め込まれるフラグメントの核酸配列を含むべきである。
　ＤＮＡ配列が化学的に合成される場合、単鎖オリゴヌクレオチドが生じる。これは、相補的配列とのハイブリダイゼーションによって、またはテンプレートとして単鎖を使用するＤＮＡポリメラーゼを用いる重合化によって、二本鎖ＤＮＡに変換され得る。単鎖Ｆｖ領域の全体を化学的に合成することは可能であるが、後で一緒にライゲートされる多くのより短い配列（約１００〜１５０塩基）を合成することが好ましい。
　あるいは、サブ配列はクローニングされ得、そして適切なサブ配列は、適切な制限酵素を使用して切断される。次いで、フラグメントは、所望のＤＮＡ配列を産生するためにライゲートされ得る。
　一旦、Ｆｖ可変軽鎖および重鎖ＤＮＡが得られると、配列は、当業者に周知の技術を使用して、直接的にまたはペプチドリンカーをコードするＤＮＡ配列を介してのいずれかで、一緒にライゲートされ得る。したがって、完全な配列は、単鎖抗体の形態でＦｖドメインをコードする。
　あるいは、Ｂ細胞に対する抗体は、例えば、免疫学的試薬の供給業者から市販される（例えば、Ａｎｃｅｌｌ　Ｃｏｒｐ．，Ｂａｙｐｏｒｔ，ＭＮ（ＲＦＢ４）；Ｂｅｃｔｏｎ　Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｓａｎ　Ｊｏｓｅ，ＣＡ；Ｔｈｅ　Ｂｉｎｄｉｎｇ　Ｓｉｔｅ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ；ＣａｌＴａｇ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｓｏｕｔｈ　Ｓａｎ　Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ；Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ；Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ；およびＺｙｍｅｄ，Ｆｏｓｔｅｒ　Ｃｉｔｙ，ＣＡ）。ＲＦＢ４は、他の抗体と比較した場合、驚くべき効率を有する本発明の好ましい抗体である。これは特徴づけられており、そしてＦｉｔｚＧｅｒａｌｄらが「Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ＲＦＢ４　Ｉｍｍｕｎｏｔｏｘｉｎｓ　Ｅｘｈｉｂｉｔ　Ｐｏｔｅｎｔ　Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ　Ａｃｔｉｖｉｔｙ　ｆｏｒ　ＣＤ−２２　Ｂｅａｒｉｎｇ　Ｃｅｌｌｓ　Ａｎｄ　Ｔｕｍｏｒｓ」と題する１９９８年３月１９日に出願されたＰＣＴ特許出願、ならびにＭａｎｓｆｉｅｌｄら，Ｂｉｏｃｏｎｊ．Ｃｈｅｍ．７：５５７（１９９６）；Ｍａｎｓｆｉｅｌｄら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓ．２５：７０９（１９９７）；およびＭａｎｓｆｉｅｌｄら，Ｂｌｏｏｄ　９０：２０２０（１９９７）（これらのすべてはその全体が本明細書に援用される）に記載される。
　Ｂ．細胞傷害性ｏｎｃタンパク質
　本願は、Ｒａｎａ　ｐｉｐｉｅｎｓからのｏｎｃタンパク質についての新しい使用を開示する。Ｒａｎａ　ｐｉｐｉｅｎｓ　ｏｎｃタンパク質は、質量分析法で約１２，０００ダルトンの分子量、および９．５と１０．５との間の等電点を有するＲａｎａ　ｐｉｐｉｅｎｓの卵および／または胚に由来する実質的に純粋なタンパク質である。Ａｌｆａｃｅｌｌ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｂｌｏｏｍｆｉｅｌｄ，ＮＪから入手可能な、商品名ＯＮＣＯＮＡＳＥ（登録商標）として本明細書にときどき言及される産物によっても例示される。
　本発明については好ましくは、ｏｎｃタンパク質は、配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質である。
　本発明で使用されるｏｎｃタンパク質は、膵臓ＲＮａｓｅファミリーのモノマーメンバーでありそしてインターナリゼーションするリガンドなして特定のガン細胞に毒性であるので、免疫毒素構築物に使用される他のＲＮａｓｅと独特に比較される（米国特許第５，５５９，２１２号を参照のこと）。しかし、Ｂ細胞に対する抗体に結合した場合、ｏｎｃタンパク質の細胞傷害性が、２，０００倍にまで劇的に増加することは、本発明の発見である。ガン細胞に対する細胞傷害性にもかかわらず、患者の毒性および免疫原性は、この特定の免疫毒素の効率および毒素の小さいサイズのため、低いと予測される。
　配列番号１が、本明細書で提供される配列の機能的有利点に実質的に影響を及ぼさないように変更され得ることは、当業者に理解される。例えば、グリシンおよびアラニンは、代表的には、アスパラギン酸およびグルタミン酸ならびにアスパラギンおよびグルタミンのように交換可能であると考えられる。配列の機能的有利点が維持される任意のこのような改変は、配列番号１に記載の配列によって包含されることが意図される。
