DE3688671T3 - Menschliches Interferon-beta2A ; Vektoren, die Gene enthalten, die für das genannte Interferon kodieren; Zellinien, die dieses produzieren und Verwendung des genannten Interferons als Pharmazeutikum. - Google Patents

Description

• Interferon ist ein bedeutendes antivirales und gegen Tumoren wirkendes Protein, das vom menschlichen Körper erzeugt wird. Wegen seiner Artspezifität ist bei einer klinischen Verwendung von Interferon humanes Interferon erforderlich. Auf der Grundlage ihrer Neutralisierung durch Antikörper sind drei Typen von Interferonen definiert worden, die Interferon-α, das hauptsächlich von Leukozyten erzeugt wird, Interferon-β, hauptsächlich erzeugt von Fibroblasten, und Interferon-γ, hauptsächlich von T-Lymphozyten erzeugt, umfassen.
• Die vorherrschende Interferonart, die von humanen Fibroblasten als Antwort auf ds RNAs erzeugt wird, ist das 20 kD Glycoprotein IFN-β&sub1;, für das eine 0,9 kb RNA kodiert, die von einem Intron-freien Gen auf dem Chromosom 9 transkribiert wird. Es sind jedoch in humanen Fibroblasten, die mit Poly(rI)(rC) und durch eine anschließende Cycloheximid(CHX)- Actinomycin-D-Behandlung induziert worden sind, weitere mRNAs beobachtet worden, die eine IFN-Aktivität ergeben, wenn sie in Froschoozyten mikroinjiziert werden. Bei der Klonierung der IFN-β&sub1;-cDNA sind cDNA-Klone einer anderen co-induzierten 1,3 kb RNA isoliert worden, die in Retikulozytenlysaten für ein 23 bis 26 kD Polypeptid kodiert und in Oozyten eine antivirale humane IFN-Aktivität erzeugt (J. Weissenbach et al. 1980 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 7152-7156; GB-B-2 063 882)
• Da diese Aktivität durch Antikörper gegen IFN-β&sub1; inhibiert wurde, wurde sie IFN-β&sub1; genannt. Das Proteinprodukt der IFN-β&sub2;-RNA ist von IFN-β&sub1; immunologisch verschieden, obwohl die biologischen Aktivitäten der beiden Proteine von den gleichen Antikörpern kreuzneutralisiert werden. Die IFN-β&sub2; 1,3 kb RNA stammt eindeutig von einem anderen Gen als IFNβ&sub1;, da IFN-β&sub2;-RNA in Maus-Mensch-Hybriden, denen das Chromosom 9 fehlt, gebildet wird (U. Nir (1984) Doktorarbeit, Weizmann Institute of Science, Rehovot, Israel).
• In der deutschen Patentanmeldung P 30 43 981 wird ein Verfahren zur Herstellung von Interferon-β&sub2; in gereinigter Form offenbart. Das Interferon-β&sub2; wird durch Isolieren der DNA, die die für Interferon-β&sub2; in menschlichen Zellen kodierende Nukleotidsequenz enthält, nach Kultivieren dieser Zellen, die zur Erzeugung von Interferon-β&sub2; fähig sind, wenn sie einem Interferoninduktor ausgesetzt werden, erzeugt. Die mRNA dieser induzierten Zellen wird extrahiert und gereinigt. Anschließend wird die mRNA in DNA transkribiert und die DNA in einen geeigneten Vektor kloniert.
• Es konnte gezeigt werden, (Zilberstein et al., in Dianzani und Rossi et al., (Hrsg.) The Interferon System, Serono Symposia, Band 24, Raven Press, N. Y. 73-83 (1985)), daß es ein zweites für IFN-β&sub2; kodierendes Gen gibt, das, wenn es isoliert und in Hamster- oder Mauszellen transfiziert wird, nach Induktion durch ds RNA und Cycloheximid eine humanspezifische IFN-Aktivität erzeugt. Das erzeugte IFN hat die gleichen Eigenschaften, die IFN-β&sub2; zugeschrieben werden, hat jedoch keine identischen Aminosäuresequenzen. Die von den beiden Genen erzeugten Proteine werden IFN-β2A bzw. IFN-β2B genannt.
• Revel et al. in Stewart et al., (Hrsg.), The Biology of the Interferon System 1985, Elsevier Science Publishers, 207-216 (1986) offenbaren die mutmaßliche Aminosäuresequenz von IFN-β2A. Es stellte sich jedoch später heraus, daß die veröffentlichte Sequenz 56 unrichtige Aminosäuren an ihrem N-terminalen Ende umfaßte.
• Dementsprechend ist es eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, eine cDNA bereitzustellen, die für humanes IFN-β2A kodiert.
• Weitere Aufgabe der Erfindung ist es, einen rekombinanten Vektor zur Verfügung zu stellen, der eine IFN-β2A-cDNA und eine Promotorsequenz enthält, die eine Transkriptionskontrolle über das Interferon-Gen ausüben kann.
• Weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, Zellen bereitzustellen, die biologisch aktives humanes IFN-β2A erzeugen.
• Weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, solche Zellen bereitzustellen, die substantielle Mengen eines solchen IFN-β2A'S erzeugen.
• Weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein Verfahren für die Erzeugung von biologisch aktivem humanen IFN-β2A durch rekombinante DNA-Technologie bereitzustellen.
• Weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, eine cDNA bereitzustellen, die, wenn sie mit einem starken viralen Transkriptionspromotor fusioniert wird und in Hamster- oder Mauszellen transfiziert wird, substantielle Mengen von biologisch aktivem humanen IFN-βzA erzeugt.
• Demgemäß stellt die vorliegende Erfindung eine cDNA bereit, bestehend im wesentlichen aus der in Fig. 1 gezeigten cDNA, die für humanes Interferon-β2A mit der in Fig. 1 gezeigten Aminosäuresequenz kodiert.
• Die Erfindung stellt auch einen rekombinanten Vektor bereit, umfassend die vorstehende cDNA und umfassend weiterhin regulatorische Bereiche, die auf eine Art und Weise angeordnet sind, daß die Expression von humanem Interferon-β2A möglich ist.
• Zellinien, die mit dem vorstehend erwähnten Vektor transformiert sind, sowie ein Verfahren zum Herstellen von humanem Interferon-β2A werden ebenfalls bereitgestellt.
