TR201807128T4 - Viral vektör imalatı. - Google Patents
Viral vektör imalatı. Download PDFInfo
- Publication number
- TR201807128T4 TR201807128T4 TR2018/07128T TR201807128T TR201807128T4 TR 201807128 T4 TR201807128 T4 TR 201807128T4 TR 2018/07128 T TR2018/07128 T TR 2018/07128T TR 201807128 T TR201807128 T TR 201807128T TR 201807128 T4 TR201807128 T4 TR 201807128T4
- Authority
- TR
- Turkey
- Prior art keywords
- cell
- virus
- cells
- cho
- cell line
- Prior art date
Links
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title description 33
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 title description 11
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 493
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims abstract description 164
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 claims abstract description 36
- 101150016130 CP77 gene Proteins 0.000 claims abstract description 10
- 101100372716 Escherichia phage 186 fil gene Proteins 0.000 claims abstract 3
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 140
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 claims description 97
- 101150044623 D13L gene Proteins 0.000 claims description 57
- 101150083809 D10L gene Proteins 0.000 claims description 55
- 101100498120 Vaccinia virus (strain Western Reserve) VACWR118 gene Proteins 0.000 claims description 55
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 53
- 241000700647 Variola virus Species 0.000 claims description 40
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 35
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 34
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims description 28
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims description 28
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 18
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 claims description 15
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 claims description 13
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims description 10
- 241000288906 Primates Species 0.000 claims description 9
- 241000700629 Orthopoxvirus Species 0.000 claims description 8
- 230000029812 viral genome replication Effects 0.000 claims description 8
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 claims description 6
- 230000001902 propagating effect Effects 0.000 claims 1
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 abstract description 8
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 216
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 132
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 124
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 102
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 64
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 60
- 206010046865 Vaccinia virus infection Diseases 0.000 description 54
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 51
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 50
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 50
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 50
- 208000007089 vaccinia Diseases 0.000 description 48
- 241000700618 Vaccinia virus Species 0.000 description 45
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 40
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 36
- 206010072219 Mevalonic aciduria Diseases 0.000 description 35
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 35
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 29
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 29
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 description 28
- BRZYSWJRSDMWLG-CAXSIQPQSA-N geneticin Natural products O1C[C@@](O)(C)[C@H](NC)[C@@H](O)[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](C(C)O)O2)N)[C@@H](N)C[C@H]1N BRZYSWJRSDMWLG-CAXSIQPQSA-N 0.000 description 28
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 27
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 26
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 25
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 24
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 24
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 24
- 239000000047 product Substances 0.000 description 23
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 22
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 22
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 22
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 22
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 21
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 21
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 description 20
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 19
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 19
- 108010021843 fluorescent protein 583 Proteins 0.000 description 19
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 19
- 239000005090 green fluorescent protein Substances 0.000 description 18
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 18
- 210000002845 virion Anatomy 0.000 description 18
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 17
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 17
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 17
- 230000007505 plaque formation Effects 0.000 description 17
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 17
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 17
- 102000004144 Green Fluorescent Proteins Human genes 0.000 description 16
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 16
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 16
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 16
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 15
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 15
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 15
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 15
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 15
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 14
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 14
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 14
- 241000700626 Cowpox virus Species 0.000 description 13
- 241000699802 Cricetulus griseus Species 0.000 description 13
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 13
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 13
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 13
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 13
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 12
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 12
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 12
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 11
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 11
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 11
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 description 11
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 11
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 11
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 11
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 10
- 238000011161 development Methods 0.000 description 10
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 10
- 230000006870 function Effects 0.000 description 10
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 10
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 10
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 description 9
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 9
- 239000006146 Roswell Park Memorial Institute medium Substances 0.000 description 9
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 9
- 239000000463 material Substances 0.000 description 9
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 9
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 9
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 9
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 9
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 9
- 108010077524 Peptide Elongation Factor 1 Proteins 0.000 description 8
- 239000006180 TBST buffer Substances 0.000 description 8
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 8
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 8
- 210000002472 endoplasmic reticulum Anatomy 0.000 description 8
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 8
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 8
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 8
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 8
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 8
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 8
- 210000003501 vero cell Anatomy 0.000 description 8
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 8
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 7
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 7
- 238000010222 PCR analysis Methods 0.000 description 7
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 7
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 7
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 7
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 7
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 7
- 239000013553 cell monolayer Substances 0.000 description 7
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 7
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 7
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 7
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 7
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 7
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 7
- 241000894007 species Species 0.000 description 7
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 7
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 7
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 6
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 6
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 6
- 102100031483 High mobility group protein 20A Human genes 0.000 description 6
- 101000867036 Homo sapiens High mobility group protein 20A Proteins 0.000 description 6
- GRRNUXAQVGOGFE-UHFFFAOYSA-N Hygromycin-B Natural products OC1C(NC)CC(N)C(O)C1OC1C2OC3(C(C(O)C(O)C(C(N)CO)O3)O)OC2C(O)C(CO)O1 GRRNUXAQVGOGFE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 6
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 6
- 108020005202 Viral DNA Proteins 0.000 description 6
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 6
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 6
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 6
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 6
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 6
- GRRNUXAQVGOGFE-NZSRVPFOSA-N hygromycin B Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](NC)C[C@@H](N)[C@H](O)[C@H]1O[C@H]1[C@H]2O[C@@]3([C@@H]([C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](C(N)CO)O3)O)O[C@H]2[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 GRRNUXAQVGOGFE-NZSRVPFOSA-N 0.000 description 6
- 229940097277 hygromycin b Drugs 0.000 description 6
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 6
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 6
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 6
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 6
- 238000011321 prophylaxis Methods 0.000 description 6
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 6
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 6
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 6
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 6
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 6
- 239000012096 transfection reagent Substances 0.000 description 6
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 6
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 5
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 5
- 108090000157 Metallothionein Proteins 0.000 description 5
- 229930193140 Neomycin Natural products 0.000 description 5
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 5
- 102000010292 Peptide Elongation Factor 1 Human genes 0.000 description 5
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 5
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 5
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 5
- -1 for example Substances 0.000 description 5
- 238000005755 formation reaction Methods 0.000 description 5
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 5
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 5
- 229960004927 neomycin Drugs 0.000 description 5
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 5
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 5
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 5
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 5
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 5
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 5
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 5
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 5
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 5
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 5
- 230000024540 transposon integration Effects 0.000 description 5
- HJCMDXDYPOUFDY-WHFBIAKZSA-N Ala-Gln Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(N)=O HJCMDXDYPOUFDY-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 4
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 4
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 4
- 108020005038 Terminator Codon Proteins 0.000 description 4
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 description 4
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 4
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 4
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 4
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 4
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 4
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 4
- 239000010410 layer Substances 0.000 description 4
- 108010054624 red fluorescent protein Proteins 0.000 description 4
- 230000022532 regulation of transcription, DNA-dependent Effects 0.000 description 4
- 238000011160 research Methods 0.000 description 4
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 4
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 4
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 4
- 230000017105 transposition Effects 0.000 description 4
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 4
- 238000003260 vortexing Methods 0.000 description 4
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 4
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 3
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 3
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 3
- 102100024746 Dihydrofolate reductase Human genes 0.000 description 3
- YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N Epihygromycin Natural products OC1C(O)C(C(=O)C)OC1OC(C(=C1)O)=CC=C1C=C(C)C(=O)NC1C(O)C(O)C2OCOC2C1O YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- HVLSXIKZNLPZJJ-TXZCQADKSA-N HA peptide Chemical group C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC(O)=CC=1)C1=CC=C(O)C=C1 HVLSXIKZNLPZJJ-TXZCQADKSA-N 0.000 description 3
- 108091092195 Intron Proteins 0.000 description 3
- 241000270322 Lepidosauria Species 0.000 description 3
- 241000282553 Macaca Species 0.000 description 3
- 241001272720 Medialuna californiensis Species 0.000 description 3
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 3
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 3
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 3
- 101001099217 Thermotoga maritima (strain ATCC 43589 / DSM 3109 / JCM 10099 / NBRC 100826 / MSB8) Triosephosphate isomerase Proteins 0.000 description 3
- 108010022394 Threonine synthase Proteins 0.000 description 3
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 3
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 3
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 3
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 3
- 108020001096 dihydrofolate reductase Proteins 0.000 description 3
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 3
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 3
- 102000034287 fluorescent proteins Human genes 0.000 description 3
- 108091006047 fluorescent proteins Proteins 0.000 description 3
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 3
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 3
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 3
- 238000007689 inspection Methods 0.000 description 3
- 239000012160 loading buffer Substances 0.000 description 3
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 3
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 3
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 3
- 210000005036 nerve Anatomy 0.000 description 3
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 3
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 3
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 3
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 3
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 3
- 230000004044 response Effects 0.000 description 3
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 3
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 3
- 235000020183 skimmed milk Nutrition 0.000 description 3
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 3
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- DIGQNXIGRZPYDK-WKSCXVIASA-N (2R)-6-amino-2-[[2-[[(2S)-2-[[2-[[(2R)-2-[[(2S)-2-[[(2R,3S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2R)-2-[[(2S,3S)-2-[[(2R)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[(2R)-2-[[2-[[2-[[2-[(2-amino-1-hydroxyethylidene)amino]-3-carboxy-1-hydroxypropylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1-hydroxypropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxybutylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1-hydroxypropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1,5-dihydroxy-5-iminopentylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxybutylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]hexanoic acid Chemical compound C[C@@H]([C@@H](C(=N[C@@H](CS)C(=N[C@@H](C)C(=N[C@@H](CO)C(=NCC(=N[C@@H](CCC(=N)O)C(=NC(CS)C(=N[C@H]([C@H](C)O)C(=N[C@H](CS)C(=N[C@H](CO)C(=NCC(=N[C@H](CS)C(=NCC(=N[C@H](CCCCN)C(=O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)N=C([C@H](CS)N=C([C@H](CO)N=C([C@H](CO)N=C([C@H](C)N=C(CN=C([C@H](CO)N=C([C@H](CS)N=C(CN=C(C(CS)N=C(C(CC(=O)O)N=C(CN)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O DIGQNXIGRZPYDK-WKSCXVIASA-N 0.000 description 2
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000251468 Actinopterygii Species 0.000 description 2
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 description 2
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 2
- 241000272517 Anseriformes Species 0.000 description 2
- 108010032595 Antibody Binding Sites Proteins 0.000 description 2
- 241000271566 Aves Species 0.000 description 2
- 101100342815 Caenorhabditis elegans lec-1 gene Proteins 0.000 description 2
- 101100074330 Caenorhabditis elegans lec-8 gene Proteins 0.000 description 2
- 101710167800 Capsid assembly scaffolding protein Proteins 0.000 description 2
- 241000700198 Cavia Species 0.000 description 2
- 241000283153 Cetacea Species 0.000 description 2
- 101000709520 Chlamydia trachomatis serovar L2 (strain 434/Bu / ATCC VR-902B) Atypical response regulator protein ChxR Proteins 0.000 description 2
- 101150074155 DHFR gene Proteins 0.000 description 2
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 description 2
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 2
- 241000283086 Equidae Species 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108700024394 Exon Proteins 0.000 description 2
- 108091006010 FLAG-tagged proteins Proteins 0.000 description 2
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 2
- CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N Gentamicin Chemical compound O1[C@H](C(C)NC)CC[C@@H](N)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](NC)[C@@](C)(O)CO2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N 0.000 description 2
- 229930182566 Gentamicin Natural products 0.000 description 2
- 241000701024 Human betaherpesvirus 5 Species 0.000 description 2
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 2
- 101710128836 Large T antigen Proteins 0.000 description 2
- ILJREDZFPHTUIE-GUBZILKMSA-N Leu-Asp-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O ILJREDZFPHTUIE-GUBZILKMSA-N 0.000 description 2
- 102000003792 Metallothionein Human genes 0.000 description 2
- 241000700627 Monkeypox virus Species 0.000 description 2
- 241000713333 Mouse mammary tumor virus Species 0.000 description 2
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 2
- 108091092724 Noncoding DNA Proteins 0.000 description 2
- 238000000636 Northern blotting Methods 0.000 description 2
- 241000282520 Papio Species 0.000 description 2
- 241000700639 Parapoxvirus Species 0.000 description 2
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 2
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 2
- CUMXHKAOHNWRFQ-BZSNNMDCSA-N Phe-Asp-Tyr Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(O)=O)C1=CC=CC=C1 CUMXHKAOHNWRFQ-BZSNNMDCSA-N 0.000 description 2
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 2
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 2
- 101710130420 Probable capsid assembly scaffolding protein Proteins 0.000 description 2
- 108091034057 RNA (poly(A)) Proteins 0.000 description 2
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 2
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 2
- 241000714474 Rous sarcoma virus Species 0.000 description 2
- 241000282695 Saimiri Species 0.000 description 2
- 206010039491 Sarcoma Diseases 0.000 description 2
- 101710204410 Scaffold protein Proteins 0.000 description 2
- 241000030366 Scorpidinae Species 0.000 description 2
- ZOPISOXXPQNOCO-SVSWQMSJSA-N Ser-Ile-Thr Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CO)N ZOPISOXXPQNOCO-SVSWQMSJSA-N 0.000 description 2
- 241000700584 Simplexvirus Species 0.000 description 2
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 2
- 238000010459 TALEN Methods 0.000 description 2
- 108010043645 Transcription Activator-Like Effector Nucleases Proteins 0.000 description 2
- HDOVUKNUBWVHOX-QMMMGPOBSA-N Valacyclovir Chemical compound N1C(N)=NC(=O)C2=C1N(COCCOC(=O)[C@@H](N)C(C)C)C=N2 HDOVUKNUBWVHOX-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 2
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 230000019552 anatomical structure morphogenesis Effects 0.000 description 2
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 2
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 2
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 2
- 229910052793 cadmium Inorganic materials 0.000 description 2
- BDOSMKKIYDKNTQ-UHFFFAOYSA-N cadmium atom Chemical compound [Cd] BDOSMKKIYDKNTQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000004422 calculation algorithm Methods 0.000 description 2
- 229910002091 carbon monoxide Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 230000007541 cellular toxicity Effects 0.000 description 2
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 2
- 238000004590 computer program Methods 0.000 description 2
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 2
- 201000003740 cowpox Diseases 0.000 description 2
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 2
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 2
- 235000011389 fruit/vegetable juice Nutrition 0.000 description 2
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 2
- 108091006104 gene-regulatory proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000034356 gene-regulatory proteins Human genes 0.000 description 2
- 238000010362 genome editing Methods 0.000 description 2
- 229960002518 gentamicin Drugs 0.000 description 2
- 229960002743 glutamine Drugs 0.000 description 2
- 230000036541 health Effects 0.000 description 2
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- 229940065638 intron a Drugs 0.000 description 2
- 238000010983 kinetics study Methods 0.000 description 2
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 2
- 238000000464 low-speed centrifugation Methods 0.000 description 2
- 230000002101 lytic effect Effects 0.000 description 2
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 2
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 2
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 2
- 150000002739 metals Chemical class 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 2
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 2
- 238000007747 plating Methods 0.000 description 2
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 2
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 2
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 2
- 238000009877 rendering Methods 0.000 description 2
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 2
- 210000003705 ribosome Anatomy 0.000 description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 238000004114 suspension culture Methods 0.000 description 2
- 230000001360 synchronised effect Effects 0.000 description 2
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 2
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 2
- 230000007502 viral entry Effects 0.000 description 2
- 229960004854 viral vaccine Drugs 0.000 description 2
- 230000001018 virulence Effects 0.000 description 2
- MUSGYEMSJUFFHT-UWABRSFTSA-N 2-[(4R,7S,10S,13S,19S,22S,25S,28S,31S,34R)-34-[[(2S,3S)-2-[[(2R)-2-amino-3-(4-hydroxyphenyl)propanoyl]amino]-3-methylpentanoyl]amino]-4-[[(2S,3S)-1-amino-3-methyl-1-oxopentan-2-yl]-methylcarbamoyl]-25-(3-amino-3-oxopropyl)-7-(3-carbamimidamidopropyl)-10-(1H-imidazol-5-ylmethyl)-19-(1H-indol-3-ylmethyl)-13,17-dimethyl-28-[(1-methylindol-3-yl)methyl]-6,9,12,15,18,21,24,27,30,33-decaoxo-31-propan-2-yl-1,2-dithia-5,8,11,14,17,20,23,26,29,32-decazacyclopentatriacont-22-yl]acetic acid Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](NC(=O)[C@H](N)Cc1ccc(O)cc1)C(=O)N[C@H]1CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](Cc2cnc[nH]2)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)CN(C)C(=O)[C@H](Cc2c[nH]c3ccccc23)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](Cc2cn(C)c3ccccc23)NC(=O)[C@@H](NC1=O)C(C)C)C(=O)N(C)[C@@H]([C@@H](C)CC)C(N)=O MUSGYEMSJUFFHT-UWABRSFTSA-N 0.000 description 1
- GOJUJUVQIVIZAV-UHFFFAOYSA-N 2-amino-4,6-dichloropyrimidine-5-carbaldehyde Chemical group NC1=NC(Cl)=C(C=O)C(Cl)=N1 GOJUJUVQIVIZAV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- 208000030507 AIDS Diseases 0.000 description 1
- DPNZTBKGAUAZQU-DLOVCJGASA-N Ala-Leu-His Chemical compound C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC1=CN=CN1)C(=O)O)N DPNZTBKGAUAZQU-DLOVCJGASA-N 0.000 description 1
- ZJLORAAXDAJLDC-CQDKDKBSSA-N Ala-Tyr-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O ZJLORAAXDAJLDC-CQDKDKBSSA-N 0.000 description 1
- 102000008102 Ankyrins Human genes 0.000 description 1
- 108010049777 Ankyrins Proteins 0.000 description 1
- 241000269350 Anura Species 0.000 description 1
- 241000726096 Aratinga Species 0.000 description 1
- BNODVYXZAAXSHW-IUCAKERBSA-N Arg-His Chemical compound NC(=N)NCCC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CNC=N1 BNODVYXZAAXSHW-IUCAKERBSA-N 0.000 description 1
- JZRLLSOWDYUKOK-SRVKXCTJSA-N Asn-Asp-Phe Chemical compound C1=CC=C(C=C1)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)N JZRLLSOWDYUKOK-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- QCWJKJLNCFEVPQ-WHFBIAKZSA-N Asn-Gln Chemical compound NC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(N)=O QCWJKJLNCFEVPQ-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- BKFXFUPYETWGGA-XVSYOHENSA-N Asn-Phe-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O BKFXFUPYETWGGA-XVSYOHENSA-N 0.000 description 1
- XCBKBPRFACFFOO-AQZXSJQPSA-N Asn-Thr-Trp Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CNC2=CC=CC=C21)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)N)O XCBKBPRFACFFOO-AQZXSJQPSA-N 0.000 description 1
- FLJVGAFLZVBBNG-BPUTZDHNSA-N Asn-Trp-Arg Chemical compound N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)N[C@@H](Cc1c[nH]c2ccccc12)C(=O)N[C@@H](CCCNC(=N)N)C(=O)O FLJVGAFLZVBBNG-BPUTZDHNSA-N 0.000 description 1
- KWBQPGIYEZKDEG-FSPLSTOPSA-N Asn-Val Chemical compound CC(C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O KWBQPGIYEZKDEG-FSPLSTOPSA-N 0.000 description 1
- ZLGKHJHFYSRUBH-FXQIFTODSA-N Asp-Arg-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O ZLGKHJHFYSRUBH-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- VGRHZPNRCLAHQA-IMJSIDKUSA-N Asp-Asn Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O VGRHZPNRCLAHQA-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 1
- FRYULLIZUDQONW-IMJSIDKUSA-N Asp-Asp Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O FRYULLIZUDQONW-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 1
- ZSJFGGSPCCHMNE-LAEOZQHASA-N Asp-Gln-Val Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)N)NC(=O)[C@H](CC(=O)O)N ZSJFGGSPCCHMNE-LAEOZQHASA-N 0.000 description 1
- KLYPOCBLKMPBIQ-GHCJXIJMSA-N Asp-Ile-Ser Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)O)N KLYPOCBLKMPBIQ-GHCJXIJMSA-N 0.000 description 1
- PLOKOIJSGCISHE-BYULHYEWSA-N Asp-Val-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O PLOKOIJSGCISHE-BYULHYEWSA-N 0.000 description 1
- 241000726103 Atta Species 0.000 description 1
- 241000700663 Avipoxvirus Species 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- KLYCPFXDDDMZNQ-UHFFFAOYSA-N Benzyne Chemical compound C1=CC#CC=C1 KLYCPFXDDDMZNQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 241001455646 Buffalopox virus Species 0.000 description 1
- 125000001433 C-terminal amino-acid group Chemical group 0.000 description 1
- 241000288951 Callithrix <genus> Species 0.000 description 1
- 241001137864 Camelpox virus Species 0.000 description 1
- 241000178270 Canarypox virus Species 0.000 description 1
- 241000282421 Canidae Species 0.000 description 1
- 241000282465 Canis Species 0.000 description 1
- 241000700664 Capripoxvirus Species 0.000 description 1
- 102000053642 Catalytic RNA Human genes 0.000 description 1
- 108090000994 Catalytic RNA Proteins 0.000 description 1
- 241000282994 Cervidae Species 0.000 description 1
- 241000251556 Chordata Species 0.000 description 1
- 241000700628 Chordopoxvirinae Species 0.000 description 1
- 101710094648 Coat protein Proteins 0.000 description 1
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 1
- 108091035707 Consensus sequence Proteins 0.000 description 1
- 241001125840 Coryphaenidae Species 0.000 description 1
- 101100440908 Cowpox virus (strain Brighton Red) CP77 gene Proteins 0.000 description 1
- DEVDFMRWZASYOF-ZLUOBGJFSA-N Cys-Asn-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O DEVDFMRWZASYOF-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 1
- YQEHNIKPAOPBNH-DCAQKATOSA-N Cys-Val-Lys Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CS)N YQEHNIKPAOPBNH-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- 101150108527 D13 gene Proteins 0.000 description 1
- 230000004543 DNA replication Effects 0.000 description 1
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 1
- 241000725630 Ectromelia virus Species 0.000 description 1
- 206010014612 Encephalitis viral Diseases 0.000 description 1
- 102100031780 Endonuclease Human genes 0.000 description 1
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 108010067770 Endopeptidase K Proteins 0.000 description 1
- 241000283074 Equus asinus Species 0.000 description 1
- 241000283073 Equus caballus Species 0.000 description 1
- 108700039887 Essential Genes Proteins 0.000 description 1
- XZWYTXMRWQJBGX-VXBMVYAYSA-N FLAG peptide Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 XZWYTXMRWQJBGX-VXBMVYAYSA-N 0.000 description 1
- 241000282324 Felis Species 0.000 description 1
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 1
- 241000237858 Gastropoda Species 0.000 description 1
- IULKWYSYZSURJK-AVGNSLFASA-N Gln-Leu-Lys Chemical compound NC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(O)=O IULKWYSYZSURJK-AVGNSLFASA-N 0.000 description 1
- MLSKFHLRFVGNLL-WDCWCFNPSA-N Gln-Leu-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O MLSKFHLRFVGNLL-WDCWCFNPSA-N 0.000 description 1
- IOFDDSNZJDIGPB-GVXVVHGQSA-N Gln-Leu-Val Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O IOFDDSNZJDIGPB-GVXVVHGQSA-N 0.000 description 1
- FYBSCGZLICNOBA-XQXXSGGOSA-N Glu-Ala-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O FYBSCGZLICNOBA-XQXXSGGOSA-N 0.000 description 1
- YYOBUPFZLKQUAX-FXQIFTODSA-N Glu-Asn-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O YYOBUPFZLKQUAX-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- CBEUFCJRFNZMCU-SRVKXCTJSA-N Glu-Met-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O CBEUFCJRFNZMCU-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- BKMOHWJHXQLFEX-IRIUXVKKSA-N Glu-Tyr-Thr Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC1=CC=C(C=C1)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)O)N)O BKMOHWJHXQLFEX-IRIUXVKKSA-N 0.000 description 1
- KIEICAOUSNYOLM-NRPADANISA-N Glu-Val-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O KIEICAOUSNYOLM-NRPADANISA-N 0.000 description 1
- QRWPTXLWHHTOCO-DZKIICNBSA-N Glu-Val-Tyr Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(O)=O QRWPTXLWHHTOCO-DZKIICNBSA-N 0.000 description 1
- SOYWRINXUSUWEQ-DLOVCJGASA-N Glu-Val-Val Chemical compound CC(C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O SOYWRINXUSUWEQ-DLOVCJGASA-N 0.000 description 1
- LOEANKRDMMVOGZ-YUMQZZPRSA-N Gly-Lys-Asp Chemical compound NCCCC[C@H](NC(=O)CN)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O LOEANKRDMMVOGZ-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- 108091006013 HA-tagged proteins Proteins 0.000 description 1
- 108010052512 High Mobility Group Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000018802 High Mobility Group Proteins Human genes 0.000 description 1
- CTJHHEQNUNIYNN-SRVKXCTJSA-N His-His-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O CTJHHEQNUNIYNN-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- FHGVHXCQMJWQPK-SRVKXCTJSA-N His-Lys-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O FHGVHXCQMJWQPK-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- 101000651211 Homo sapiens Transcription factor PU.1 Proteins 0.000 description 1
- WMDZARSFSMZOQO-DRZSPHRISA-N Ile-Phe Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 WMDZARSFSMZOQO-DRZSPHRISA-N 0.000 description 1
- 208000022120 Jeavons syndrome Diseases 0.000 description 1
- PMGDADKJMCOXHX-UHFFFAOYSA-N L-Arginyl-L-glutamin-acetat Natural products NC(=N)NCCCC(N)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(O)=O PMGDADKJMCOXHX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- 241001425930 Latina Species 0.000 description 1
- 206010024229 Leprosy Diseases 0.000 description 1
- 241000880493 Leptailurus serval Species 0.000 description 1
- JUWJEAPUNARGCF-DCAQKATOSA-N Leu-Arg-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O JUWJEAPUNARGCF-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- PVMPDMIKUVNOBD-CIUDSAMLSA-N Leu-Asp-Ser Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O PVMPDMIKUVNOBD-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- IEWBEPKLKUXQBU-VOAKCMCISA-N Leu-Leu-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O IEWBEPKLKUXQBU-VOAKCMCISA-N 0.000 description 1
- ODRREERHVHMIPT-OEAJRASXSA-N Leu-Thr-Phe Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 ODRREERHVHMIPT-OEAJRASXSA-N 0.000 description 1
- BTEMNFBEAAOGBR-BZSNNMDCSA-N Leu-Tyr-Lys Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(C=C1)O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O)N BTEMNFBEAAOGBR-BZSNNMDCSA-N 0.000 description 1
- VUBIPAHVHMZHCM-KKUMJFAQSA-N Leu-Tyr-Ser Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 VUBIPAHVHMZHCM-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 1
- ABHIXYDMILIUKV-CIUDSAMLSA-N Lys-Asn-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O ABHIXYDMILIUKV-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- WRODMZBHNNPRLN-SRVKXCTJSA-N Lys-Leu-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O WRODMZBHNNPRLN-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- GHKXHCMRAUYLBS-CIUDSAMLSA-N Lys-Ser-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O GHKXHCMRAUYLBS-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- ZUGVARDEGWMMLK-SRVKXCTJSA-N Lys-Ser-Lys Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCCN ZUGVARDEGWMMLK-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- 241000282567 Macaca fascicularis Species 0.000 description 1
- 241000282560 Macaca mulatta Species 0.000 description 1
- OSOLWRWQADPDIQ-DCAQKATOSA-N Met-Asp-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O OSOLWRWQADPDIQ-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- 241000700559 Molluscipoxvirus Species 0.000 description 1
- YBAFDPFAUTYYRW-UHFFFAOYSA-N N-L-alpha-glutamyl-L-leucine Natural products CC(C)CC(C(O)=O)NC(=O)C(N)CCC(O)=O YBAFDPFAUTYYRW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AUEJLPRZGVVDNU-UHFFFAOYSA-N N-L-tyrosyl-L-leucine Natural products CC(C)CC(C(O)=O)NC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 AUEJLPRZGVVDNU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 206010067482 No adverse event Diseases 0.000 description 1
- 108091093105 Nuclear DNA Proteins 0.000 description 1
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 1
- 241000282579 Pan Species 0.000 description 1
- 241000282577 Pan troglodytes Species 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 241000286209 Phasianidae Species 0.000 description 1
- KIAWKQJTSGRCSA-AVGNSLFASA-N Phe-Asn-Glu Chemical compound C1=CC=C(C=C1)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)N[C@@H](CCC(=O)O)C(=O)O)N KIAWKQJTSGRCSA-AVGNSLFASA-N 0.000 description 1
- PYOHODCEOHCZBM-RYUDHWBXSA-N Phe-Met Chemical compound CSCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 PYOHODCEOHCZBM-RYUDHWBXSA-N 0.000 description 1
- GKZIWHRNKRBEOH-HOTGVXAUSA-N Phe-Phe Chemical compound C([C@H]([NH3+])C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C([O-])=O)C1=CC=CC=C1 GKZIWHRNKRBEOH-HOTGVXAUSA-N 0.000 description 1
- BQMFWUKNOCJDNV-HJWJTTGWSA-N Phe-Val-Ile Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O BQMFWUKNOCJDNV-HJWJTTGWSA-N 0.000 description 1
- SMCHPSMKAFIERP-FXQIFTODSA-N Pro-Asn-Asp Chemical compound OC(=O)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)NC(=O)[C@@H]1CCCN1 SMCHPSMKAFIERP-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- UREQLMJCKFLLHM-NAKRPEOUSA-N Pro-Ile-Ser Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O UREQLMJCKFLLHM-NAKRPEOUSA-N 0.000 description 1
- FXGIMYRVJJEIIM-UWVGGRQHSA-N Pro-Leu-Gly Chemical compound OC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H]1CCCN1 FXGIMYRVJJEIIM-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 1
- GZNYIXWOIUFLGO-ZJDVBMNYSA-N Pro-Thr-Thr Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O GZNYIXWOIUFLGO-ZJDVBMNYSA-N 0.000 description 1
- 102000014961 Protein Precursors Human genes 0.000 description 1
- 241001455645 Rabbitpox virus Species 0.000 description 1
- 241000700638 Raccoonpox virus Species 0.000 description 1
- 101000836070 Rattus norvegicus Serine protease inhibitor A3L Proteins 0.000 description 1
- 108091028664 Ribonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 241000288959 Saguinus Species 0.000 description 1
- 241000288961 Saguinus imperator Species 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- PTWIYDNFWPXQSD-GARJFASQSA-N Ser-Lys-Pro Chemical compound C1C[C@@H](N(C1)C(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CO)N)C(=O)O PTWIYDNFWPXQSD-GARJFASQSA-N 0.000 description 1
- GSCVDSBEYVGMJQ-SRVKXCTJSA-N Ser-Tyr-Asp Chemical compound C1=CC(=CC=C1C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CO)N)O GSCVDSBEYVGMJQ-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- 241000287231 Serinus Species 0.000 description 1
- 241000270295 Serpentes Species 0.000 description 1
- 241000321597 Skunkpox virus Species 0.000 description 1
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 241000700565 Swinepox virus Species 0.000 description 1
- DFTCYYILCSQGIZ-GCJQMDKQSA-N Thr-Ala-Asn Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O DFTCYYILCSQGIZ-GCJQMDKQSA-N 0.000 description 1
- JMZKMSTYXHFYAK-VEVYYDQMSA-N Thr-Arg-Asn Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)O)N)O JMZKMSTYXHFYAK-VEVYYDQMSA-N 0.000 description 1
- AHOLTQCAVBSUDP-PPCPHDFISA-N Thr-Ile-Lys Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](NC(=O)[C@@H](N)[C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(O)=O AHOLTQCAVBSUDP-PPCPHDFISA-N 0.000 description 1
- VMSSYINFMOFLJM-KJEVXHAQSA-N Thr-Tyr-Met Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(C=C1)O)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)O)N)O VMSSYINFMOFLJM-KJEVXHAQSA-N 0.000 description 1
- 102100027654 Transcription factor PU.1 Human genes 0.000 description 1
- 239000007984 Tris EDTA buffer Substances 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- ZSXJENBJGRHKIG-UWVGGRQHSA-N Tyr-Ser Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 ZSXJENBJGRHKIG-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 1
- FZADUTOCSFDBRV-RNXOBYDBSA-N Tyr-Tyr-Trp Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 FZADUTOCSFDBRV-RNXOBYDBSA-N 0.000 description 1
- AEOFMCAKYIQQFY-YDHLFZDLSA-N Tyr-Val-Asn Chemical compound NC(=O)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 AEOFMCAKYIQQFY-YDHLFZDLSA-N 0.000 description 1
- OGNMURQZFMHFFD-NHCYSSNCSA-N Val-Asn-Lys Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O)N OGNMURQZFMHFFD-NHCYSSNCSA-N 0.000 description 1
- ZEVNVXYRZRIRCH-GVXVVHGQSA-N Val-Gln-Lys Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(=O)N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O)N ZEVNVXYRZRIRCH-GVXVVHGQSA-N 0.000 description 1
- GVJUTBOZZBTBIG-AVGNSLFASA-N Val-Lys-Arg Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)O)N GVJUTBOZZBTBIG-AVGNSLFASA-N 0.000 description 1
- IECQJCJNPJVUSB-IHRRRGAJSA-N Val-Tyr-Ser Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](Cc1ccc(O)cc1)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O IECQJCJNPJVUSB-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 1
- 101000803389 Viola hederacea Root cyclotide 1 Proteins 0.000 description 1
- 108700005077 Viral Genes Proteins 0.000 description 1
- 108010067390 Viral Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108020000999 Viral RNA Proteins 0.000 description 1
- 241001137865 Volepox virus Species 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- KOSRFJWDECSPRO-UHFFFAOYSA-N alpha-L-glutamyl-L-glutamic acid Natural products OC(=O)CCC(N)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(O)=O KOSRFJWDECSPRO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 230000030741 antigen processing and presentation Effects 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 108010008355 arginyl-glutamine Proteins 0.000 description 1
- 238000003491 array Methods 0.000 description 1
- 210000004507 artificial chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 108010040443 aspartyl-aspartic acid Proteins 0.000 description 1
- 108010093581 aspartyl-proline Proteins 0.000 description 1
- 108010092854 aspartyllysine Proteins 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 238000000429 assembly Methods 0.000 description 1
- 230000000712 assembly Effects 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 238000005452 bending Methods 0.000 description 1
- 102000012740 beta Adrenergic Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010079452 beta Adrenergic Receptors Proteins 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 1
- 210000003855 cell nucleus Anatomy 0.000 description 1
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 1
- 210000004671 cell-free system Anatomy 0.000 description 1
- 108091092356 cellular DNA Proteins 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 235000013330 chicken meat Nutrition 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 1
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 239000005547 deoxyribonucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000002637 deoxyribonucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 239000000032 diagnostic agent Substances 0.000 description 1
- 229940039227 diagnostic agent Drugs 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 1
- 231100000676 disease causative agent Toxicity 0.000 description 1
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 1
- 230000002222 downregulating effect Effects 0.000 description 1
- 238000011143 downstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 238000000635 electron micrograph Methods 0.000 description 1
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 1
- 230000028023 exocytosis Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000010195 expression analysis Methods 0.000 description 1
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 1
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 108010055341 glutamyl-glutamic acid Proteins 0.000 description 1
- 108010089804 glycyl-threonine Proteins 0.000 description 1
- 239000011544 gradient gel Substances 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 238000001889 high-resolution electron micrograph Methods 0.000 description 1
- 108010040030 histidinoalanine Proteins 0.000 description 1
- 108010085325 histidylproline Proteins 0.000 description 1
- 238000000265 homogenisation Methods 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- BJRNKVDFDLYUGJ-RMPHRYRLSA-N hydroquinone O-beta-D-glucopyranoside Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC1=CC=C(O)C=C1 BJRNKVDFDLYUGJ-RMPHRYRLSA-N 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 230000008676 import Effects 0.000 description 1
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 230000001524 infective effect Effects 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 230000002427 irreversible effect Effects 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 238000009533 lab test Methods 0.000 description 1
- 238000002386 leaching Methods 0.000 description 1
- 108010034529 leucyl-lysine Proteins 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 238000009630 liquid culture Methods 0.000 description 1
- 239000006194 liquid suspension Substances 0.000 description 1
- 244000144972 livestock Species 0.000 description 1
- 108010003700 lysyl aspartic acid Proteins 0.000 description 1
- 201000004792 malaria Diseases 0.000 description 1
- 241001515942 marmosets Species 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 229940126601 medicinal product Drugs 0.000 description 1
- 230000002438 mitochondrial effect Effects 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 231100000344 non-irritating Toxicity 0.000 description 1
- 230000008689 nuclear function Effects 0.000 description 1
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 1
- 108010073025 phenylalanylphenylalanine Proteins 0.000 description 1
- 230000001766 physiological effect Effects 0.000 description 1
- 230000035479 physiological effects, processes and functions Effects 0.000 description 1
- 239000006187 pill Substances 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 230000001323 posttranslational effect Effects 0.000 description 1
- 230000002028 premature Effects 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 108700042769 prolyl-leucyl-glycine Proteins 0.000 description 1
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 1
- 235000019833 protease Nutrition 0.000 description 1
- 239000011814 protection agent Substances 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 238000002331 protein detection Methods 0.000 description 1
- 230000004853 protein function Effects 0.000 description 1
- 238000001243 protein synthesis Methods 0.000 description 1
- 230000006337 proteolytic cleavage Effects 0.000 description 1
- 229960000160 recombinant therapeutic protein Drugs 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 239000002336 ribonucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000002652 ribonucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 108091092562 ribozyme Proteins 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 238000007790 scraping Methods 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 1
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 1
- 229940083538 smallpox vaccine Drugs 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 1
- 230000002123 temporal effect Effects 0.000 description 1
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 1
- 108010061238 threonyl-glycine Proteins 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 1
- 230000014621 translational initiation Effects 0.000 description 1
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 1
- 239000003656 tris buffered saline Substances 0.000 description 1
- 201000008827 tuberculosis Diseases 0.000 description 1
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 1
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 1
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 1
- 201000002498 viral encephalitis Diseases 0.000 description 1
- 230000006490 viral transcription Effects 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/86—Viral vectors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/24011—Poxviridae
- C12N2710/24111—Orthopoxvirus, e.g. vaccinia virus, variola
- C12N2710/24122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/24011—Poxviridae
- C12N2710/24111—Orthopoxvirus, e.g. vaccinia virus, variola
- C12N2710/24141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
- C12N2710/24143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/24011—Poxviridae
- C12N2710/24111—Orthopoxvirus, e.g. vaccinia virus, variola
- C12N2710/24151—Methods of production or purification of viral material
- C12N2710/24152—Methods of production or purification of viral material relating to complementing cells and packaging systems for producing virus or viral particles
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Virology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Abstract
Mevcut buluş bir modifiye edilmiş memeli hücresi ile ilgilidir, burada hücrenin genomu bir promotör kontrolü altında CP77 kodlayan bir dizi içermesi için modifiye edilir, böylece modifiye edilmiş hücre hattı, modifiye edilmemiş hücre içinde daha az çoğalabilen veya hiç çoğalamayan bir çiçek virüsünün propagasyonunu sürdürür.