　本明細書に記載されそして請求される代表的な組換えｏｎｃタンパク質は、配列番号２を含むように定義される。本発明の組換えｏｎｃタンパク質は、天然のｏｎｃタンパク質と比較して類似の測定可能なリボ核酸分解活性を有する。しかし、当業者は、ｏｎｃ配列の多くの異なる変更が、天然のｏｎｃタンパク質とほぼ同じ測定可能なリボ核酸分解活性を有するｏｎｃタンパク質をコードすることを認識する。
　好ましい組換えｏｎｃタンパク質、組換えｏｎｃタンパク質の改変体、および組換えｏｎｃタンパク質を合成するための技術の説明については、ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ９７／０２５８８号を参照のこと、これは参考として本明細書に援用される。
　Ｃ．免疫毒素
　毒性部分および抗体は、化学作用によってまたは組換え手段によって結合され得る（Ｒｙｂａｋら，Ｔｕｍｏｒ　Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ　１：１４１（１９９５）を参照のこと）。化学的改変には、例えば、タンパク質化学の分野で周知である方法によって、直接的または連結化合物を介してのいずれかで、互いに部分を連結する目的のための誘導体化が含まれる。現在好ましい化学的結合の実施態様では、毒性部分および認識部分を連結する手段は、２つの部分間の分子間ジスルフィド結合の形成に最終的に寄与するヘテロ二官能性カップリング試薬を含む。本発明についてこの能力に有用である他のタイプのカップリング試薬は、例えば、米国特許４，５４５，９８５に記載される。あるいは、分子間ジスルフィドは、天然に存在するまたは遺伝子操作によって挿入される各部分でシステイン間で便利に形成され得る。部分を連結する手段はまた、ヘテロ二官能性架橋試薬または特異的低ｐＨ切断可能架橋剤または特異的プロテアーゼ切断可能リンカー間のチオエーテル結合、あるいは他の切断可能または切断可能でない化学結合を使用し得る。免疫毒素の部分を連結する手段はまた、標準的ペプチド合成化学または組換え手段によって別々に合成される部分間に形成されるペプチジル結合を含み得る。
　本発明のタンパク質部分の可能な化学的改変はまた、周知の方法に従って、循環系における滞留時間を延長しそして免疫原性を減少させるためのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）での誘導体化が含まれる（例えば、Ｌｉｓｉら，Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｃｈｅｍ．４：１９（１９８２）；Ｂｅａｕｃｈａｍｐら，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１３１：２５（１９８２）；およびＧｏｏｄｓｏｎら，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　８：３４３（１９９０）を参照のこと）。
　免疫毒素のタンパク質の可能な遺伝子操作改変は、組換えＤＮＡ技術によって誘導される単一遺伝子から発現される単鎖多機能性生合成タンパク質へのそれぞれの関連の機能的ドメインの組み合わせを含む。（例えば、ＰＣＴ公表出願ＷＯ／８８／０９３４４を参照のこと）。さらに、組換えＤＮＡ技術は、組換えｏｎｃタンパク質および抗体を連結するために使用され得る。したがって、免疫毒素は、ｏｎｃタンパク質の一方の末端で始まりそして抗体で終わる融合されたタンパク質を含み得る。
　組換え融合タンパク質を産生する方法は、当業者に周知である。したがって、例えば、Ｃｈａｕｄｈａｒｙら，Ｎａｔｕｒｅ　３３９：３９４（１９８９）；Ｂａｔｒａら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５：１５１９８（１９９０）；Ｂａｔｒａら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８６：８５４５（１９８９）；Ｃｈａｕｄｈａｒｙら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８７：１０６６（１９９０）（すべては参考として援用される）は、種々の単鎖抗体−毒素融合タンパク質の調製を記載する。
　一般的に、免疫毒素融合タンパク質を産生する工程は、Ｆｖ軽鎖および重鎖ならびに使用されるｏｎｃタンパク質をコードするＤＮＡを別々に調製する工程を包含する。２つの配列は、特定の所望の融合タンパク質をコードする構築物を形成するためにプラスミドまたは他のベクター中で組み合わされる。より単純なアプローチは、所望のｏｎｃタンパク質を既にコードする構築物中に、特定のＦｖ領域をコードするＤＮＡを挿入する工程を包含する。
　したがって、例えば、抗Ｂ細胞単鎖抗体／ｏｎｃタンパク質免疫毒素をコードするＤＮＡは、所望のｏｎｃタンパク質またはその逆をコードするＤＮＡを既に含む構築物中に、抗体ＶＨおよびＶＬ鎖（Ｆｖ領域）をコードするＤＮＡに挿入する工程によって、最も容易に調製される。Ｆｖ領域をコードするＤＮＡ配列は、当業者に周知の技術を使用して構築物に挿入される。