• Erfindungsgemäß ist die Existenz biologisch aktiver humaner Interferon-β&sub2;(IFN-β&sub2;)-Moleküle bestätigt worden und diese Moleküle werden mittels rekombinanter DNA-Technologie erzeugt. IFN-β&sub2; ist ein Glycoprotein, das von humanen Fibroblasten ausgeschieden wird, die durch doppelsträngige (ds) RNA oder Viren dazu veranlaßt werden, Interferon zu erzeugen. IFN-β&sub2; beläuft sich auf ungefähr 5% der gesamten IFN-Aktivität, die von den Fibroblasten erzeugt wird. Die Aminosäuresequenz von IFN-β&sub2;, die durch cDNA-Sequenzierung bestimmt wurde, weist auf nur ungefähr 20% Gesamthomologie mit der von anderen humanen Interferonen hin, die von solchen humanen Zellen erzeugt werden (IFN-β&sub1; und IFN-α's).
• Erfindungsgemäß kann eine humane cDNA, die für IFN-β2A kodiert, kloniert werden und mit einem starken viralen Transkriptionspromotor fusioniert werden. Hamsterzellen, die mit der fusionierten cDNA oder dem fusionierten Gen transformiert werden, erzeugen konstitutiv eine humanspezifische Interferonaktivität, die eine virale Replikation und cytopathische Effekte inhibiert und Proteine induziert, die typisch für die biologische Antwort menschlicher Zellen auf Interferone sind. Ein zweites für IFN-β&sub2; kodierendes Gen wird ebenfalls offenbart, das, wenn es isoliert und in Hamster- oder Mauszellen transfiziert wird, nach Induktion durch ds RNA und Cycloheximid eine humanspezifische IFN-Aktivität erzeugt. Da das von beiden Genen erzeugte IFN die IFN-β&sub2; zugeschriebenen Eigenschaften hat, aber die Aminosäuresequenzen nicht identisch sind, werden die von den beiden Genen erzeugten Protaine IFN-β2A bzw. IFN-β2B genannt.
Figurenbeschreibung
• Fig. 1 zeigt die Restriktionskarte, Sequenzierungsstrategie und Nukleotidsequenz der IFN-β2A-cDNA, bestimmt bei Klon AE20, der durch Fusionieren der cDNA-Klone E474 und A341 an ihrer Xba-1-Stelle gebildet wurde (Weissenbach et al., (1980), s. o.). Die 5'.-terminale Sequenz wurde anhand des in Fig. 2 gezeigten genomischen Klones IFA-2 vervollständigt. Die Numerierung beginnt am Start S - 1 der Fig. 3 und 4. Die Aminosäuresequenz des IFN-β2A-Proteins ist abgeleitet.
• Fig. 2 zeigt die Struktur des genomischen Klons IFA-2, der das IFN-β2A-Gen enthält. A132 ist ein Subklon eines EcoRI- Segmentes von IFA-2 in pBR322. Die schattierten Bereiche sind Genbereiche, die mit den cDNA-Klonen A341 und E474 (Weissenbach et al. (1980), s. o.) hybridisieren. Die Positionen der beiden RNA-Starts (cap 1 und 2) und die TATA- Boxen sind gezeigt. In der RNA ist das längste offene Leseraster (ORF) von 212 Aminosäuren (Fig. 1) in schwarz gezeigt. M. C. weist auf ein zweites internes ATG im selben Leseraster hin. In der gesamten IFN-β2A-cDNA ist kein anderes langes offenes Leseraster gefunden worden (Fig. 1).
• Fig. 3 zeigt die S1-Nuklease-Analyse der 5'-Starts in der IFN-β&sub2;-RNA. Die DNA-Sonde, ein an der BstNl-Stelle markiertes Fragment aus dem Subklon A132 des IFA-2-Genes (Fig. 2), wurde mit der Gesamt-RNA aus diploiden Fibroblasten hybridisiert, die (von links nach rechts) wie folgt behandelt worden waren: Sensibilisieren (Primen) mit IFN-β&sub1; 200 E/ml, 16 Std.; Sensibilisieren und Poly(rI)(rC) (pIC) 50 ug/ml, 3,5 Std.; Sensibilisieren und Cycloheximid (CHX) 50 ug/ml, 3,5 Std.; Sensibilisieren und pIC plus CHX, 3,5 Std.; Sensibilisieren und CHX für 6,5 Std.; keine Sensibilisierung und pIC, 3,5 Std.; gleiches CHX, 3,5 Std.; gleiches pIC plus CHX, 3,5 Std. S-1 und S-2 sind die von den zwei RNA-Starts von Fig. 2 erzeugten Signale.
• Fig. 4 zeigt die Sequenz des Promotorbereiches des IFA-2- Genes, das für IFN-β2A kodiert. Die Sequenz eines Teiles von Subklon A132 (Fig. 2) ist im Vergleich zu IFN-β&sub2;-cDNA gezeigt. S1 und S2 sind die zwei RNA-Starts, die in Fig. 3 bestimmt worden sind. Das Initiator-ATG ist mit X markiert. Das erste Intron beginnt bei intr 1.