Description
TARIFNAME
VIRAL VEKTÖR IMALATI
ILGILI BASVURULAR
basvurusu ile iliskilidir ve bunlardan öncelik talep etmektedir.
BULUSUN SAHASI
Mevcut bulus, çiçek virüsü-temelli ilaçlari çogaltmak ve böylelikle imal etmek için uygun
olan hücrelerin ve hücre hatlarinin gelistirilmesi ile ilgilidir. Özel olarak, spesifikasyon,
terapötik veya profilaktik ajanlarin imalati için bu tarz çiçek virüslerini çogaltmak
amaciyla rekombinant modifiye edilmis hücresel substratlar ile ilgilidir.
BULUSUN ALT-YAPISI
Söz konusu spesifikasyonda referanslarin bibliyografik detaylari, spesifikasyonun
sonunda Iistelenir.
Çiçek virüsü familyasi, iki alt-familya, Chordopoxvi'ri'nae ve Entomopoxw'rinae içerir.
Chordopoxvi'r/'nae, insanlari enfekte eden türleri (örnegin, variola virüsünü, çiçek
hastaliginin nedensel ajanini, (1796'da Jenner tarafindan bildirilen orijinal çiçek
hastaligi asisindan olusturulan) inek çiçek virüsünü, (bir ikinci nesil çiçek hastaligi asisi
olarak kullanilan) vaksiniya virüsünü ve maymun çiçek virüsünü) içeren
Orthopoxviridae'yi ve kuslari enfekte eden türleri, örnegin, kus çiçek virüsünü ve
kanarya çiçek virüsünü, içeren Avipoxviridae virüslerini içeren sekiz cinsi içerir.
Bunlarin çiçek hastaligi asilarinda antijenler olarak kullanimini ek olarak, bir "omurga"
vektörler olarak rekombinant vaksiniya-temelli virüslerin ve kus-çiçek virüslerinin
kullanimina yönelik çok ilgi vardir. Intra-sitoplazmik vektörler olarak, Orthopoxviridae,
inter ali'a, yabanci antijenleri konak sitoplazmasina ve hücre yüzeyi üzerinde sunulmasi
için antijenleri peptitlere isleyen antijen isleme yollarina aktarabilir. Yabanci antijenleri
kodlayan bu tarz vektörler, diger asilama stratejileri ile tedavi edilmesinin zor oldugu
kanitlanmis olan, hastaliklar, örnegin, AIDS, tüberküloz, malarya ve kanser, için
asilarin gelistirilmesinde kullanilir.
Chordopoxvirinae, boyut olarak para-çiçek virüslerinde 130 kb ila kus-çiçek virüslerinde
300 kb'den fazla olan aralikta lineer çift-sarmalli DNA genomlarina sahiptir ve bunlarin
konak içindeki yasam siklusu bütünüyle konak hücre sitoplazmasinda geçirilir. Çiçek-
virüsleri büyük ölçüde, özellikle erken mRNA sentezine dahil edilen prosesler için,
bunlarin konak hücresinden ve konak hücre moleküllerinden bagimsiz çalisir. Bununla
birlikte, konak moleküllerinin ara ve geç viral transkripsiyonun baslatilmasi veya
sonlandirilmasi için kullanildigi görülür. Çiçek-virüsleri, viral replikasyona olanak
saglayan hücresel kosullara izin vermek için spesifik olarak konak sinyalleme yollarini
hedef alan ve manipüle eden yapisal olarak çesitli "konak aralik faktörleri" üretir. Çogu
çiçek-virüsü memeli hücrelerini baglayabilir ve enfekte edebilir, ancak müteakip
enfeksiyonun permisif olmasi (enfeksiyöz viriyonlar üretebilmesi) veya permisif-
olmamasi (büyük ölçüde enfeksiyöz viriyonlar üretememesi) dahil edilen spesifik çiçek-
virüsüne ve spesifik hücre tipine baglidir. Çiçek virüsü-konak etkilesimleri, özellikle
konak-aralik genleri, moleküler düzeyinde ve hangi faktörlerin hem viral hem de
hücresel propagasyonu kolaylastirmak amaciyla iliskiyi modüle etmek için gerekli
olduguna yönelik güncel olarak görece zayif bir kavrayis vardir. Konak aralik genlerinin
bir Incelemesi için, burada bütünüyle eklenmis olan Werden et al., 2008, kaynagina
basvurulabilir.
Çiçek hastaligi asilari olarak ve bunu takiben viral vektörler olarak bunlarin kullanimina
iliskin vaksiniya suslari konusundaki gözlemler, 1960'larin baslarindan günümüze
kadar yayimlanmaktadir. Vaksiniyanin, çiçek hastaligi asilari olarak kullanilan suslari
içeren, belirli suslari, insan hücrelerinde çogalabilir ve bundan dolayi saglik risklerini,
örnegin, viral ensefalit gelismesini, temsil eder. Daha güvenli bir asi gelistirmek
amaciyla, Ankara'dan bir vaksiniya susu ("CVA" olarak ifade edilir), insan-olmayan
hücrelerde 500 kattan daha fazla geçirilmistir. Bu proses sirasinda, vaksiniya genomu
orijinal CVA genomuna kiyasla en az alti majör silinmenin gelismesini içererek büyük
ölçüde degismistir. Modifiye edilmis virüs, insanda daha az patojeniktir, ancak hala bir
koruyucu immün yanit meydana getirebilir. Bu atenüe edilmis vaksiniya virüsü, MVA
(Modifiye Edilmis Vaksiniya Ankara) olarak ifade edilir ve ayrica farkli geçis numaralari
olan virüslerin genetik ve fenotipik olarak farkli oldugu bulundugundan, geçis numarasi
ile de kategorize edilir. Bununla birlikte, geçis numarasi 515 MVA515`iri genetik olarak
kararli oldugu anlasilmistir. 1990'Iarin baslarinda, MVA suslarinin, örnegin,
MVA572'nin ve bunun türevinin, MVA F6'nin, permisif-olmayan hücrelerde (burada
virüs çogalmayacaktir) yüksek düzeylerde vaksiniya proteinleri ve heterolog
(rekombinant) proteinler eksprese edebildigi gözlenmistir; bu, söz konusu heterolog
moleküller, örnegin, asi veya terapi aktarimi için antijenleri kodlayanlar, için bir vektör
olarak MVA'nin gelistirilmesine olanak saglar.
Daha güncel olarak, MVA'nin bilinen alti büyük silinmesini CVA'ya uygulama ile
MVA'nin kalitelerini tasiyan bir modifiye edilmis vaksiniya virüsü üretmeye tesebbüs
edilmistir. Ilginç bir sekilde, bu, MVA'nin atenüe edilmis kalitelerini tasiyan bir virüs ile
sonuçlanmamistir. Konak aralik genlerinin yoklugunun gözlenen atenüasyondan
sorumlu olabilecegi önerilmistir, bununla birlikte, bu dogrulanmamistir (bakiniz,
Çiçek-virüsleri, bir büyük, lineer dsDNA genomu, bir sitoplazmik propagasyon yeri ve
bir kompleks viriyon morfolojisi ile karakterize edilen virüslerin genis bir familyasini
olusturur. Vaksiniya virüsü, virüsün bu grubunun temsili virüsüdür ve viral morfojenez
açisindan en çok çalisilir. Vaksiniya virüsü viriyonlarinin, iki yaninda "lateral cisimler"
yer alan bir çeperli, bikonkav çekirdek özelligi gösteren bir kompleks iç yapisi olan
yolu, immatür viriyonlara (lV'Iere) gelisen ve akabinde matür viriyonlara (MV'Iere)
evrilen yarim aylari içeren membranin bir fabrikasyonunu içerir. 70`ten fazla spesifik
gen ürünü, vaksiniya virüsü viriyonlarina dahil edilir, burada 50'den fazla spesifik gende
mutasyonlarin vaksiniya virüsü birlesmesi üzerinde etkileri simdi tarif edilir.
Vaksiniya virüsü, bunun yüzey membranlarinin konak hücrenin plazma membrani ile
füzyonu, böylece çekirdegi (ve lateral cisimleri) sitoplazma için salma ve virüsün
transkripsiyonel programini aktive etme, ile hücrelere girer. Viriyon çekirdekleri, erken
mRNA'nin sentezi ve modifikasyonu için gerekli olan virüs-kodlu enzimlerin tam
komplemanini içerir. Erken genler, DNA propagasyonu için gerekli olan enzimleri
kodlar ve böylelikle erken gen ekspresyon pikleri olarak, viral DNA propagasyonu,
i'fabrikalar" olarak adlandirilan sitoplazmik yerlerde meydana gelir. Erken genler ayrica,
ara transkripsiyon faktörlerini ve ara genleri de kodlar, nihayetinde, geç transkripsiyon
faktörlerini kodlar, böylece ara ve geç genler, viral DNA propagasyonunun ön-kosul
baslatilmasindan sonra ardi ardina eksprese edilir. Böylelikle, viral genlerin tam
komplemani, erken, ara ve geç siniflarin sinif-spesifik transkripsiyonel promotörler ve
viral olarak kodlanmis transkripsiyon faktörleri ile ayirt edilmesi ile bir temporal
kaskadda transkribe edilir. Dahasi, yalnizca çogaltilmis genomlar, ara ve geç
transkripsiyon için kompetan sablonlardir. Genlerin bu iki sinifi birlikte, viriyon yapisal
proteinlerini, viriyon enzimlerini ve birlesme faktörlerini kodlar ve yeni projeni virüs
parçaciklarinin birlesmesi için gereklidir.
Kisa bir süre sonra, viral alim ve erken ekspresyon enfeksiyon-spesifik sitoplazmik
alanlari hücre içinde olusur, bunlar yogunluk açisindan tekdüzedir ve bazen, zamanla
boyutu artan sisternalardan türetilen endoplazmik retikulum (ER) ile çevrelenir. Bu
alanlar, viral DNA propagasyonu yerlerini temsil eder ve bunlar siklikla "viral fabrikalar"
olarak adlandirilir.
Viral birlesme, viral fabrikalar içinde kati yarim ay-sekilli yapilarin (üç boyutlu
kadehçiklerin) olusmasi ile baslar. Yüksek rezolüsyonlu elektron mikrograflarinda, bu
yarim ay sekilli yapilarin dis katmani, "spiküller" olarak adlandirilan düzenli sekilde
araliklandirilmis çikintilardan olusturulur. Yarim aylar, immatür viriyonlar (lV) olarak
adlandirilan kapali daireler (üç boyutlu küreler) halinde gelene kadar ayni egriligi idame
ettirirken, boylari görünür bir sekilde artar. IV, yogunluk açisindan tekdüze olan, ancak
çevreleyen fabrikaya kiyasla ayirt edilebilir bir sekilde elektron açisindan daha yogun
olan "viroplazm“ materyali ile doldurulur. IV'Ier olustukça, enkapsüle edilmis DNA'nin
alimi ayrica asagidaki sekilde gerçeklesir: bunlar lV'ler içinde "nükleoid" olarak
adlandirilan bir elektron açisindan yogun, yuvarlak veya ovoid alt-alanlar olarak
elektron mikrograflarinda görülür. Kondense olmus DNA'nin nükleoidlerini içeren IV'Ier,
siklikla "IVN" olarak ifade edilir. Bir kaç viriyon protein öncülünün proteolitik klevaj
yoluyla matürasyonu, IVN'nin matür viriyonlara (MV) morfojenezi için gereklidir. Matür
viriyonlarin büyük çogunlugu, dis fabrikalarda bulunur ve bir fabrikanin periferinde veya
en yakin fabrikadan bir anlamli mesafe ile görünür bir sekilde ayrilmis kümeler olarak
var olabilir.
Çiçek virüsü viriyonlari, üç enfeksiyöz formda var olur: matür viriyonlar (MV), sarili
viriyonlar (WV) ve ekstraselüler viriyonlar (EV). MV, virüsün en basit formudur,
çekirdegin konkavliklarini dolduran, iki yaninda lateral cisimler yer alan bir bikonkav,
DNA-içeren çekirdek içeren membranlanmis parçaciklardir. MV normal olarak özellikle
hücrelerin içinde bulunur ve yalnizca hücre Iizisi ile serbest birakilir. WV, trans-Golgi
sisternalarindan türetilen iki ilave Iipit ikili-katmani ile çevrelenen MV'den olusur. Dis
membranlari karakteristik viral proteinler içeren WV, EV'nin öncülleridir ve ayrica hücre
içinde de bulunur. EV, en dis WV membraninin plazma membrani ile füzyonu, böylece
bir ilave membran içinde sarili bir MV'yi serbest birakma yoluyla ekzositoz yapilmis
olan WV'den olusur. EV'nin bir fraksiyonu, hücre yüzeyine tutturulmus olarak
bulunurken, bazlari ekstraselüler ortam içinde serbest halde bulunur. EV'nin, virüsün
bir organizma içinde yayilmasi için önemli oldugu düsünülür.
Esansiyel genlerin virüslerden uzaklastirilmasi ve konak hücrelerde komplementasyon,
tedavi ve terapi amaciyla güvenli ve etkili viral vektörler üretmek için bir genel önerilen
strateji olarak teknikte bilinir. Arttirilmis güvenligi, ekspresyonu ve/veya
immünojenisitesi olan iyilestirilmis atenüe edilmis orto-çiçek vektörlerine yönelik bir
ihtiyaç ve bu tarz orto-çiçek vektörlerini güvenli ve ekonomik bir sekilde çogaltmanin ve
imal etmenin yöntemleri için orantili bir ihtiyaç vardir.
Çok sayida memeli hücre hatti, arastirma amaçlari için rekombinant proteinlerin
üretilmesi için kullanilir. Bunlar, tavsan, hamster, primat ve insan kaynakli hücre
hatlarini, örnegin, sinirlandirma olmaksizin ve teknikte bilindigi üzere, HEK293, 293T,
1438, CHO, HeLa, Vero ve BHK, HepGZ ve 3T3 hücrelerini içerir. Göze çarpan bir
sekilde, bununla birlikte, rekombinant terapötik proteinlerin büyük çogunlugunun GMP
üretimi CHO hücrelerinde yapilmaktadir; bu durum, bu hücre hattini insan terapötikleri
için en iyi sekilde çalisilmis ve onaylanmis hücre hatti yapmistir. CHO hücreleri,
süspansiyon kültürleri için çok yüksek yogunluklara kadar büyüyebilir ve ürünleri
saflastirmak için asagi akis prosesleri çok iyi gelistirilmistir. Ilgili olarak, ne vaksiniya,
örnegin, vaksiniya-COP veya vaksiniya-WR ne de bunun türevleri, örnegin, MVA ve
NYVAC, CHO hücrelerin çogalacaktir.
Lokal viral promotörler ve çiçek viral RNA polimerazi kontrolü altinda çiçek virüsünden
viral konak aralik genlerinin ekspresyonu teknikte bilinir.
Viral replikasyonu kurtarmak veya viral replikasyona izin vermek ve konak hücresi sag
kalimina izin vermek için vakitli bir sekilde bir memeli hücresinin genomundan belirli
viral konak aralik genlerinin ekspresyonu daha önceden tarif edilmemistir.
KISA AÇIKLAMA
Mevcut spesifikasyon, bir çiçek-viral konak aralik faktörünü eksprese etmesi için
transforme edilmis in vitro kültürlenmis memeli hücrelerini ve viral vektörleri çogaltmak
için, bu tarz hücreleri kültürlemeyi içeren, bir yöntemi tarif eder.
Bir birinci yönünde, mevcut bulus, bir modifiye edilmis memeli hücresi saglar, burada
hücrenin genomu, bir promotör kontrolü altinda CP77'yi kodlayan bir dizi içermesi için
modifiye edilir, böylece modifiye edilmis hücre hatti, modifiye edilmemis hücrede daha
az çogalabilen veya hiç çogalamayan bir çiçek virüsünün propagasyonunu sürdürür.
Bir ikinci yönünde, mevcut bulus, CHO hücrelerinde çogalmayan bir orto-çiçek virüsünü
çogaltmak için, çiçek virüsünün bir memeli hücre hattinda in vitro çogaltilmasini içeren,
bir proses saglar, burada hücre hatti, CP77'yi kodlamasi ve bir promotör kontrolü
altinda eksprese etmesi modifiye edilir.
Çesitli alternatif uygulamalarda, modifiye edilmis hücreler ilaveten, bir promotör
kontrolü altinda D13L'yi kodlayan bir dizi içermesi ve/veya bir promotör kontrolü altinda
K1 L'yi kodlayan bir dizi içermesi için modifiye edilir.
Burada "CP77", “K1L" ve "D13L" atiflari, fonksiyonel ortologlari ve fonksiyonel
varya ntlari içerir.
ÖZEL UYGULAMALARIN DETAYLI AÇIKLAMASI
Söz konusu bulus, özel prosedürler veya ajanlar, ajanlarin spesifik formülasyonlari ve
çesitli tibbi metodolojiler ile sinirli degildir, böyle olunca da çesitlilik gösterebilir. Burada
kullanilan terminoloji, yalnizca özel uygulamalari tarif etme amaci tasir ve sinirlayici
olmasi amaçlanmaz. Aksi tanimlanmadikça, burada kullanilan tüm teknik ve bilimsel
terimler, bu bulusun ait oldugu teknikte normal uzmanligi olan bir kisi tarafindan yaygin
bir sekilde anlasilan ile ayni anlama sahiptir.
Burada tarif edilenlere benzer veya es-deger herhangi bir materyal ve yöntem, mevcut
bulusu tatbik etmek veya test etmek için kullanilabilir. Tatbik edenler özellikle
asagidakilere yönlendirilir: Sambrook et al., (1989) Molecular Cloning: A Laboratory
Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Press, Plainsview, N.Y.; Ausubel et al., (1999)
Current Protocols in Molecular Bio/ogy (Supplement 47), John Wiley & Sons, New
York; Murphy et al., (1995) Virus Taxonomy Springer Verlagz79-87, Mahy Brian WJ
and Kangro O Hillar (Eds): Virology Methods Manual 1996, Academic Press; ve
Davison AJ and Elliott RM (Eds): Molecular Virology, A practical Approach 1993, IRL
teknigin tanimlari ve terimleri ve teknikte uzmanligi olan kisi tarafindan bilinen diger
yöntemler.
Burada tarif edilenlere benzer veya es-deger herhangi bir yöntemin ve materyalin
mevcut bulusun tatbikinde veya test edilmesinde kullanilabilmesine ragmen, terchi
edilen yöntemler ve materyaller tarif edilir. Mevcut bulusun amaçlari için, asagidaki
terimler, asagida tanimlanir.
Bu spesifik boyunca, baglam aksini gerektirmedikçe, “içermek", "içerir“ ve "içeren"
sözcüklerinin, bir ifade edilen adimin veya elemanin veya adimlar veya elemanlar
grubunun dahil edilmesini, ancak herhangi bir baska adimin veya elemanin veya
adimlar veya elemanlar grubunun dislanmamasini gösterdigi anlasilacaktir. Böylelikle,
mecburi oldugunu, ancak diger elemanlarin opsiyonel oldugunu ve bulunabilecegini
veya bulunamayacagini gösterir. Atenüe edilmis orto-çiçek vektörleri baglaminda, söz
konusu vektörler, bir esansiyel matürasyon veya birlesme geninin silinmesini, bununla
birlikte, örnegin, vektöre bir antijenin veya baska proteinin kapsanmasi için, ilave
modifikasyonu içerme ile atenüasyon için modifiye edilir.
kastedilir. Böylelikle, "olusan" ifadesi, listelenen elemanlarin gerektigini veya mecburi
oldugunu ve baska elemanlarin bulunamayacagini gösterir. "Esas olarak olusan" ile,
ifadesinden sonra listelenen herhangi bir elemani içerdigi ve listelenen elemanlar için
açiklamada belirtilen aktiviteye veya etkiye müdahale etmeyen veya katki saglamayan
diger elemanlar ile sinirli oldugu kastedilir. Böylelikle, “esas olarak olusan" ifadesi,
listelenen elemanlarin gerektigini veya mecburi oldugunu, ancak diger elemanlarin
opsiyonel oldugunu ve bunlarin listelenen elemanlarin aktivitesini veya etkisini etkileyip
etkilememesine bagli olarak bulunabilecegini veya bulunamayacagini gösterir.
Burada kullanildigi sekliyle, "bir", "biri" ve "bu" tekil formlari, baglam açik bir sekilde
aksini söylemedikçe, çogul yönleri de içerir. Böylelikle, örnegin, "bir hücre" atfi, bir tek
hücreyi ayni zamanda iki veya daha fazla hücreyi içerir; "bir organizma" atfi, bir
organizmayi ayni zamanda iki veya daha fazla organizmayi içerir; ve benzeri. Bazi
uygulamalarda, "biri", "bir veya birden fazla" anlamina gelir.
Burada kullanildigi sekliyle, "ve/veya", iliskili listelenen maddelerin birinin veya birden
fazlasinin herhangi bir ve tüm olasi kombinasyonlarini ayni zamanda alternatif (veya)
seklinde yorumlandiginda kombinasyonlarin yoklugunu ifade eder ve kapsar.
Burada kullanildigi sekliyle, "atenüasyon" veya "atenüe edilmis", viral vektör
virülansinda bir düsüs anlamina gelir. Virülans, bir virüsün bir özel konakta hastaliga
neden olma yetisi olarak tanimlanir. Enfeksiyöz virüsleri üretemeyen bir çiçek-viral
vektör baslangiçta hücreleri enfekte edebilir, ancak büyük ölçüde konak içinde kendi
kendine tamamen kopyalayamaz veya çogalamaz veya bir rahatsizliga neden olamaz.
Bu, vektör bunun proteinini veya nükleik asidini konak hücre sitoplazmasina
aktardigindan, ancak süjeye zarar vermediginden, arzu edilebilir.
hücre içinde bir operatif olarak baglanmis kodlama dizisinin ekspresyonu için gerekli
olan nükleik asit dizileri (örnegin, DNA) kastedilir. Ökaryotik hücreler için uygun olan
kontrol dizileri, transkripsiyonel kontrol dizilerini, örnegin, promotörleri, poliadenilasyon
sinyallerini, transkripsiyonel hizlandiricilari, translasyonel kontrol dizilerini, örnegin,
translasyonel hizlandiricilari ve iç ribozom baglama yerlerini (IRES), mRNA kararligini
modüle eden nükleik asit dizilerini ayni zamanda bir transkribe edilmis polinükleotid
tarafindan kodlanan bir ürünü bir hücre içindeki bir intraselüler kompartimana veya
ekstraselüler ortama hedefleyen hedefleme dizilerini içerir.
Diziler saglandiginda, karsilik gelen diziler kapsanir. "Karsilik gelir" "karsilik gelen"
veya "-e karsilik gelen" ile, bir referans nükleik asit dizisine büyük ölçüde dizi özdesligi
(Örnegin, referans nükleik asit dizisinin tümünü veya bir kismina en az yaklasik %50,
97, 98, 99 veya hatta en fazla %100 dizi özdesligi) gösteren bir nükleik asit dizisi veya
bir referans amino asit dizisine büyük ölçüde dizi benzerligi veya özdesligi (örnegin,
hatta en fazla %100 dizi benzerligi veya özdesligi) gösteren bir amino asit dizisi
kastedilir.
Bir rahatsizligi tedavi etme veya önleme baglaminda veya bir hedef antijene veya
organizmaya bir immün yaniti modüle etmek için, "etkili miktar" ile, bir ajanin (örnegin,
burada tarif edildigi üzere bir atenüe edilmis orto-çiçek vektörünün) veya bunu içeren
bilesimin bu tarz tedaviye veya profilaksiye ihtiyaci olan bir bireye, bir tek doz halinde
veya bir serinin parçasi olarak, bu rahatsizligin bir semptomuna yakalanmanin
önlemesi, bu tarz semptomlarinin kontrol altinda tutulmasi ve/veya var olan
semptomlarinin tedavi edilmesi için veya hedef antijene veya organizmaya immün
yaniti modüle etmek için etkili olan bir miktarinin uygulanmasi kastedilir. Etkili miktar,
tedavi edilecek olan bireyin sagligina ve fiziksel rahatsizligina, tedavi edilecek olan
bireyin taksonomik grubuna, bilesimin formülasyonuna, tibbi durumun
degerlendirilmesine ve diger ilgili faktörlere bagli olarak çesitlilik gösterecektir. Miktarin,
rutin denemeler yoluyla belirlenebilen bir görece genis aralik içinde yer almasi beklenir.