　哺乳動物細胞は、抗体−サイトカイン（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ　１０９６：３４５（１９９１）；Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍら，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２８：１０２７（１９９１））および抗体−酵素（Ｃａｓａｄｅｉら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８７：２０４７（１９９０）；Ｗｉｌｌｉａｍｓら、Ｇｅｎｅ　４３：３１９（１９８６））のようなハイブリッド分子を発現しそして分泌するために使用されている。一部は、外来タンパク質の免疫原性は、組換えタンパク質に存在する間違ったグリコシル化パターンによる。したがって、真核生物細胞株は、発現されたタンパク質がグリコシル化されるので、原核生物細胞よりも好ましい。ヒト由来細胞株は、これらの細胞が末端グリコシドとしてシアル酸を組み込む点で特に好ましい。ハムスターＣＨＯおよびＢＨＫ、ならびにＨＥＫ−２９３ヒト線維芽細胞株のような細胞株は、組換えヒトタンパク質を発現させるために使用されている。
　本発明の免疫毒素のタンパク質部分の他の遺伝子操作改変は、タンパク質のサイズを減少させるため、または溶解性に影響を及ぼす配列変化（例えば、システインからセリン）もしくはグリコシル化部位のような、産生もしくは利用性を容易にする他のパラメータを改変させるための、機能的に不必要なドメインの欠失を含む。当業者は、タンパク質の多くの追加の周知の化学的および遺伝子改変が、本発明の細胞傷害性試薬のように、非経口投与が意図される任意のタンパク質に有利に適用され得ることを理解する。
　本発明の好ましい免疫毒素は、毒性部分として配列番号１のアミノ酸配列を有するタンパク質、および目的の細胞上の特異的細胞表面マーカーを結合するヒト化抗体（より好ましくはＢ細胞に対する）を含む融合タンパク質である。ｏｎｃタンパク質と抗体との間の融合タンパク質のこの独特の遺伝子結合の構築は、化学的に結合した抗体／ｏｎｃタンパク質結合体の異種性を排除する。これは、免疫毒素の増加した効力および減少した免疫原性に寄与し得ると考えられる。
　本発明は、本明細書に記載の新規タンパク質をコードする核酸構築物を含む。核酸構築物は、適切なベクターに組み込まれる場合、宿主中で複製し得るものである。構築物は、プロモーターおよびエンハンサーのような構築物の発現に影響を及ぼし得る他の配列に連結され得る。
　本発明の免疫毒素は、腫瘍細胞の選択的殺傷に利用され得る。この方法は、選択的に殺傷されるべき細胞のタイプで特異的または優先的に見られる細胞表面マーカーに結合する抗体の適切な選択に基づく。例えば、本発明の免疫毒素は、多くが当該技術分野で公知である腫瘍細胞特異的表面マーカーに結合する抗体を含むものを包含する。ヒト適用について好ましい実施態様では、抗体は、悪性を示すＢ細胞を優先的に結合するヒト化単鎖タンパク質またはその改変形態である。
　Ｄ．薬学的組成物
　本発明はまた、薬学的に受容可能なキャリア中に本発明の免疫毒素を含む薬学的組成物に関する。治療的適用では、組成物は、疾患およびその合併症を治癒または少なくとも部分的に阻止するために十分な量で、疾患に苦しむ患者に投与される。これを達成するために適切な量は、治療的有効量として定義される。この使用に有効な量は、疾患の重篤度および患者の健康の一般状態に依存する。
　好都合には、薬学的組成物は、非経口投与に適切である。本発明の免疫毒素は、他の免疫毒素について当該技術分野で公知の方法に従って、例えば、体の種々の部分で腫瘍を処置するための、異なる目的に適切な種々の手段によって投与され得る。（例えば、Ｒｙｂａｋら，Ｈｕｍａｎ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ　ＡＮＤ　ＡＬＬＥＲＧＹ　ＣＬＩＮＩＣＳ　ＯＦ　ＡＭＥＲＩＣＡ，Ｗ．Ｂ．Ｓａｕｎｄｅｒｓ，１９９０、およびそれに引用される参考文献を参照のこと）。したがって、本発明はまた、本発明の免疫毒素および薬学的に受容可能なキャリアを含む薬学的組成物、特に、投与の上記の手段に適切であるこのような組成物に関する。
　組成物の単回または複数回投与は、患者によって必要とされおよび耐容されるような投与量および頻度に依存して投与され得る。いずれにしても、組成物は、患者を効果的に処置するために本発明のタンパク質の十分量を提供すべきである。
　好ましくは、投与のための組成物は、普通、薬学的に受容可能なキャリア、好ましくは水性キャリアに溶解された単鎖抗体およびｏｎｃタンパク質を含む融合タンパク質の溶液を含む。種々の水性キャリア、例えば、緩衝化生理食塩水などが使用され得る。これらの溶液は、滅菌されており、そして一般的に望ましくない物質を含まない。これらの組成物は、従来の周知の滅菌技術によって滅菌され得る。組成物は、ｐＨ調節および緩衝化剤、毒性調節剤などのようなほぼ生理学的条件に必要とされるような薬学的に受容可能な補助物質、例えば、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、乳酸ナトリウムなどを含み得る。これらの処方物中の融合タンパク質の濃度は、広く変化し得、そして選択された投与の特定の態様および患者の必要性に従って、主として液体容量、粘度、体重などに基づいて選択される。