• Fig. 5 zeigt die Fusion der IFN-β2A-cDNA mit dem frühen 5V40-Promotor. Durch Subklonieren des 5'-Xhol-BamH1 (Xh-B)- Segmentes des IFA-2-Genes (von 5,5 kb bis 7,5 kb in Fig. 2), fusioniert mit einem synthetischen Cla&sub1;-Xho&sub1;-Adaptor von 26 bp (der die 5'-cDNA-Sequenz wieder herstellt), in ein mit Cla&sub1;- und BamH1-geschnittenes pBR-Plasmid wurde zunächst ein Plasmid pSVIFA2-II konstruiert. Das 3'-BamH&sub1;-HindIII (B-H)- Gensegment (von 7,5 kb bis 10,5 kb in Fig. 2), subkloniert in ein HindIII, BamH&sub1;-geschnittenes pBR-Plasmid, wurde unter Verwendung der HindIII benachbarten Cla&sub1;-Stelle in pBR322 ausgeschnitten und mit dem oben genannten 5'-Segment ligiert, um das vollständige IFA-2-Gen zu erhalten. Ein Vektor pSVE3, geschnitten mit HindIII wie beschrieben in Y. Chernajovsky et al. (1984) DNA 3: 294-308, wurde mit Clal-Linkern wieder geschlossen (unter Bildung von pSVCla), und das oben genannte IFA-2-Gen in die Cla&sub1;-Stelle von pSVCla in gleicher Orientierung wie der frühe SV40-Promotor unter Bildung von pSVIFA2-II eingeführt. Plasmid pSVIFA2-I wurde ähnlich konstruiert, aber die Xhol-Stelle von IFA-2 wurde vor der Einführung in pSVE3 direkt mit der Cla&sub1;-Stelle von pBR fusioniert. Um das Plasmid pSVCIFβ2 zu erhalten, bei dem die IFN-β2A-cDNA an den SV40 Promotor fusioniert ist, wurde die oben genannte pSVIFA2-II-DNA, geschnitten mit Xba&sub1;, partiell mit Xmn&sub1; geschnitten, um die 60 Basenpaare stromabwärts von der Xho&sub1;-Stelle in der IFN-β&sub2;-cDNA-Sequenz angeordnete Xmn&sub1;-Stelle zu öffnen (Fig. 1), aber eine im amp-Gen des Vektors lokalisierte Xmn&sub1;-Stelle nicht zu öffnen. Mit dieser Konstruktion wurde das Xmn&sub1;-Xba&sub1;-Segment des IFN-β&sub2;-cDNA-Klones AE20 (Koordinaten 92-566 in Fig. 1) ligiert, wodurch die vollständige IFN-β&sub2;-cDNA-Sequenz, wie in der Figur gezeigt, wieder hergestellt wurde. EES ist der "early-early" (frühe-frühe) RNA-Start des SV40 T-(Antigen)- ag-Genes; ATG ist das IFN-β&sub2;-Initiationskodon; pA sind IFN-β&sub2;- bzw. SV40-Polyadenylierungsstellen. pSVCIFβ&sub2; DNA wurde mit einem pDHFR-Plasmid in CHO-K&sub1;-DHFR&supmin; Zellen cotransfiziert, wie in Y. Chernajovsky et al. (1984), (s. o.), beschrieben, und die Klone wurden auf ihre antivirale Human-IFN-Aktivität in FS11-Zellen unter Verwendung von Vesicular Stomatitis Virus (VSV) getestet. Eine Genamplifikation wurde erreicht, indem die CHO-Klone auf Methotrexat (MTX)-Resistenz selektioniert wurden. Der Test des Kulturmediums von CHO-SVCIFβ&sub2; B132-5M- Zellen, die gegen 250 nM MTX resistent sind, ist im unteren Teil der Figur gezeigt. Nach der Entwicklung des cytopathischen Effektes von VSV wurden die Zellen in der Mikrotiterplatte mit Methylenblau gefärbt. Serielle Zweifachverdünnungen des Mediums sind von links nach rechts vorgenommen worden. Durch Vergleich mit dem IFN-Standard (ST) und nicht-transfizierten CHO-Zellen wurde ein Titer von 300 E rIFN-β&sub2; pro ml berechnet.
• Fig. 6 zeigt die Ergebnisse eines Tests von (2'-5') Oligo A-Synthetase mit Poly(rI)(rC) Agarose-gebundenen NP40-Extrakten (M. Revel et al. (1981) Meth. Enzymol. 79: 149-161) aus humanen FS11-Fibroblasten, die zuvor 16 Std. einem Medium ausgesetzt worden waren von a) Cos7-Zellen zwei Tage nach Transfektion mit pSVIFA2-II-DNA (beschrieben in Fig. 5) (4 Bahnen zur Linken), b) Hamster CHO 51-15-Zellen, die mit der pSVIFA2-I-DNA aus Fig. 5 stabil transformiert waren (die nächsten 4 Spuren), c) CHO MEIF-5-Zellen, die das IFN- β&sub1;-Gen exprimieren (Y. Chernajovsky et al. (1984), (s. o.) (die nächsten beiden Spuren); d) CHO-Zellen mit nur dem DHFR-Gen (nächste Spur); e) frischem Medium (nicht ind.). Die antivirale IFN-Aktivität, die pro ml des den FS11-Zellen zugesetzten Mediums gemessen wurde, ist angegeben. Es wird eine Elektrophorese von Phosphatase-behandeltem, ³²P-α-ATP markiertem (2'-5') Oligo A-Produkt gezeigt.
• Fig. 7 ist ein Vergleich der Aminosäuresequenzen zwischen Typ I-Human-IFNs. Die Aminosäuren, dis in IFN-β&sub1; und den verschiedenen IFN-α's (gezeigt sind αA, αC, Austausche in anderen α's ausschließlich αE, und IFN-α Klasse II) konserviert sind, sind durch * über der IFN-β&sub1;-Sequenz markiert. Aminosäuren, die in IFN-β&sub2; konserviert sind, sind über dessen Sequenz durch * gekennzeichnet, wenn sie in allen Typ I-IFNs konserviert sind, oder durch Quadrate, wenn sie in einigen IFNs konserviert sind. IFN-β2A wurde durch Vergleich von Hydropathieplots (siehe Text) angeordnet und von der angenommenen Prozessierungsstelle aus numeriert.
• Fig. 8 zeigt die Restriktionskarten von zwei verschiedenen humanen IFN-β&sub2;-Genen, die in Nagetierzellen exprimiert werden. Die IFA-11 DNA (IFN-β2B-Gen) wurde entweder in CHO- oder L-Zellen transfiziert und exprimierte nach Induktion IFN-β-Aktivität (Tabelle 1).
• Fig. 9 zeigt einen für IFN-β&sub2; spezifischen Immunkompetitionstest mit R-Antikörpern, um zu zeigen, daß humane FS11-Fibroblastenzellen das IFN-β&sub2;-Protein als Antwort auf die beiden Cytokine Interleukin-I (Il-I) und Tumornekrosefaktor (TNF-α) ausscheiden. Beide Cytokine induzieren die Synthese und Ausscheidung des IFN-β&sub2;-Proteins auf zwei Niveaus, die durch den Immuntest auf 10 bis 20 E/ml IFN-β&sub2; geschätzt worden sind. Eine optimale IFN-β&sub2;-Induktion wurde bei einer Konzentration von rIL-1α von 4 E/ml (0,13 ng/ml) gesehen. Die optimale Konzentration von TNF-α für die IFN-β&sub2;-Induktion (400 E/ml; 40 ng/ml) war höher als die, die für eine cytolytische Wirkung auf empfindliche Zellen (0,1 ng/ml) erforderlich ist, und sogar höher als die, die eine optimale Wachstumsstimulation für diploide Fibroblasten ergibt (2 ng/ml).