Burada kullanildigi sekliyle, "kodlamak", "kodlayan" ve benzeri terimler, bir nükleik
asidin bir baska nükleik asit veya bir polipeptit saglama kapasitesini ifade eder.
Örnegin, bu polipeptit üretmek için transkribe edilebildiginde ve/veya aktarilabildiginde
veya bu polipeptit üretmek için transkribe edilebilen ve/veya aktarilabilen bir forma
islenebildiginde, bir nükleik asit dizisinin bir polipeptidi "kodladigi söylenir. Bu tarz bir
nükleik asit dizisi, bir kodlama dizisi veya hem bir kodlama dizisi hem de bir
kodlamayan dizi içerebilir. Böylelikle, "kodlamak", "kodlayan" ve benzeri terimler, bir
DNA molekülünün transkripsiyonundan kaynaklanan bir RNA ürününü, bir RNA
molekülünün translasyonundan kaynaklanan bir proteini, bir DNA molekülünün bir RNA
ürünü olusturmak için transkripsiyonundan ve RNA ürününün müteakip
translasyonundan kaynaklanan bir proteini veya bir DNA molekülünün bir RNA ürünü
saglamak için transkripsiyonundan, RNA ürününün bir islenmis RNA ürünü (örnegin,
mRNA) saglamak için islenmesinden ve islenmis RNA ürününün müteakip
translasyonundan kaynaklanan bir proteini içerir.
nükleik asit dizisini veya segmentini ifade eder.
hücrenin bir nükleotid dizisini RNA'ya transkribe etme ve opsiyonel olarak mRNA'yi bir
biyolojik veya biyokimyasal fonksiyon saglayan bir peptit veya polipeptit sentezlemek
için aktarma yetisini ifade eder.
Burada kullanildigi sekliyle, "gen" terimi, opsiyonel olarak bu prosese yardim eden
elemanlarin eklenmesi ile mRNA üretmek için kullanilabilmekte olan bir nükleik asit
molekülünü içerir. Genler, bir fonksiyonel protein üretmek için kullanilabilmekte olabilir
veya olmayabilir. Genler, hem kodlayan hem de kodlamayan bölgeler (Örnegin,
intronlar, regülatör elemanlar, promotörler, hizlandiricilar, sonlandirma dizileri ve 5' ve
3' aktarilmamis bölgeler) içerebilir.
manipülasyonlar ile bir organizmanin genomu içine uygulanan herhangi bir nükleik
asidi (örnegin, bir IRES içeren bir nükleotid dizisini) ifade etmek için birbiri yerine
kullanilir ve uygulanan genin modifikasyondan önceki viral genomik diziye kiyasla bazi
modifikasyonlar (örnegin, bir nokta mutasyonu, en az bir nükleotidin Silinmesini,
substitüsyonunu veya eklenmesini, bir endonükleaz klevaj yerinin varligini, bir onP
yerinin varligini, vb.) içermesi kaydiyla bu organizmada bulunan gen dizilerini içerebilir.
tanimlandigi üzere, bir "heterolog nükleik asit dizisi", "heterolog nükleotid dizisi",
herhangi bir peptidi veya polipeptidi ifade etmek için birbiri yerine kullanilir.
edilmis orto-çiçek vektörünü içeren bir vektörün bunun içine uygulanabildigi bir hücre
anlamina gelir. Bir uygulamada, hücre bir sürekli hücre hattidir. Modifiye edilmis
hücrenin sürekli olarak bölünebilen bir hücre hatti olmasi daha az mecburidir. Bir
memeli veya daha yüksek ökaryotik hücre, mevcut bulusa uygun sekilde modifiye
edilebilir ve bunu takiben bir sürekli olarak bölünen hücre hatti haline gelmesi için
transforme edilebilir veya ölümsüz hale getirilebilir. Bununla birlikte, modifikasyondan
önce hücre, teknikte bilinen, kolay bir sekilde bir iyi karakterize edilmis ve sürekli olarak
bölünen biyoteknoloji uyumlu sürekli hücre hattidir. Bu tarz hücrelere kolaylikla,
depolama kuruluslarindan, örnegin, Amerikan Tipi Kültür Koleksiyonu'ndan (ATCC)
veya Avrupa Hücre Kültürleri Koleksiyonu'ndan (ECACC), erisilebilir.
Uygun memeli hücre hatlari, bunlarla sinirli kalmamak kaydiyla, örnegin, ATCC'den
PM1, CEM, miyelom hücreleri (örnegin, SBZO hücrelerini) ve CEMX174'ü içerir.
Heterolog genleri eksprese eden modifiye edilmis hücre hatlari üretmek için teknikte
bilinen herhangi bir genom mühendisligi yöntemi kullanilabilir. Genleri piggyBac
vektörleri kullanilmasi ile hücresel genom içine yerlestirmek için transpozon
teknolojisinin kullanilmasina atif yapilir. Bununla birlikte, geni hücrelere uygulamak için,
sinirlandirma olmaksizin, retrovirüs transdüksiyonunu (örnegin, MOMLV, vb.), Ientivirüs
transdüksiyonunu, plazmid transfeksiyonunu ve entegrasyonunu, hücre hatlarini
aktarmak için baska viral sistemi, örnegin, Adenovirüsü, AAV'yi (Adenovirüs Iliskili
Virüsü), EBV'yi ve lineer DNA ile homolog rekombinansyon ile yer spesifik içeri
yerlestirme için genom düzeltme tekniklerini, mühendislik uygulanmis meganükleazlari,
transkripsiyon-aktivatör benzeri efektör nükleazlari (TAL-nükleazini), Çinko-fermuari-
nükleazlarini (ZFN'Ieri) ve CRlSPR'Ieri, içeren, çok sayida yöntem bilinir.
Bir uygulamada, memeli hücresi, bir CHO hücresidir. Viral konak ad genlerini
kodlamayan, önceki teknigin CHO hücre hatlari, insanlarda büyük ölçüde çogalamayan
vaksiniyanin veya vaksiniya türevlerinin imalatini desteklemez. Teknikte uzmanligi olan
kisiler tarafindan bilindigi üzere, hamsterin, Cricetulus griseus, overinden türetilen, Çin
hamsteri over (CHO) hücreleri, antikorlari içeren rekombinant protein terapötiklerinin
biyo-endüstriyel ve GMP üretimi için en yaygin sekilde kullanilan memeli hücresidir. Bu
amaç için CHO hücrelerinin popülaritesi, kismen, bunlarin çabuk büyümesinden ve
yüksek protein üretiminden köken alir. Bunun sonucu olarak, CHO hücre hatlari iyi
karakterize edilmistir. Uygun CHO hücre hatlari, sinirlandirma olmaksizin, A2, A2H,
XrSG, CHO-K1, CHO/dhfr, RR-CHO-Ki, UT-I, P22, CHO-1Cö, Lec1, Le02, Lec8, Pro-5
ve CDKXB1 hatlarini içerir. ATCC CLL-61 veya ATCC CRL-9618 Erisim Numarasi
altinda ATCC ile depolanan CHO-K1 hücre hatti siklikla kullanilir. CHO-K1 hücre hatti,
Puck T. (1957) tarafindan bir eriskin Çin hamsterinin bir overinin bir biyopsisinden
baslatilan parental CHO hücre hattindan bir alt-klon olarak türetilmistir. Mevcut
spesifikasyon, modifiye edilmis CHO hücrelerinden ziyade modifiye edilmis hücreleri
tarif eder.
Bazi uygulamalarda, memeli hücresi, bir insan hücresidir, bir primat hücresidir, bir
hamster hücresidir veya bir tavsan hücresidir.
Hücreler, tek-hücreli olabilir veya sivi kültürler, tek-katmanlar veya benzerleri olarak
doku kültürü içinde büyütülebilir. Konak hücreler ayrica, dokulardan dogrudan veya
dolayli olarak da türetilebilir veya hayvanlari içeren bir organizma içinde de bulunabilir.
Burada tasarlandigi üzere bir immün yaniti "indüklemenin", bir immün yanit meydana
getirmeyi veya stimüle etmeyi ve/veya bir önceden var olan immün yaniti güçlendirmeyi
içerdigi anlasilacaktir.
Burada kullanildigi sekliyle, "iç ribozomal giris geri" veya "IRES" terimi, iç ribozomal
giris yerinin asagi akis (yani, 3' ucunda) yer olan bir operatif olarak baglanmis kodlama
bölgesinin translasyonunu saglamak için, ayni mRNA içinde bir kodlama bölgesinin
içindeki bir yerde veya mRNA'nin 5' ucunun 3' tarafindaki bir yerde bir mRNA'nin
translasyonunu baslatmaya olanak saglayan bir viral, hücresel veya sentetik (örnegin,
rekombinant) nükleotid dizisini ifade eder. Bu, translasyonu 5` baslik yapisindan
bagimsiz ve mRNA'nin 5' ucundan bagimsiz hale getirir. Bir IRES dizisi, bir operatif
olarak baglanmis kodlama bölgesinin translasyonunun baslatilmasi için ihtiyaç duyulan
gerekli cis-etki eden diziler saglar.
Burada kullanildigi sekliyle, "izole edilmis" teriminin, burada bilesigin dogal olarak
içinde bulundugundan farkli bir ortamda olan bir hücreyi, söz konusu bir bilesigi
(örnegin, bir rekombinant çiçek-virüsünü, bir nükleik asit molekülünü, örnegin, bir
genomu, bir polipeptidi, vb.) tarif etmesi kastedilir. "Izole edilmis" teriminin, söz konusu
bilesik için büyük ölçüde zenginlestirilmis ve/veya burada söz konusu bilesigin kismen
veya büyük ölçüde saflastirildigi örnekler içindeki bilesikleri içermesi kastedilir.
Burada kullanildigi sekliyle, "operatif olarak bagli" veya "operatif olarak baglanmis"
terimi, birjukstapozisyonu ifade eder, böylece bu sekilde tarif edilen bilesenler, bunlarin
hedeflenen sekilde fonksiyon göstermesine izin veren bir iliski içindedir. Örnegin, bir
kodlama dizisine "operatif olarak baglanmis" transkripsiyonel kontrol dizisi,
transkripsiyonel kontrol dizisi ile uyumlu kosullar altinda kodlama dizisinin
ekspresyonuna izin vermesi için kodlama dizisine kiyasla transkripsiyonel kontrol
dizisinin konumlandirilmasini ve/veya oryantasyonunu ifade eder. Bir baska örnekte,
bir orto-çiçek virüsü kodlama dizisine operatif olarak bagli bir IRES, orto-çiçek virüsü
kodlama dizisinin basliktan bagimsiz translasyonuna izin vermesi için orto-çiçek virüsü
kodlama dizisine kiyasla IRES'in kunomlandirilmasini ve/veya oryantasyonunu ifade
Burada kullanildigi sekliyle, "açik okuma çerçevesi" ve "ORF", bir kodlama dizisinin
translasyon baslatma ve sonlandirma kodonlari arasinda kodlanan amino asit dizisini
ifade etmek için burada birbiri ile degistirilebilir bir sekilde kullanilir. "Baslatma kodonu"
(örnegin, ATG) ve "sonlandirma kodonu" (örnegin, TGA, TAA, TAG), bir kodlama dizisi
içinde protein sentezinin (mRNA translasyonunun) sirasiyla baslatilmasini ve zincir
sonlandirilmasini belirten bitisik üç nükleotidlik bir birimi ('kodon') ifade eder.
Burada kullanildigi sekliyle, "ana virüs" teriminin, mevcut bulusun bir rekombinant
virüsünü olusturmak için heterolog nükleik asit dizisini katmasi için modifiye edilen bir
virüse bir atif oldugu anlasilacaktir.
Burada kullanildigi sekliyle, "polinükleotid", "polinükleotid dizisi", "nükleotid dizisi",
gösterir. Terim tipik olarak, en az 10 baz uzunlugunda, ribonükleotidler veya
deoksiribonükleotidler veya nükleotidin her bir tipinin bir modifiye edilmis formu olan,
nükleotidlerin polimerik formunu ifade eder. Terim, RNA'nin veya DNA'nin tek ve çift
sarmalli formlarini içerir.
polimerini içeren veya bundan olusan molekülleri ve bunlarin varyantlarini ve sentetik
analoglarini ifade etmek için burada birbiri ile degistirilebilir bir sekilde kullanilir.
Böylelikle, bu terimler, burada bir veya birden fazla amino asit rezidüsünün sentetik
dogal-olusumlu olmayan amino asitler, örnegin, bir karsilik gelen dogal olusumlu amino
asidin bir kimyasal analogu, oldugu amino asit polimerleri ayni zamanda dogal-
olusumlu amino asit polimerleri için geçerlidir.
Burada kullanildigi sekliyle, "nükleik asit molekülleri", "polinükleotidler'i ve benzerleri
için kullanilan "rekombinant" teriminin, konak hücrelerde veya burada tarif edilen
hücresiz sistemlerde transkribe edilebilen ve/veya aktarilabilen yapay nükleik asit
yapilari (yani, kopyalamayan cDNA veya RNA; veya replikonlar, kendi kendini
kopyalayan CDNA veya RNA) anlamina geldigi anlasilir. Rekombinant nükleik asit
molekülleri veya polinükleotidler, bir vektör içine yerlestirilebilir. Viral-olmayan vektörler,
örnegin, plazmid ekspresyon vektörleri veya viral vektörler, kullanilabilir. Bu bulusa
göre nükleik asit yapisinin içeri yerlestirilmesinin vektörler çesidi ve teknigi uzman kisi
tarafindan bilinir. Bulusa göre bir nükleik asit molekülü veya polinükleotid, mevcut bulus
tarafindan tarif edilen dizilimde dogada bulunmaz. Bir baska ifadeyle, bir heterolog
nükleotid dizisi, bir ana virüs genomunun elemanlari (örnegin, promotör, ORF,
poliadenilasyon sinyali, ribozim) ile dogal olarak birlestirilmez.
Burada kullanildigi sekliyle, "rekombinant virüs" teriminin, en az bir heterolog nükleik
asit dizisi içeren bir "ana virüs" için bir atif oldugu anlasilacaktir.
Burada kullanildigi sekliyle, "dizi özdesligi terimi, bir karsilastirma penceresi boyunca
bir nükleotid-nükleotid temelinde veya bir amino asit-amino asit temelinde dizilerin ne
dereceye kadar özdes oldugunu ifade eder. Böylelikle, bir "dizi özdesliginin yüzdesi",
karsilastirma penceresi boyunca iki optimal olarak hizalanmis diziyi karsilastirma,
eslesmis pozisyonlarin sayisini elde etmek için burada Özdes nükleik asit bazinin
(örnegin, A, T, C, G, I) veya özdes amino asit rezidüsünün (örnegin, Ala, Pro, Ser, Thr,
Gly, Val, Leu, Ile, Phe, Tyr, Trp, Lys, Arg, His, Asp, Glu, Asn, Gln, Cys ve Met) her iki
dizide bulundugu pozisyonlarin sayisini belirleme, eslesmis pozisyonlarin sayisini
karsilastirma penceresi içindeki toplam pozisyon sayisina (yani, pencere boyutuna)
bölme ve dizi özdesliginin yüzdesini elde etmek için sonucu 100 ile çarpma ile
hesaplanir. Mevcut bulusun amaçlari için, "dizi özdesligi teriminin, yazilima eslik eden
referans manüelden kullanildigi üzere standart varsayilan parametreler kullanilarak
DNASIS bilgisayar programi (Windows için Versiyon 2.5; Hitachi Software engineering
Co., Ltd., South San Francisco, California, ABD firmasindan erisilebilir) ile hesaplanan
örnegin, mesela, nükleusa, mitokondriyal matrikse ve endoplazmik retikuluma, ko- veya
post-translasyonel tasinmasini yönlendiren bir kisa (yaklasik 3 ila yaklasik 60 amino
asit uzunlugundaki) peptidi ifade eder. Bir ER hedefleme sinyal peptidine sahip olan
proteinler için, sinyal peptitler tipik olarak, proteinler ER'ye tasindiktan sonra, sinyal
peptidazi ile öncül formda yarilir ve elde edilen proteinler sekretuvar yol boyunca
bunlarin intraselüler (örnegin, Golgi cisimcigi, hücre membrani veya hücre duvari) veya
ekstraselüler Iokasyonlarina hareket eder. Burada kullanildigi sekliyle, "ER hedefleme
sinyal peptitleri", ER membrani yoluyla proteinin parçasinin veya tümünün ER'nin
ucu hidrofobik dizileri içerir. Böylelikle, bir dizinin bir sinyal öncül formunun bir proteinin
bir öncül formunun parçasi olarak bulunabilecegi, ancak genellikle proteinin matür
formunda bulunmayacagi teknikte bilinir.
sübstitüsyonlari olusturan amino asitlerin yüzde numarasini ifade eder. Benzerlik, dizi
karsilastirma programlari, örnegin, GAP (Deveraux et al., 1984, Nuc/eic Aci'ds
Research12: 387-395) kullanilarak belirlenebilir. Böylelikle, burada alinti yapilanlar için
bir benzer veya büyük ölçüde farkli uzunluktaki diziler, hizalama içine bosluklarin
yerlestirilmesi ile karsilastirilabilir, bu tarz bosluklar, örnegin, GAP tarafindan kullanilan
karsilastirma algoritmasi ile, belirlenir.
TABLO A: Emsal Konservatif Amino Asit Sübstitüsyonlari
Orijinal Rezidü Emsal Sübstitüsyonlar
Asn Gln, His
His Asn, Gln
Orijinal Rezidü Emsal Sübstitüsyonlar
Leu Ile, Val
Lys Arg, Gln, Glu
Met Leu, Ile,
Phe Met, Leu, Tyr
Tyr Trp, Phe
Val Ile, Leu
Bir karsilastirma penceresini hizalamak için dizilerin optimal hizalanmasi, algoritmalarin
bilgisayarli uygulamalari (Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0'de,
Genetics Computer Group, 575 Science Drive Madison, WI, USA, GAP, BESTFIT,
FASTA ve TFASTA) ile veya Inceleme ve seçilen çesitli yöntemlerin herhangi biri ile
üretilen (yani, karsilastirma penceresi boyunca en yüksek yüzdeli homoloji ile
sonuçlanan) en iyi hizalama ile yürütülebilir. Referans ayrica, örnegin, Altschul et al.,
familyasina da yapilabilir. Dizi analizinin detayli bir tartismasi, Ausubel et al., "Current
kaynaginin Unit 19.3'ünde bulunabilir.
Burada birbiri ile degistirilebilir bir sekilde kullanilan "süje", "hasta", "konak" veya "birey"
terimleri, bunun için terapinin veya profilaksinin arzu edildigi herhangi bir süjeyi,
özellikle bir omurgali süjeyi ve hatta daha özel olarak bir memeli süjeyi, ifade eder.
Bulusun kapsami içinde kalan uygun omurgali hayvanlar, bunlarla sinirli kalmamak
kaydiyla, primatlari (örnegin, insanlari, maymunlari ve sebekleri ve maymunlarin
türlerini, Macaca cinsinden (örnegin, sinomolgus maymunlarini, örnegin, Macaca
fascicu/aris ve/veya rhesus maymunlarini (Macaca mu/atta)) ve babunlari (Papio
ursi'nus) ayni zamanda marmosetleri (Callithrix cinsinden türleri), sincap maymunlarini
(Saimiri cinsinden türleri) ve pembe maymunlari (Saguinus cinsinden türleri) ayni
zamanda sebeklerin türlerini, örnegin, sempanzeleri (Pan troglodytes) içerir),
kemirgenleri (örnegin, fareleri, siçanlari, gine domuzlarini), Iagomorflari (örnegin,
tavsanlari, yabani tavsanlari), bovinleri (örnegin, sigirlari), küçükbaslari (örnegin,
koyunlari), keçigilleri (örnegin, keçileri), domuzgilleri (örnegin, domuzlari), ekuinleri
(örnegin, atlari), kaninleri (örnegin. köpekleri), felinleri (örnegin, kedileri), kusgilleri
(örnegin, tavuklari, hindileri, ördekleri, kazlari, evcil kuslari. örnegin, kanaryalari,
muhabbet kuslarini, vb.), deniz memelilerini (örnegin, yunuslari, balinalari),
sürüngenleri (yilanlari, kurbagalari, kertenkeleleri, vb.) ve baliklari içeren Chordata alt-
subesinin herhangi bir üyesini içerir. Tercih edilen bir süje, bir rahatsizligin tedavisine
veya profilaksisine ihtiyaci olan bir insandir. Bununla birlikte, yukarida bahsedilen
terimlerin semptomlarin var oldugunu ima etmedigi anlasilacaktir.
veya uygulanmak üzere olan ve bu konagin projenisine aktarilan genetik materyali tarif
etmek için burada kullanilir. Bazi uygulamalarda, bu, burada bunun içine uygulandigi
bir memeli hücresine veya bir orto-çiçek vektörüne arzu edilen özelligi saglar veya
baska durumda arzu edilen bir terapötik veya tanisal sonuca yol açar.
Burada kullanildigi sekliyle, "tedavi", "tedavi etme" ve benzeri terimler, arzu edilen bir
farmakolojik ve/veya fizyolojik etkiyi elde etmeyi ifade eder. Etki, bir hastaligi veya
bunun semptomunu tamamen veya parsiyel olarak önleme açisindan profilaktik olabilir
ve/veya bir hastalik ve/veya hastaliga atfedilebilen advers etki için bir parsiyel veya tam
kür açisindan terapötik olabilir. Burada kullanildigi sekliyle, "tedavi", bir memelide,
özellikle bir insanda, bir hastaligin herhangi bir tedavisini kapsar ve asagidakileri içerir:
(a) hastaliga yatkin olabilen ancak henüz buna sahip oldugu seklinde tani koyulmamis
olan bir süjede hastaligin gerçeklesmesini önleme; (b) hastaligi inhibe etme, yani,
bunun gelismesini durdurma; ve (c) hastaligi rahatlatma, yani, hastaligin regresyonuna
neden olma.
Bir organizma, polipeptit veya nükleik asit dizisi açisindan "dogal-sus", "dogal", “natif”
ve benzeri terimler için, bu organizma, polipeptit veya nükleik asit dizisi dogal
olusumludur veya degistirilmemis, mutasyona ugratilmamis veya baska sekilde insan
eli ile manipüle edilmemis en az bir dogal olusumlu organizmada mevcuttur.
Varyantlar, bir referanslanmis moleküle veya bunlarin komplementer formlarina bunun
tümü veya parçasi boyunca yeterli sekilde benzer olan, böylece selektif
hibridizasyonun orta derecede veya yüksek derecede zorlayici kosullar altinda
basarilabildigi veya en az yaklasik 15 nükleotid içeren bir karsilastirma penceresi
boyunca bir referanslanmis çiçek-virüsü konak aralik faktörünü tanimlayan nükleotid
dizilerine yaklasik %60 ila %90 veya %90 ila 98 dizi özdesligine sahip olan, nükleik asit
moleküllerini içerir. Tercihen, hibridizasyon bölgesi, yaklasik 12 ila yaklasik 18 veya
daha fazla nükleobaz uzunlugundadir. Tercihen, bir özel nükleotid dizisi ve referans
dizi arasindaki yüzde özdeslik, en az yaklasik %80 veya %85 veya daha tercihen
fazla, benzerdir. %80 ila %100 araligindaki yüzde özdeslikleri kapsanir. Nükleotid
dizisinin uzunlugu, bunun önerilen fonksiyonuna baglidir. Homologlar kapsanir.
türlerden olanlari içeren fonksiyonel ve yapisal olarak ilgili molekülleri ifade eder.
Homologlar ve ortologlar, varyantlarin örnekleridir.
Nükleik asit dizisi özdesligi, asagidaki sekilde belirlenebilir. Söz konusu nükleik asit
dizisi, BLASTM programi versiyon Nuclei'c Acids Research
Genbankasi veri tabanini (http://www.ncbi.nln.nih.gov/blast/ internet sitesinden
erisilebilir), arastirmak için kullanilir. Program, bosluk-olusturulmamis modda kullanilir.
Varsayilan filtreleme, düsük karmasiklik bölgelerinden kaynaklanan dizi homolojilerini
uzaklastirmak için kullanilir. BLASTM'nin varsayilan parametreleri kullanilir.
Amino asit dizisi özdesligi, asagidaki sekilde belirlenebilir. Söz konusu polipeptit dizisi,
BLASTP programi kullanilarak, bir polipeptit dizisi veri tabanini, örnegin, Genbankasi
veri tabanini (http://www.ncbi.nln.nih.gov/blast/ internet sitesinden erisilebilir),
arastirmak için kullanilir. Program, bosluk-olusturulmamis modda kullanilir. Varsayilan
filtreleme, düsük karmasiklik bölgelerinden kaynaklanan dizi homolojilerini
uzaklastirmak için kullanilir. BLASTP'nin varsayilan parametrelerinden yararlanilir.
Düsük karmasiklik dizileri için filtreleme, SEG programini kullanabilir.
Tercih edilen diziler, zorlayici kosullar altinda bir referans diziye veya bunun
komplemanina hibridize olacaktir. "Zorlayici kosullar altinda hibridize olmak" terimi ve
bunun dilbilgisel es-degerleri, bir nükleik asit molekülünün tanimlanmis sicaklik ve tuz
konsantrasyonu kosullari altinda bir hedef nükleik asit molekülüne (örnegin, bir DNA
veya RNA blotu, örnegin, bir Southern blot veya Northern blot, üzerine immobilize
edilmis bir hedef nükleik asit molekülüne) hibridize olma yetisini ifade eder. Yaklasik
100 bazdan daha uzun olan nükleik asit molekülleri açisindan, tipik zorlayici
hibridizasyon kosullari, natif dubleksin erime sicakliginin (Tm) en fazla 25°C ila 30°C
(örnegin, 10°C) altindadir (bakiniz, genel olarak, Sambrook et al., (yukarida): Ausubel
et al., (1999)). Yaklasik 100 bazdan daha uzun olan nükleik asit molekülleri için Tm,
Tm=81,5+% formülü ile hesaplanabilir. 100 bazdan daha kisa olan
nükleik asit molekülleri açisindan, emsal zorlayici hibridizasyon kosullari Tm'nin 5°C ila
°C altindadir.
Mevcut baglamda "silinme" terimi, hedef genin kodlama bölgesinin tümünün veya
parçasinin uzaklastirilmasidir. Terim ayrica, hedef genin gen ekspresyonunu kesip
çikaran veya kodlanan proteinin düzeyini veya aktivitesini kesip çikaran veya büyük
ölçüde asagi yönde regüle eden mutasyonun veya transformasyonun herhangi bir
formunu da kapsar.
içerir. Burada bir "gen" atfinin ayrica asagidakileri de içerdigi sayilir: transkripsiyonel
ve/veya translasyonel regülatör dizilerden ve/veya bir kodlama bölgesinden ve/veya
aktarilmamis dizilerden (yani, intronlardan, 5'- ve 3'-aktarilmamis dizilerden) olusan bir
klasik genomik gen; veya genin kodlama bölgelerine (yani, ekzonlara) ve 5'- ve 3'-
aktarilmamis dizilerine karsilik gelen mRNA veya cDNA.
baglanmis kodlama dizisinin ekspresyonu için gerekli olan nükleik asit dizileri (örnegin,
DNA) kastedilir. Prokaryotik hücreler için uygun olan regülatör diziler, örnegin, bir
promotörü ve opsiyonel olarak bir cis-etki eden diziyi, örnegin, bir operatör dizisini ve
bir ribozom baglama yerini içerir. Ökaryotik hücreler için uygun olan kontrol dizileri,
promotörleri, poliadenilasyon sinyallerini, transkripsiyonel hizlandiricilari, translasyonel
hizlandiricilari, mRNA kararliligini modüle eden ön-bilgi veya arka-bilgi dizilerini ayni
zamanda bir transkribe edilmis polinükleotid tarafindan kodlanan bir ürünü bir hücre
içindeki bir intraselüler kompartimana veya ekstraselüler ortama hedeflemek için
hedefleme dizilerini içerir.
Mevcut modifiye edilmis memeli hücrelerini etkilemek için uygun kimerik yapilar, bir
regülatör diziye operatif olarak bagli, bir orto-çiçek konak aralik faktörünü kodlayan bir
nükleik asit dizisi içerir. Regülatör dizi uygun sekilde, hücre içinde ekspresyon için
uygun olacak olan transkripsiyonel ve/veya translasyonel kontrol dizileri içerir. Tipik
olarak, transkripsiyonel ve translasyonel regülatör kontrol dizileri, bunlarla sinirli
kalmamak kaydiyla, bir promotör dizisini, bir 5' kodlamayan bölgeyi, bir CIS-regülatör
bölgeyi, örnegin, transkripsiyonel regülatör protein veya translasyonel regülatör protein
için bir fonksiyonel baglama yerini, bir yukari akis açik okuma çerçevesini, ribozomal-
baglama dizilerini, transkripsiyonel baslangiç yerini, translasyonel baslangiç yerini
ve/veya bir ön-bilgi dizisini kodlayan nükleotid dizisini, sonlandirma kodonunu,
translasyonel durdurma yerini ve bir 3' aktarilmamis bölgeyi içerir. Teknikte bilindigi
üzere konstitütif veya indüklenebilen promotörler tasarlanir. Promotörler, dogal
olusumlu promotörler veya birden fazla promotörün elemanlarini birlestiren hibrit
promotörler olabilir.
Tasarlanan promotör dizileri, memeli hücreleri için natif olabilir veya bir alternatif
kaynaktan türetilebilir, burada bölge seçilen organizma içinde fonksiyoneldir. Promotör
seçimi, hedeflenen konak hücreye bagli olarak çesitlilik gösterecektir. Örnegin, memeli
hücrelerinde ekspresyon için kullanilabilen promotörler, digerleri arasinda, agir
metallere, örnegin, kadmiyuma, yanitta indüklenebilen metalotiyonein promotörünü, ß-
aktin promotörünü ayni zamanda viral promotörleri, örnegin, SV4O büyük T antijeni
promotörünü, insan sitomegalovirüs (CMV) hemen erken (IE) promotörünü, Rous
sarkom virüsü LTR promotörünü, fare mamari tümör virüsü LTR promotörünü,
adenovirüs majör geç promotörünü (Ad MLP), herpes simpleks virüsü promotörünü ve
bir HPV promotörünü, özellikle HPV yukari akis regülatör bölgesini (URR) içerir. Bu
promotörlerin tümü iyi tarif edilmistir ve teknikte kolaylikla erisilebilirdir.