　したがって、静脈内投与について代表的な薬学的組成物は、約０．０１〜１００ｍｇ／患者／日である。０．１〜約１０００ｍｇ／患者／日までの投与量は、特に、薬物が、腫瘍または腫瘍がある器官へのような、遮断された部位におよび血流中以外に投与される場合、使用され得る。非経口投与可能な組成物を調製する実際の方法は、当業者に公知であるかまたは明らかであり、そしてＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ　ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ　ＳＣＩＥＮＣＥ，第１５版，Ｍａｃｋ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ，（１９８０）のような刊行物により詳細に記載される。
　さらに、本発明は、抗体の結合を可能にする条件下で殺傷されるべき細胞の表面上の標的に特異的な抗体を有する本発明の選択的免疫毒素を使用する、細胞を選択的に殺傷する方法に関する。細胞上の表面マーカーへの抗体の結合は、試薬のｏｎｃタンパク質に細胞を選択的に殺傷させる。本発明のこの方法は、例えば、照射によって骨髄除去を受けている患者への移植前の骨髄において、望ましくないタイプの細胞を選択的に殺傷することによる、インビトロでの細胞分離に使用され得る。
　実施例
　以下の限定されない実施例では、本発明は、毒性部分がＯＮＣＯＮＡＳＥ（登録商標）であり、そして抗体が腫瘍細胞、特にＢ細胞を認識する免疫毒素によって例示される。
　実施例１：Ｒａｎａ　ｐｉｐｉｅｎｓからの天然のｏｎｃタンパク質および組み換えｏｎｃタンパク質の産生
　Ａ．天然のｏｎｃタンパク質の単離および精製
　Ｒａｎａ　ｐｉｐｉｅｎｓからの卵母細胞の単離、卵のインビトロ受精、ならびにカエル胚からの天然のｏｎｃタンパク質の単離および精製を記載する技術は、米国特許第５，５５９，２１２号および第５，７２８，８０５号に非常に詳述され、これらは両方とも参考として本明細書に援用される。
　Ｂ．組換えｏｎｃタンパク質の産生およびアッセイ
　組換えｏｎｃタンパク質の産生を、ＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ９７／０２５８８に記載のように行った。高分子量ＲＮＡおよびｔＲＮＡを使用するリボ核酸分解活性を、刊行されたプロトコル、Ｎｅｗｔｏｎら，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１４：５３８（１９９４）に従って、過塩素酸可溶性ヌクレオチドの形成によって３７℃にて決定した（Ｎｅｗｔｏｎら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．３５：５４５（１９９６）を参照のこと）。ポリ（Ａ，Ｃ）、ＵｐＧ、およびポリＵで、リボヌクレアーゼ活性を、Ｌｉｂｏｎａｔｉら，Ｂｉｏｃｈｉｍ．ｅｔ　Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ　７８８：３５６（１９８４）、ならびにＬｉｂｏｎａｔｉおよびＦｌｏｒｉｄｉ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．８：８１（１９６９）に従って分光光度法でアッセイした。簡単にいえば、活性を、２６０ｎｍでの吸光度の増加を測定することによってアッセイした。インキュベーション混合物（１ｍＬの１０ｍＭイミダゾール、０．１Ｍ　ＮａＣｌ、ｐＨ　６．５またはｐＨ　７）は、２５℃にて基質および適切な量の酵素を含んでいた。ＭｏｓｓｍａｎのＭＴＴ方法を使用して、インビトロ翻訳アッセイ（Ｓｔ．Ｃｌａｉｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８４：８３３０（１９８７））、および細胞生存率アッセイ（Ｐｅａｒｓｏｎら，Ｊ．Ｎａｔ’ｌ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｉｎｓｔ．８３：１３８６（１９９１））を、既述のように行った。
　実施例２：ｏｎｃタンパク質の化学分析および組成
　上記の天然のｏｎｃタンパク質は、化学的に十分特徴づけられている。天然のｏｎｃタンパク質と同じくらい十分に機能的であるために、組換えｏｎｃタンパク質が、以下に記載のような化学的性質および構造を有するべきであると考えられる。
　天然のｏｎｃタンパク質を、（タンパク質の均質性をアッセイするために使用される標準試験によって確立されるように）均質まで精製した。電気泳動によって、天然のｏｎｃタンパク質の分子量を、約１４，５００ダルトンであると決定した。天然のｏｎｃタンパク質の分子量を示す、列挙されたアミノ酸配列（以下を参照のこと）に基づく分子量の算出は、１１，８６０ダルトンであるべきである。しかし、金属イオンが、それらを除去するためのすべての努力にもかかわらずタンパク質に結合され得、そして異なる同位体が含まれ得るので、質量分析法によって決定される天然のｏｎｃタンパク質の分子量は１２，４３０ダルトンであった。この矛盾を考慮して、質量分析法によって決定される場合の製薬の分子量は、約１２，０００ダルトンであると考えた。天然のｏｎｃタンパク質の等電点（ｐＩ）を、等電点電気泳動によって決定した場合、約９．５と１０．５との間であることを見いだした。天然のｏｎｃタンパク質のアミノ末端基をブロックし、そして本質的に炭水化物を含まないことを見いだした（アントロンおよびオルシノール方法によって決定した場合）。