Eingehende Beschreibung bevorzugter Ausführungsformen
• Die Existenz von Interferon-β&sub2; wurde im Verlauf von Versuchen zur Isolierung genetischen Materials, das die für Interferon in humanen Fibroblastenzellen kodierende Nukleotidsequenz enthält, entdeckt. In diesem Verfahren wurden Fibroblastenzellen zur Produktion induzierbarer Interferon-mRNA mit einem geeigneten exogenen Faktor induziert und die mRNAs anschließend extrahiert. Zum gleichen Zeitpunkt wurden die mRNAs einer nicht-induzierten Kultur der gleichen Wirtszellen extrahiert. Von den mRNAs sowohl der induzierten Kultur als auch der nicht-induzierten Kontrollkultur wurden cDNA- Sonden synthetisiert, wobei die korrespondierenden mRNAs als Matrizen verwendet wurden (induzierte cDNAs und nichtinduzierte cDNAs). Dann wurden von den aus der induzierten Kultur extrahierten mRNAs abgeleitete doppelsträngige cDNAs synthetisiert und diese cDNAs wurden in entsprechende Vektoren insertiert und in geeignete Mikroorganismen transfiziert. Die Mikroorganismen wurden unter Bedingungen kultiviert, die geeignet sind, eine selektive Entwicklung von Mikroorganismenkolonien des modifizierten Vektors (Initialkolonien) zu verursachen. Duplikatkolonien der Initialkolonien wurden gebildet und die DNAs sowohl der Initial- als auch der Duplikatkolonien in situ freigesetzt. Die DNAs eines der beiden Sets von Duplikatkolonien wurden mit den cDNA-Sonden hybridisiert, die mit den aus der induzierten Kultur extrahierten mRNAs synthetisiert worden waren, und das andere der beiden Sets von Duplikatkolonien wurde mit den cDNA-Sonden hybridisiert, die mit den aus der nicht-induzierten Kultur extrahierten mRNA synthetisiert worden waren. Klone, die selektiv mit der induzierten cDNA-Sonde hybridisierten, aber nicht mit den nicht-induzierten cDNA-Sonden, wurden ausgewählt, und ihre DNAs gewonnen. Diese klonierten DNAs wurden weiter untersucht, um solche DNAs zu bestimmen, die mit der RNA hybridisieren, die in Froschoozyten oder Retikulozytenlysaten in Interferon translatierbar ist, wobei diese DNAs im wesentlichen Gene sind, die für Interferon kodieren oder genug von der für Interferon kodierenden Sequenz enthalten, um verwendet werden zu können, um eine vollständige Interferon-DNA zu erhalten.
• Während dieser Untersuchung wurde festgestellt, daß zwei verschiedene für Interferon kodierende mRNAs aus humanen Fibroblastenzellen, nachdem diese entsprechend induziert worden waren, isoliert werden konnten. Nach einer Glycerin- Gradientenzentrifugation sedimentiert die kleinste mRNA bei 11S und ergibt nach Translation in einem zellfreien System ein Protein mit einem Molekulargewicht von 20000, das selektiv durch Antikörper präzipitiert wird, die gegen eines der Interferone hergestellt worden sind, das aus diesen Zellen gereinigt werden kann. Dieses Protein ist humanes Interferon-β&sub1;, dessen Aminosäuresequenz von E. Knight et al., Science, 207, (1980) 525-526, partiell bestimmt worden war. Von der größten mRNA wurde festgestellt, daß sie bei 14S sedimentiert und ein Protein mit einem Molekulargewicht von 23000 ergibt, das durch Antikörper gegen eine weniger gereinigte Fibroblasten-Interferonpräparation präzipitiert wurde. Dieses Protein wird humanes Interferon-β&sub2; genannt. cDNA- Klone, die mit einer mRNA hybridisierbar sind, die in Interferon-β&sub2; translatiert wird, wurden auf eine solche Weise hergestellt, und die IFN-β&sub2;-cDNA-Sonde wurde daraus erzeugt.
• Von zwei solchen IFN-β&sub2;-Klonen, A341 und E474, wurde festgestellt, daß sie überlappende Sequenzen enthalten; sie wurden fusioniert, um die IFN-β2A-AE20-cDNA (Fig. 1) zu rekonstituieren. Die Nukleotidsequenz dieser IFN-β2A-cDNA wurde bestimmt und ergab ein offenes Leseraster von 212 Aminosäuren, woraus ein Protein von 23500 Dalton vorhergesagt wurde. Transkriptions-Translations-Experimente bestätigten, daß diese cDNA für ein solches Protein kodiert.