Hizlandirici elemanlar ayrica burada, memeli yapilarinin ekspresyon düzeylerini
arttirmak için de kullanilabilir. Örnekler, örnegin, Dijkema ata!.. (1985) EMBO J. 42761,
kaynaginda tarif edildigi üzere, SV4O erken gen hizlandiricisini, örnegin, German et al.,
Sarkom Virüsünün uzun uç tekrarindan (LTR) türetilen hizlandiriciyi/promotörü ve
örnegin, Boshart et al., (1985) Cell 41:521, kaynaginda tarif edildigi üzere, insan
CMV'sinden türetilen elemanlari, örnegin, CMV intron A dizisine dahil edilen elemanlari
Kimerik yapi ayrica, bir 3' aktarilmamis dizi de içerebilir. Bir 3' aktarilmamis dizi, bir
genin, bir poliadenilasycn sinyali ve mRNA islenmesini veya gen ekspresyonunu
etkileyebilen herhangi bir baska regülatör sinyal içeren bir DNA segmenti içeren
kismini ifade eder. Poliadenilasyon sinyali, mRNA öncülünün 3' ucuna poliadenilik asit
yollarinin eklenmesini etkileme ile karakterize edilir. Poliadenilasyon sinyalleri,
varyasyonlarin olagandisi olmamasina ragmen, 5' AATAAA-3' kanonikal formuna
homolojinin varligi ile yaygin bir sekilde bilinir. 3' aktarilmamis regülatör DNA dizisi
tercihen, yaklasik 50 ila 1.000 nts içerir ve bir poliadenilasyon sinyaline ve mRNA
islenmesini veya gen ekspresyonunu etkileyebilen herhangi bir baska regülatör sinyale
ek olarak transkripsiyonel ve translasyonel sonlandirma dizileri içerebilir.
Bazi uygulamalarda, kimerik yapi ilaveten, yapiyi içeren hücrelerin seleksiyonuna izin
vermesi için bir seçilebilen belirteç geni içerir. Seleksiyon genleri teknikte iyi bilinir ve
söz konusu hücre içinde ekspresyon için uygun olacaktir.
Bir uygulamada, orto-çiçek yapisal veya birlesme geninin ekspresyonu, bir promotör
kontrolü altindadir. Bir sinirlayici-olmayan uygulamada, promotör, bir hücresel
konstitütif promotördür, örnegin, insan EF1 alfa (insan elongasyon faktörü 1 alfa geni
promotörüdür), DHFR (dihidrofolat redüktaz geni promotörüdür) veya konak hücre
üzerinde anlamli toksik etkiler yoklugunda viral propagasyonu sürdürmek Için CP77'nin
bir yeterli düzeyinin ekspresyonunu yönlendiren PGK (fosfogliserat kinaz geni
promotörüdür). Promotörler ayrica, indüklenebilen, örnegin, hücresel indüklenebilen
promotör de olabilir, MTH (bir metalotiyonein geninden) viral promotörler, örnegin,
CMV, RSV, SV-40 ve MOU3 de memeli hücrelerinde kullanilir.
Bir birinci yönünde, mevcut bulus burada hücrenin genomunun bir promotör kontrolü
altinda CP77'yi kodlayan bir dizi içermesi Için modifiye edildigi bir modifiye edilmis
memeli hücresi saglar, böylece modifiye edilmis hücre hatti modifiye edilmemis
hücrede daha az çogalabilen veya hiç çogalamayan bir çiçek-virüsünün
propagasyonunu sürdürür.
Bir ikinci yönünde, mevcut bulus, CHO hücrelerinde çogalmayan bir orto-çiçek virüsünü
çogaltmak için, çiçek virüsünün bir memeli hücre hattinda in vitro çogaltilmasini içeren,
bir proses saglar, burada hücre hatti, CP77'yi kodlamasi ve bir promotör kontrolü
altinda eksprese etmesi modifiye edilir.
Bir uygulamada, hücrenin genomu ilaveten bir promotör kontrolü altinda D13L'yi
kodlayan bir dizi içerir ve/veya ilaveten bir promotör kontrolü altinda K1L'yi kodlayan bir
dizi içerir.
Bir baska uygulamada, hücre, bir sürekli hücre hattidir, tercihen bir CHO hücresidir.
Diger uygulamalarda, hücre, bir insan hücresi, bir primat hücresi, bir hamster hücresi
veya bir tavsan hücresi, olabilir.
Bir baska uygulamada, CP77 geni, D13L geni ve/veya K1L geni, bir memeli promotörü
kontrolü altindadir.
Bir baska uygulamada, CP77 geninin ekspresyonu, bir permisif hücre hattinda
gözlenene es-deger virüs verimleri üretmek için virüsün propagasyonunu destekler ve
tercihen 500'den büyük olan bir virüs replikasyon amplifikasyon oranini destekler.
Bir baska uygulamada, CP77, D13L ve/veya K1L, memeli hücrelerinde ekspresyon Için
kodon optimize edilmis nükleotidlerin bir bitisik dizisi tarafindan kodlanir.
Bir örnek K1 L dizisi, SEQ ID NO: 6'da ve SEO ID NO: 7'de saglanir.
Spesifikasyon genis bir sekilde, modifiye edilmis (rekombinant veya transforme edilmis)
hücreler ile ve kültürlenmis daha yüksek ökaryotik konak hücrelerde virüs vektörlerinin
in vitro imalati için bir proses ile ilgilidir, burada hücre in vitro hücrelerin bir popülasyonu
içinde veya bu vasitayla virüs vektörünün çogaltilmasini hizlandiracak veya
kolaylastiracak bir sekilde genetik olarak modifiye edilir. Bir sinirlayici-olmayan
uygulamada, spesifikasyon modifiye edilmis Çin hamsteri over (CHO) hücrelerinde
vaksiniya-temelli çiçek-virüslerinin propagasyonunu saglar.
Teknikte uzmanligi olan kisiler tarafindan bilindigi üzere, hamsterin, Cricetulus griseus,
overinden türetilen Çin hamsteri over (CHO) hücreleri, antikorlari içeren rekombinant
protein terapötiklerinin biyo-endüstriyel ve GMP üretimi için en yaygin sekilde kullanilan
memeli hücresidir. Bu amaç için CHO hücrelerinin popülaritesi, kismen, bunlarin çabuk
büyümesinden ve yüksek protein üretiminden köken alir. Bunun sonucu olarak, CHO
hücre hatlari iyi karakterize edilmistir. Uygun CHO hücre hatlari, sinirlandirma
olmaksizin, A2, A2H, XrSG, CHO-K1, CHO/dhfr, RR-CHO-K1, UT-I, P22, CHO-1C6,
Lec1, Le02, Lec8, Pro-5 ve CDKXBl hatlarini içerir. ATCC CLL-61 veya ATCC CRL-
9618 Erisim Numarasi altinda ATCC ile depolanan CHO-K1 hücre hatti siklikla
kullanilir. CHO-K1 hücre hatti, Puck T. (1957) tarafindan bir eriskin Çin hamsterinin bir
overinin bir biyopsisinden baslatilan parental CHO hücre hattindan bir alt-klon olarak
türetilmistir. Mevcut spesifikasyon, modifiye edilmis CHO hücrelerinden ziyade modifiye
edilmis hücreleri tarif eder.
Üretilen virüsün verimini maksimuma çikarmak için, hücre hatlari, örnegin, CHO
hücreleri, standart teknikler kullanilarak süspansiyon kültürüne uyarlanabilir. Bir
rekombinant veya modifiye edilmis hücreye atif, bunun projenisini içerir. Hücreler,
dondurulmus formu içeren herhangi bir formda veya sivi süspansiyon formunda
satilabilir. Bir çiçek-virüsü vektörü ile enfekte edilmis hücreler satilabilir.
Burada CP77'ye ve burada belirlendigi üzere bir memeli konak hücresinin genomunda
bir heterolog geri olarak eksprese edildiginde çiçek viral büyümesini destekleyebilen
fonksiyonel ortologlarina ve bunlarin modifiye edilmis formlarina atif, Sphener et al.
(1988) ve Hsiao et al., (2006), kaynaklarinda ifade edilen inek çiçek virüsü konak aralik
geni anlamina gelir. "Modifiye edilmis formlar" atfi, dogal-sus veya referans diziden bir
varyasyonu (örnegin, bir silinmeyi, sübstitüsyonu veya eklenmeyi) içerir. Bir referans
nükleotid dizisi, SEQ ID NO: 1'de saglanir. Modifiye edilmis formlar, kodlama bölgesi
veya bunun en az 200 bitisik baz-çifti içeren bir veya birden fazla kismi boyunca en az
hücrelerinin içeren bir memeli veya baska daha yüksek ökaryotik hücrelerde
ekspresyon için optimize edilen kodon optimize edilmis formlari içerir. CP77 atfi,
ortologlari, yani, diger türlerde bulunan ile ayni fonksiyonu olan veya farkli adlar ile
tanimlanmis genleri içerir. Inek çiçek virüsü konak aralik faktörü, CP77, ayrica VHR1,
CHOhr. ve CPXV025, olarak da ifade edilir. Vaksiniyanin Western Reserve (WR)
susundaki CHOhr/CP77 geni büyük ölçüde fragmente edilir ve bir fonksiyonel faktör
üretemez. CP77, MVA'da ve Kopenhag susunda yoktur.
Burada "CP77“, "D13L" ve "K1 L" atfi, fonksiyonel ortologlari ve fonksiyonel varyantlari
içerir. "Fonksiyonel", eksprese eden hücre sitoplazmasi içinde çiçek-virüsü
propagasyonunu desteklemek için, bir kültürlenmis hücrenin memeli genomundan
yönlendirilen ekspresyonun (yani, transkripsiyonun ve translasyonun) burada tarif
edilen kalitesini ifade eder. "Çogalmak" terimi, intraselüler propagasyonu ve interselüler
propagasyonu içerir ve matür viral parçaciklarin üretilmesini kapsar.
Bir uygulamada, modifiye edilmis hücrelerin bir popülasyonu, bir modifiye edilmemis
kontrol hücresinde daha az çogalabilen veya büyük ölçüde çogalamayan bir çiçek-
virüsünün propagasyonunu sürdürür. Çogalamama yetisi, hücreden hücreye veya
süjeden süjeye aktarimin tipik olarak gerçeklesmedigi anlamina gelir.
gruptan seçilen en az bir viral konak aralik faktörünü kodlamasi için ve bir promotör
kontrolü altinda bunun genomundan bunu eksprese etmesi için modifikasyondan önce
var oldugu sekilde modifiye edilmis hücreyi ayni zamanda teknikte bilinen diger uygun
kontrol hücrelerini içerir.
Örnegin, çiçek-virüsleri, örnegin, MVA ve vaksiniya, CHO hücrelerinde çogalamaz.
Bununla birlikte, burada sürpriz bir sekilde belirlendigi üzere, bir promotör kontrolü
altinda bunlarin genomundan CP77 eksprese etmesi için rekombinant olarak modifiye
edilmis CHO hücreleri, yalnizca vaksiniyanin degil ayni zamanda vaksiniyanin, örnegin,
MVA'nin, türevlerinin de propagasyonunu destekleyebilir. Söz konusu modifiye edilmis
CHO-CP77 hücrelerinde propagasyondan sonra, MVA ve vaksiniya modifiye edilmemis
CHO hücrelerinde veya baska uygun kontrolde hala çogalamaz.
Burada "çiçek-virüsü" atfi, bir ilaç, profilaktik, tanisal veya terapötik ajan olarak, söz
konusu bir heterolog molekülü (örnegin, söz konusu bir antijeni) kodlayan bir
rekombinant çiçek-virüsü vektörünü içerir. Bu tarz rekombinant çiçek-virüsü vektörleri
tipik olarak, çiçek-viral indüklü olmayan hastaliklara veya rahatsizliklara karsi asilar
olarak kullanilmasi içindir. Ayrica, çiçek-virüsü terimi, bir çiçek-virüsü enfeksiyonuna,
örnegin, variyola veya çiçek hastaligi enfeksiyonuna, karsi bir terapötik veya profilaktik
asi olarak kullanilmasi için önerilen izole edilmis çiçek-virüslerini ve bunlarin türevlerini
Burada "vaksiniya-temelli" atfi, vaksiniyayi ve vaksiniya virüsünün türevlerini ve
modifiye edilmis formlarini içerir. Vaksiniya temelli türevler, herhangi bir sekilde
sinirlandirmadan, MVA'yi ve NYVAC'yi içerir. MVA ve NYVAC atfi, teknikte bilinen bu
çiçek-virüslerinin suslarini veya türevlerini içerir. Modifiye edilmis formlar, bir ila ori
veya daha fazla gende modifikasyonlara sahip olabilir. "Modifikasyon" teriminin, dogal-
sus veya referans diziden bir varyasyonu (örnegin, bir silinmeyi, sübstitüsyonu veya
eklenmeyi) kastetmesi amaçlanir. "Atenüe edilmis“ atfi, ilgili bir süjede çogalmayan
veya ayni virüsün bir atenüe-edilmemis formuna kiyasla büyük ölçüde daha az bir
dereceye kadar çogalan çiçek-virüsünü içerir. Terim ayrica, bir süjede patojenik-
olmayan virüsleri de içerir.
Bir uygulamada, hücre bir sürekli hücre hattidir. Modifiye edilmis hücrenin sürekli
olarak bölünebilen bir hücre hatti olmasi daha az mecburidir. Bir memeli veya daha
yüksek ökaryotik hücre, mevcut bulusa uygun sekilde modifiye edilebilir ve bunu
takiben bir sürekli olarak bölünen hücre hatti haline gelmesi için transforme edilebilir
veya ölümsüz hale getirilebilir. Bununla birlikte, modifikasyondan önce hücre, teknikte
bilinen, kolay bir sekilde bir iyi karakterize edilmis ve sürekli olarak bölünen
biyoteknoloji uyumlu sürekli hücre hattidir. Bu tarz hücrelere kolaylikla, depolama
kuruluslarindan, örnegin, Amerikan Tipi Kültür Koleksiyonu'ndan (ATCC) veya Avrupa
Hücre Kültürleri Koleksiyonu'ndan (ECACC), erisilebilir.
Uygun memeli hücre hatlari, bunlarla sinirli kalmamak kaydiyla, örnegin, ATCC'den
PM1, CEM, miyelom hücrelerini (örnegin, 8820 hücrelerini) ve CEMX174'ü içerir.
Bir uygulamada, hücre, bir CHO hücresidir. Viral konak ad genlerini kodlamayan,
önceki teknigin CHO hücre hatlari, insanlarda büyük ölçüde çogalamayan vaksiniyanin
veya vaksiniya türevlerinin imalatini desteklemez.
Bazi hücrelerde, hücre, bir insan hücresidir, bir primat hücresidir, bir hamster hücresidir
veya bir tavsan hücresidir.
Mevcut modifiye edilmis memeli hücrelerini etkilemek için uygun kimerik yapilar, bir
regülatör diziye operatif olarak bagli, bir çiçek-viral konak aralik faktörünü kodlayan bir
nükleik asit dizisi içerir. Regülatör dizi uygun sekilde, hücre içinde ekspresyon için
uygun olacak olan transkripsiyonel ve/veya translasyonel kontrol dizileri içerir. Tipik
olarak, transkripsiyonel ve translasyonel regülatör kontrol dizileri, bunlarla sinirli
kalmamak kaydiyla, bir promotör dizisini, bir 5' kodlamayan bölgeyi, bir cis-regülatör
bölgeyi, örnegin, transkripsiyonel regülatör protein veya translasyonel regülatör protein
için bir fonksiyonel baglama yerini, bir yukari akis açik okuma çerçevesini, ribozomal-
baglama dizilerini, transkripsiyonel baslangiç yerini, translasyonel baslangiç yerini
ve/veya bir ön-bilgi dizisini kodlayan nükleotid dizisini, sonlandirma kodonunu,
translasyonel durdurma yerini ve bir 3' aktarilmamis bölgeyi içerir. Teknikte bilindigi
üzere konstitütif veya indüklenebilen promotörler tasarlanir. Promotörler, dogal
olusumlu promotörler veya birden fazla promotörün elemanlarini birlestiren hibrit
promotörler olabilir.
Tasarlanan promotör dizileri, memeli hücreleri için natif olabilir veya bir alternatif
kaynaktan türetilebilir, burada bölge seçilen organizma içinde fonksiyoneldir. Promotör
seçimi, hedeflenen konak hücreye bagli olarak çesitlilik gösterecektir. Örnegin, memeli
hücrelerinde ekspresyon için kullanilabilen promotörler, digerleri arasinda, agir
metallere, örnegin, kadmiyuma, yanitta indüklenebilen metalotiyonein promotörünü, ß-
aktin promotörünü ayni zamanda viral promotörleri, örnegin, SV4O büyük T antijeni
promotörünü, insan sitomegalovirüs (CMV) hemen erken (lE) promotörünü, Rous
sarkom virüsü LTR promotörünü, fare mamari tümör virüsü LTR promotörünü,
adenovirüs majör geç promotörünü (Ad MLP), herpes simpleks virüsü promotörünü ve
bir HPV promotörünü, özellikle HPV yukari akis regülatör bölgesini (URR) içerir. Bu
promotörlerin tümü iyi tarif edilmistir ve teknikte kolaylikla erisilebilirdir.
Hizlandirici elemanlar ayrica burada, memeli yapilarinin ekspresyon düzeylerini
arttirmak için de kullanilabilir. Örnekler, örnegin, Dijkema et al., (1985) EMBO J. 4:761,
kaynaginda tarif edildigi üzere, SV4O erken gen hizlandiricisini, örnegin, Gorman et al.,
Sarkom Virüsünün uzun uç tekrarindan (LTR) türetilen hizlandiriciyi/promotörü ve
CMV'sinden türetilen elemanlari, örnegin, CMV intron A dizisine dahil edilen elemanlari
Kimerik yapi ayrica, bir 3' aktarilmamis dizi de içerebilir. Bir 3' aktarilmamis dizi, bir
genin, bir poliadenilasyon sinyali ve mRNA islenmesini veya gen ekspresyonunu
etkileyebilen herhangi bir baska regülatör sinyal içeren bir DNA segmenti içeren
kismini ifade eder. Poliadenilasyon sinyali, mRNA öncülünün 3' ucuna poliadenilik asit
yollarinin eklenmesini etkileme ile karakterize edilir. Poliadenilasyon sinyalleri,
varyasyonlarin olagandisi olmamasina ragmen, 5' AATAAA-3' kanonikal formuna
homolojinin varligi ile yaygin bir sekilde bilinir. 3' aktarilmamis regülatör DNA dizisi
tercihen, yaklasik 50 ila 1.000 nts içerir ve bir poliadenilasyon sinyaline ve mRNA
islenmesini veya gen ekspresyonunu etkileyebilen herhangi bir baska regülatör sinyale
ek olarak transkripsiyonel ve translasyonel sonlandirma dizileri içerebilir.
Bazi uygulamalarda, kimerik yapi ilaveten, yapiyi içeren hücrelerin seleksiyonuna izin
vermesi için bir seçilebilen belirteç geni içerir. Seleksiyon genleri teknikte iyi bilinir ve
söz konusu hücre içinde ekspresyon için uygun olacaktir.
Bir uygulamada, viral konak aralik geninin ekspresyonu, bir promotör kontrolü
altindadir. Bir sinirlayici-olmayan uygulamada, promotör, bir hücresel konstitütif
promotördür, örnegin, insan EF1 alfa (insan elongasyon faktörü 1 alfa geni
promotörüdür), DHFR (dihidrofolat redüktaz geni promotörüdür) veya konak hücre
üzerinde anlamli toksik etkiler yoklugunda viral propagasyonu sürdürmek Için CP77'nin
bir yeterli düzeyinin ekspresyonunu yönlendiren PGK (fosfogliserat kinaz geni
promotörüdür). Promotörler ayrica, indüklenebilen, örnegin, hücresel indüklenebilen
promotör de olabilir. MTH (bir metalotiyonein geninden) viral promotörler, örnegin,
CMV, RSV, SV4 ve MOU3 de memeli hücrelerinde kullanilir.
Uygun sekilde, bir uygulamada, viral konak aralik geninin ekspresyonu, permisif hücre
hatlarinda gözlenene es-deger virüs verimleri üretmek için virüsün propagasyonunu
destekler. Viral konak aralik geninin ekspresyonu, örnegin, 500'den büyük olan bir virüs
replikasyon amplifikasyon oranini destekler. Viral konak aralik geninin ekspresyonu,
anlamli konak hücre toksisitesi yoklugunda viral propagasyonu destekler. Anlamli
konak hücre toksisitesi, viral konak aralik faktörü ekspresyonunun, prematüre konak
hücresi ölümünden veya bölünememeden dolayi viral verimi düsüren bir düzeyini ifade
eder. Uzmanligi olan kisi, konak hücresi parametrelerini, örnegin, konak hücresi sag
kalimini ve çogalmasini ve viral parametreleri, örnegin, viral konak aralik geni
ekspresyonunu, viral replikasyonu ve viral verimi kalitatif veya kantitatif bir sekilde
degerlendirmek için yöntemlere asinadir.
Bir uygulamada, çiçek-virüsü, bir fonksiyonel CP77'yi veya CP77 ortologunu kodlayan
bir oito-çiçek virüsü disindaki bir kordo-çiçek virüsüdür. Inek çiçek virüsü, CP77'yi
kodlar ve bundan dolayi bu yönde kapsanmaz. Orto-çiçek virüsleri, bufalo çiçek
virüsünü, inek çiçek virüsünü, deve çiçek virüsünü, ektromeli virüsünü, maymun çiçek
virüsünü, tavsan çiçek virüsünü, rakun çiçek virüsünü, tetera çiçek virüsünü, vaksiniya
virüsünü, tarla faresi çiçek virüsünü, kokarca çiçek virüsünü ve atlarin Uasin Gishu
hastaligi virüsünü içerir. Diger cinsler, para-çiçek virüslerini, avi-çiçek virüslerini, kapri-
çiçek virüslerini, lepori-çiçek virüslerini, domuz-çiçek virüslerini, mollusci-çiçek
virüslerini ve yata-çiçek virüslerini içerir.
Bir uygulamada, çiçek-virüsü MVA'dir veya MVA'nin insanda/bir süjede büyük ölçüde
kopyalayamayan bir türevidir.
Bir uygulamada, çiçek-virüsü vaksiniyadir veya vaksiniyanin insanda in vivo büyük
ölçüde kopyalayamayan bir türevidir.
Bir baska uygulamada, çiçek-virüsü, bir çiçek viral asi olarak kullanilmasi için
uygundur.
Bir ilave uygulamada, çiçek-virüsü, söz konusu bir heterolog molekülü, örnegin, söz
konusu bir tibbi antijeni, kodlayan ve eksprese eden bir rekombinant çiçek-viral
vektördür, burada rekombinant çiçek-viral vektör, bir süjede bir tanisal, terapötik veya
profilaktik ajan olarak kullanilmasi içindir.
Burada K1L atfi, Shisler ve Jin (2004) tarafindan tarif edilen gen ve bunun ortologlari
veya modifiye edilmis formlari anlamina gelir.
Burada SPI-1 atfi, Brookes et al., (1995) tarafindan tarif edilen konak aralik geni ve
bunun ortologlari veya modifiye edilmis formlari anlamina gelir.
Bazi uygulamalarda ve süpheye mahal vermemek için, mevcut hizlandirilmis viral
propagatif proses, çiçek-viral genomuna genlerin eklenmesini gerektirmez. Bu, elbette,
diger amaçlar için, örnegin, sinirlandirma olmaksizin, asi amaçlari için söz konusu
antijenler olarak heterolog molekülleri kodlamasi için veya bir süjede bir immün yanit
meydana getirmesi için. viral vektörlerin modifikasyonlarini, dislamaz.
Konak hücre nükleusundan çiçek-viral konak aralik geninin transkripsiyonu ve
kodlanan ürünün translasyonu, enfekte edilmis hücre içinde gerçeklesir ve konak hücre
sitoplazmasinda çiçek viral propagasyonu için yeterlidir. Herhangi bir özel etki modu
sinirlandirmasi olmaksizin, CP77'nin bir viral koruma ajani oldugu önerilir.
Bir açiklayici uygulamada, enfekte edilmis hücre hatti tarafindan eksprese edilen çiçek-
viral konak aralik geni, CP77'dir. Örnek 4'te gösterildigi üzere, bir CHO hücresi
nükleusu CP77'yi kodlamasi ve eksprese etmesi için modifiye edildiginde, bu bir
permisif hücre hatti, örnegin, 143B, olmusçasina, bu viral amplifikasyonu sürdürebilir.
Tipik olarak, konflüent plaklar, enfeksiyondan sonraki iki gün içinde gözlenir.
Bir baska uygulamada, modifiye edilmis hücre içinde viral propagasyon düzeyi, en az
ila 5000 olan bir amplifikasyon orani saglar. Amplifikasyon oranlari, bazi
Bir baska uygulamada, heterolog çiçek viral konak aralik geninin promotör
yönlendirmeli ekspresyonu, hücre içinde çiçek viral konak aralik heterolog geni
ekspresyonunun bir düzeyini saglar. CP77 ekspresyonunun düzeyi, permisif hücrelerde
inek çiçek virüsü tarafindan üretilene benzer olabilir veya bunu asabilir.
Bir baska uygulamada, heterolog çiçek viral konak aralik geninin promotör
yönlendirmeli ekspresyonu, hücre içinde heterolog gen ekspresyonunun en azindan bir
permisif hücre içindeki viral propagasyon düzeyinde viral propagasyona izin vermek
için yeterli olan bir düzeyini saglar.
Bir uygulamada, bir CHO hücre hattinda çiçek viral üretim, bir pozitif kontrol
hücresindeki çiçek viral üretimin düzeyine esittir veya bunu asar.
Bir uygulamada, CHO hücrelerin MVA viral üretiminin düzeyi, CEF hücrelerinde MVA
viral üretiminin düzeyine büyük ölçüde esittir veya bunu asar.
Bir uygulamada, CP77, K1 L ve/veya SPI-i, memeli hücrelerinde ekspresyon için kodon
optimize edilmis nükleotidlerin bir bitisik dizisi tarafindan kodlanir.
Burada ilaveten tarif edildigi üzere, CP77'yi kodlayan kodori optimize edilmis nükleik
asit dizisi, Brighton Red susunun (UniprotKB/Swiss-ProtzPi29321) inek çiçek CP77
proteinini kodlayan diziye %80'den daha az veya %75'ten daha az nükleotid dizi
özdesligine sahip olabilir. Bazi uygulamalarda, kodon optimize edilmis dizi, SEQ ID
NO: 1'de izah edilen diziye sahiptir veya SEQ ID NO: 1'de izah edilen diziye en az %70
dizi özdesligine sahip olan bir nükleik asit dizisi içeren bir fonksiyonel varyanttir. Bazi
uygulamalarda, CP77 virüs konak aralik faktörü, SEO ID NO: 2'de izah edilen bir amino
asit dizisine sahiptir veya SEQ ID NO: 2'de izah edilen amino asit dizisine en az %70
amino asit dizisi özdesligine sahiptir.
Bazi uygulamalarda, burada tarif edildigi üzere, bunlarin genomundan CP77'yi
eksprese eden modifiye edilmis memeli hücrelerinin bir popülasyonunu, örnegin, bir
klonal popülasyonunu, içeren veya esas olarak bundan olusan bir kit tasarlanir. Bazi
uygulamalarda, modifiye edilmis hücre, bir vaksiniya virüsü içermez.
Mevcut tarifname ilaveten, CHO hücrelerinde çogalmayan bir çiçek-virüsünü imal etme
yöntemini veya buna yönelik bir prosesi tanimlar, proses in vitro bir memeli hücre
hattinda çiçek-virüsünü çogaltmasini içerir, burada hücre hatti CP77'yi kodlamasi ve bir
promotör kontrolü altinda eksprese etmesi için modifiye edilir. Proses ilaveten, viral
parçaciklari izole etmeyi içerebilir.
Hücre hatti uygun bir sekilde, teknikte uzmanligi olan kisiler tarafindan, bir ilacin veya
terapötik, tanisal veya profilaktik ajanin imalati için uygun oldugu bilinen bir memeli
hücre hattidir.
Spesifikasyon, bir modifiye edilmis CHO hücresini tarif eder, burada CHO hücresi
CP77'yi kodlamasi ve bir promotör kontrolü altinda bunun genomundan bunu eksprese
etmesi için modifiye edilir.
Bir uygulamada, modifiye edilmis CHO hücre hatti, CP77'yi eksprese etmeyen bir
modifiye edilmemis kontrol CHO hücresinde daha az çogalabilen veya hiç
çogalamayan bir virüsün propagasyonunu sürdürür.
Bir uygulamada, virüs, CP77'yi kodlayan bir orto-çiçek virüsü disindaki bir orto-çiçek
virüsüdür. Teknikte bilindigi üzere, inek çiçek virüsü, CP77'yi kodlayan bir çiçek
Bazi uygulamalarda, virüs, vaksiniyadir veya vaksiniyanin insanda/bir süjede büyük
ölçüde kopyalayamayan bir türevidir.
Bazi uygulamalarda, virüs, MVA'dir.
Bir baska uygulamada, spesifikasyon insanda büyük ölçüde kopyalamayan bir çiçek-
virüsünü çogaltmanin bir yöntemini saglar, yöntem asagidakileri içerir: (i) CP77'yi
eksprese etmesi için transforme edilmis bir CHO hücresini kültürleme; ve (ii) (i)'den
elde edilen kültürlenmis CHO hücresini insanda büyük ölçüde kopyalamayan çiçek-
virüsü ile enfekte etme.
Bir baska uygulamada, spesifikasyon insanda büyük ölçüde kopyalamayan bir çiçek-
virüsünü çogaltmanin bir yöntemini saglar, yöntem asagidakileri içerir: (i) CP77'yi ve
D13L'yi ve/veya K1L'yi eksprese etmesi için transforme edilmis bir CHO hücresini
kültürleme ve (ii) (i)'den elde edilen kültürlenmis CHO hücresini insanda büyük ölçüde
kopyalamayan çiçek-virüsü ile enfekte etme.
Bir baska uygulamada, spesifikasyon MVA'yi çogaltmanin bir yöntemini saglar, yöntem
asagidakileri içerir: (i) CP77'yi ve D13L'yi ve/veya K1L'yi eksprese etmesi için
transforme edilmis bir CHO hücresini kültürleme ve (ii) (i)'den elde edilen kültürlenmis
CHO hücresini MVA ile enfekte etme.
Bir baska uygulamada, spesifikasyon insanda büyük ölçüde kopyalamayan bir
vaksiniya türevini çogaltmanin bir yöntemini saglar, yöntem asagidakileri içerir: (i)
CP77'yi ve D13L'yi ve/veya K1 L'yi eksprese etmesi için transforme edilmis bir CHO
hücresini kültürleme ve (ii) (i)'den elde edilen kültürlenmis CHO hücresini vaksiniya
türevi ile enfekte etme.
Bir baska uygulamada, spesifikasyon bir heterolog proteini kodlayan MVA'yi
çogaltmanin bir yöntemini saglar, yöntem asagidakileri içerir: (i) CP77'yi ve D13L'yi
ve/veya K1 L'yi eksprese etmesi için transforme edilmis bir CHO hücresini kültürleme ve
(ii) (i)'den elde edilen kültürlenmis CHO hücresini MVA ile enfekte etme.
Bir baska uygulamada, spesifikasyon insanda büyük ölçüde kopyalamayan, bir
heterolog proteini kodlayan bir vaksiniya türevini çogaltmanin bir yöntemini saglar,
yöntem asagidakileri içerir: (i) CP77'yi ve D13L'yi ve/veya K1L'yi eksprese etmesi için
transforme edilmis bir CHO hücresini kültürleme ve (ii) (i)'den elde edilen kültürlenmis
CHO hücresini vaksiniya türevi ile enfekte etme.
Bir baska uygulamada, mevcut spesifikasyon operatif olarak regülatör elemanlara,
örnegin, bir memeli hücre hattinda ekspresyon için bir promotöre, bagli bir virüs konak
aralik geninin nükleik asit dizisini içeren bir yapay olarak olusturulmus vektör,
polinükleotid veya plazmid saglar. Bazi uygulamalarda, virüs geni, inek çiçek ankirin
CP77 proteini]. Bir uygulamada, virüs konak aralik geni, örnegin, CP77, bir memeli
hücre hattinda ekspresyon için kodon optimize edilmistir. Uygun vektörler ve plazmidler
teknikte bilinir.