　表１は、天然のｏｎｃタンパク質のアミノ酸組成を示す。
Figure 2004115529
　注１：トレオニン、システイン／２、およびメチオニンは、加水分解中に部分的に破壊され、そしてこの値はこのような部分破壊のため正確ではない。
　注２：この値は、不完全な加水分解のため正確ではない。
　注３：トリプトファンは、破壊されるので、タンパク質の酸加水分解で検出され得ず、そして結果として決定されずと示される。しかし、紫外スペクトルの分析は、１分子当たり１つのトリプトファン残基の存在を示した。
Figure 2004115529
　天然のｏｎｃタンパク質を配列決定した。天然のタンパク質のＮ−末端はピログルタミン酸（＜Ｇｌｕ）である。これは、直接配列決定に必要な遊離アミノ基を欠き、したがってタンパク質のＮ−末端を「ブロックする」グルタミン酸の環化誘導体である。分子のアミノ末端を、既に引用されたＰＣＴ／ＵＳ９７／０２５８８に記載のように分子の組換え産生を容易にするように変更した。細胞傷害性ＲＮａｓｅの好ましいアミノ酸配列を、配列番号１に示す。
　実施例３：抗ＣＤ２２−ＯＮＣＯＮＡＳＥ（登録商標）免疫毒素
　Ａ．材料および方法
　ＯＮＯＣＯＮＡＳＥ（登録商標）（以前はＰ−３０と命名された）を、凍結乾燥したタンパク質としてＡｌｆａｃｅｌｌ　Ｃｏｒｐ．から得て、そしてリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）に溶解した。少なくとも１ｍｇ／ｍＬのストック溶液を、アッセイについて希釈物を調製するまで、−２０℃で凍結させたままにした。すべての他の試薬を、既述の供給源から購入した（Ｒｙｂａｋら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６：２１２０２（１９９１）；Ｎｅｗｔｏｎら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：１９５７２（１９９２）；Ｍｉｋｕｌｓｋｉら，Ｃｅｌｌ　Ｔｉｓｓｕｅ　Ｋｉｎｅｔ．２３：２３７（１９９０）、これは参考として本明細書に援用される）。
　ＬＬ２は、ヒトＢ細胞上のＣＤ２２を認識しこれに特異的に結合するマウスモノクローナル抗体である。ＬＬ２抗体を、Ｉｍｍｕｎｏｍｅｄｉｃｓ，Ｉｎｃ．（Ｍｏｒｒｉｓ　Ｐｌａｉｎｓ，ＮＪ）から得た。ＲＦＢ４もまた、ＣＤ２２に結合するマウスモノクローナル抗体である。この抗体は、Ａｎｃｅｌｌ　Ｃｏｒｐ．を含む多くのソースから入手可能である。
　３つのバーキットリンパ腫細胞株（Ｄａｕｄｉ（ＡＴＣＣ　ＣＣＬ　２１３）、ＣＡ　４６（ＡＴＣＣ　ＣＲＬ　１６４８）、およびＲａｊｉ（ＡＴＣＣ　ＣＣＬ８６））を、１０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）、２ｍＭグルタミン、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、および１０μｇ／ｍＬゲンタマイシンを含むＲＰＭＩ　１６４０培地中で増殖した。ヒト皮膚Ｔ細胞リンパ腫細胞株であるＨＵＴ　１０２（ＡＴＣＣ　ＴＩＢ　１６２）も、補充したＲＰＭＩ培地中で増殖した。すべての細胞を、５％ＣＯ２湿潤雰囲気中で３７℃にてインキュベートした。
　Ｂ．ＬＬ２−ＯＮＣＯＮＡＳＥ（登録商標）免疫毒素の調製
　ジスルフィド連結した結合体を、以下の改変とともに、Ｎｅｗｔｏｎら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：１９５７２（１９９２）に記載のように調製した。抗体（１２．５ｎｍｏｌ）を、１００ｍＭホウ酸ナトリウム、ｐＨ　８．５中の２５０ｎｍｏｌ　２−イミノチオランおよび２．５ｍＭ　５，５’ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）（ＤＴＮＢ）とともに、最終容量＜０．５ｍＬで室温にて１時間インキュベートした。反応混合物を、緩衝液Ａ（０．１Ｍ　ＮａＣｌを含む０．１Ｍ　ＮａＰＯ４，ｐＨ　７．５）で平衡化したＰＤ−１０（登録商標）カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ．ＮＪ）にアプライした。
　ＳＰＤＰ−改変したＯＮＣＯＮＡＳＥ（登録商標）（０．９〜１．２ｍｏｌ　Ｎ−スクシンイミジル３（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）／ｍｏｌ　ＯＮＣＯＮＡＳＥ（登録商標））を、記載のように調製した（Ｎｅｗｔｏｎら，（１９９２）　前出）。ＳＰＤＰ−改変したＯＮＣＯＮＡＳＥ（登録商標）（３４０ｎＭ）を、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）とともに２ｍＭの最終ＤＴＴ濃度で室温にて１時間還元し、そして緩衝液Ａで平衡化したＰＤ−１０（登録商標）カラムでゲル濾過して、過剰のＤＴＴを除去した。改変したＯＮＣＯＮＡＳＥ（登録商標）を、改変した抗体に添加し、そして反応物を室温にて一晩インキュベートした。ＯＮＣＯＮＡＳＥ（登録商標）は、抗体よりも少なくとも１０倍モル過剰であった。