• Aus einer Human-Genbank von Blutzellen-DNA erwachsener Menschen, die nach EcoRI-Partialverdau in λ Charon 4A kloniert worden war (Y. Mory et al. (19819 Eur. J. Biochem. 120: 197- 202), wurden zwei genomische Klone, IFA-2 und IFA-11, die an eine solche IFN-β&sub2;-cDNA-Sonde hybridisierten, isoliert. Der Klon IFA-2 enthält ein Gen mit mindestens 4 Exons, die an verschiedene Segmente der klonierten cDNA (Fig. 1) hybridisieren. Eine Xhol-Stelle, die nahe dem 5'-Ende der AE20- cDNA vorhanden war, gestattete, das genomische Segment A132 (Fig. 2), das das erste, 70 bp stromabwärts von dieser Xho&sub1;-Stelle endende IFA-2-Exon enthält, zu kartieren. Durch S1-Nuklease-Analyse mit DNA-Sonden, die an einer BstN1-Stelle 40 bp nach der Xhol-Stelle markiert waren, wurde festgestellt, daß induzierte humane FS11-Fibroblasten IFN-β&sub2;-RNA mit zwei verschiedenen 5'-Enden, S-1 und S-2, die durch 20 Nukleotide getrennt sind (Fig. 3), enthalten. Jedem dieser beiden Starts geht in dem IFA-2-Gen eine mögliche TATA-Box bei -30 (Fig. 4) voraus. Die bei S-2 endende RNA scheint unter einer Vielzahl von Induktionsbedingungen (Fig. 3) häufiger vorzukommen als die längere RNA. Beide RNA 5'-Enden wurden mit cytoplasmatischer RNA anstelle von Gesamtzell-RNA ebenfalls beobachtet. Es ist daher offensichtlich, daß beide RNAs in humanen Zellen gebildet werden und aktiv sind. Beide IFN-β2A-RNAs werden in humanen Fibroblasten durch Poly(rI)- (rC) induziert und die Induktion wird durch Sensibilisieren mit IFN stimuliert, wie im Fall von IFN-β&sub1;-RNA in diesen Zellen (U. Nir et al. (1984) Nucl. Acids Res. 12: 6979-6993). Eine verlängerte Behandlung mit CHX (6,5 Std.) induziert IFN-β&sub2;-RNA ebenfalls, eine kürzere (3,5 Std.) CHX-Behandlung ist jedoch nur mit Poly(rI)(rC) wirksam (Fig. 3). Die geringe Induktion von IFN-β2A-RNA durch CHX ohne ds RNA unterscheidet dieses Gen von IFN-β&sub1;.
• Es wurden DNA-Konstruktionen für die Expression des IFA-2- Genes unter der Kontrolle des frühen SV40 Genpromotors hergestellt. Ein 4,8 kb-Segment der IFA-2-DNA wurde über ein synthetisches Oligonukleotid an pSVE3-DNA fusioniert (Y. Chernajovsky et al. (1984), s. o.), so daß das ATG-Kodon 150 bp stromabwärts vom frühen SV40 RNA Start liegt (pSVIFA2-II, siehe Legende, Fig. 5). Nach Transfektion der pSVIFA2-II- DNA in Cos7-Affenzellen (Y. Gluzman (1981) Cell 23: 175-182), wurden in Northern-Blotts zwei RNAs von 1,35 und 2,2 kb durch IFN-β&sub2;-cDNA nachgewiesen; diese beiden RNAs würden Transkripten entsprechen, die bei der IFN-β&sub2;- bzw. SV40-Polyadenylierungsstelle enden (Fig. 5). Das Medium der Cos7-Zellen wurde während einer transienten Expression der pSVIFA2-II-DNA durch Inhibition des cytopathischen Effektes von VSV auf humane FS11- und Wish-Zellen getestet, wie in D. Novick et al.,(1983), J. Gen. Virol. 64: 905-910, beschrieben. Zwei Tage nach der Transfektion konnte eine antivirale Aktivität eindeutig nachgewiesen werden (Tabelle 1). Die spezifische antivirale Aktivität von IFN-β2A pro Einheit Protein ist auf 30 bis 100 mal niedriger als die von IFN-/31 und näher der von IFN-α&sub1; (5-10 · 10&sup6; Einheiten/mg) geschätzt worden. Die mit transienter Expression des IFA-2-Genes beobachteten IFN-Titer betrugen, wie erwartet, ungefähr 3% dessen, was mit dem IFN-β&sub1;-Gen unter der Kontrolle des gleichen SV40-Promotors beobachtet wird (Tabelle 1). Die Erzeugung von IFN-β&sub2;-Aktivität durch pSVIFA2-II-DNA-Zellen wurde weiter durch Induktion der (2'-5') Oligo A-Synthetase (M. Revel et al. (1981), s. o.) in FS11-Zellen, die dem Medium der transfizierten Cos7-Zellen ausgesetzt wurden (Fig. 6), gezeigt. Die Induktion war dosisabhängig und entsprach quantitativ der antiviralen Aktivität.
• Das IFA-2-Gen wurde ebenfalls an den frühen SV40-Promotor direkt an der Xho&sub1;-Stelle nahe S-2 fusioniert (pSVIFA2-I- DNA, Legende von Fig. 5). Hamster CHO-K1 DHFR&supmin; Zellen wurden mit pSVIFA2-I- und pSVDHFR- (Y. Chernajovsky et al. (1984), s. o.) DNAs cotransformiert und eine stabil transformierte Linie SI-15 wurde isoliert. Diese Zellinie erzeugt konstitutiv 10 bis 50 E/ml antiviraler IFN-Aktivität, gemessen mit humanen FS11- und Wishzellen, während CHO-Zellen, die nur mit pSVDHFR allein transformiert werden, kein humanes IFN erzeugen (Tabelle 1). Durch Konzentrieren des Mediums von SI-15-Kulturen konnten rIFN-β2A-Lösungen mit Titern von ungefähr 3000 E/ml regelmäßig erhalten werden. Dieses rIFN-β2A hat die für ein humanes IFN erwarteten Eigenschaften und induziert die (2'-5') Oligo A-Synthetase in FS11-Zellen selbst bei geringen Konzentrationen von 1 E/ml (Fig. 6). Das von CHO SI-15-Zellen konstitutiv erzeugte rIFN-β2A zeigte eine humanspezifische Induktion der mRNAs für (2'-5') Oligo A-Synthetase, C56 und HLA in Gegenwart von Cycloheximid, seine antivirale Aktivität wurde durch polyklonale und monoklonale Antikörper gegen IFN-β&sub1; (aber nicht durch Antikörper gegen IFN-α oder IFN-γ) neutralisiert und es wirkte auf Maus-Mensch-Hybride nur, wenn sie das humane Chromosom 21 tragen, das das Gen für den Typ I-IFN-Rezeptor trägt. Diese weiteren Eigenschaften der biologischen Aktivität von rIFN-β2A zeigen überzeugend, daß es direkt als ein IFN wirkt und nicht ein Induktor von IFN-β&sub1; ist.