Bir uygulamada, polinükleotid, CP77'yi kodlar. Bazi uygulamalarda, polinükleotid,
(memeli hücrelerinde, örnegin, CHO'da, ekspresyon için kodon optimize edilmis) SEQ
lD NO: 1'de izah edilen nükleotid dizisini içerir. Bazi uygulamalarda, izole edilmis
polinükleotid, SEO ID NO: 1'de izah edilen nükleotid dizisini veya bunun SEQ ID NO:
2'de gösterilen amino asit dizisini kodlayan bir varyantini içerir.
Bir baska uygulamada, mevcut spesifikasyon, bir virüs konak aralik geninin bir memeli
hücresine kararli yerlestirilmesi için bir transpozisyon aktarim vektörünü tarif etmistir.
Mevcut tarifname ayrica, bir virüse büyük ölçüde permisif-olmayan bir memeli veya
daha yüksek ökaryotik kültür hücresini bir virüse permisif olan bir hücreye transforme
etmenin bir yöntemini de saglar, yöntem hücreyi CP77'yi eksprese etmesi için
transforme etmeyi içerir.
Bazi uygulamalarda, yöntem hücreyi bir memeli promotörü kontrolü altinda bir
kodlanmis CP77'nin ekspresyonunu yönlendirebilen bir vektör ile transfekte etmeyi
Bazi uygulamalarda, vektör, bir memeli promotörü kontrolü altinda CP77'yi kodlayan bir
transpozisyon aktarim vektörüdür.
Bir sinirlayici-olmayan uygulamada, promotör, bir hücresel konstitütif promotördür,
örnegin, insan EF1 alfa (insan elongasyon faktörü 1 alfa geni promotörüdür), DHFR
(dihidrofolat redüktaz geni promotörüdür) veya konak hücre üzerinde anlamli toksik
etkiler yoklugunda viral propagasyonu sürdürmek için CP77'nin bir yeterli düzeyinin
eKSpresyonunu yönlendiren PGK (fosfogliserat kinaz geni promotörüdür). Promotörler
ayrica, indüklenebilen, örnegin, hücresel indüklenebilen promotör de olabilir, MTH (bir
metalotiyonein geninden) viral promotörler, örnegin, CMV, RSV, SV4 ve MOU3 de
memeli hücrelerinde kullanilir.
Bazi uygulamalarda, hücre, bir CHO hücresidir.
Bazi uygulamalarda, virüs, bir çiçek virüsüdür.
Bazi uygulamalarda, çiçek-virüsü, insanda patojenik-olmayan veya kopyalamayan bir
vaksiniya türevidir.
büyük ölçüde veya esas olarak yoksun olan materyal kastedilir. Örnegin, burada
kullanildigi sekliyle, bir "izole edilmis polinükleotid" veya bir "izole edilmis polipeptit" ve
benzerlerini, bir polinükleotid veya polipeptit molekülünün bunun dogal hücresel
ortamindan ve hücrenin diger bilesenleri ile iliski halinden in vitro izolasyonunu ve/veya
saflastirilmasini ifade eder. Sinirlandirma olmaksizin, bir izole edilmis bilesim,
kompleks, polinükleotid, peptit veya polipeptit, saflastirma ile izole edilen bir natif diziyi
veya rekombinant veya sentetik araçlar ile üretilen bir diziyi ifade edebilir.
Varyantlar, bir referanslanmis moleküle veya bunlarin komplementer formlarina bunun
tümü veya parçasi boyunca yeterli sekilde benzer olan, böylece selektif
hibridizasyonun orta derecede veya yüksek derecede zorlayici kosullar altinda
basarilabildigi veya en az yaklasik 15 nükleotid içeren bir karsilastirma penceresi
boyunca bir referanslanmis çiçek-virüsü konak aralik faktörünü tanimlayan nükleotid
dizilerine yaklasik %60 ila %90 veya %90 ila 98 dizi özdesligine sahip olan, nükleik asit
moleküllerini içerir. Tercihen, hibridizasyon bölgesi, yaklasik 12 ila yaklasik 18 veya
daha fazla nükleobaz uzunlugundadir. Tercihen, bir özel nükleotid dizisi ve referans
dizi arasindaki yüzde özdeslik, en az yaklasik %80 veya %85 veya daha tercihen
fazla, benzerdir. %80 ile %100 araligindaki yüzde özdeslikleri kapsanir. Nükleotid
dizisinin uzunlugu, bunun önerilen fonksiyonuna baglidir. Homologlar kapsanir.
türlerden olanlari içeren fonksiyonel ve yapisal olarak ilgili molekülleri ifade eder.
Homologlar ve ortologlar, varyantlarin örnekleridir.
Nükleik asit dizisi özdesligi, asagidaki sekilde belirlenebilir. Söz konusu nükleik asit
dizisi, BLASTM programi versiyon Nuclei'c Aci'ds Research
Genbankasi veri tabanini (http://www.ncbi.nln.nih.gov/blast/ internet sitesinden
erisilebilir), arastirmak için kullanilir. Program, bosluk-olusturulmamis modda kullanilir.
Varsayilan filtreleme, düsük karmasiklik bölgelerinden kaynaklanan dizi homolojilerini
uzaklastirmak için kullanilir. BLASTM'nin varsayilan parametreleri kullanilir.
Amino asit dizisi özdesligi, asagidaki sekilde belirlenebilir. Söz konusu polipeptit dizisi,
BLASTP programi kullanilarak, bir polipeptit dizisi veri tabanini, örnegin, Genbankasi
veri tabanini (http://www.ncbi.nln.nih.gov/blast/ internet sitesinden erisilebilir),
arastirmak için kullanilir. Program, bosluk-olusturulmamis modda kullanilir. Varsayilan
filtreleme, düsük karmasiklik bölgelerinden kaynaklanan dizi homolojilerini
uzaklastirmak için kullanilir. BLASTP'nin varsayilan parametrelerinden yararlanilir.
Düsük karmasiklik dizileri için filtreleme, SEG programini kullanabilir.
nükleik asit molekülünün tanimlanmis sicaklik ve tuz konsantrasyonu kosullari altinda
bir hedef nükleik asit molekülüne (örnegin, bir DNA veya RNA blotu, örnegin, bir
Southern blot veya Northern blot, üzerine immobilize edilmis bir hedef nükleik asit
molekülüne) hibridize olma yetisini ifade eder. Yaklasik 100 bazdan daha büyük olan
nükleik asit molekülleri açisindan, tipik zorlayici hibridizasyon kosullari, natif dubleksin
erime sicakliginin (Tm) en fazla 25°C ila 30°C (örnegin, 10°C) altindadir (bakiniz,
genel olarak, Sambrook et al., (yukarida); Ausubel et al., (1999)). Yaklasik 100 bazdan
daha uzun olan nükleik asit molekülleri için Tm, Tm=81,5+%
formülü ile hesaplanabilir. 100 bazdan daha kisa olan nükleik asit molekülleri
açisindan, emsal zorlayici hibridizasyon kosullari Tm'nin 5°C ila 10°C altindadir.
yerlestirilebilecegi veya klonlanabilecegini, bir plazmidden, bakteriyofajdan, mayadan,
virüsten, memeliden, kustan, sürüngenden veya baliktan türetilen, uygun sekilde bir
DNA molekülü kastedilir. Bir vektör tercihen, bir veya birden fazla essiz restriksiyon yeri
içerir ve bir hedef hücre veya doku veya bir progenitör hücre veya bunun dokusunu
içeren bir tanimlanmis konak hücre için otonom replikasyon yapabilir veya klonlanmis
dizinin yeniden-üretilebilir olacagi sekilde tanimlanmis konagin genomuna entegre
edilebilir. Bu dogrultuda, vektör bir otonom bir sekilde kopyalayan vektör, yani, bir
ekstra-kromozomal varlik olarak var olan, replikasyonu kromozomal replikasyondan
bagimsiz olan, bir vektör, örnegin, bir lineer veya kapali dairesel plazmid, bir ekstra-
kromozomal eleman, bir mini-kromozom veya bir yapay kromozom, olabilir. Vektör,
kendi kendin replikasyonu garantilemek için herhangi bir araç içerebilir. Alternatif
olarak, vektör, konak hücreye uygulandiginda, genom içine entegre edilen ve içine
entegre edildigi kromozom(lar) ile birlikte kopyalanan bir vektör olabilir. Bir vektör
sistemi, bir tek vektör veya plazmid, birlikte konak hücrenin genomuna uygulanacak
olan toplam DNA'yi içeren iki veya daha fazla vektör veya plazmid veya bir transpozon,
içerebilir. Vektör seçimi tipik olarak, vektörün, vektörün içine uygulanacagi konak hücre
ile uyumluluguna bagli olacaktir. Vektör ayrica, uygun transformantlarin seleksiyonu
için kullanilabilen bir seleksiyon belirteci, örnegin, bir antibiyotik direnç geni de
içerebilir. Bu tarz direnç genlerinin örnekleri, teknikte uzmanligi olan kisiler tarafindan
ayrica asagidakileri de içerdigi sayilir: transkripsiyonel ve/veya translasyonel regülatör
dizilerden ve/veya bir kodlama bölgesinden ve/veya aktarilmamis dizilerden (yani,
intronlardan, 5'- ve 3'-aktarilmamis dizilerden) olusan bir klasik genomik gen; veya
genin kodlama bölgelerine (yani, ekzonlara) ve 5'- ve 3'-aktarilmamis dizilerine karsilik
gelen mRNA veya CDNA.
baglanmis kodlama dizisinin ekspresyonu için gerekli olan nükleik asit dizileri (örnegin,
DNA) kastedilir. Prokaryotik hücreler için uygun olan regülatör diziler, örnegin, bir
promotörü ve opsiyonel olarak bir cis-etki eden diziyi, örnegin, bir operatör dizisini ve
bir ribozom baglama yerini içerir. Ökaryotik hücreler için uygun olan kontrol dizileri,
promotörleri, poliadenilasyon sinyallerini, transkripsiyonel hizlandiricilari, translasyonel
hizlandiricilari, mRNA kararliligini modüle eden ön-bilgi veya arka-bilgi dizilerini ayni
zamanda bir transkribe edilmis polinükleotid tarafindan kodlanan bir ürünü bir hücre
içindeki bir intraselüler kompartimana veya ekstraselüler ortama hedeflemek için
hedefleme dizilerini içerir.
Komplementer diziler ve bu dizilerin parçalari kapsanir. Bir nükleik asit molekülü ile
baglantili olarak kullanildiginda "kompleman" ve "komplementer" terimi, Watson-Crick
baz-eslesmesi ile belirlendigi üzere komplementer nükleik asit dizisini ifade eder.
Örnegin, 5'CCATGS' nükleik asit dizisinin komplemani, 5'CATGGS' dizisidir.
(Örnegin, toplam hücresel) DNA veya RNA içinde bulundugunda, zorlayici kosullar
altinda bir molekülün yalnizca bir özel nükleotid dizisini baglamasini, bununla dubleks
olusturmasini veya buna hibridize olmasini ifade eder.
Burada birbiri ile degistirilebilir bir sekilde kullanilan, "süje" veya “birey" veya "hasta"
terimleri, bunlar için terapinin veya profilaksinin arzu edildigi herhangi bir süjeyi, özel
olarak bir omurgali süjeyi ve hatta daha özel olarak bir memeli süjeyi, ifade eder.
Bulusun kapsami içinde kalan uygun omurgali hayvanlar, bunlarla sinirli kalmamak
kaydiyla, primatlari, kusgilleri, çiftlik hayvanlarini (örnegin, koyunlari, inekleri, atlari,
esekleri, domuzlari), laboratuvar test hayvanlarini (örnegin tavsanlari, fareleri,
siçanlari, gine domuzlarini, hamsterlari), evcil hayvanlari (örnegin, kedileri, köpekleri)
ve yakalanmis vahsi hayvanlari (örnegin, tilkileri, geyikleri, yaban köpeklerini) içerir.
Tercih edilen bir süje, bir primattir, örnegin, tedaviye veya profilaksiye ihtiyaci olan bir
insandir. Bununla birlikte, yukarida bahsedilen terimlerin semptomlarin var oldugunu
ima etmedigi anlasilacaktir.
Burada saglanan çesitli uygulamalar asagidaki sinirlayici-olmayan örnekler ile ilaveten
tarif edilir.
VACV-COP, CHO hücrelerinde büyüyemez
Materyaller ve Reaktifler
e CHO: SA-Pathology 7.05.2004
- Büyüme ortami: RPMI, %10 FBS, Pen/Strep
- Idame ortami: RPMI, % 2 FBS, Pen/Strep
CHO ve Vero hücreleri, her bir hücre hatti için bir B-Gözlü plaka (6-WP) içinde
konflüansa kadar kültürlenmistir. Her bir göz, oda sicakliginda 45 dakika boyunca
4x10(4) pfu VACV-COP VSSO2 ile enfekte edilmistir ve akabinde bundan sonra
37°C/%5 COg'de inkübe edilmistir. Her bir hücre hattindan, 2 gözün içerikleri burada
enfeksiyondan 24 saat, 48 saat, 72 saat sonra hasat edilmistir ve bir araya getirilmistir
(havuzlanmistir). Viral ekstraktlar, üç kere dondurma-çözülme ile yapilmistir ve
titrasyonlar için hazir olana kadar -80°C'de saklanmistir. Her bir ekstrakt, Örnek 4'te
tarif edilen Protokol'de tarif edildigi üzere Vero hücreleri kullanilarak titre edilmistir.
Dondurma-çözülmeden sonra, bir homojenizasyon probu, bu büyük çözünmeyen
topaklari dagitip parçalamak için kullanilabilir. Hasat edilecek olan her bir göz, 2 mL
MM içerir. Her bir zaman noktasi için, her bir zaman noktasi için 4 mL'Iik bir toplam
hacim vermesi için 2 göz havuzlanmistir. TE tamponu, her bir zaman noktasi için 6
mL'Iik bir toplam hacim vermesi için eklenebilir.
Titrasyon sonuçlari, viral verim sonuçlari ve üretim verimleri, Tablo 1'de tablo haline
getirilir. Sonuçlar, VACV-COP'nin, burada viral üretimin zamanla arttigi Vero
hücrelerinden farkli olarak CHO hücrelerinde bir düsük moi'den çogalamadigini
gösterir. VACV-COP, CHO hücrelerinde permisif-degildir.
Vero 'ya kiyasla CHO'da VACV+PH22 [CP77] için çok-adimli büyüme
- CP77, VACV'de aktiftir
CP77'yi kodlayan inek çiçek virüsü BR025L genini eksprese eden bir rekombinant
VACV-COP'nin (VACV-PH22 [CP77]) CHO'daki propagasyon potansiyeli. bir çok-
adimli büyüme çalismasinda Vero hücrelerine kiyasla belirlenmistir.
VACV-PH22, CHO konak aralik proteinini, CP77'yi, kodlayan inek çiçek virüsünün
Brighton susundan natif 025L ORF'yi eksprese eden bir rekombinant vaksiniya virüsü
Kopenhag susudur. Vaksiniyada bu ORF ayrica, BR025L natif promotörü kontrolü
altindadir. Natif BR, ayrica bir kirmizi flüoresan
proteini, DsRed-Expressz de kodlayan pPH22 olusturmak için klonlanmistir. pPH22,
BR025L genini ve DsRed genini VACV-COP'nin BiQR ORF'si içine yerlestirecek olan,
çözünebilen ve hücre yüzeyi IFN alfa/beta reseptör proteinini kodlayan, bir entegrasyon
vektörüdür. BR025L'nin ve DsRed'in VACV-COP içine yerlestirilmesi, CHO'yu bir düsük
çokluluktaki VACV-COP ile enfekte etmenin ve pPH22 ile transfeksiyonun bir sonucu
olarak homolog rekombinasyon ile basarilmistir. Yalnizca BR025L genini içeren virüs,
CHO hücrelerinde ilaveten çogaltilacaktir, bu kirmizi flüoresan enfekte edilmis
hücrelerin veya plaklarin varligi ile görsel olarak dogrulanabilir.
Homolog rekombinasyondan 3 gün sonra ekstrakte edilen virüs, CHO içinde üç kere
çogaltilmistir ve akabinde CHO hücrelerinde bu çok-adimli büyüme çalismasinda
kullanilmadan önce Vero hücreleri içinde titre edilmistir.
Materyaller ve reaktifler
- VACV-PH22 [CP77], Titre: 8x106 pfu/mL
- CHO: SA-Pathology 7.05.2004
- Büyüme ortami: CHO ve Vero için RPMI, %10 FBS, Pen/Strep
CHO ve Vero hücreleri, her bir hücre hatti için 2 x T25 balonlar içinde konflüansa kadar
kültürlenmistir. Her bir hücre hattinin 1 balonu, oda sicakliginda 45 dakika boyunca
ve akabinde bundan sonra 37°C/%5 COz'de inkübe edilmistir. Her bir hücre hattindan,
her bir balonun içerikleri burada enfeksiyondan 96 saat sonra hasat edilmistir. Viral
ekstraktlar, üç kere dondurma-çözülme ile yapilmistir ve titrasyonlar için hazir olana
kadar -80°C'de saklanmistir. Her bir ekstrakt, Örnek 4'te detaylandirilan protokolde tarif
edildigi üzere Vero hücreleri kullanilarak 24 gözlü plaka formatlari halinde titre
edilmistir.
Enfeksiyonlar, T25 balonu, her bir hücre hatti için 2 balon içinde, yapilmistir, burada
balon 1, VACV-COP ile enfeksiyondur ve balon 2, VACV-PH22 ile enfeksiyondur.
Hasat etme yalnizca, enfeksiyondan 96 saat sonra gerçeklestirilmistir. Sonuçlar, Tablo
2'de tablo haline getirilir. Tablo Z'den, asagidakiler görülebilir: CHO hücreleri, VACV-
COP viral projeni üretimini destekleyemez. Bu, Örnek 1'de tarif edilen sonuçlari
konfirme eder. ilaveten, VACV-COP, 200 katin üstündeki inokülüm düzeyine
çogaltilmis bir permisif hücre hattinin, bu çalismada Vero hücrelerinin, enfeksiyonu
olarak canlidir, bu nedenle, buradaki konak hücre restriksiyonundan dolayi, sonuçlar
CHO'da görülür. Bununla birlikte, CP77, bir rekombinant vaksiiya virüsü, VACV-PH22,
tarafindan eksprese edildiginde, yaklasik 700 kat inokülüm amplifikasyonu
basarilmistir. Vero hücrelerinin VACV-PH22 ile enfeksiyonu ayrica inokülümü de
çogalttigindan, CP77'nin ekspresyonu vaksiniya konak araligini yalnizca CHO hücreleri
ile sinirlandirmaz. Bununla birlikte, amplifikasyon düzeyi, CP77 olmadan vaksiniya
kadar iyi olmayabilir. Titrasyon sonuçlarinin standart hatasi bu derece büyük
oldugundan, verimdeki farklilik anlamli olmayabilir.
Bu sonuçlar, viral genomdan eksprese edilen CP77'nin bir permisif hücre
substratindan, örnegin, Vero'dan, beklenene benzeyen verimler üretme ile permisif-
olmayan CHO hücre hattinda VACV-COP'nin çogalmasina olanak saglamada yeterli
olmaktan fazlasi oldugunu gösterir.
CHO hücrelerinin vaksiniya virüsü enfeksiyonu sirasinda CP77 proteini için olasi bir
fonksiyon, Hsiao et al., (2006), tarafindan bildirilmistir. Bunlar, CP77'nin HMG20A'yi
bagladigini ve bunu viral fabrikalar içinde yer alan yeni sentezlenmis vaksiniya
genomundan uzaklastirdigini, böylece vaksiniya yasam siklusunun CHO hücrelerinde
devam etmesine olanak sagladigini öne sürer. CP77'nin, HMG20a'nin genomu
baglamasindan ve "kilitlemesinden“ dolayi aksi durumda CHO hücrelerinde erisilebilir
olmayacak olan yeni sentezlenmis genomun paketleme için erisilebilir olmasina olanak
sagladigi öne sürülür. CP77`nin fonksiyonu permisif hücre hatlarinda, örnegin, Vero'da,
viral amplifikasyon için gerekli olmadigindan, burada bu fonksiyona sahip olan, en
azindan CHO hücrelerinde inaktif olabilen veya bulunmayabilen, ancak permisif hücre
hatlarinda aktif olabilen veya bulunabilen, bir alternatif es-deger protein, hatta bir
hücresel protein, oldugu burada önerilir. Altematif protein, CP77'yi gereksiz hale
getirebilir ve böylece vaksiniyanin evrimi üzerine, bunun fonksiyon kaybi genis konak
araligi için esansiyel olmadigindan, bu müteakiben silinebilir veya yeniden-
düzenlenebilir.
p-LLO7-CHO'nin (CP77'yi eksprese eden poliklonal hücre hattinin) yapilmasi
Bir CHO hücre hatti, CP77 proteinini eksprese etmesi için yapilmistir. Bir yesil
flüoresan protein (EGFP) eksprese eden bir VACV-COP rekombinant virüsü,
enfeksiyonun bir kaç günü içinde bir konflüent enfeksiyona gelisen plaklar olusturur.
Vaksini'ya-COP (SCV Güçlendirilmis Yesil
Flüoresan Proteinin (EGFP) protein kodlama dizisine operatif olarak baglanmis bir
güçlü vaksiniya virüsü erken/geç promotöründen olusan ve çiçek-virüsü erken
transkripsiyonel durdurma dizisi ile sonlandirilan A39R ORF bir ekspresyon kaseti içine
yerlestirilmis bir rekombinant vaksiniya virüsüdür. Permisif-olmayan ve permisif
hücrelerin enfeksiyonu üzerine, EGFP enfekte edilmis hücreler içinde eksprese
edilecektir, bu bir flüoresan mikroskop kullanilarak görsellestirilebilir. Permisif
hücrelerde, yesil flüoresansin, virüs hücrelerin popülasyonu boyunca yayildikça,
hücreden hücrede yayildigi görülebilir.
CP77 proteini kodlama dizisi, inek çiçek virüsü Brighton Red susu UhiProtKB/Swiss-
dizisini geri-olusturma (geri translasyon veya ters translasyon) ile GeneArt GmbH
(Almanya) tarafindan sentetik olarak yapilmistir ve memeli hücresinde (CHO
hücrelerinde) ekspresyon için kodon optimize edilmistir. CP77'nin protein kodlama
dizisinin ekspresyonu için kodon optimize edilmis nükleotid dizisi için bakiniz SEQ ID
pPH51'den (kodon optimize edilmis CP77 protein kodlama dizisi barindiran bir
klonlama plazmidinden) kodon optimize edilmis CP77 protein kodlama dizisi, PCR
primerleri kullanilarak PCR ile çogaltilmistir, burada 5' primer, baslangiç kodonu
etrafina bir kozak dizisi eklemek için tasarlanmistir ve 3' primer, durdurma kodonundan
önce bayrak-etiket dizisi eklemek için tasarlanmistir. Çogaltilmis PCR ürünü DNA2.0
Bsa I klonlama yeri vasitasiyla alt-klonlanmistir. Bsal içine klonlama etkili bir sekilde,
pLL07 olusturmak için komet GPF kodlama dizisini CP77 proteini kodlama dizisi ile
degistirir. CP77 simdi, insan konstitütif Elongasyon Faktörü 1 alfa promotörü (EF1a)
kontrolü altinda olan bir hale gelir ve her ikisi transfekte edilmis hücrelerin genomu
içine kararli bir sekilde entegre edildiginde, higromisin direnç geni ile birlikte-eksprese
CHO'nun CP77'nin ve higromisin direnci ekspresyon kasetlerinin transpozon yardim/i
kararli içeri yerlestirilmesi ile transdÜksi'yonu.' CHO hücreleri bir 6 gözlü plakalarin
gözleri içine ekilmistir, böylece bir gece boyu inkübasyondan sonra, bunlar %50
konflüans civarindadir. Qiagen firmasindan Effectene transfeksiyon reaktifi kullanilarak,
1 ug pLL07, üreticinin talimatlari izlenerek %50 konflüent CHO hücrelerinin 1 gözüne
transfekte edilmistir. Transfekte edilmis hücreler akabinde, büyüme ortami içinde gece
boyu inkübe edilmistir. Sonraki gün, ortam aktarilmis hücreleri seçmek için 500 uglmL
higromisin B içeren büyüme ortami ile degistirilmistir. Seleksiyon ortami, her 2-3 günde
bir degistirilmistir ve aktarilmis hücreler sayi açisindan büyümeye basladiginda, bunlar
TrypLE Select (Life Technologies) kullanilarak geri-kazanilmistir ve ilave hücre
genislemesi için bir T25 balon içine ekilmistir.
CP77 ekspresyonunun western blotlama (Bayrak Etiketli) ile dogrulanmasi
Tavsan anti-CP77 serum/arini meydana getirme: Tavsanlara, CP77 proteininin bir kisa
iç amino asit dizisini temsil eden KHL proteinine bagli bir 15 amino asitlik peptit enjekte
edilmistir. Bu amino asit dizisi asagidaki sekildedir: SGSDVNIRSNNGYTC -
arasindaki amino asit pozisyonlari.
1 ay arayla, toplamda üç enjeksiyon, bu KHL konjuge edilmis amino asit dizisine karsi
antikorlar meydana getirmek için yapilmistir. Enjekte edilmis tavsandan elde edilen
kan, eksprese edilmis bakteriyel ve Ni-NTA saflastirilmis N-ucu His-etiketli CP77
proteinine karsi western blot ile test edilmistir. Tavsan anti-CP77 serumunun,
rekombinant CP77 proteinini net bir sekilde tanidigi gösterilmistir.
CP77 ekspresyonunun p-LL07-CHO ile test edilmesi: Iki T25 balonuna, CHO ve p-
LLO7-CHO ekilmistir ve bunlar her bir balon içindeki hücre tek-katmanlari %100
konflüansa ulasana kadar kültürlenmistir. Her bir balondan elde edilen hücreler, hasat
edilmistir, PBS ile yikanmistir ve akabinde 200 uL içinde yeniden-süspanse edilmistir.
Buna, yeniden-süspanse edilmis hücrelerin her bir tüpüne 50 pL 5X SDS-PAGE
yükleme tamponu eklenmistir ve akabinde bunlar 98°C'de 5 dakika boyunca inkübe
edilmistir. Her bir hücre proteini ekstraktinin 15 uL'si, %10'luk iki SDS-PAGE jeline
yüklenmistir, elektroforez uygulanmistir ve akabinde elektro-blotlama ile Hybond ECL
nitroselüloz üzerine blotlanmistir.
Elektro-blotlanmis membranlara akabinde, membran üzerindeki tüm mevcut spesifik-
olmayan antikor baglama yerlerini bloke etmek için Tween 20 içeren Tris Tamponlu
Salin (TBST) içinde çözünmüs %5'lik yagsiz süt tozu ile oda sicakliginda 1 saat
boyunca muamele edilmistir. Membranlar akabinde, antikorlar ile problanmadan önce
TBST içinde bir kaç kere yikanmistir. Membran 1, HRP içinde konjuge edilmis anti-
ile gece boyu 4°C'de problanmistir. Membran 2, anti-CP77 anti-serumlarinin 1:100'Iük
seyreltmesi ile gece boyu 4°C'de problanmistir, TBST ile 3 kere yikanmistir ve
akabinde sekonder antikor, HRP konjuge edilmis anti-tavsan antikorunun (GE
Healthcare) 1:5000'Iik seyreltmesi ile 2 saat boyunca problanmistir. Her iki membran
akabinde TBST ile 3 kere yikanmistir ve kullanici manüeli ile talimat verildigi üzere
bunlara ECL western blotlama saptama reaktifleri (GE Healtheare) ile muamele
edilmistir ve bunlar X-isini filmine maruz birakilmistir.
CHO'da ve p-LL7-CHO'da plak analizi: CHO ve p-LL7-CHO hücreleri, çok sayida 6
gözlü plakalata ekilmistir ve hücre tek-katmanlari %100 konflüent olana kadar
kültürlenmistir.
Bir erken/geç vaksiniya virüsü promotörü (SCV401C) kontrolü altinda bir EGFP
ekspresyon kaseti (yesil flüoresan protein) barindiran bir rekombinant Vaksiniya virüsü
(Kopenhag susu), hücreleri enfekte etmek için kullanilmistir. SCV401C'nin bilinmeyen
titresinden dolayi, 10 ul stok virüs ilk olarak, 1 ml MM ortami (Seyreltme 1: 1:100)
içinde seyreltilmistir ve akabinde her bir göz 500 pl viral diluent ile enfekte edilmistir.
Enfeksiyondan sonraki Gün 1'de, çok sayida hücrenin yesil flüoresan isik yaydigi
yerlerde yüksek moi enfeksiyon fark edilmistir. 2 ml MM ortamina 100 pl Seyreltme 1
ekleme ile Seyreltme 1'in bir ilave 1:20'Iik seyreltmesini (Seyreltme 2) gerçeklestirmeye
karar verilmistir. Akabinde, bu her bir gözü 500 pl Seyreltme 2 ile enfekte etmek için
kullanilmistir.
Viral enfeksiyonlar, GFP filtre (Kat#U-MGFPHQ, Olympus) ile flüoresan mikroskop
altinda (Olympus IX51) incelenmistir. Görüntü, ceIISens Digital lmaging Software
(Olympus) kullanilarak çekilmistir.
Sonuçlardan, yesil flüoresan protein eksprese eden VACV-COP'nin (SCV40lC)
beklenildigi üzere CHO hücrelerinde çogalmadigi görülmüstür. Yesil flüoresan isik
yayan tek hücreler, hücreye giren, bunun EGFP'yi içeren genini eksprese eden ancak
yeni enfeksiyöz viral parçaciklar üretemeyen ve bundan dolayi enfeksiyonu komsu
hücrelere yayamayan virüsün sonucudur. Bununla birlikte, CP77 eksprese eden bir
CHO hücre hattinda, vaksiniya virüsü, enfeksiyondan sonraki gün 1 ile enfeksiyonun
odaklarini olusturmak için komsu hücrelere yayilan yeni enfeksiyöz virüsler üretebilir.
Bu enfeksiyon Odaklari, enfeksiyondan hemen sonraki iki gün ile bir konflüent
enfeksiyon haline gelir, burada gün 3 ile tüm hücre tek-katmani SCV401C ile enfekte
edilmistir. Konak aralik proteini, CP77, eksprese eden CHO hücreleri, parental (natif)
CHO hücrelerinden farkli olarak vaksiniya virüsü enfeksiyonlarina permisiftir.
HMGZOA, HMG kutu alani içeren proteinlerin bir familyasina aittir. HMG proteinleri,
bozulmus DNA yapilarini, örnegin, krusiformlari, taniyan kromozom yeniden-
modelleme proteinleridir. Bunlar ayrica, DNA içindeki minör oyugu baglama ile DNA
egilmesini de indükleyebilir. Böylelikle, HMG kutusu-içeren proteinlerin DNA
replikasyonu, rekombinasyonu veya onarimi sirasinda kromozom yeniden-
modellenmesinde önemli oldugu düsünülür. Buna ek olarak, belirli HMG kutusu-içeren
proteinler, promotör yerindeki transkripsiyon faktörleri ile etkilesime girme ile fen
transkripsiyonunu etkileyebilir.