　チオエーテル連結した結合体を、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＢＳ）を使用して、Ｒｙｂａｋら，Ｄｒｕｇ　Ｄｅｌｉｖｅｒｙ　１：３（１９９３）およびＮｅｗｔｏｎら，Ｉｎｔ’ｌ　Ｊ．Ｏｎｃｏｌｏｇｙ　８：１０９５（１９９６）に従って調製した。簡単にいえば、ＬＬ２抗体（２ｍｇ）を、５倍モル過剰のＭＢＳ（ストック溶液、ＤＭＦ中３０ｍＭ）とともに室温にて１０分間インキュベートした。反応内容物を、緩衝液Ａで平衡化したＰＤ−１０（登録商標）カラムにアプライした。ピーク画分（１．５ｍＬ）をプールした。ＳＰＤＰ−改変したＯＮＣＯＮＡＳＥ（登録商標）を、０．１Ｍ　ＮａＣｌを含む０．１Ｍ酢酸ナトリウム，ｐＨ　４．５に対して透析し、次いで２５ｍＭ　ＤＴＴ（最終濃度）とともに室温にて３０分間インキュベーションを行った。反応内容物を、緩衝液Ａで平衡化したＰＤ−１０（登録商標）カラムにアプライし、そしてピーク画分をプールし、そしてＭＢＳ抗体に添加した。反応物を、室温にて一晩インキュベートした。ＯＮＣＯＮＡＳＥ（登録商標）は、抗体よりも１０倍モル以上過剰で存在した。結合体を、ＴＳＫ−３０００（登録商標）　ＨＰＬＣカラム（Ｔｏｓｏ−Ｈａａｓ）でのゲル濾過によって未反応のＯＮＣＯＮＡＳＥ（登録商標）と分離した。
　調製物中に存在するタンパク質の量を、ＵＶ分光法によって、次いで２７７ｎｍで以下の吸光係数とＢｅｅｒの法則：［Ａ＝ε（濃度）］によって決定した：ＯＮＣＯＮＡＳＥ（登録商標）、ε（１％）＝７．３；および免疫毒素、ε（１％）＝１０。
　抗体に結合したＯＮＣＯＮＡＳＥ（登録商標）のモルを、ＯＮＣＯＮＡＳＥ（登録商標）および抗体の標準とともに還元した免疫毒素のゲル電気泳動によって決定した。ゲルを、Ｉｍａｇｅ（ＮＩＨ公共のドメインソフトウエア）を使用して分析した。
　成分タンパク質を証明する還元条件下でＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動によってＯＮＣＯＮＡＳＥ（登録商標）免疫毒素の分析を、還元後に再生した。非還元条件下で、抗体結合体は、複数の高分子量形態からなった。チオール−ジスルフィド交換反応における架橋基の反応性は、結合体の異種性を説明し得る。免疫毒素は、１〜２モルのＯＮＣＯＮＡＳＥ（登録商標）／ｍｏｌの抗体を含んだ。精製した免疫毒素は、ゲル電気泳動によって、おそらく１０倍以上のモル過剰のＯＮＣＯＮＡＳＥ（登録商標）が本質的にすべての免疫毒素を得、そして遊離抗体を含まないので、顕著な量の遊離抗体を含まないようであった。
　Ｃ．ＲＦＢ４−ＯＮＣＯＮＡＳＥ（登録商標）免疫毒素の調製
　ＲＦＢ４−ＯＮＣＯＮＡＳＥ（登録商標）免疫毒素を、上記のように調製する。ＲＦＢ４はＣＤ２２を認識するので、ＲＦＢ４を含む免疫毒素はまた、悪性Ｂ細胞に対して細胞傷害性である。したがって、以下に記載の実験は、さらにＲＦＢ４−ＯＮＣＯＮＡＳＥ（登録商標）でも同様に行われ得る。
　実施例４：インビトロ細胞生存率研究
　タンパク質合成を、Ｒｙｂａｋら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６：２１２０２（１９９１）に記載のように測定した。細胞を３μＣｉの［３Ｈ］ウリジンでパルスした以外は、同じプロトコルを使用して、ＲＮＡ合成を測定した。細胞数を、血球計数盤での直接計数によって決定した。細胞のアリコートを、等容量の０．５％トリパンブルー排除染料とともに５分間インキュベートし、そして生存細胞をスコアした。ＭＴＴ比色アッセイ（Ｍｏｓｓｍａｎ，Ｔ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ　６５：５５（１９８３））を、記載のように行った（Ｍｉｋｕｌｓｋｉら，Ｃｅｌｌ　Ｔｉｓｓｕｅ　Ｋｉｎｅｔ．２３：２３７（１９９０））。
　ＯＮＣＯＮＡＳＥ（登録商標）−免疫毒素によるバーキットリンパ腫細胞におけるタンパク質合成阻害についてのＩＣ５０を、表４に示す。
Figure 2004115529
　２４時間後にＢ細胞においてタンパク質合成を５０％阻害するために必要とされる免疫毒素の濃度は、結合していないＯＮＣＯＮＡＳＥ（登録商標）についてナノモル範囲と比較してピコモル範囲である。ＣＤ２２を発現しないＨＵＴ　１０２細胞は、ＬＬ２−ＯＮＣＯＮＡＳＥ（登録商標）免疫毒素に感受性ではなかったが、Ｂ細胞株よりも結合していないＯＮＣＯＮＡＳＥ（登録商標）に対してより感受性であった。図１を参照のこと。
　図２に示され得るように、ＯＮＣＯＮＡＳＥ（登録商標）単独では、ＬＬ２抗体に結合したＯＮＣＯＮＡＳＥ（登録商標）と比較して、２４時間後にＢ細胞リンパ腫細胞に対して細胞傷害性ではなかった。したがって、インターナライゼーションし得る抗体に結合したＯＮＣＯＮＡＳＥ（登録商標）は、結合していないＯＮＣＯＮＡＳＥ（登録商標）よりも効力があった。