• Verbesserte Ausbeuten von rIFN-β2A wurden mit DNA-Konstruktionen erhalten, die die IFN-β2A-cDNA-Sequenzen an den frühen SV40-Promotor fusioniert enthielten (pSVCIFβ2, gezeigt in Fig. 5), wenn diese DNA, cotransfiziert mit pSVDHFR in CHO-Zellen, wie oben, durch Selektion von gegen steigende Konzentration von Methotrexat resistenten Zellen amplifiziert wurde. Ohne Amplifikation erzeugten die pSVCIFβ2A transformierten CHO-Zellen (z. B. Klon B-132) Spiegel einer IFN-β2A Aktivität ähnlich der von SI-15-Zellen (Tabelle 2) Nach Selektion auf Resistenz gegen Methotrexat wurden jedoch höhere Ausbeuten mit bis zu 800 E/ml (Tabelle 2) beobachtet.
• Es war möglich, aus solchen Klonen das IFN-β2A-Protein zu immunpräzipitieren, das in das Kulturmedium ausgeschieden wurde, und, wenn die Zellen mit ³&sup5;S-Methionin markiert worden waren, das IFN-β2A-Protein durch Dodecylsulfatpolyacrylamid-Gelelektrophorese zu analysieren. Es wurde festgestellt, daß die Größe des ausgeschiedenen rIFN-β2A 21000 Dalton betrug. Tatsächlich haben Experimente gezeigt, daß das primäre Translationsprodukt von IFN-β2A-RNA von 23 bis 26 kD in Retikulozytenlysaten in vitro durch pankreatische Hunde-Pankreas-Membnan zu einem kürzeren 21 kD Protein weiterverarbeitet (prozessiert) wird, und daß induzierte humane Fibroblasten ein 21 kD Protein erzeugen, das immunologisch einem IFN-β2A-RNA-Produkt mit 26 kD ähnlich ist, aber von IFN-β&sub1; unterschiedlich ist. Der N-Terminus des reifen IFNβ2A-Proteins mit 21 kD ist nicht bestimmt worden; es gibt zwei mögliche Glycosylierungsstellen in der IFN-β2A-Sequenz (Fig. 1), die es schwierig machen, die Größe des durch die Weiterverarbeitung entfernten Bereiches abzuschätzen. Die Größenabnahme weist jedoch darauf hin, daß dieser weiterverarbeitete Bereich länger ist als der in IFN-β&sub1;, dessen Größe durch die Reifung zunimmt (W. Degrave et al. (1981) Gene 10: 11-15). Ein Hydropathieplot des 26 kD-IFN-β2A-Polypeptids hat gezeigt, daß es eine bemerkenswerte Ähnlichkeit zwischen hydrophoben bzw. hydrophilen Bereichen von IFN-β2A und reifem IFN-β&sub1; gibt, wenn die beiden Proteine an ihren C-Termini gegenübergestellt werden. Die gleiche Gegenüberstellung deckt auch konservierte Bereiche in der Aminosäuresequenz von IFN-β2A mit der von anderen Typ I-Human-IFNs (Fig. 7). Unter allen bekannten IFN-α- und -β&sub1;-Sequenzen gibt es 38 Aminosäuren, die konserviert sind (mit einem * in Fig. 7 gekennzeichnet). Wenn IFN-β2A wie oben gegenübergestellt wird, kann festgestellt werden, daß 18 dieser 38 Aminosäuren, die allen Typ I-Human-IFNs gemeinsam sind, konserviert sind (Fig. 7). Insgesamt besteht eine Homologie von ungefähr 20% zwischen IFN-β2A und den anderen Typ I-IFNs.
• Obwohl die Sequenzhomologie zwischen IFN-β&sub1; und -β2A gering ist, könnte die Kreuzneutralisierung der antiviralen Aktivitäten von IFN-β&sub1; und IFN-β2A durch die gleichen Antikörper, einschließlich eines monoklonalen Antikörpers gegen IFN-β&sub1; (D. Novick et al. (1983), s. o.) durch einige der konservierten Strukturen in der aktiven Stelle von IFN-β bedingt sein. Die IFN-β2A-Aktivität wird nicht durch anti-IFN-α oder -γ-Antikörper neutralisiert, was seine Benennung als ein β-Typ-IFN rechtfertigt. Die für IFN-β&sub2; kodierenden Gene sind nicht auf Chromosom 9 (U. Nir (1984), s. o.) und unterscheiden sich von den Typ I-IFN-Genen im Cluster von Chromosom 9 durch die Gegenwart von Introns. Es wurde festgestellt, daß das IFA-2-Gen auf Chromosom 7 liegt (P. B. Sehgal et al. (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. im Druck). Die nachgewiesene Aminosäuresequenzhomologie ist mit der Vorstellung kompatibel, daß die IFN-β&sub2;-Gene mit den ankestralen Genen verwandt sind, aus denen der Typ I-IFN-Gencluster hervorgegangen ist.
• Der zweite genomische DNA-Klon, IFA-11, der mit der IFN-β2A cDNA hybridisiert, hat eine Restriktionskarte, die sich von der von IFA-2 unterscheidet (Fig. 8). Transkriptionskartierung und Sequenzierung zeigten, daß die 3'-Exons von IFA-2 und IFA-11 (Xba&sub1;-HindIII-Segment) identisch sind (99% Sequenzhomolagie), während es unter stringenten Bedingungen keine Kreuzhybridisierung zwischen weiter 5' gelegenen Exons gibt. Der genomische Klon IFA-11 (19 kb) wurde zusammen mit einem HSV-TK-Gen (F. Coibere-Garapin et al. (1981) J. Mol. Biol. 150: 1-14) in L-TK&supmin;-Zellen transfiziert und es wurden stabile Transformanten isoliert. Die Tabelle 1 zeigt, daß der L-Zellklon LI-39, der das humane IFA-11-Gen enthält, eine Human-IFN-Aktivität erzeugt, wenn er mit Poly(rI)(rC) und Cycloheximid induziert wird, während L-TK&spplus;-Zellen keine solche Aktivität erzeugten. Ein CHO-Klon 1C40, der das IFA-11- Gen enthält, erzeugte ebenfalls Human-IFN-Aktivität (Tabelle 1). In nicht-induzierten LI-39- oder 1C40-Zellen wurde keine Aktivität beobachtet. Die IFN-Aktivität, die mit IFA-11- Transformanten nach Induktion erhalten wurde, war signifikant höher als die mit dem IFA-2-Gen. Das rIFN-β2B, das durch Expression des IFA-11-Genes erhalten wurde, wurde ähnlich dem IFA-2-Genprodukt mit anti-IFN-β&sub1; neutralisiert. IFA-11 spezifische DNA-Sonden hybridisierten mit RNA von induzierten humanen Fibroblasten ähnlich den IFN-2-DNA-Sonden, was darauf hinweist, daß beide Gene in humanen Zellen aktiv sind.