Hsiao et al., 2006, tarafindan yayimlanan çalisma, CHO-K1 hücrelerinde CP77'nin
HMG20A'yi bagladigini göstermistir. Bu konak hücre proteininin, HMG20A'nin,
vaksiniya ile enfekte edilmis CHO hücrelerinin viral fabrikalarinda viral DNA'yi bagladigi
görülür ve bu konak hücre proteininin viral fabrikalar içindeki DNA'yi "kilitledigi" ve
akabinde vaksiniya yasam siklusunun sonraki evresini önledigi ve böylece projeni
enfeksiyöz virüsün üretilmesini önledigi öne sürülmüstür. Inek çiçek virüsü tarafindan
CP77'nin ekspresyonunun, HMG20A'yi viral DNA'nin disina çikardigi ve viral yasam
siklusunun projeni enfeksiyöz virüs parçaciklarinin nihai üretimi ile yeniden-
baslamasina izin verdigi görülür.
Bununla birlikte, bir viral enfeksiyon yoklugunda CHO'da CP77'nin ekspresyonu ile, bir
kisi bu proteinin, nükleusa yer degistirmeden önce sitoplazma içinde bulunan yeni
sentezlenmis HMG20A'yi sikistirmasini bekleyecektir. Eger durum bu olsaydi, nükleus
içindeki HMG20A'nin fonksiyonu kaybedilecekti ve bu DNA replikasyonu,
rekombinasyonu ve onarimi sirasinda kritik bir rol oynadigindan arti gen
transkripsiyonu sirasinda bunun fonksiyonundan dolayi, bir kisi CP77'nin
ekspresyonunun hücre çogaltilmasi ve idamesi sirasinda CHO hücresinin bütünlügüne
zarar vermesini bekleyecektir. CP77 eksprese eden CHO hücre hatti, parental CHO
hücre hattina kiyasla çok sayida jenerasyon boyunca bunun kopyalama yetisi üzerinde
fark edilebilen etkiler olmadan bir sürekli kültür olarak kolaylikla idame ettirildiginden,
bunun beklenmedik bir sekilde söz konusu durum olmadigi görülür.
Çok-adimli büyüme çalismalari
Çok-adimli büyüme kinetigi çalismasi, p-LLO7-CHO'da yürütülmüstür: Konak aralik
geni CP77 eksprese eden bir CHO hücre hattinin vaksiniya virüsü enfeksiyonuna
permisif dogasi degerlendirilmistir ve viral üretim düzeyi bir dogal olarak permisif insan
hücre hattinda - 1438'de - elde edilen üretim düzeyleri ile karsilastirilmistir.
Amaç, p-LL07-CHO, CHO ve 1435 hücre hatlarinda VACV-COP'nin propagasyon
karakteristigini karsilastirmaktir. Bu çalismada, p-LL07-CHO tarafindan eksprese
edilen CP77'nin islevselligi, CHO (permisif-olmayan) ve 1438 (permisif) hücrelerde
bunun amplifikasyon karakteristigine kiyasla bu hücre hattinda VACV-COP'nin
amplifikasyon karakteristigini inceleme ile test edilmistir.
Materyaller ve Yöntemler
Hücre hatti düzenegi
CHO düzenegi: Bir 6-gözlü Plaka'ya (6WP) CHO hücreleri ekilmistir ve plaka büyüme
ortami (RPMI+%10 FBS) içinde konflüent olanak kadar kültürlenmistir.
Ortami (RPMI+%1O FBS) içinde konflüent olanak kadar kültürlenmistir.
p-LL07-CHO düzenegi: Bir 6-gözlü Plaka'ya (6WP) p-LLO7-CHO hücreleri ekilmistir ve
plaka büyüme ortami (RPMI+%1O FBS+500 pg/ml Higromisin B) içinde konflüent
olanak kadar kültürlenmistir.
VACV-COP'n/n seyre/tilmesr'.' Her bir 6WP'nin her bir gözü, 500 uL'Iik bir toplam hacim
içinde 0,01 pfu ile enfekte edilmistir. %100 konflüansta her bir göz için hücre sayisinin
4x106 hücre oldugu varsayilmistir. 0,01 pfu/göz olan bir enfeksiyon orani Için, her bir
göz için
içinde 8x104pfu/mL'ye seyreltilmistir.
Enfeksiyon/ar: Kültür ortami, her bir plakanin her bir gözünden uzaklastirilmistir,
buraya seyreltilmis virüsün 500 uL'si eklenmistir ve hücrenin virüsü adsorbe etmesi için
oda sicakliginda 1 saat boyunca inkübe olmaya birakilmistir. Virüs inokülümü akabinde
uzaklastirilmistir ve her bir enfekte edilmis göz, 1 mL steril PBS ile bir kere yikanmistir
ve akabinde her bir göz için 2 mL MM içinde 37°C/%5 COz'de inkübe edilmistir.
Hasat etme: Her bir plakadan gözlerin iki kümesi, burada enfeksiyondan sonra
asagidaki zamanlarda hasat edilmistir: 24 saat, 48 saat ve 72 saat. Hasat etme
gününde, hücreler kültür ortami içine kazinmistir, burada her bir hücre hattindan
gözlerin iki kümesi birlestirilmistir ve hücreler 1000 9'de 5 dakika boyunca
sentrifügasyon ile pelet haline getirilmistir. Her bir hücre peleti, 1 mL 10 mM TrisHCI,
pH 8, içinde yeniden-süspanse edilmistir. Yeniden-süspanse edilmis pelet akabinde, üç
siklus dondurma-çözülmeye tabi tutulmustur ve titrasyon için hazir olana kadar -
80°C'de saklanmistir.
Titrasyonlar, 24-gözlü plakalarda %100 konflüansa kadar kültürlenmis Vero ve 1438
hücrelerinde yapilmistir.
Seyreltmeler: Viral ekstraktlar, dondurucudan çikarilmistir, bunlarin buzu çözülmüstür
ve herhangi görünebilir topagi homojenize etmek için sonike edilmistir. Viral ekstraktlar,
idame ortami içinde 10'8'e seri seyreltilmistir.
Enfeksiyonlar.' Büyüme ortami her bir gözden uzaklastirilmistir ve her bir seyreltmenin
1 mL'si (her bir seyreltme için 4 göz, 10'2 seyreltmeden baslayarak her bir virüs için bir
plaka) ile oda sicakliginda 1 saat boyunca enfekte edilmistir. Inkübasyondan sonra, her
bir plaka inkübatöre yerlestirilmistir ve plaklarin gelismesi için 3 gün boyunca 37°C/%5
COz'de inkübe edilmistir.
Titreriin Hesaplanmasi: 20 ila 50 plak içeren seyreltme, plaklar sayilmistir ve akabinde
ortalamasi alinmistir. Bu ortalama sayi, seyreltmenin çarpmaya göre tersi ile
çarpilmistir ve 1 mL enfeksiyon kullanildigindan, elde edilen sayi, pfu/mL cinsinden
titre olacaktir.
Standart Hatanin Hesaplanmasi: %95 güvende standart hata (SE), asagidaki formül
kullanilarak ortalamaya olusturan 4 titrasyon degerinden hesaplanmistir: 1,95 x
(SDNn), burada: SD, bir küçük örnekten standart sapmadir, n, titrasyon tekrarlarinin
sayisidir (bu durumda 4).
Verimin Hesaplanmasi: Bu, titre edilmis olan viral ekstrakt içindeki virüsün toplam
miktardir: Ortalama Titrasyon (pfu/mL) X Viral Ekstraktin Toplam Hacmi = pfu.
Amplifikasyon Oraninin Hesap/anmasi: Bu sayi, inokülüm olarak kullanilan miktara
kiyasla kat amplifikasyonunu temsil eder: pfu cinsinden verim/pfu cinsinden inokülüm
Çok-adimli büyüme kinetigi çalismalari, 6 gözlü plakalar - her bir zaman noktasi için
her bir hücre hatti için iki göz - içinde çalisilmistir. Her bir göz, 4x1 04 pfu VACV-COP ile
enfekte edilmistir ve hasat etme için her bir hücre hatti ve zaman noktasi için 2 göz
hasat edilmistir ve birlestirilmistir bundan bir viral ekstrakt hazirlanmistir. Bu viral
elde edilen 2 birlestirilmis enfeksiyonu temsil eder, akabinde titre edilmistir. Titrasyon,
iki indikatör hücre hatti 1438 ve Vero kullanilarak yürütülmüstür.
Titrasyon ve viral verim sonuçlari sirasiyla Tablolar 3'te ve 4'te tablo haline getirilir.
VACV-COP, permisif-olmayan CHO hücrelerinde çogalmamistir, yani, bu girdi
inokülümde kullanilan miktara kiyasla daha az virüs üretmistir. Bununla birlikte, konak-
aralik geni CP77'yi eksprese eden CHO hücre hattinda virüs amplifikasyonu, (indikatör
hücre hatti olarak 1438 hücreleri kullanilan titrasyon sonuçlarina göre) girdi inokülüme
kiyasla yaklasik 2000 kat daha fazladir. Permisif hücreden amplifikasyon, girdi
inokülüme kiyasla yaklasik 3000 kat daha fazladir. Standart hatalar kesistiginden, p-
LL07-CHO ve 1438 hücreleri arasinda amplifikasyondaki farklilik istatistiksel olarak
anlamli degildir.
Iki hücre hatti arasindaki viral amplifikasyon Vero indikatör hücrelerinden elde edilen
titrasyon sonuçlari kullanilarak karsilastirildiginda, amplifikasyonun 143B hücrelerine
kiyasla p-LL07-CHO hücrelerinde marjinal olarak daha fazla oldugu görülecektir,
bununla birlikte bu istatistiksel olarak anlamli degildir.
Bu çalismada, viral üretim düzeyi inokülüm olarak kullanilan virüsün miktarina kiyasla
çok daha az oldugundan, vaksiniya virüsünün CHO hücrelerinde permisif olmadigi
ilaveten konfirme edilmistir. Bununla birlikte, CHO CP77 proteinini kodlayan inek çiçek
virüsü konak aralik genini eksprese ettiginde, bu simdi vaksiniya virüsüne permisif hale
gelir ve bir permisif hücre hattinda görülen ile ayni düzeylerde virüs üretimini destekler.
Vaksiniyanin üretilmesi amaciyla bu hücre hattini bir "kullanilabilir" permisif hücre
substratina dönüstürmek için, bunun yalnizca bir konak aralik geninin, CP77'nin,
ekspresyonunu gerektirmesi de kayda degerdir. CHO, bunun bakteriler kadar çabuk
büyümesi, bunun biyolojik katki maddeleri, örnegin, Fötal Bovin Serumu için gereklilik
olmadan tanimlanmis sentetik kültür ortami içinde kültürlenebilmesi ve bir biyo-reaktör
içinde bir hücre süspansiyonu olarak kültürlenebilmesi açisindan bir biyoteknoloji dostu
hücre hatti oldugundan, CHO'dan vaksiniya üretme çok arzu edilir. CHO ayrica,
biyolojik tibbi ürünler üretmeye yönelik bir öyküye de sahiptir, iyi karakterize edilmistir
ve biyo-medikal kontrol ajanslari, örnegin, FDA ve EMEA, tarafindan bilinir ve sevilir.
Bir konstitütif hücresel promotör kontrolü altinda CP77 proteinini eksprese eden bir
transgenik CHO hücre hatti, yüksek düzeylerde projeni virüsü üreten bir dogal olarak
permisif hücre hattinda görülen ile ayni düzeylerde vaksiniya virüsü replikasyonuna ve
propagasyona permisiftir.
CNO-CP77 hücrelerinde MVA propagasyonu
CHO'da, 1438 'de ve p-LL07-CHO 'da MVA+GFP Propagasyonu
Materyaller ve Yöntemler
Büyüme ortami (GM): %10 FBS, 2 mM L-Glutamin, Penisilin ve gentamisin, Hepes ile
takviye edilmis RPMI-1640.
idame ortami (MM): %2 FBS, 2 mM L-Glutamin, Penisilin ve gentamisin, Hepes ile
takviye edilmis RPMl-1640.
p-LL07-CHO'yu kültürleme konusunda notlar.' p-LL07-CHO hücre hattinin genel
propagasyonu ve idamesi, GM arti 500 ug/mL higromisin B içinde yürütülmüstür, ancak
bununla birlikte, plakalamak ve enfeksiyondan önce %100 konflüansa kültürlemek için,
hücreler higromisin B içermeyen GM içinde kültürlenmistir.
Hücre düzenegi.' 1438, CHO ve P-LLO7-CHO hücreleri, çok sayida 6-gözlü plakaya
ekilmistir ve hücre tek-katmanlari %100 konflüent olana kadar 37°C/%5 COz'de
büyüme ortami (GM) içinde kültürlenmistir. Her bir hücre hatti için bir plaka,
kültürlenmistir.
Enfeksiyon
0 Bir GFP ekspresyon kaseti (yesil flüoresan protein) barindiran bir rekombinant
MVA, G-gözlü plakalar içinde kültürlenmis hücreleri enfekte etmek için
kullanilmistir. MVA-GFP'nin bilinmeyen titresinden dolayi, virüs asagida oldugu
üzere idame ortami (MM) içinde seri olarak seyreltilmistir:
o Seyreltme 1: stok virüsünün 20 ultsi, 2 ml MM ortami (1:100 seyreltme)
içinde seyreltilmistir ve kuvvetli vorteksleme ile karistirilmistir.
eklenmistir ve kuvvetli vorteksleme ile karistirilmistir.
eklenmistir ve kuvvetli vorteksleme ile karistirilmistir.
o Seyreltme 4: Seyreltme 3*ün
eklenmistir ve kuvvetli vorteksleme ile karistirilmistir.
0 Her bir plakanin bir gözü, asagidaki virüs seyreltmeleri Seyreltme 2'in,
Seyreltme 3'ün ve Seyreltme 4'ün 500 ul'si ile enfekte edilmistir.
0 Her bir plaka, 5 günlük bir periyot boyunca inkübe edilmistir ve flüoresan
hücrelerin odaklarinin gelismesi ve yayilmasi için incelenmistir. Bu çalismada,
Seyreltme 4, bir üç günlük periyot boyunca flüoresan hücrelerin ayirt edilebilen
odaklarini üretmistir. Her bir plakanin enfekte edilmemis gözleri, oto-flüoresans
için kontrollerdir.
Mikroskop Incelemesi
Viral enfeksiyon, GFP filtre (Kat#U-MGFPHQ, Olympus) ile flüoresan mikroskop
(Olympus IX51) altinda incelenmistir. Görüntü, ceIISens Digital Imaging Software
(Olympus) kullanilarak çekilmistir.
Bulgular
Sonuçlar, yesil flüoresan protein (GFP) eksprese eden MVA'nin beklenildigi üzere CHO
ve 1438 hücrelerinde çogalmadigini göstermistir. Yesil flüoresan isik yayan tek
hücreler, hücreye giren, bunun GFP'yi içeren genini eksprese eden ancak yeni
enfeksiyöz viral parçaciklar üretemeyen ve bundan dolayi enfeksiyonu komsu
hücrelere yayamayan virüsün sonucudur. Bununla birlikte, CP77 eksprese eden bir
CHO hücre hattinda, MVA, gün 3 ile ilave gelisme ile, enfeksiyondan sonraki gün 1 ile
enfeksiyonun odaklarini olusturmak için komsu hücrelere yayilan yeni enfeksiyöz
virüsler üretebilir.
p-LL07-CHO enfeksiyonundan hasat edilen MVA'nin konak aralik
restriksiyonunun konfirmasyonu
Hücre düzenegi
143B, CHO ve BHK-21 hücreleri, çok sayida 6-gözlü plakaya ekilmistir ve hücre tek-
katmanlari %100 konflüent olana kadar 37°C/%5 COz'de büyüme ortami (GM) içinde
kültürlenmistir. Herbir hücre hatti için bir plaka, kültürlenmistir.
Örnek 5'te Seyreltme 3 ile enfekte edilmis P-LL07-CHO gözünden MVA+GFP, asagida
oldugu üzere 5 günlük enfeksiyondan sonra hasat edilmistir:
0 Hem süpernatant hem de hücreler, gözden toplanmistir ve enfekte edilmis
hücreleri pelet haline getirmek Için 1000 9'de 5 dakika boyunca sentrifüj
edilmistir.
0 Hücre peleti, 500 ul 100 mM Tris-HCI, pH 8, tamponu içinde yeniden-süspanse
edilmistir.
0 Yeniden-süspanse edilmis hücre peleti, enfekte edilmis hücrelerden virüsü
serbest birakmak için en az üç kere dondurulmustur ve çözülmüstür.
Enfeksiyon
o Ham viral ekstraktin bilinmeyen titresinden dolayi, virüs Örnek 5'teki ile ayni
sekilde MM ortami içinde seri olarak seyreltilmistir.
0 Her bir plakanin bir gözü, asagidaki virüs seyreltmeleri Seyreltme 2'nin,
Seyreltme 3'ün ve Seyreltme 4'ün 500 pl'si ile enfekte edilmistir.
0 Her bir plaka, 5 günlük bir periyot boyunca inkübe edilmistir ve flüoresan
hücrelerin odaklarinin gelismesi ve yayilmasi için incelenmistir. Bu deneyde,
Seyreltme 3, bir üç günlük periyot boyunca flüoresan hücrelerin ayirt edilebilen
odaklarini üretmistir.
Mikroskop Incelemesi
Viral enfeksiyon, GFP filtre (Kat#U-MGFPHQ, Olympus) ile flüoresan mikroskop
(Olympus IX51) altinda incelenmistir. Görüntü, cellSens Digital Imaging Software
(Olympus) kullanilarak çekilmistir.
Bulgular
CP77 eksprese eden CHO hücre hattindan hasat edilen MVA, permisif-olmayan hücre
hatti CHO (hamster) ve 1438 hücresi (insan) içinde çogalamama ile, hala bunun
sinirlandirilmis konak araligini idame ettirilmistir. CHO ve 1438 hücrelerinin
enfeksiyonu sonrasinda üç günlük periyot boyunca yesil flüoresan fokuslarin yoklugu,
enfeksiyöz projeni virüsünün bu hücre hatlarinda üretilmedigini gösterir. Bununla
birlikte, sonraki 3 gün boyunca boyut açisindan büyüyen enfeksiyonun yesil flüoresan
odaklari enfeksiyondan sonraki gün 1 ile görülebilecegi gibi, bu MVA BHK21 hücreleri
(hamster) için bunun konak araligini hala idame ettirmistir.
Sonuçlar
0 Konak aralik proteini CP77'yi eksprese eden CHO hücreleri, parental (natif)
CHO hücrelerinden farkli olarak MVA enfeksiyonlarina permisiftir.
o CP77 eksprese eden bir CHO hücre hattinda çogaltilmis MVA, permisif-
olmayan hücre hatlari, örnegin, CHO ve 1438 (insan), için bunun konak
araligini arttirmamistir.
pLL07'nin Yapilmasi
Alt-Yapi Bilgi: pPH51 DNA sablonundan CP77 (CHO kodon optimize edilmis) CDS
PCR ürünü, pLLO7 olusturmak için Clontech InFusion klonlama sistemi ile pJ507-2
(Hyg+) PiggyBac sistemine klonlanmistir. Bayrak-etiketli CP77 dizisi, pJ507-2'nin Bsal'i
içine yerlestirilmistir, böylece komet GFP dizisini (SEO ID NO: 3) uzaklastirmistir.
pPH51 plazmid DNA'sindan CP77-CHO genini PCR ile çogaltmak için kullanilan PCR
primer çifti:
AACACGTCTCGGGGGgccgccaccATGTTCGACTACCTGGAAAATGAGGAAGTG
(SEQ ID NO: 4) ve
CAGGAAGACGCTTTTtcaCTTGTCATCGTCATCCTTGTAATCCTGCTGCTCGAA
GATCTTGTACT (SEQ ID NO: 5). Bayrak Etiket dizisi, Inf-LL07-CP77-Rv primeri içinde
koyu renkte gösterilir.
Plazmid IÇERI YERLESTIRME/KASET Konfigürasyonu asagidaki sekildedir. Içeri
yerlestirme/Kaset Haritasi. pLL7 klonu #3, dizileme için gönderilmistir.
pLL07 referans dosyasi "pLLO7_ref.sbd" ile birlikte 15 ABI dizileme dosyalari, burada
Lasergene DNAstar Seqman bilgisayar programina girilmistir ve 1 konsensüs bitisik
haline birlestirilmistir. Referans dizisinin baslangici ve sonu ile eslesmesi için kirpilmis,
bundan sonra referans dizi olarak ifade edilen, hizalama dizileri, konsensüs dizinin
olusturulmasi üzerinde etkiye sahip olmama suretiyle hizalamadan silinmistir. Bitisigin
konsensüs dizisi, "pLLO7_#3 consensusseq" adli bir DNA dizi dosyasi olarak
kaydedilmistir. Bitisigin okuma yönü belirlenmistir ve referans dizi ile ayni okuma
yönünü temsil ettigi bulunmustur. Megalign (DNAstar) kullanilarak, "pLLO7_#3
consensus", referans dizi ve pLL07_#3 içindeki dizi arasindaki uyusmazliklari
tanimlamaya yardimci olmak için "pLLO7_ref.sbd" referans dizisine manüel olarak
hizalanmistir. Seqman (varsayilan ayarlar) kullanilarak AGRF-dizileme servisinden
pLL07KIon#3 için 15ABt dosyalarini birlestirme, pLLO7 içeri yerlestirme referans
dizisinin tam boyunu kapsayan bir konsensüs bitisik ile sonuçlanmistir. pLLO7_#3
içindeki dizi ve referans dizi arasinda uyusmazlik yoktur. pLL07_#3 bitisik konsensüs
içindeki içeri yerlestirme dizileri, referans diziye özdestir.
Memeli hücrelerinde G1L'nin ve !TL 'nin ekspresyonu
Bayrak-etiketIi-G1L'yi veya Bayrak-etiketli-ITL'yi kodlayan ekspresyon plazmidleri
yapilmistir ve bu proteinleri eksprese eden transgenik 1438 hücre hatlari yapmak için
kullanilmistir. Bu hücrelerin aktarilmis hücreleri pozitif bir sekilde seçmek için Genetioin
varliginda çogaltilmis olmasina ve PCR analizinin bu hücre hatlarinin genomlari içinde
bu proteini kodlayan dizilerin varligini konfirme etmesine ragmen, western blot analizi,
bir anti-DDDDK antikoru ile problandiginda, eksprese edilmis Bayrak-etiketli-
proteinlerin varligini saptayamamistir.
C-ucu Bayrak-etiketli COP-G1L'nin ve COP-I7L'nin protein kodlama dizileri, burada
GeneArt (Life Technologies) ile sentezlenmistir ve DNA firmasindan satin
alinan pJ503-2'nin (piggyBac - neomisin antibiyotik seleksiyonu) Bsa I yerine alt-
klonlanmistir. Bu klonlama prosedürü, komet-GFP'yi Bayrak-etiketIi-GtL veya -I7L
protein kodlama dizileri ile degistirir. Elde edilen klonlar, G1L piggyBac vektörü için
pLL08 ve I7L piggyBac vektörü için pLL1O olarak gösterilmistir.
Bu iki plazmid vektörünün önemli özellikleri asagidaki sekildedir: bayrak-etiketli protein
kodlama dizileri, konstitütif insan promotörü EF1aIfa kontrolü altindadir, NPT ll
ekspresyon kaseti (neomisin direnç geni) ile birlikte bu ekspresyon kasetinin iki
yaninda, bir yapay transpozon elemani olusturmak için Sol ve Sag Transpozon sinirlari
yer alir. Transpozon elemanin konak genom içine geri-dönüsümsüz entegrasyonuna
aracilik eden Transpozon enzimi ekspresyon kaseti yapay transpozon elemaninin
disindadir ancak ayni plazmide dahil edilir. Bu transpozon elemanlarini tasiyan
hücreler, G418'i (Geneticin) hücre büyüme ortamina dahil etme ile pozitif bir sekilde
seçilebilir.
Plazmid vektörü pLL08 (Bayrak-etiketIi-G1L) ve pLL1O (Bayrak-etiketIi-I7L), aktarilmis
iki transgenik hücre hatti; (G1L ekspresyon kaseti içeren) G1L-14SB ve (l7L
ekspresyon kaseti içeren) I7L-1438, olusturmak için 1438 hücrelerine transfekte
edilmistir. Basarili transpozon entegrasyonu olan hücreler, Geneticin'in büyüme
ortamina dahil edilmesi ile çalisilabilen miktarlarda çogaltilmistir. Basarili entegrasyonu
dogrulamak için, toplam hücresel DNA, kitin talimat manüelinden talimatlar izlenerek
Qiagen firmasindan DNeasy DNA ekstraksiyon kiti kullanilarak bu transgenik
hücrelerden ekstrakte edilmistir. Ekstrakte edilmis DNA akabinde, G1L'nin ve l7L'nin
PCR amplifikasyonuna spesifik PCR primer çiftleri kullanilarak PCR amplifikasyon
reaksiyonlari için sablon olarak kullanilmistir. Her iki hücre hatti, bunlarin genomlari
içinde G1L ve I7L DNA dizisinin varligi için pozitiftir.
Bu hücre hatlari tarafindan G1L ve I7L ekspresyonu için test etmek için, Western blot
analizi, HRP'ye (anti-DDDDK antikoru. Abcam #ab49763) konjuge edilmis bir anti-
Bayrak Etiketi antikoru [M2] kullanilarak her bir Bayrak-etiketli proteinin varligini
toplam proteinin kullanildigi bu western blot analizinin sonuçlari, anti-Bayrak-etiketi
antikorunun beklenildigi üzere 1438'den ekstrakte edilen herhangi bir proteini
tanimadigini ve bir Bayrak-etiket-CP77 transgenik CHO hücre hattinda (CP77-CHO)
eksprese edildiginde bir Bayrak-etiket proteinini taniyabildiginde, anti-bayrak-etiket
antikorunun bayrak-etiketli proteinleri taniyabildigini konfirme ettigini göstermistir.
Bununla birlikte, G1L-1438 örneginden protein ekstraktinda Bayrak-etiketIi-G1L proteini
saptanamaz. Bakteriyel olarak eksprese edilmis Bayrak-etiketIi-I7L proteini, anti-
Bayrak-etiket antikoru ile saptanabilir, ancak antikoru I7L-1438 hücre hatti tarafindan
Bayrak-etiketli-I7L ekspresyonunu saptayamaz.
G1L ve I7L ekspresyon kasetleri bunlarin ilgili hücre hattinda saptanabileceginden,
sonuçlar ya eksprese edilmis proteinlerin bir vaksiniya enfeksiyonu yoklugunda
sentezden sonra çabuk bir sekilde parçalandigi, yani, hem Gi hem de l7 proteinlerinin
virüs spesifik enzimler olmasi ve bunlarin vaksiniya spesifik enzim substratlari olmadan
kararsiz olabilecegi veya bu iki ekspresyon kasetini yönlendiren promotörün kusurlu
olmasi olabilir. Bir baska hipotez, bir vaksiniya enfeksiyonu yoklugunda bu proteinlerin
ekspresyonunun hücreler için "toksik" olmasidir ve Geneticin seleksiyon prosesi
sirasinda, NPT II ekspresyon kasetini degil ancak transgenik G1L ve I7L ekspresyon
kasetlerini susturmus olan hücrelerin, G1L veya I7L proteinlerini eksprese etmemis
olan Geneticin dirençli hücrelerin amplifikasyonuna olanak saglamasidir. pJ503-2
piggyBac plazmidi, 1438 hücrelerinde COP-D13L'nin ekspresyonu için
laboratuvarimizda basarili bir sekilde kullanildigindan, EF1alfa promotörünün
fonksiyonel oldugu ve bu proteinlerin bir vaksiniya enfeksiyonu yoklugunda kararsiz
oldugu veya bu proteinlerin ekspresyonunu yönlendiren promotörün burada Geneticin
varliginda hücre amplifikasyonu sirasinda "toksik" proteinlerin ekspresyonunu önlemek
için selektif bir sekilde susturuldugu önerilmistir.
Bir esansiyel yapisal matürasyon veya birlesme proteininin bir örnegi olarak
D13L, memeli hücresi tarafindan eksprese edilir ve D13L geninin silinmesi
olmadan vaksiniyayi kurtarir ve D13L silinmis vaksiniya, enfekte edilmis
hücrelerde proteini eksprese eder
Birlesme/matürasyon prosesini bloke etme ile vaksiniyayi atenüe etmenin bir örnegi
olarak - D13-Kurtarma Hücre Hattinin Yapi/masi, Kopenhag susunun D13L ORF'si,
silinme için hedef alinmistir. Bunu yaparken, bu proteini eksprese eden bir hücre
hattinin ilk olarak yapilmasi gerekecektir, böylece bir COP-D13L-silinmis virüs
çogaltilabilir. Kurtarma hücre hattinin yapilmasi için, bu hücre hatti "biyoteknoloji" dostu
oldugundan, siklikla CHO olarak ifade edilen, Çin Hamsteri Over hücre hatti seçilmistir.
Bir COP-D13L silinmesi olan enfeksiyöz vaksiniya virüsünü kurtarmak için, bu hücre
hattinin, vaksiniya virüsününkini degil hücrenin transkripsiyon mekanizmasini
kullanarak bunun nükleer genomundan D13-proteinini eksprese etmesi gerekir.
Hücresel eksprese edilmis D13-proteininin protein amino asit dizisi, DYKDDDDK'nin
(Bayrak-etiket, Hopp et al., 1988) bir C-ucu etiketli amino asit dizisini içerir ve karsilik
gelen nükleotid dizisini üretmek için CHO kodon optimize edilmistir. Bir memeli
promotöründen ve bir memeli poIi-adenilasyon sinyal dizisinden olusan bu etiketli
D13L-CHO kodon optimize edilmis ekspresyon kasetinin nükleer DNA içine kararli
entegrasyonu, Urschitz et al., 2010 ve Matasci et al., 2011, tarafindan bildirilen tipteki
Transpozon entegrasyon teknolojisi ile basarilmistir. CHO`nun transdüksiyonu, DNA2.0
basarilmistir.
D13L protein kod/ama dizisinin yapilmasi - D13L protein kodlama dizisi, Vaksiniya
virüsü Kopenhag susunun D13L ORF'si tarafindan kodlanan D13-amino asidinden
DNA dizisini yeniden-olusturma ile GeneAit of Life Technologies tarafindan sentetik
olarak yapilmistir ve CHO hücrelerinde ekspresyon için kodon optimize edilmistir.
VACV-COP D13L ORF'nin protein kodlama dizisi, Dizi listesinde gösterilir.
D13L hücre aktarma vektörünün yapilmasi - pLL17'den kodon optimize edilmis D13-
protein kodlama dizisi (D13Lcho-Eti'ketli) PCR ile çogaltilmistir ve pLL19 üretmek için
DNA2.0 lnc (Kat # pJ503-2) firmasindan satin alinan transpozon piggyBac vektörü
içine Bsa l klonlama yerleri vasitasiyla alt-klonlanmistir. ln-Fusion klonlama (Clontech:
bunu in vitro homolog rekombinasyon ile etiketli D13-protein kodlama dizisi ile
degistirir. D13Lcho-Etiketli protein kodlama dizisi simdi, insan Elongasyon Faktörü 1
alfa promotörü (EF1a) kontrolü altindadir ve her ikisi transfekte edilmis hücrelerin
genomuna kararli bir sekilde entegre edildiginde, Neomisin direnç geni ile birlikte-
eksprese edilecektir. Konak genomu içine kararli entegrasyona, piggyBac vektörünün
Sol ve Sag Transpozon siniri ile baglanmis DNA dizisinin Transpozon entegrasyonu ile
aracilik edilir.