　ＯＮＣＯＮＡＳＥ（登録商標）単独よりも有効であることに加えて、図３および４は、ＯＮＣＯＮＡＳＥ（登録商標）免疫毒素が、毒性部分が、ヒト非毒性ＲＮａｓｅ、好酸球由来神経毒（ＥＤＮ）（図５）、またはヒト膵臓ＲＮａｓｅ（図６）のいずれかである免疫毒素よりも、非常に効果的であったことを証明する。
　図５では、ＬＬ２またはＬＬ１抗体を、上記のようにＥＤＮに結合し、そしてＤａｕｊｉまたはＣＡ　４６バーキットリンパ腫細胞でアッセイした。［］ＬＬ１およびＬＬ２免疫毒素は、免疫毒素が抗体およびＲＮａｓｅ部分に分解されるリソソームに送達されると考えられる。ＲＮａｓｅは、リソソームを離れて、そしてリボソーム活性を妨害するサイトゾルに入る。図５に示すデータから、ＯＮＣＯＮＡＳＥ（登録商標）が、リソソームによる分解によって不活性化されないので、ＯＮＣＯＮＡＳＥ（登録商標）が、ＥＤＮよりも約２，０００倍活性であると仮定される。したがって、サイトゾルにはいるタンパク質は、インタクトのままの細胞毒素である。
　図６では、ＬＬ２−ＯＮＣＯＮＡＳＥ（登録商標）を、ＬＬ２−膵臓ＲＮａｓｅと比較した。また、約１ｎＭの濃度で、ＬＬ２−ＯＮＣＯＮＡＳＥ（登録商標）は、タンパク質合成を完全にブロックした。同じ濃度で、約７５％のタンパク質合成のみを、ＬＬ２−膵臓ＲＮａｓｅの添加によってブロックした。
　ＯＮＣＯＮＡＳＥ（登録商標）が、タンパク質合成および細胞傷害性の増加した阻害を生じるリソソームによって分解されないという仮説を試験するために、１２５−Ｉ標識したＬＬ２およびＬＬ２免疫毒素を、Ｄａｕｄｉ細胞に添加した。図７に示され得るように、指示した時間間隔後、ＬＬ２−ＯＮＣＯＮＡＳＥ（登録商標）で処理した細胞は、その溶解物中により多くの１２５−Ｉ標識したタンパク質を含み、これは、免疫毒素を、ＬＬ２−ＥＤＮおよびＬＬ２単独よりも遅い速度で分解したことを示した。したがって、ＯＮＣＯＮＡＳＥ（登録商標）はリソソーム中で分解されないようである。
　ＣＤ２２が、ハイブリッドタンパク質の抗体部分の結合によってＯＮＣＯＮＡＳＥ（登録商標）免疫毒素の毒性を媒介するという仮説を試験するために、免疫毒素を、過剰のＬＬ２抗体の存在下でアッセイした（図６）。ＯＮＣＯＮＡＳＥ（登録商標）免疫毒素の存在下で２４時間後にＤａｕｄｉ細胞で観察される細胞傷害性は、等モル量のＬＬ２によって逆転した。これらのデータは、ＣＤ２２が、バーキットリンパ腫細胞に対してＯＮＣＯＮＡＳＥ（登録商標）細胞傷害性を媒介し得ることを示す。
　実施例５：ＬＬ２−ＯＮＣＯＮＡＳＥ（登録商標）免疫毒素のインビボ効率
　インビボでのＬＬ２−ＯＮＣＯＮＡＳＥ（登録商標）の効果をテストするために、Ｄａｕｄｉ細胞を、ＳＣＩＤマウスに移植した。１日後、マウスを、ＯＮＣＯＮＡＳＥ（登録商標）およびＬＬ２−ＯＮＣＯＮＡＳＥ（登録商標）、ＬＬ２−Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ外毒素およびＬＬ２−ドキソルビシン免疫毒素で処置した。
　表５で見出され得るように、ＬＬ２−ＯＮＣＯＮＡＳＥ（登録商標）は、マウスにおいて細胞傷害性副作用（死亡）を引き起こさなかった。比較として、マウスを、同様にＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ外毒素のドメインＩＩの変異体に結合したＬＬ２で処置した。見出され得るように、この免疫毒素は致死性であった。したがって、免疫毒素の毒性部分としてのＯＮＣＯＮＡＳＥ（登録商標）は、処置した動物に毒性ではなく、したがって治療剤としてより良好に耐容されるようである。
Figure 2004115529
＊Ｋｒｅｉｔｍａｎら，Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．５３：８１９（１９９３）
ＱＤ＝毎日
ＱＯＤ＝隔日
　表６は、Ｄａｕｄｉ移植したＳＣＩＤマウスにおけるＬＬ２−ＯＮＣＯＮＡＳＥ（登録商標）およびＬＬ２−ドキソルビシンの効果を示す。マウスに、５×１０６Ｄａｕｄｉ細胞を静脈内で移植した。２４時間後、処置を、毎日５回の等用量で始めた。ドキソルビシン免疫毒素を静脈内注射し、そしてＯＮＣＯＮＡＳＥ（登録商標）免疫毒素を腹腔内に注射した。見出され得るように、重量で、ＬＬ２−ＯＮＣＯＮＡＳＥ（登録商標）の約半分の量が、全身的化学療法薬のドキソルビシンと比較して、マウスの生存を著しく増強した。
Figure 2004115529
　５×１０６ＤａｕｄｉＢリンパ腫細胞を静脈内に移植したＳＣＩＤマウスでは、腹腔内に注射されたＬＬ２−ＯＮＣＯＮＡＳＥ（登録商標）は、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）またはモノクローナル抗体ＬＬ２単独で処置したマウスと比較して、マウスの生存を延長することを証明した。図７は、ＰＢＳで処置したすべての動物が、重篤なＢ細胞リンパ腫を発症し、そして３５日目までに屠殺したことを示す。ＬＬ２で処置した動物の全てを、リンパ腫のため３７日目までに屠殺した。他方では、免疫毒素で処置した動物の全ては、３７日にわたって生存した。免疫毒素で処置した最後の動物を、４６日目に屠殺した。