• Die Funktion der IFN-β&sub2;-Gene scheint von ihrer Expression unter Bedingungen herzurühren, unter denen andere IFN-Gene nicht exprimiert werden. Wir haben festgestellt, daß Fibroblasten, die dem Tumornekrosefaktor (TNF) oder Lymphokin IL-1 ausgesetzt werden, das IFN-β&sub2;-Protein erzeugen. Andere haben festgestellt, daß die Neutralisierung von IFN-β durch Antikörper zu einer Stimulation der Zellproliferation führt (M. Kohase et al. (1986) Cell, im Druck; D. Resnitzky et al. (1986) Cell, im Druck); das legt nahe, daß IFN-β&sub2; als Antwort auf Wachstumsfaktoren das Zellwachstum begrenzend wirkt. Diese Schlußfolgerung wird durch die Tatsache gestützt, daß eine mit IFN-β&sub2;-cDNA hybridisierende RNA kürzlich in peripheren mononukleären Blutzellen, die durch Mitogene wie PHA induziert worden waren, zusammen mit IFN-γ mRNA nachgewiesen werden konnte. Weiterhin ist berichtet worden, daß ein IL-1 ähnliches Lymphokin eine mit IFN-β&sub2;-cDNA hybridisierende RNA in diploiden Fibroblasten und anderen humanen Zellinien stark induziert (J. Content et al. (1985) Eur. J. Biochem. 152: 253-257). Der Promotorbereich der IFA-2-Gene scheint zwei TATA-Boxen und zwei RNA-Starts (Fig. 1 und 3) 2u enthalten. Es wurde gezeigt, daß dieser IFN-β&sub2;-Promotor entweder auf Poly(rI)(rC) oder auf Cycloheximid reagiert (Y. Chernajovsky et al. (1984), s. o.). Die beiden IFN-β&sub2;-Genpromotoren können in vivo durch verschiedene Induktoren aktiviert werden (ds RNA, Proteinsyntheseinhibitoren, IL-1, PHA). Es ist festgestellt worden, daß eine Vielzahl von Zellen autokrines IFN-β in geringen Mengen während des Wachstumsstillstandes und der Differenzierung erzeugt (M. Revel (1983)- Interferon 5, Seiten 205-239, Acad. Press, London). IFN-β&sub2; kann zu der gleichen Gruppe kleinerer IFN- Arten gehören, das von den Zellen erzeugt wird, um ihr Wachstum selbst zu regulieren, während die klassischen Typ I-Interferone wahrscheinlich spezifisch in die Antwort auf virale Infektionen verwickelt sind.
• Die biologische Signifikanz von IFN-β&sub2; liegt wahrscheinlich in der Tatsache, daß es unter Bedingungen induziert wird, unter denen IFN-β&sub1; nicht induziert wird, wie in metabolisch beanspruchten Zellen (A. Zilberstein et al., (1985) in The Interferon System, Serono Symposia Raven Press, Seiten 73- 83). Am bedeutendsten ist die Beobachtung, daß TNF IFN-β&sub2; in Fibroblasten induziert und daß die Proliferation dieser Zellen, die durch TNF stimuliert wird, weiter gesteigert wird, wenn anti-IFN-β-Antikörper zugefügt werden. Von einer Anzahl humaner Zellinien ist gezeigt worden, daß sie autokrine IFN-β-Arten erzeugen, wenn sie differenzieren, und daß diese IFNs für die Induktion von HLA-Antigenen auf diesen Zellen verantwortlich sind (A. Yarden et al. (1984) Embo. J. 3: 969-973). In einer durch CFS-1 zur Differenzierung induzierten myeloleukämischen Mauszellinie wird der Wachstumsstillstand der Zellen, der die terminale Differenzierung charakterisiert, durch anti-IFN-β-Antikörper beseitigt. IL-1 stimuliert das Wachstum verschiedener Zelltypen; vom klassischen Wachstumsfaktor PDGF wurde festgestellt, daß er IFN-β- RNA in Mauszellen induziert (J. N. Zullo et al. (1985) Cell 43: 793-800). Obwohl viele IFN-β-Arten darin verwickelt sein können (P. B. Sehgal, (1982) in Interferon 4, Academic Press, Seiten 1-22, und M. Revel (1983) in Interferon 5, Academic Press, Seiten 205-239), scheint IFN-β&sub2; einer dieser autokrinen Autoregulatoren des Zellwachstums zu sein, der als Antwort auf die Wachstumsfaktoren erzeugt wird. Dieses würde mit der geringen spezifischen Aktivität von IFN-β&sub2; übereinstimmen (diese wird durch Vergleich des Immuntests und der antiviralen Aktivität 50 bis 100 mal niedriger als für IFN-/31 eingeschätzt), da in den die autokrine IFN-β-Art produzierenden Zellen nur eine sehr geringe antivirale Aktivität beobachtet wird (M. Revel (1983) in Interferon 5, Academic Press, Seiten 205-239). Dieses könnte außerdem erklären, warum die IFN-β&sub2;-cDNA exprimierenden Hamsterzellen weniger IFN-Aktivität erzeugen, als ähnliche CHO-Zellen, die das menschliche IFN-β&sub1;-Gen beherbergen (Y. Chernajovsky et al. (1984), DNA 3: 297-308). Interessanterweise hat die IFN-α&sub1; (D)-Art ebenfalls eine hundertfach geringere spezifische Aktivität auf menschliche Zellen als andere IFN-α-Arten (T. Goren et al. (1983), Virology 130: 273-280), obwohl sie einen großen Teil der Gesamtmasse des Leukozyten-IFNs darstellt (C. Weissmann (1981) in Interferon 3, Academic Press, N. Y. Seiten 101-134). Es ist nicht ausgeschlossen, daß einige der vielen IFN-Funktionen effizienter bei IFN-β&sub2; ausgeprägt sind, als die antivirale Wirkung. Ungeachtet ihrer geringen Konzentration induzieren wachstumsregulierende IFN-β HLA und (2'-5') oligo A-Synthetase stärker als erwartet, haben längere Wirkungen und inhibieren das Wachstum von Zellen, das sie erzeugen, merklich. Die Induktion von IFN-β&sub2; durch IL-1 und TNF legt nahe, daß es eine Rolle als autokriner Mediator einiger Wirkungen dieser Cytokine bei Entzündungen und "acute-phase responses" sowie bei der Regulation der Zellproliferation spielt.