D13LchoEtiket/i' dizinin PCR amplifikasyonu, asagidaki primer çifti kullanilarak
yapilmistir:
Ileri Primer dizisi:
Büyük harf ile, koyu ve alti çizili metin halindeki dizi, In-Fusion klonlama için gerekli
olan pJ içindeki komet GFP'nin yukari akis Bsa l yerine homolog diziyi
temsil eder. Küçük harf ile kirmizi ve alti çizili metin halindeki dizi, bir modifiye edilmis
Kozak dizisidir. Normal büyük harf ile yazilmis metin halindeki dizi, pLL17 içindeki
D13Lcho-Etiket/i dizinin 5' ucuna homologdur.
Geri Primer Dizisi:
lnf-LL1 9-D1 3LC-Rv:
Büyük harf ile, koyu ve alti çizili metin halindeki dizi, In-Fusion klonlama için gerekli
olan pJ içindeki komet GFP'nin asagi akis Bsa I yerine homolog diziyi
temsil eder. Normal büyük harf ile yazilmis metin halindeki dizi, pLL17 içindeki
D13Lcho-Etiketli dizinin 3' ucuna homologdur. Beklenen 1719bp'lik PCR ürünü, pLL19
olusturmak için üreticinin talimatlari izlenerek InFusion klonlama (Clontech) ile Bsal ile
kesilmis pJ içine klonlanmistir.
D13-proteini'ni eksprese eden bir CHO hücre hattinin yapilmasi.' p-LL19-CHO -CHO
hücreleri, bir 6-gözlü plakanin gözlerine ekilmistir, böylece bir gece boyu
inkübasyondan sonra, bunlar %50 konflüans civarindadir. Qiagen firmasindan (Kat #
301425) Effectene transfeksiyon reaktifi kullanilarak, 1 ug pLL19, üreticinin talimatlari
izlenerek %50 konflüent CHO hücrelerinin 1 gözüne transfekte edilmistir. Transfekte
edilmis hücreler akabinde, büyüme ortami (RPMI 1640/%10 FBS/2 mM Glutamax/Pen-
Strep) içinde gece boyu inkübe edilmistir. Sonraki gün, ortam aktarilmis hücreleri
Seçmek için 1000 ug/mL Geneticin içeren büyüme ortami ile degistirilmistir. Seleksiyon
ortami, her 2 ila 3 günde bir degistirilmistir. Aktarilmis hücreler %90 ila 100 konflüansa
kadar büyüdügünde, bunlar TrypLE Select (Gibco-Invitrogen Corp, Kat #12563-029)
kullanilarak geri-kazanilmistir ve ilave hücre genislemesi için bir T25 balon içine
ekilmistir.
D13L ekspresyonunun Western blot/ama ile dogrulanmasi - Tavsan anti-D13 anti-
serumlarinm üretilmesi.' Tavsanlara, natif D13-pr0teininin C-ucu amino asidini temsil
eden KHL proteinine bagli bir 16 amino asitlik peptit enjekte edilmistir. Bu amino asit
dizisi asagidaki sekildedir: CYDQGVSITKIMGDNN. 1 ay arayla, toplamda üç
enjeksiyon, bu amino asit dizisine karsi antikorlar meydana getirmek için yapilmistir.
Enjekte edilmis tavsandan elde edilen serum, asagidaki hücre ekstraktlarina karsi
western blot analizi ile test edilmistir: 1438 tam hücre ekstrakti, Bayrak-etiketli-D13L
eksprese eden 1438 transgenik hücre hattindan (p-LL06-143b) tam ekstrakt ve VACV-
COP enfekte edilmis 1438 hücre ekstrakti. Sonuçlar açik bir sekilde, tavsan anti-D13
serumunun D13-proteinini net bir sekilde spesifik olarak taniyabildigini göstermistir.
CHO-aktarilmis hücre preparasyonu - D130ho-Etiketli aktarilmis CHO poliklonal
genisletilmis hücre hatti (p-LL19-CHO), normal CHO hücreleri ile oldugu gibi, bir T25
balon içinde %100 konflüansa kadar kültürlenmistir. Her bir balondan elde edilen
hücreler, TrypLE Select (Gibco-Invitrogen Corp, Kat #12563-029) ile hasat edilmistir,
düsük hizli sentrifügasyon (300 g, 5 dakika) ile pelet haline getirilmistir, PBS ile
yikanmistir ve 200 uL PBS içinde yeniden-süspanse edilmistir.
Western Blot analizi - 50 uL 5x SDS-PAGE yükleme tamponu her bir hücre
süspansiyonuna eklenmistir ve akabinde bunlar 98°C'de 5 dakika boyunca inkübe
edilmistir, her bir hücre proteini ekstraktinin 15 uL'si, %10`luk iki SDS-PAGE jeline
yüklenmistir, elektroforez uygulanmistir ve akabinde elektro-blotlama ile Hybond ECL
nitroselüloz üzerine blotlanmistir. Elektro-blotlanmis membranlara akabinde, membran
üzerindeki tüm mevcut spesifik-olmayan antikor baglama yerlerini bloke etmek için
Tween 20 içeren Tris Tamponlu Salin (TBST) içinde çözünmüs %5'Iik yagsiz süt tozu
ile oda sicakliginda 1 saat boyunca muamele edilmistir. Membranlar akabinde,
antikorlar ile problanmadan önce TBST içinde bir kaç kere yikanmistir. Membran 1,
HRP içinde konjuge edilmis anti-DDDDK etiket antikoru [M2]'nin (Abcam, Kat #
Tavsan D13-anti-serumlarinin 1:2000'Iik seyreltmesi ile gece boyu 4°C'de
problanmistir, TBST ile 3 kere yikanmistir ve akabinde sekonder antikor, HRP konjuge
saat boyunca problanmistir. Her iki membran akabinde TBST ile 3 kere yikanmistir ve
kullanici manüeli ile talimat verildigi üzere bunlara ECL western blotlama saptama
reaktifleri (GE Healtheare) ile muamele edilmistir ve bunlar X-isini filmine maruz
birakilmistir.
VA CV-COP'nin D13L ORF silinmesi ile atenüasyonu
Vaksiniya virüsünü atenüe etmek için, COP-D13L ORF`sinin protein kodlama dizisinin
büyük bir kismi ile birlikte korunmus geç promotör dizisi, homolog rekombinasyon ile
silinme için tahsis edilmistir ve bunun yerine, bir seleksiyon/raportör kaset
yerlestirilmistir, böylece homolog rekombinasyon ile basarili silinme, D13-pr0teinini
eksprese eden bir CHO hücre hattinda seçilebilir ve burada enfeksiyon kirmizi
flüoresans ile görsellestirilebilir. Seleksiyon/raportör kaseti, bir vaksiniya promotörü
kontrolü altinda CP77 eksprese eden CHO konak aralik geninden ve DsRed-ExpressZ
dizisinden olusur.
GOP-013L silinme homolog rekombinasyon vektörünün yapilmasi - VACV-COP'den
homolog rekombinasyon ile D13L ORF'sinin silinmesi için, COP-D13L ORF'sinin her iki
yaninda yer alan iki homolog rekombinasyon kolu tasarlanmistir. Bununla birlikte,
COP-D12L ORF'nin promotör dizisi, COP-D13L ORF'sinin 3' ucu içine
uzanabileceginden. COP-D13L ORF'sinin 3' ucunun yaklasik olarak 200 bp'si aynen
birakilmistir.
Homo/og rekombinasyon kollari F1'i'n ve F2'nin yapi/masi - Homolog rekombinasyon
kollari, asagida gösterilen primer çiftleri kullanilarak VACV-COP genomik DNA'sindan
PCR ile çogaltilmistir. Koyu ve alti çizili metin, F1 ve F2 kollarini seleksiyon/rapor
kasetine ve Clontech firmasindan ln-Fusion kiti içinde saglanan lineer hale getirilmis
pUC19'a birlestirmek için In-Fusion kollarini temsil eder. In-Fusion Iigasyonui pLLO9
olarak gösterilen daire haline getirilmis plazmid ile sonuçlanacaktir.
VACV-COP DNA 'sindan D13L-F1 kolunu PCR ile çogaltmak için kullanilan PCR primer
lnf-PCR-D13L-F1-Fw: 5'-CGGTACCCGGGGATCACGAAAAATAATAGTAACCA-3'.
Koyu ve alti çizili metin (15bp), CIonTech In-Fusion kiti ile saglanan lineer hale
getirilmis pUC19 plazmidinin sol ucuna homolog diziyi temsil eder.
3'. Koyu ve alti çizili metin (15bp), Seleksiyon/Raportör kasetinin 5' ucuna homolog
diziyi temsil eder. Beklenen PCR ürünü boyutu: 657 bp
VACV-COP DNA 'sindan D13L-F2 kolunu PCR ile çogaltmak için kullanilan PCR primer
lnf-PCR-D1 3L-Fw: 5'-ATATTTAAATGCGCGCAATAATGGAACAAGAACCCT-3'.
Koyu ve alti çizili metin (15bp), Seleksiyon/Raportör kasetinin 3' ucuna homolog diziyi
temsil eder.
lnf-PCR-D13L-F2-Rv: 5'-CGACTCTAGAGGATCGCGCTGAGGTCGGCAACTACG-S'.
Koyu ve alti çizili metin (15bp). ClonTeCh In-Fusion kiti ile saglanan lineer hale
getirilmis pUC19 plazmidinin sag ucuna homolog diziyi temsil eder. Beklenen PCR
ürünü boyutu: 621 p
Seleksiyon/raportör kasetinin yapilmasi - Seleksiyon/raportör ekspresyon kaseti, inek-
çiçek virüsü CP77 CHO konak-aralik geninden
ve DsRed-ExpressZ'nin kirmizi flüoresan protein kodlama dizisinden olusur. Bu
ekspresyon kaseti Life Technologies GeneArt tarafindan sentetik olarak yapilmistir,
böylece CP77 proteini kodlama dizisi, bunun natif promotörü (CP77 ATG baslangiç
kodonunun yukari akis dizisinin 100 bp'si) kontrolü altindadir ve çiçek-virüsü erken
transkripsiyonel durdurma dizisi (T5NT) ile sonlandirilmistir. DsRed proteini kodlama
dizisi, bir vaksiniya erken/geç promotörü kontrolü altindadir ve ayrica çiçek-virüsü
erken transkripsiyonel durdurma dizisi içinde sonlandirilmistir.
pLL09'un birlesmesi - Seleksiyon/Raportör kaseti ile birlikte D13L-F1 ve D13L-F2 PCR
ürünleri, pLL09 üretmek için ClonTech firmasindan InFusion Kit'i içinde saglanan
pUCiQ içine üreticinin talimatlari izlenerek In-Fusion klonlama ile birlestirilmistir.
Homolog rekombinasyon ile COP-D13L'nin silinmesi ve SCV104 üretmek için plak
saflastirma - COP-D13L ORF'si, protein kodlama dizisinin büyük bölümünü ve "TAAAT"
korunmus geç promotör elemanini silme ile inaktif hale getirilmistir. COP-D13L ORF'si,
bir vaksiniya virüsü geç promotörü kontrolü altindadir, burada korunmus geç promotör
elemani, promotör aktivitesi için kritikti (Moss, 2007) - bunun silinmesi COP-D13L
ORFsinin susturulmus hale gelmesi ile sonuçlanacaktir. Protein kodlama dizisinin ve
korunmus promotör elemanin silinmesi, VACV-COP ve pLL09 arasindaki homolog
rekombinasyondan etkilenir, burada homolog rekombinasyonun sonucu, CP77-DsRed
ekspresyon kasetinin silinmis bölge içine yerlestirilmesidir. Bu ekspresyon kasetinin
içeri yerlestirilmesi, simdi SCV104 olarak gösterilen, rekombinant virüsün CHO
hücrelerinde, ancak yalnizca bir fonksiyonel D13-proteini eksprese eden hücrelerde,
örnegin, p-LL19-CHO'da, çogalmasina olanak saglar. Homolog rekombinasyondan
sonra, "sarkinti" parental virüsü (VACV-COP) kontamine etme, birbirini takip eden plak
saflastirma turlari ile elimie edilmistir. Kontamine eden parental virüsün varligi, içeri
yerlestirme yerinin PCR analizi ile görüntülenmistir.
Homolog rekombinasyon - Büyüme ortami (RPMI-1640/%10 PCS/2 mM
GIutamax/Pen-Strep ve 1000 ug/mL Geneticin) içeren üç T25 balona, p-LL19-CHO
ekilmistir ve 37°C/%5 COz'de %100 konflüent olana kadar kültürlenmistir. Enfeksiyon
gününde, iki balon, 0,01 pfu/hücre olan bir moi'de VACV-COP ile enfekte edilmistir,
burada diger balon enfekte edilmemistir (enfekte edilmemis kontrol). Balon 1 ve 2 oda
sicakliginda 45 dakika boyunca enfekte edildikten sonra, virüs inokülümleri
uzaklastirilmistir ve hücrelerin tek-katmani, PBS ile iki kere yikanmistir. Yikamadan
sonra, 4 ml Idame Ortami (MM: RPMl-,
ayrica ayni yikama adimindan da geçmis balon 3'ü içeren her bir balona eklenmistir.
Transfeksiyon, Effectene Transfeksiyon reaktifi (Qiagen, Kat No 301425) kullanilarak
ve üreticinin talimatlari izlenerek yürütülmüstür. Özet olarak, 16 uL Güçlendirici. 150 uL
EC tamponu içinde lineer hale getirilmis 2 ug pLL09'a eklenmistir ve iyice
karistirildiktan sonra oda sicakliginda 5 dakika boyunca beklemeye birakilmistir. Buna,
pl Effectene Transfeksiyon reaktifi eklenmistir ve oda sicakliginda 10 dakika
boyunca beklemeye birakilmistir. Son olarak, 1 ml MM (RPMI-1640/%2 PCS/2 mM
GIutamax/Pen-Strep) karisima eklenmistir ve kibar bir sekilde iyice birbirine
karistirilmistir. Bu transfeksiyon akabinde, önceden VACV-COP ile enfekte edilmis
balon 1'e eklenmistir.
Balonlar 1 (homolog rekombinasyon), 2 (yalnizca enfeksiyon kontrol), 3 (enfekte
edilmemis kontrol), 37°C/%5 COg'de gece boyu inkübe edilmistir, burada sonraki gün
her bir balona, her bir balon için 5 mL'Iik taze MM ile bir ortam degisimi yapilmistir ve
ilaveten CPE'nin tamami yalnizca balon 1`de görülebilene kadar 37°C/%5 COz'de
inkübe edilmistir. VACV-COP CHO hücrelerine enfeksiyöz-olmadigindan balon 2'de
enfeksiyon bulgulari olmamalidir ve tek-katman balon 3'te saglikli görünmelidir.
Gece boyu enfeksiyondan sonra, kirmizi flüoresan hücreler, bir çevrik flüoresan
mikroskop ile inceleme altinda net bir sekilde ayirt edilebilir olabilir. Hücreleri kültür
ortami içine kazima, akabinde düsük hizli sentrifügasyon (oda sicakliginda 5 dakika
boyunca 500 9) ile pelet haline getirme ve hücre peletini 1 mL 10 mM Tris-HCI, pH 8,
içinde yeniden-süspanse etme ile balon 1 içindeki hücreleri hasat etmeye karar
verilmistir. Bir viral ekstrakt, çok sayida dondurma ve çözülme sikluslari ile
hazirlanmistir ve plak saflastirma fazi için hazir olarak -80°C'de saklanmistir. Viral
yapi, SCV104 olarak gösterilmistir.
Plak saf/astirma prosesi - Gerekçe, homolog rekombinasyon ekstraktini seri olarak
seyreltmektir ve her bir seyreltmeyi bir 48 gözlü plaka içinde kültürlenen p-LL19-CHO
hücrelerinin bir satirini enfekte etmek için kullanmaktir. Amaç, virüsü her bir göz için
asagiya 1 pfu enfeksiyona seyreltmektir ve akabinde hasat edilmeden önce yaklasik
olarak 30 saatlik enfeksiyondan sonra yalnizca 1 flüoresan plak içeren hücreleri
arama ktir.
p-LL19-CHO hücreleri, bir 48-gözlü plakanin her bir gözüne ekilmistir ve 37°C/%5
Glutamax/pen-strep) içinde %100,e kadar kültürlenmistir.
Enfeksiyon için, homolog rekombinasyon ekstraktinin (SCV104) buzu çözülmüstür ve
topaklari ve aggregatlari dagitip parçalamak kisa bir süre sonike edilmistir. Viral
ekstraktin 10'5'ine asagiya on-katlik seri seyreltme, 1 mL'Iik hacimlerde MM (RPMl/%2
FBS/Glutamax/PenStrep) kullanilarak gerçeklestirilmistir. Her bir seyreltme için, 48-
gözlü plakanin bir satirina, büyüme ortami her bir gözden uzaklastirildiktan sonra
seyreltilmis virüsün 500 uL'si ekilmistir ve bunlar PBS ile bir kere yikanmistir. 48-gözlü
plaka, viral adsorpsiyonun gerçeklesmesi için 45 dakika boyunca oda sicakliginda
birakilmistir. Viral adsorpsiyondan sonra, virüs inokülümü her bir gözden dikkatli bir
sekilde uzaklastirilmistir, burada rezidüel inokülüm, her bir göz için 500 uL PBS'den
olusan bir yikama adimi ile uzaklastirilmistir. Yikamadan sonra, 500 uL MM (RPMl/%2
FBS/GIutamax/PenStrep) her bir göze eklenmistir ve akabinde enfeksiyonlarin
flüoresan kirmizi odaklari bir flüoresan mikroskop altinda net bir sekilde görülebilene
kadar 37°C/C02'de inkübe edilmistir.
Hasat etmek için, yalnizca olasi en düsük seyreltmede bir tek flüoresan odak içeren
gözler seçilmistir. Seçilmis gözlerden ortam dikkatli bir sekilde uzaklastirilmistir ve 100
uL 10 mM TrisHCI, pH 8, eklenmistir. Plaka üç kere dondurulmustur çözülmüstür ve
akabinde seçilmis gözlerin içerikleri, geri-kazanilmistir. Her bir geri-kazanilmis plak için,
plak saflastirma prosesi, bes kere daha tekrar edilmistir.
Bir seçilmis klon akabinde akabinde ilaveten, büyüme ortamini gözden uzaklastirma ve
PBS içinde 500 uL'ye seyreltilmis viral ekstraktin 10 uL'sini ekleme ile, %100
konflüansta p-LL19-CHO hücreleri içeren bir ö-gözlü plakanin 1 gözünü enfekte etme
ile çogaltilmistir. Oda sicakliginda 45 dakikadan sonra, 2 mL MM göze eklenmistir ve
hücrelerin büyük çogunlugu bir flüoresan mikroskop altinda kirmizi flüoresan isik
yayana kadar 3 gün boyunca 37°C/%5 COz'de ilaveten inkübe edilmistir. Enfekte
edilmis göz içindeki hücreler, kültür ortami içine kazinmistir ve akabinde 500 9'de 5
dakika boyunca pelet haline getirilmistir. Pelet haline getirilmis hücreler, 500 uL 10 mM
TrisHCl, pH 8, içinde yeniden-süspanse edilmistir ve bir viral ekstrakt yapmak için kisa
bir süre sonike edilmistir.
SCV104'ün D13L ORF'sinin içine CP77/DsRed ekspresyon kaseti yerlestirilmesinin
PCR ile dogrulanmasi - Homolog rekombinasyondan ve plak saflastirmasindan sonra
D13L ORF'sinin gerçekten CP77/DsRed ekspresyon kaseti ile sübstüte edilip
edilmedigini belirlemek için PCR analizi yapilmistir. Bir PCR primer çifti, iki yaninda yer
alan homolog rekombinasyon kollarinin bölgesi disini baglamasi için tasarlanmistir,
böylece bunlar, "uygulanmis" DNA'dan ziyade "natif" DNA dizisini baglayacaklardir. Bu
sekilde primer çifti tasarlama, bu primer çiftinin PCR amplifikasyonu için DNA sablonlari
olarak VACV-COP'yi ve SCV104'ü kullanabilecegi ve PCR ürünlerinin boyutunun
eKSpresyon kasetinin D13L ORF'sinin içine yerlestirilmesi veya içeri yerlestirme
olmayan virüsün, yani', VACV-COP, saptanmasi için gösterge olacagi anlamina gelir.
Bu PCR analizi yalnizca içeri yerlestirmenin varligini göstermez, ayni zamanda
rezidüel kontamine etme parental virüsün (VACV-COP) çok sayida plak saflastirma
turundan sonra hala mevcut olup olmadigini da belirleyebilir. VACV-COP'nin
istenmeyen iz kontaminasyonun varligi, bu kontaminant SCV104`e in trans D13
yardimi saglayabileceginden ve böylece SCV104'ün atenüasyonunu
azaltabileceginden hiç arzu edilmez.
QIAGEN DNeasy Doku Kit/'ni' (Kat # 69504) kullanilarak DNA ekstraksi'yon/ari - Viral
DNA, üreticinin talimati izlenerek DNeasy Doku kiti kullanilarak yukarida SCV104
çogaltilmis virüsün 200 uL'sinden ekstrakte edilmistir. Özet olarak, bu 200 uL viral
ekstrakte 20 ul Proteinaz K ekleme ve iyice karistirma ile yapilmistir. Buna, 200 uL
tampon AL eklenmistir ve 56°C'de (isitma bloku) 10 dakika boyunca inkübe etmeden
önce iyice içine karistirilmistir. Inkübasyondan sonra, 200 uL %100 etanol eklenmistir
ve iyice içine karistirilmistir ve akabinde toplam hacim, bir spin kolonuna eklenmistir.
Sivi, üretici kullanici el kitabi ile talimat verildigi üzere sentrifügasyon ile spin kolondan
geçirilmistir, akabinde spin kolonu AW1 ve AW2 tamponlari ile yikanir. Spin kolona
bagli DNA, iki kere 100 uL AE tamponu ile ayristirilmistir. Ayristirilmis DNA. bir tek tüp
içine birlestirilmistir ve PCR analizi için hazirdir ve PCR analizi Için hazir olana kadar
4°C`de saklanmistir.
PCR amplifikasyonu - SCV104'ten (bakiniz, yukaridaki bölüm 4.2.3.1) ekstrakte edilmis
DNA, içeri yerlestirmenin D13L ORF'si içinde gerçeklesip gerçeklesmedigini belirlemek
amaciyla PCR amplifikasyonu için bir sablon olarak kullanilmistir. Asagida tarif edilen
PCR primerleri, D13L ORF'sinin disinda iki yaninda yer alan dizileri baglar, böylece
SCV104 DNA'sindan amplifikasyon, parental virüsten, VACV-COP'tan, çogaltilmis
2881 bp'lik bir PCR ürününün aksine 4360 bp'lik bir PCR ürününü çogaltmalidir. PCR
analizi, SCV104'ün 6. plak saflastirilmis klonlarinin yalnizca, 4000 bp'den büyük ve
5000 bp'den küçük olanlara karsilik gelen bir ürünü çogaltir, bu SCV104'ün D13L
ORF'si içinde CP77/DsRed kaseti içerdigini gösterir. 3000 bp civarinda bir PCR
ürününün olmamasi, SCV104 çogaltilmis stoklarda saptanabilen düzeylerde parental
virüs kontaminasyonu olmadigi anlamina gelir.
Primer çiftinin detaylari
SCV104'ü Plak Enfektivite Analizleri ile atenüasyon için test etme
D13L ORF'si tarafindan kodlanan protein viral birlesme için esansiyel oldugundan, bir
kili, bir SCV104 kurtarilmis virüsün hücreye girisimin vaksiniya virüsü için permisif olan
normal hücrelerde enfeksiyöz projeni viriyonlari üretmeyebilecegi ve bundan dolayi ilk
enfeksiyonun, enfeksiyonun giderek genisleyen odaklarini olusturmak Için komsu
hücrelere yayilmama yetisini bekleyecektir. Durumun bu olup olmadigini konfirme
etmek için, bu bulusta tarif edilen D13L silinmis virüs (SCV104), daha az sayida plak
olusum biriminin bir 6-gözlü plaka içinde kültürlenmis hücreleri enfekte etmek için
kullanilabilecegi bir noktaya kadar seri olarak seyreltilmistir, böylece enfekte eden
virüsün hücreden hücreye yayilmasi, günler süren bir periyot boyunca görüntülenebilir.
Bu çalismada, üç hücre hatti çalisilmistir: vaksiniya virüsüne permisif olan 1438
hücresi, vaksiniya virüsüne permisif olmayan, ancak vaksiniya virüsü CP77 proteinini
eksprese ettiginde permisif olabilen CHO hücreleri ve D13L proteinini eksprese eden
bir rekombinant hücre hatti olan p-LL19-CHO. Bu bulusta tarif edilen, D13L ORF'si
içine yerlestirilmis bir CP77/DsRed ekspresyon kasetine sahip olan, böylece D13-
proteini fonksiyonunun eksprese edilemedigi, virüs p-LL19-CHO hücre hattinda
enfeksiyonun yalnizca enfeksiyöz odaklarini olusturmalidir. 1438 hücresi tek-katmani
içinde enfeksiyonlarin odaklarinin varligi, kontaminant in trans D13L yardimi
saglayacagindan, viral popülasyon karisimi içinde kontamine etme vaksiniya virüsünün
varligini gösterir. CHO tek-katmani içinde enfeksiyonlarin odaklarinin varligi,
CP77/DsRed kasetinin içeri yerlestirilmesinin D13L ORF'sini inaktive etmedigi
anlamina gelir.
Hücre düzenegi - 1438, CHO ve p-LL19-CHO hücreleri 6 gözlü plakalara ekilmisti ve
hücre tek-katmanlari %100 konflüent olana kadar 37°C/%5 COz'de büyüme ortami
ug/mL Geneticin) içinde kültürlenmistir.
Enfeksiyon - Çogaltilmis 3. plak saflastirilmis viral ekstrakt, hücreleri enfekte etmek için
kullanilmistir. Bu virüsün bilinmeyen titresinden dolayi, stok virüsün 10'4'e 10-katlik seri
seyreltilmesi asagidaki sekilde yapilmistir: ilk olarak 60 ul stok virüs, 6 ml MM ortami
içinde seyreltilmistir (Seyreltme 1, 1:100 seyreltme) ve akabinde ilave seyreltmeler 800
ul Seyreltme 1 ila 7,2 ml MM ortamina ekleme ile hazirlanmistir (Seyreltme 2; 10'3
seyreltme) ve akabinde bir 10'4'Iük seyreltme yapmak için tekrar edilmistir. Enfeksiyon
için, her bir seyreltmenin 500 uL'si, bir 6-gözlü plakanin her bir gözüne eklenmistir - her
bir hücre hatti için bir plaka kullanilmistir. Viral adsorpsiyon, oda sicakliginda 45 dakika
boyunca gerçeklestirilmistir, bundan sonra viral inokülüm her bir gözden
uzaklastirilmistir ve her bir göz, her bir göze 2 mL MM eklenmeden önce PBS ile iyice
yikanmistir. Plakalar 37°C/%5 COz'de inkübe edilmistir ve bir flüoresan mikroskop
altinda günlük olarak gözlenmektedir. 10'2'Iik seyreltme, gözlem için en iyi viral
enfeksiyon hizini üretmistir.
Mikroskop incelemesi - Viral enfeksiyon, DsRed filtre (Kat#U-MRFPHQ, Olympus) ile
flüoresan mikroskop (Olympus IX51) altinda incelenmistir. Görüntü, CellSens Digital
Sonuçlar - 10'2'Iik seyreltme enfeksiyonu, baslangiç tek hücre enfeksiyonunu ve
enfeksiyonun komsu hücrelere yayilmasini gözlemlemek için en iyi sonuçlari üretmistir.
1438 hücresinin incelenmesi, gün 1'de tek hücre enfeksiyonlarinin varligini gösterir,
burada virüs gün 2 ve gün 3 ile komsu hücrelere yayilamaz, bu virüsün tek hücrelere
girisimin gerçeklestigini, ancak enfeksiyöz viral projeninin gün 2 ve gün 3 ile
üretilmedigini gösterir. Bu ayni zamanda, CHO tek enfekte edilmis hücreleri için de
dogrudur, yani, enfeksiyöz viral projeni baslangiç tek hücre enfeksiyonlarindan
üretilmistir.
p-LL19-CHO hücre hattinin incelenmesi, baslangiç tek hücre enfeksiyonunun gün 1 ile
enfeksiyonun küçük odaklari kadar görülen projeni enfeksiyöz virüsü üretmistir.
Enfeksiyonlarin bu Odaklari gün 2 ve gün 3 ile boylari çabucak artar, bu viral
amplifikasyonun zamanla gerçeklestigini gösterir.
Bu dogrultuda, herhangi bir vaksiniya virüsünden bir fonksiyonel vaksiniya yarim ay
iskele proteini kodlayan dizinin uzaklastirilmasi bu virüsü fazla bir sekilde atenüe
edecektir. Bu virüsün ilk enfeksiyon üzerinde enfeksiyöz projeni virüsü üretememesine
ragmen, bunun proteininin, özellikle DsRed'in, ekspresyonu, görsel görüs kirmizi
flüoresanstan bulgulandigi üzere, ilk tek enfekte edilmis hücrelerde gerçeklesir. Bu
virüs, vaksiniya virüsü enfeksiyonundan bagimsiz olarak vaksiniya yarim ay iskele
proteinini eksprese eden bir hücre hattindan kurtarilabilir. Transgenik hücre hatti
tarafindan vaksiniya yarim ay iskele proteininin konstitütif ekspresyonu, bu hücre
hattinin büyümesi veya fizyoloji Üzerinde advers etkiye sahip degildir.
D13L eksprese eden C11-LL19-HeLa hücre hattinin yapilmasi
Bir D13L silinmesi olan bir flüoresan-olmaya SCV'yi titre etmek için, litik plak
olusumunu destekleyen bir vaksiniya permisif hücre hattindan olusan, D13 proteinini
eksprese eden bir kurtarma hücre hatti yapilmistir. CHO hücrelerinde, CP77 eksprese
eden vaksiniya virüsü veya CP77'nin hücre hatti ekspresyonu kristal viyolet ile
boyanabilen ve göz ile sayilabilen litik plak olusumlarini desteklemez. Bir titrasyon
hücre hatti olusturmak için, HeLa hücreleri, D13 proteini eksprese etmesi için bir
konstitütif memeli promotöründen, baslangiç kodonu etrafinda Kozak dizisi içeren ve
bir poliadenilasyon sinyal dizisi içinde sonlanan D13-pr0teini kodlama dizisinden olusan
bir ekspresyon kasetinin kararli entegrasyonu ile aktarilmistir. Bu kaset akabinde,
konak hücre genomik DNA'si içine karar gen transferine ve antibiyotik seleksiyonu ile
basarili entegrasyon için seleksiyona olanak saglayan bir plazmid vektörü içine
klonlanmistir. Aktarilmis hücreler akabinde, D13 ekspresyon kaseti içeren hücreleri
seçmek için antibiyotik seleksiyonu kullanilmasi ile çogaltilmistir ve akabinde hücrelerin
tek-katmanlarini her bir hücre için 0,001 pfu olan bir moi'de enfekte etme ve 3 günlük
bir periyot boyunca en büyük plagi üreten hücre-hatti klonunu seçme ile SCV104
(D13L ORF silinmesi) ile bir plak analizi yapilmistir. SCV104 sahip oldugu D13L
ORF'sini iki ekspresyon kaseti ile degistirir: biri CP77 proteininin ekspresyonu içindir ve
digeri bir kirmizi flüoresan proteininin ekspresyonu içindir. D13 proteini eksprese eden
bir HeLa hücre hattinin SCV104 ile enfeksiyonu, kirmizi flüoresan Iitik plaklar ile
sonuçlanacaktir.
pLL19 - D13 hücre aktarma vektörÜnÜn yapi/masi.' pLL19'un yapilmasi asagida tarif
edilir. Bu plazmidde, C-ucu Bayrak-etiketli D13-proteini kodlama dizisi, konstitütif insan
Elongasyon Faktörü 1 alfa promotörü kontrolü altindadir ve hücresel genomik DNA
içine kararli gen transferine transpozisyon ile aracilik edilir. Transpozisyon ayrica, bir
Neomisin antibiyotigi seleksiyon ekspresyon kasetini de içeri yerlestirir, böylece
aktarilmis hücreler büyüme ortamina G418/Geneticin eklenmesi ile pozitif bir sekilde
seçilebilir.