　図８は、２×１０６Ｄａｕｄｉ細胞を腹腔内に移植し、次いで５００μｇのＬＬ２−ＯＮＣＯＮＡＳＥ（登録商標）を腹腔内に１００μｇ／投与／日で処置したＳＣＩＤマウスが、１００日以上生存したことを示す。ＰＢＳ、ならびに結合していないＬＬ２およびＯＮＣＯＮＡＳＥ（登録商標）で処置した動物の同齢集団は、時間枠内に疾患のいくつかの徴候を示した。ＰＢＳコントロール群についての生存の平均時間は７１日であり、ＬＬ２＋ＯＮＣＯＮＡＳＥ（登録商標）については、生存の平均時間は８０日であり、そしてＬＬ２−ＯＮＣＯＮＡＳＥ（登録商標）処置したマウスは、１１２日よりも長く生存した。
　最後に、図９は、ＬＬ２−ＯＮＣＯＮＡＳＥ（登録商標）が、ＯＮＣＯＮＡＳＥ（登録商標）単独またはＲＦＢ４−脱グリコシル化リシンＡ鎖よりも毒性が少ないことを示す。３０ｍｇ／ｋｇ　ＯＮＣＯＮＡＳＥ（登録商標）の致死用量と比較して、３００ｍｇ／ｋｇ　ＬＬ２−ＯＮＣＯＮＡＳＥ（登録商標）で処置したマウスは、生存しただけでなく、実験の経過中に体重が増加した。ＲＦＢ４は、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ外毒素フラグメントに結合した場合、免疫毒素が１日当たりに１回のみ与えられるマウスモデルにおいて１ｍｇ／ｋｇのＬＤ５０を有した（Ｍａｎｓｆｉｅｌｄら，Ｂｉｏｃｏｎｊ．Ｃｈｅｍ．７：５５７（１９９６））。
　これらのインビボ結果は、ＬＬ２−ＯＮＣＯＮＡＳＥ（登録商標）が、ＯＮＣＯＮＡＳＥ（登録商標）単独、ＬＬ２単独、ならびにＬＬ２−Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ外毒素およびＬＬ２−ドキソルビシンの免疫毒素と比較して、優れたＢ細胞毒素であることを示す。毒性研究は、ＬＬ２−ＯＮＣＯＮＡＳＥ（登録商標）に十分に耐容であり、もしあるとしても副作用はほとんどないことを示す。
　本明細書中、上記の特許および特許出願を含むすべての刊行物は、参考として本明細書に援用される。
　上記の発明は、明確さおよび理解の目的のためにいくらか詳細に説明されている。形態および詳細の種々の組み合わせもまた、本発明の範囲から逸脱せずに行われ得ることは明らかである。
図１は、ＯＮＣＯＮＡＳＥ（登録商標）が、免疫毒素ＬＬ２−ＯＮＣＯＮＡＳＥ（登録商標）よりもＨＵＴ　１０２　Ｔ細胞リンパ腫細胞（ＬＬ２によって認識されるＣＤ２２マーカーを有さない）に対してより細胞傷害性であることを示す。 図２は、ＯＮＣＯＮＡＳＥ（登録商標）単独と比較した場合、バーキットリンパ腫細胞株に対するＬＬ２−ＯＮＣＯＮＡＳＥ（登録商標）のより優れた細胞傷害性を証明する。 図３は、ＣＤ２２に対する抗体に結合したＯＮＣＯＮＡＳＥ（登録商標）が、抗ＣＤ２２抗体に結合したＥＤＮよりもタンパク質合成がより阻害的であることを示す。ＥＤＮは、本文に記載のようにヒト非毒性ＲＮａｓｅである。 図４は、ＯＮＣＯＮＡＳＥ（登録商標）が、ヒト膵臓ＲＮａｓｅと比較して、抗体に結合した場合にタンパク質合成がより阻害的であることを示す。 図５Ａおよび５Ｂは、１２５Ｉ−標識したＬＬ２−ＯＮＣＯＮＡＳＥ（登録商標）が、ＬＬ２抗体またはＬＬ２−ＥＤＮ免疫毒素ほど迅速にＤａｕｄｉ細胞のリソソームによって分解されないことを証明する。図５Ａは、細胞に保持されるＲＮａｓｅ物質の割合を示し、そして図５Ｂは、分解されそして上清に放出されるＲＮａｓｅ物質の割合を示す。 図６は、ＬＬ２抗体がＬＬ２−ＯＮＣＯＮＡＳＥ（登録商標）の細胞傷害性効果を減少させることを証明する。ＬＬ２が、　ＣＤ２２への結合についてＬＬ２−ＯＮＣＯＮＡＳＥ（登録商標）と競合し、そしてＯＮＣＯＮＡＳＥ（登録商標）のインターナリゼーションを抑制し、そのため細胞傷害性を減少させると考えられる。 図７は、ＬＬ２−ＯＮＣＯＮＡＳＥ（登録商標）がＢ細胞リンパ腫からＳＣＩＤマウスを防御したをこと示す生存グラフである。５×１０６Ｄａｕｄｉ細胞を、マウスに腹腔内移植した。２４時間後、マウスを５００μｇの示された化合物で静脈内処理した。 図８は、ＬＬ２−ＯＮＣＯＮＡＳＥ（登録商標）が２×１０６のＤａｕｄｉ細胞の腹腔内移植からＳＣＩＤマウスを完全に防御したことを示す生存グラフである。マウスを、５００μｇの示された化合物（１００μｇを５日間毎日）を用いて移植の２４時間後に処理した。 図９は、ＯＮＣＯＮＡＳＥ（登録商標）単独およびＩＴ−ｄｇＲＴＡ（ＲＦＢ４−脱グリコシル化リシンＡ鎖）と比較した場合、ＬＬ２−ＯＮＣＯＮＡＳＥ（登録商標）免疫毒素の減少した毒性を示す。薬物を、１日当たり２時間毎に４回で５日間投与した。矢印は、各それぞれの処理でのマウスの死亡が見られた日数を示す、すなわち、３０ｍｇ／ｋｇ　ＯＮＣＯＮＡＳＥ（登録商標）で処理したマウスは４日目に死亡が見られ、そして５０ｍｇ／ｋｇ　ＩＴ−ｄｇＲＴＡで処理したマウスは７日目に死亡が見られた。（配列表）
Figure 2004115529
Figure 2004115529

Claims (1)

  1. 　Ｂ細胞に特異的な表面マーカーに対する抗体に連結した測定可能なリボ核酸分解活性を有するｏｎｃタンパク質を含む、選択的細胞傷害性試薬。
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