• In menschlichen Zellinien ist die Induktion einer mRNA, die mit IFN-β&sub2;-cDNA-Sonden hybridisiert, aber nicht mit IFN-β&sub1;cDNA, beobachtet worden, wenn diese Interleukin-1 (IL-1) (J. Content et al. (1985), Eur. J. Biochem. 152: 253-257) und Tumornekrosefaktor (TNF-α) ausgesetzt worden sind. Der IFN-β&sub2;-spezifische Immunkompetitionstest mit R-Antikörpern wurde verwendet, um zu untersuchen, ob humane FS11-Fibroblastenzellen tatsächlich das IFN-β&sub2;-Protein als Reaktion auf diese beiden Cytokine ausscheiden (Fig. 9). Sowohl rIL-1α als auch TNF-α induzierten die Synthese und Ausscheidung des IFN-β&sub2;-Proteines in einer Menge, die mittels Immuntest auf 10 bis 20 E/ml IFN-β&sub2; geschätzt wurde. Optimale IFN-β&sub2;-Induktion wurde bei Konzentrationen von rIL-1α von 4 E/ml (0,13 ng/ml) beobachtet, ähnlich den Werten, die für die IL-1-Xnduktion von Prostaglandin E&sub2;, Collagenase und Hyaluronsäure in humanen Fibroblasten erforderlich sind (J. H. Korn (1985), Arthritis Rheum. 28: 315-322). Die optimale Konzentration von TNF-α für die IFN-β&sub2;-Induktion (400 E/ml; 40 ng/ml) war höher als die für den cytolytischen Effekt auf empfindliche Zellen erforderliche (0,1 ng/ml; A. M. Wang et al. (1985) Science 228: 149-154) und sogar höher als die, die eine optimale Wachstumsstimulation von diploiden Fibroblasten ergibt (2 ng/ml). Der Beginn der IFN-β&sub2;-Ausscheidung war mit TNF-α etwas schneller; mit TNF-α wurden halbmaximale Spiegel nach ungefähr 6 Stunden erreicht, im Vergleich zu 8 bis 12 Stunden mit IL-1.
Tabelle 1 Antivirale Aktivität von in mit IFN-β2A-genomischer DNA transfizierten Säugetierzellen erzeugtem rIFN-β&sub2;* I. IFA-2 Gene A. Konsfftutive Expression in CHO-Zellen
• pSVIFA2-I S1-15 Zellen : 10-50 E/ml**
• (Kontrolle CHO Zellen : O)
B. Transiente Expression in Cos7 Zellen
• pSVIFA2-II DNA : 15 E/ml
• (Kontrolle IFN-β&sub1; pSVEIF DNA : 500 E/ml)
II. IFA-11-Gen A. Induzierte Expression *** in CHO-Zellen
• Klon 1C40 : 400-500 E/ml
• (Kontrolle CHO Zellen : 100 E/ml)
B. Induzierte Expression in L-Zellen
• Klon LI-39 : 250 E/ml
• (Kontrolle L-TK&spplus;-Zellen : < 4 E/ml)
• * Test mit VSV in FS11- und Wish-Zellen. Neutralisiert durch anti-IFN-&beta;&sub1;.
• ** 3000 E/ml nach Konzentration
• *** Induktion durch 10 Stunden Behandlung mit Poly IC und Cycloheximid. Ernte nach 28 Stunden.
• Antivirale Aktivität von in Hamsterzellen erzeugtem humanen rIFN-&beta;2A, transfiziert und amplifiziert mit IFN-&beta;2A-cDNA
• * Das Medium aus den Kulturen wurde alle 24 Std. gesammelt und mit VSV in humanen FS11-Zellen getestet. Die Aktivität wurde durch anti-IFN-&beta;&sub1; neutralisiert, aber nicht anti-IFN-&alpha; oder anti-IFN-&gamma;.
• ** Die Kulturen wurden aufgrund ihrer Resistenz gegen die angegebenen Methotrexatkonzentrationen ausgewählt.

Claims (11)

1. cDNA, bestehend im wesentlichen aus der in Fig. 1 gezeigten cDNA, die für humanes Interferon-&beta;2A mit der in Fig. 1 gezeigten Aminosäuresequenz kodiert.

2. Rekombinanter Vektor, umfassend eine cDNA nach Anspruch 1 und umfassend weiterhin regulatorische Bereiche, die auf eine Art und Weise angeordnet sind, daß die Expression von humanem Interferon-&beta;2A möglich ist.

3. Rekombinanter Vektor nach Anspruch 2, worin die regulatorisehen DNA-Sequenzen einen Promotor enthalten, der bevorzugt ein früher SV40-Promotor ist.

4. Rekombinanter Vektor nach Anspruch 3, wobei der Vektor pSVCIF&beta;&sub2; ist, der in Fig. 5 gezeigt ist.

5. Zellinie, transformiert mit einem rekombinanten Vektor nach einem der Ansprüche 2 bis 4.

6. Zellinie nach Anspruch 5, wobei die Zellinie eukaryontisch ist.

7. Zellinie nach Anspruch 6, wobei die Zellinie eine Hamster-Zellinie ist.

8. Zellinie nach Anspruch 6, wobei die Zellinie eine CHO- Zellinie ist.

9. Zellinie nach einem der Ansprüche 5 bis 8, die zum Herstellen von humanem Interferon-&beta;2A fähig ist.

10. Zellinie nach Anspruch 8, wobei der zur Transformation verwendete rekombinante Vektor pSVCIF&beta;&sub2; ist und wobei die Zellinie mit pSVDHFR cotransfiziert ist und einer Methotrexat-induzierten Amplifikation unterworfen worden ist.

11. Verfahren zum Herstellen von humanem Interferon-&beta;2A, wobei eine Zellinie nach einem der Ansprüche 5 bis 10 kultiviert wird und das Interferon-&beta;2A aus dem Kulturmedium isoliert wird.