D13-Bayrak etiketli ekspresyon kasetinin pLL19 ile transdüksiyon ile HeLa
hücreleri içine kararli yerlestirilmesi: HeLa hücreleri, bir T25 balon içine ekilmistir ve
RPMl-1640/%1O FBS/2 mM GIutamax/pen-strep büyüme ortami içinde yaklasik olarak
transfeksiyon reaktifi kullanilarak, 1 ug pLL19, üreticinin talimatlari izlenerek %50
konflüent HeLa hücrelerinin T25 balonuna transfekte edilmistir. Transfekte edilmis
hücreler akabinde büyüme ortami (RPMI
içinde gece boyu inkübe edilmistir. Sonraki gün, ortam aktarilmis hücreleri seçmek için
1000 ug/mL Geneticin içeren taze büyüme ortami ile degistirilmistir. Hücrelerin çogu
öldügünde, kalan hücreler, bunlarin TrypLE Select (Gibco-Invitrogen Corp, Kat #12563-
029) ile balon yüzeyinden ayirma ile geri-kazanilmistir ve tek hücre büyüme ortami ve
1000 ug/mL Geneticin içeren 96-gözlü plakalar içinde ayrilmistir. Bu plakalar,
hücrelerin kolonileri her bir göz içinde görülebilene kadar 37°C/%5 COg'de inkübe
edilmistir. Seleksiyon ortami, her 2 ila 3 günde bir degistirilmistir. Hücrelerin her bir
kolonisi, geri-kazanilmistir ve asagidakine kültürleme ile seri olarak genisletilmistir: 48-
gözlü plaka ila 24-gözlü plaka ila ö-gözlü plaka ila T75 balon ve bir dondurulmus hücre
stoku yapmak için hazir olana kadar 1:5'Iik ayirma orani ile T75 balon içinde idame
ettirilmistir.
SCV104 plak olusumunu en iyi destekleyen bir monoklonal hücre hatti için
tarama: SCV104, inek çiçek virüsü 025L promotörü arti CP77 proteinini kodlayan ORF
ile degistirilmis D13L ORF'sine ve bir kirmizi flüoresan protein ekspresyon kasetine
(DsRed Express2) sahip olan bir vaksiniya virüsüdür. CP77 ekspresyonu, HeLa
hücrelerinde plak olusumu için önemli degildir veya gerekli degildir, ancak bu virüs D13
proteininin hücre hatti ekspresyonu yoklugunda çogaltilmayacaktir. Bununla birlikte,
D13-proteinini eksprese eden HeLa hücre hattinda, SCV104 çogalabilmelidir ve diger
komsu hücrelere yayilabilmelidir ve bunu yaparken hücre tek-katmani içinde kirmizi
flüoresan Iitik plaklar olusturmalidir. Bu virüs, plak olusumunu en iyi destekleyen klonu
seçmek için klonal LL19-HeLa hücre hattinda bir plak olusum çalismasinda
kullanilmistir.
Hücre hatti düzenegi: LL19-HeLa'nin çok sayida hücre hatti klonu 6 gözlü plakalarin
gözleri içine ekilmistir ve 37°C/%5 COz'de 1000 ug/mL Geneticin içeren büyüme ortami
içine %100 konflüansa kadar kültürlenmistir.
Virüs enfeksiyonu: SCV104, virüsü MM (RPMI-1640/%2 FBS/2 mM GIutamax/pen-
strep) içinde 103 pfu/ml'ye seyreltme ile her bir hücre için 0,001 pfu`da hücreleri enfekte
etmek için kullanilmistir. 1 ml seyreltilmis virüs enfeksiyon için her bir göze eklenmistir.
Bir 6-gözlü plakanin her bir gözü konflüent oldugunda yaklasik olarak 1x106 hücre
moi, tek enfekte edilmis hücrelerden plak olusumlarini garanti edecektir. Tüm plakalar
oda sicakliginda 1 saat boyunca inkübe edilmistir, böylece virüs hücreleri adsorbe
edebilir ve bundan sonra 1 mL MM her bir göze eklenmistir ve tüm plakalar akabinde
37°C/%5 COzde inkübe edilmistir böylece hücrelere senkronize viral girisi tesvik
edilmistir, akabinde zamanla hücreden hücreye yayilma ile sonuçlanan viral
amplifikasyon gerçeklesmistir. Kirmizi flüoresan plak olusumu, bir flüoresan mikroskop
altinda günlük olarak gözlenmistir.
Mikroskop incelemesi: Üç günlük bir periyot boyunca viral enfeksiyon ve plak
olusumu DsRed filtre (Kat# U-MRFPHQ, Olympus) ile flüoresan mikroskop (Olympus
kullanilarak çekilmistir.
Bulgular: Enfeksiyondan sonraki gün 1'de, tüm enfeksiyonlar, kirmizi flüoresansli
sporadik küçük odaklar ile sonuçlanmistir. Gün 3 ile, tüm klonal hücre hatlari, büyükçe
kirmizi flüoresan Iitik plak üretmistir, burada klon 11 (C11), test edilen tüm klonlarin
anlamli olarak en büyük plak boyutlarini üretmistir.
Sonuçlar: Bu bulgular, C11 klonunun (C11-LL19-HeLa), bir SCV104 enfeksiyonundan
test edilen tüm klonlarin en büyük plak olusumunu desteklemek için yeterli D13 proteini
eksprese ettigini gösterir. Bu hücre hatti klonu (C11), vaksiniya virüsünü titre etmek için
yaygin bir sekilde kullanilan titrasyonun Iitik plak sayma yöntemi kullanilarak bir D13L
silinmis vaksiniya virüsünü kantifiye etmek için mükemmeldir.
CP77 ve D13L eksprese eden p-LL07-LL29-CHO hücre hattinin yapilmasi
CHO hücreleri içinde bir D13L ORF'si silinmesi olan bir VACV-COP virüsünü kurtarmak
için, D13 ve CP77 proteinlerini eksprese eden bir CHO hücre hattinin yapilmasi
gerekecektir. Bu, ekspresycnu yönlendirmek için bir memeli promotöründen, D13 ve
CD?? proteinlerini kodlayan bir CHO tercihli kodon optimize edilmis DNA dizilemesinin
akabinde bir poliadenilasyon sinyal dizisinden olusan bir D13 memeli ekspresyon
kasetini ve CP77 memeli ekspresyon kasetini yapma ile yapilmistir. Bu kasetler burada
akabinde konak hücre genomik DNA'sina kararli gen transferine ve antibiyotik
seleksiyonu ile basarili entegrasyon için seleksiyona olanak saglayan plazmid
vektörlerine klonlanmistir. Aktarilmis hücreler akabinde, hem D13 hem de CP77
ekspresyon kasetlerini içeren hücreleri seçmek için antibiyotik seleksiyonu kullanilmasi
ile çogaltilmistir. CP77'nin ekspresyonunu dogrulamak için, Güçlendirilmis Yesil
Flüoresan protein eksprese eden bir vaksiniya virüsü (SCV505) transgenik hücre
hattini enfekte etmek için kullanilmistir. burada flüoresan plak gelisimi 4 günlük bir
periyot boyunca izlenmistir. 4 günlük periyot boyunca giderek genisleyen yesil
flüoresan plak boyutu, hücre hatti tarafindan CP77 ekspresyonunu konfirme etmistir.
D13 proteininin ekspresyonunu dogrulamak için, CP77 (SCV104) ve DsRed flüoresan
proteini eksprese eden bir D13L silinmis vaksiniya virüsü transgenik hücre hattini
enfekte etmek için kullanilmistir, burada plak gelisimi 4 günlük bir periyot boyunca
izlenmistir. 4 günlük periyot boyunca giderek genisleyen kirmizi flüoresan plak boyutu,
hücre hatti tarafindan D13 proteini ekspresyonunu konfirme etmistir.
pLL07 - CP77 gen transfer plazmidinin yapilmasi
CP77 proteini kodlama dizisinin yapi/masi.' CP77 protein kodlama dizisi, inek çiçek
virüsü Brighton Red susu UhiProtKB/Swiss-Prot: P12932.1'in O25L ORF'si tarafindan
kodlanan CP77'nin amino asit dizisinden DNA dizisini geri-olusturma (geri translasyon
veya ters translasyon) ile GeneArt GmbH (Almanya) tarafindan sentetik olarak
yapilmistir ve Çin Hamsteri Over (CHO) hücrelerinde ekspresyon için kodon optimize
edilmistir.
CP77 hücre aktarma vektörünün yapilmasi: pPH51'den (kodon optimize edilmis
CP77 protein kodlama dizisi barindiran bir klonlama plazmidinden) kodon optimize
edilmis CP77 protein kodlama dizisi, PCR primer çifti kullanilarak PCR ile çogaltilmistir,
burada 5' primer, baslangiç kodonu etrafina bir Kozak dizisi eklemek için tasarlanmistir
ve 3' primer, durdurma kodonundan önce Bayrak-etiket dizisi eklemek için
tasarlanmistir. Çogaltilmis PCR ürünü DNA firmasindan satin alinan
transpozon piggybac vektörü pJ içine Bsal klonlama yeri vasitasiyla alt-
klonlanmistir. Bsal içine klonlama etkili bir sekilde, pLLO7 olusturmak için kometGPF
kodlama dizisini CP77 proteini kodlama dizisi ile degistirir. CP77 simdi, insan konstitütif
Elongasyon Faktörü 1 alfa promotörü (EF1 a) kontrolü altinda olan bir hale gelir ve her
ikisi transfekte edilmis hücrelerin genomu içine kararli bir sekilde entegre edildiginde,
higromisin direnç geni ile birlikte-eksprese edilir. Konak genomu Içine kararli
entegrasyona, piggyBac vektörünün Sol ve Sag Transpozon siniri ile baglanmis DNA
dizisinin Transpozon entegrasyonu ile aracilik edilir.
pPH51 plazmid DNA'sindan CP77-CHO genini PCR ile çogaltmak için kullanilan
PCR primer çifti:
Ileri Primer dizisi:
(SEQ ID NO: 4)
Geri Primer dizisi:
CAGGAAGACGCTTTTtcaCTTGTCATCGTCATCCTTGTAATCCTGCTGCTCGAAG
ATCTTGTACT (SEQ ID NO: 5). Durdurma kodonundan (küçük harf) sonra gelen
Bayrak Etiket dizisinin alti çizilidir.
pLL29 - D13 gen transfer plazmidinin yapilmasi
CHO-kodon optimize edilmis D13 proteini kodlama dizisi, DNA2.0 lnc (Kat # pJ503-2)
firmasindan satin alinan pJ503-02 (KometGFP ve Ne0+ tasiyan pHULK piggyBac
Memeli Ekspresyon Vektörü) içine Bsa l klonama yerleri vasitasiyla klonlamadan önce
C-ucu Bayrak-etiket dizisini HA-etiket dizisi ile degistirmek için (önceden tarif edildigi
Üzere) pLL19'dan PCR ile çogaltilmistir.
D13L-HA hücre aktarma vektörünün yapilmasi: pLL19'dan C-ucu Bayrak-etiket
dizisi içermeyen kodon optimize edilmis D13-protein kodlama dizisi PCR ile
çogaltilmistir ve pLL29 üretmek için DNA2.0 Inc (Kat # pJ503-2) firmasindan satin
alinan transpozon piggyBac vektörü pJ503-2 (KometGFP ve Neo+ tasiyan pHULK
piggyBac Memeli Ekspresyon Vektörü) içine Bsa l klonlama yerleri vasitasiyla alt-
klonlanmistir. ln-Fusion klonlama (Clontech: Iigazsiz klonlama) ile Bsal yerleri arasina
klonlama, kometGPF kodlama dizisini çikarir ve bunu in vitro homolog rekombinasyon
ile yeni HA-etiketli D13-protein kodlama dizisi ile degistirir. D13LchoHA-Etiketli protein
kodlama dizisi simdi, insan Elongasyon Faktörü 1 alfa promotörü (EF'la) kontrolü
altindadir ve her ikisi transfekte edilmis hücrelerin genomuna kararli bir sekilde entegre
edildiginde, Neomisin direnç geni ile birlikte-eksprese edilecektir. Konak genomu içine
kararli entegrasyona, piggyBac vektörünün Sol ve Sag Transpozon siniri ile baglanmis
DNA dizisinin Transpozon entegrasyonu ile aracilik edilir. pLL29'un bir plazmid haritasi
asagida gösterilir.
D13Lcho-HA etiketli dizinin PCR amplifikasyonu asagidaki primer çifti
kullanilarak yapilmistir:
Ileri Primer dizisi:
Geri Primer dizisi:
SÜFaI'i'HXAI”iil'l'i(_"1".'î`ri .str (kilit?sili'T't11'ir'iât'fi`l'i"”HUT (Ji"`til-I(iTT-\l`l`(}(`l`t"
Alti çizili metindeki dizi, HA kodlama dizisini temsil eder. "tta", durdurma kodonunu
temsil eder.
CP77-Bayrak etiketli ve D13-HA etiketli ekspresyon kasetlerinin pLL07 ve pLL29 ile es-
zamanli transdüksiyon ile CHO hücreleri içine kararli ikili yerlestirilmesi
CHO hücreleri, bir T25 balonuna ekilmistir, RPMI-1640/%10 FBS/2 mM GIutamax/pen-
strep büyüme ortami içinde yaklasik olarak %50 konflüansa kadar kültürlenmistir.
Qiagen firmasindan (Kat # 301425) Effectene transfeksiyon reaktifi kullanilarak, 1 ug
pLL07 ve 1 ug pLL29, üreticinin talimatlari izlenerek %50 konflüent CHO hücrelerinin
T25 balonuna transfekte edilmistir. Transfekte edilmis hücreler akabinde, büyüme
ortami (RPMI içinde gece boyu inkübe
edilmistir. Sonraki gün, ortam aktarilmis hücreleri seçmek için 500 ug/mL Geneticin ve
250 ug/mL Higromisin B içeren büyüme ortami ile degistirilmistir. Seleksiyon ortami,
hücrelerin çogu ölene kadar her 2 ila 3 günde bir degistirilmistir ve tek hücrelerden
türetilmis olan hücrelerin kalan kolonilerini ayrilmistir. Aktarilmis hücreler %90 ila 100
konflüansa kadar büyüdügünde, bunlar TrypLE Select (Gibco-Invitrogen Corp, Kat
balon içine ekilmistir. Bu yeni poliklonal hücre hatti, p-LLOY-LL29-CHO olarak
gösterilmistir.
Vaksiniya virüsünü ve D13L ORF'si silinmis vaksiniya virüsünü kurtarma ile D13
ve CP77 ekspresyonunun dogrulanmasi
SCV eksprese eden ve yalnizca
CP77 proteini varliginda CHO hücrelerinde çogalan bir vaksiniya virüsüdür. Bu virüs,
bu hücre hatti tarafindan CP77 ekspresyonunu dogrulamak için p-LL07-LL29-CHO'da
bir plak enfektivite çalismasinda kullanilmistir. SCV104, inek çiçek virüsü 025L
promotörü arti CP77 proteinini kodlayan ORF ile degistirilmis D13L ORF'sine ve bir
kirmizi flüoresan protein ekspresyon kasetine (DsRed Express2) sahip olan bir
vaksiniya virüsüdür. Bu virüs, D13 proteininin hücre hatti ekspresyonu yoklugunda
çogalmayacaktir. Bu virüs, bu hücre hatti tarafindan D13 ekspresyonunu dogrulamak
için p-LLO7-LL29-CHO'da bir plak enfektivite çalismasinda kullanilmistir.
p-LL07-LL29-CHO hücre hatti plak-enfektivite çalismasi
Bu çalismada, SCV
tarafindan enfeksiyondan p-LL07-LL29-CHO tarafindan D13 ve CP77 ekspresyonunu
kalifiye etmeye yardimci olmak için çesitli hücre hatlari kullanilmistir. Asagidaki hücre
hatlarinda beklenen sonuçlari asagidaki sekildedir:
Vero: Bu hücre hatti normal olarak vaksiniya virüsü enfeksiyonuna permisiftir. Bu virüs
normal olarak bu hücre hattinda enfeksiyöz oldugundan, SCV505 enfeksiyonu için
YESIL flüoresans ile saptandigi üzere çogaltilmis virüsün zamanla hücreden hücreye
yayilmasini gösteren plak olusumu. Bununla birlikte, hücre hatti veya virüs tarafindan
D13 proteini ekspresyonu olmadigindan çogaltilmis virüsün zamanla hücreden hücreye
yayiliminin olmadigini gösteren, SCV104 enfeksiyonu için KIRMIZI flüoresans
olmamasi veya yalnizca bununla saptandigi üzere plak olusumu olmadigi görülmelidir.
C11-LL19-HeLa: Bu, pLL19 transdüksiyonu vasitasiyla D13 proteinini eksprese eden
bir vaksiniya virüsü permisif hücre hattidir. D13'ün hücre hatti ekspresyonuna
bakilmaksizin YESIL flüoresans ile saptandigi üzere çogaltilmis virüsün zamanla
hücreden hücreye yayilmasini gösteren SCV505 enfeksiyonundan plak olusumu
beklenir. Bu virüs simdi D13 proteininin hücre hatti ekspresyonundan dolayi bu hücre
hattinda çogalabildiginden, SCV104 enfeksiyonundan plak olusumu beklenir.
CHO: Bu hücre hatti vaksiniya virüsü enfeksiyonuna permisif-degildir. KIRMIZI veya
YESIL flüoresans olmamasi veya yalnizca tek hücre KIRMIZI veya YESIL flüoresans
ile saptandigi üzere SCV505 ve SCV104 enfeksiyonlarindan plak olusumu
görülmemesi beklenir. Bu, bu virüsün CP77 eksprese edebilmesine ve SCV505'i
kurtarmasi gereken hücre hatti tarafindan CP77 proteini ekspresyonu yokluguna
ragmen, SCV104'ü kurtarmasi gereken hücre hatti tarafindan D13 proteini
ekspresyonu yoklugundan dolayi çogaltilmis virüsün zamanla hücreden hücreye
yayilmasinin olmadigini gösterir.
p-LL07-LL29-CHO: Bu, hem D13 hem de CP77 proteinlerini eksprese eden bir CHO
hücre hattidir. YESIL flüoresans ile saptandigi üzere çogaltilmis virüsün zamanla
hücreden hücreye yayilmasinin CP77 proteininin hücre hatti ekspresyonunu
gösterdigini gösteren SCV505'ten plak olusumu beklenir. KIRMIZI flüoresans ile
saptandigi üzere çogaltilmis virüsün zamanla hücreden hücreye yayilmasinin D13
proteininin hücre hatti ekspresyonunu gösterdigini gösteren SCV104'ten plak olusumu
beklenir.
Hücre hatti düzenekleri: Vero, CHO, C11-LL19-HeLa ve p-LLO7-LL29-CHO hücre
hatlari, çok sayida 6 gözlü plakanin iki setine ekilmistir (SCV505 enfeksiyonu için biri
ve SCV104 enfeksiyonu için digeri) ve 37°C/%5 COz'de %100 konflüansa kadar
(asagida oldugu üzere) karsilik gelen büyüme ortami içinde kültürlenmistir:
. Vero, CHO: RPMl-1640/%10 FBS/2 mM Glutamax/pen-strep
ug/mL Geneticin
ug/mL Geneticin ve 250 ug/ml Higromisin B
GIutamax/pen-strep) içinde 103 pfu/ml'ye seyreltme ile her bir hücre için 0,001 pfu'da
hücreleri enfekte etmek için kullanilmistir. 1 ml seyreltilmis virüs enfeksiyon için her bir
göze eklenmistir. Bir 6-gözlü plakanin her bir gözü konflüent oldugunda yaklasik olarak
0,001 olan bir moi, tek enfekte edilmis hücrelerden plak olusumlarini garanti edecektir.
Tüm plakalar oda sicakliginda 1 saat boyunca inkübe edilmistir. böylece virüs hücreleri
adsorbe edebilir ve bundan sonra 1 mL MM her bir göze eklenmistir ve tüm plakalar
akabinde 37°C/%5 COzide inkübe edilmistir böylece hücrelere senkronize viral girisi
tesvik edilmistir, akabinde zamanla hücreden hücreye yayilma ile sonuçlanan viral
amplifikasyon gerçeklesmistir. Flüoresan plak olusumu, bir flüoresan mikroskop altinda
günlük olarak gözlenmistir.
Mikroskop incelemesi: Dört günlük bir periyot boyunca viral enfeksiyon ve plak
olusumu SCV ve SCV505 için
GFP filtre (Kat# U-MGFPHQ, Olympus) ile flüoresan mikroskop (Olympus IX51) altinda
incelenmistir. Görüntü, CeIISens Digital Imaging Software (Olympus) kullanilarak
çekilmistir.
Bulgular:
enfeksiyondan sonra gün 1'de, her iki virüsün hücrelerin içine girdigini, ancak
enfeksiyonu komsu hücrelere yaymak için henüz çogalmadigini gösteren yalnizca
sporadik tek hücre flüoresansi görülebilir. Bununla birlikte, bu enfeksiyondan sonraki
gün 2 ila gün 4 arasinda ayni ilerlemede kalmistir, yani, yalnizca tek hücre
enfeksiyonlari görülmüstür ve zamanla komsu hücrelere viral yayilma yoktur.
ile enfeksiyon beklenildigi sekildedir, tümünün tüm plaklarin gün 4 ile hücre tek-
katmanlarinin bir konflüent enfeksiyonuna birlestigi bir noktaya kadar boyunun arttigi
minik plaklar enfeksiyondan sonraki gün 1'de olusmustur. Bu, gün 1'den baslayarak
çogalan virüsün enfeksiyondan sonraki gün 4 ile tamliliga kadar enfeksiyonu yaydigini
gösterir. Bununla birlikte, bu SCV104 enfeksiyonundan tamamen farklidir.
Enfeksiyondan sonraki gün 1'de, sonraki 3 gün boyunca ayni kalan yalnizca sporadik
tek hücre flüoresansi görülebilir. Bu, virüs D13L ORF'sinden yoksun oldugundan ve
viral genom replikasyonunan sonra viral birlesmeyi baslatamayacagindan ve ayrica bu
hücre hatti viral amplifikasyonu kurtarmaya yardimci olmak için D13 proteinini eksprese
etmediginden, SCV104'ün bu hücre hattinda artamadigini ve çogalamadigini
göstermistir.
C11-LL19-HeLa hücrelerinin (D13 proteini eksprese eden HeLa hücre hattinin)
sekildedir, tüm plaklarin gün 4 ile hücre tek-katmanlarinin bir konflüent enfeksiyonuna
birlestigi bir noktaya kadar boyu artan küçük plaklar enfeksiyondan sonraki gün 1'de
olusmustur. Bu, gün 1'den baslayarak çogalan virüsün enfeksiyondan sonraki gün 4 ile
tamliliga kadar enfeksiyonu yaydigini gösterir. SCV104 ile enfeksiyon da, bu hücre
hatti tarafindan üretilen D13 proteininin SCV104'teki D13L ORF'si yoklugu için
kompleman (tamamlayici) oldugunu gösteren ayni sonuçlari üretir ve bu hücre hatti
tarafindan üretilen miktar, bir aynen D13L ORF'sine sahip olan SCV505 ile
karsilastirilabilir viral amplifikasyonu ve enfeksiyon yayilmasini desteklemek için
yeterlidir.
p-LL07-LL29-CHO hücrelerinin (D13 ve CP77 proteinleri eksprese eden CHO
hem de SCV505 için, enfeksiyondan sonraki gün 1'de minik enfeksiyon Odaklari
gözlemlenmistir. Sonraki 3 gün boyunca, bu enfeksiyon Odaklari, enfeksiyondan
sonraki gün 4 ile nihayetinde konflüent enfeksiyonlara birlesen giderek artan bir sekilde
daha büyük plaklara genislemistir. Bu, CP77'nin SCV505 amplifikasyonunu ve
propagasyonunu destekledigini eksprese edilmekte oldugunu ve D13 proteinin ayrica
SCV104 amplifikasyonunu ve propagasyonunu destekledigini eksprese edilmekte
oldugu göstermistir.
Sonuç: Bu bulgular, CP77 ve D13 proteini eksprese eden bir CHO hücre hattinin bir
D13L silinmis vaksiniya virüsünün üretilmesi ve imal edilmesi için hücre substrati olarak
kullanilabilecegini gösterir. Normal permisif hücrelerin enfeksiyonu sirasinda, bir D13L
silinmis virüs, viral birlesmeyi baslatamayabilecektir ve bundan dolayi bunun
enfeksiyöz yasam siklusunu tamamlayamayacaktir, böylece bu durum bunu güvenlik
açisindan insan ve hayvan asilamalari için bir mükemmel viral asi aktarim vektörü
yapacaktir. Bununla birlikte, bu hayli atenüe edilmis vaksiniya vektörü. bu hücre hatti
CHO konak-aralik proteinini (CP77) ve eksik birlesme proteinini (D13-proteinini)
eksprese ettiginde, biyoteknoloji dostu CHO hücre hattinda imal edilebilir.
Western blotlama ile p-LLO7-LL29-CHO hücre hattinin 013 ve CP77 proteini
ekspresyon analizi
Alt-yapi bilgi
p-LL07-LL29-CHO tarafindan eksprese edilen D13 ve CP77 proteinleri, etiketlenir ve
D13 ve CP77' proteininin C-ucu uçlarindaki amino asit etiket dizisini spesifik olarak
taniyan bir antikor kullanilarak saptanabilir. D13 ve CP77 proteinlerini spesifik olarak
taniyan antikorlarin yoklugunda. western-blot analizi, p-LL07-LL29-CHO hücre hattinda
D13 ve CP77 proteinlerinin ekspresyonunu konfirme etmek için bu anti-etiket antikorlari
kullanilarak yürütülebilir. D13 proteininin C-ucu ucu, "YPYDVPDYA" HA-etiket amino
amino asit dizisini içerir.
Western-blot analizi metodolojisi
Asagidaki hücre hatlari, T75 balonlari içine ekilmistir ve uygun seleksiyon antikorlari
içeren büyüme ortami (RPMI içinde %100
konflüansa kadar kültürlenmistir: Seleksiyon antibiyotikleri olmadan CHO, 500 ug/mL
katmani ayrilmistir ve 37°C'de 10 dakika boyunca TrypLE Select ile tek hücre
süspansiyona parçalanmistir. Her bir balondan hücreler, geri-kazanilmistir ve 300 9'de
dakika boyunca sentrifügasyon ile pelet haline getirilmistir ve PBS ile iki kere
yikanmistir. Nihai yikamadan sonra, hücre peletleri 500 uL PBS içinde yeniden-
süspanse edilmistir. 4X SDS-PAGE yükleme tamponu, 1X olan bir nihai konsantrasyonu
vermesi için protein ekstraktina eklenmistir ve 98°C'de 2 ila 3 dakika boyunca
isitilmistir. Denatüre edilmis protein örneklerine bir Biorad Mini-PROTEAN® TGX Stain-
FreeT'V' Precast Gel (gradyan jel) yoluyla 200 V'de 30 ila 45 dakika boyunca
elektroforez uygulanmistir. Elektroforezden sonra, ayrilmis proteinler 100 V'de 1 saat
boyunca elektro-blotlama ile nitroselüloz membrana transfer edilmistir.
Protein saptamasi için, nitroselüloz membran, spesifik-olmayan antikor baglama
yerlerini bloke etmek için PBS içinde %5'Iik yagsiz süt tozu içinde oda sicakliginda 1
saat boyunca inkübe edilmistir. HA etiketli proteinlerin saptanmasi için, membran bloke
etme tamponu içinde konjuge edilmis Anti-HA HRP'nin (Abcam Kat# AB1265)
1:1000'Iik bir seyreltmesi içinde gece boyu 4°C`de inkübe edilmistir. Bayrak-etiketli
proteinlerin saptanmasi için, bir ayri elektro-blotlanmis nitroselüloz membran, bloke
etme tamponu içinde konjuge edilmis Anti-Bayrak HRP'nin (Abeam Kat# AB49763)
1:1000'Iik bir seyreltmesi içinde gece boyu 4°C'de inkübe edilmistir. Membranlar
akabinde PBS ile üç kere yikanmistir, her bir yikama 5 dakika sürmüstür ve akabinde
bir BioRad XRS jel doc sistemi kullanilarak görüntü almadan önce bir kaç dakika
boyunca ECL substrati (Thermo Scientific Pierce ECL Western-blot substrati, Kat No
32106) içinde inkübe edilmistir.
Sonuçlar
HA-etiketi saptanmasi vasitasiyla D13 proteininin saptanmasi: anti-HA-etiketi
antikoru, p-LLO7-LL29-CHO'dan hazirlanan bir tam hücre proteini ekstraktindan
beklenen boyuttaki bir proteini saptayabilmistir, ancak CHO hücrelerin hazirlanan bir
tam hücre proteini ekstraktindan proteini saptayamamistir. Bu, p-LLO7-LL29-CHO'nun
D13 proteinini eksprese etmekte oldugunu açik bir sekilde göstermistir.
Bayrak-Etiketi vasitasiyla CP77 proteininin saptanmasi: anti-Bayrak-etiketi
antikoru, p-LL07-LL29-CHO'dan ve p-LL07-CHO'dan (yalnizca CP77 eksprese eden
CHO hücre hattindan) hazirlanan bir tam hücre proteini ekstraktindan beklenen
boyuttaki bir proteini saptayabilmistir, ancak CHO hücrelerin hazirlanan bir tam hücre
proteini ekstraktindan proteini saptayamamistir. Bu, p-LLO7-LL29-CHO'nun ve p-LL07-
CHO'nun CP77 proteinini eksprese etmekte oldugunu açik bir sekilde göstermistir.
Bayrak-etiketi saptanmasi vasitasiyla D13 proteininin saptanmasi: Cl1-LL19-
HeLa tarafindan eksprese edilen D13-proteini, D13-proteinini bir C-ucu Bayrak-etiketi
ile eksprese etmistir ve bu hücre hattindan yapilan tam hücre proteini ekstrakti nin bir
western bloti yapildiginda, anti-Bayrak-etiketi antikoru, beklenen boyuttaki bir proteini
saptayabilmistir. Bu, C11-LL19-HeLa'nin D13 proteinini eksprese etmekte oldugunu
Mevcut bulusun kapsamindan ayrilmadan, çok sayida modifikasyon teknikte uzmanligi
olan kisiler için asikar olacaktir.
Dizi tanimlayicilarinin özeti
DIZI ID AÇIKLAMA
1 Memeli hücrelerinde (CHO) ekspresyon için kodon optimize edilmis CP77'nin
nükleotid dizisi
2 SEQ ID NO: 1 ile kodlanan CP77'nin amino asit dizisi
3 pLL07'nin nükleotid dizisi
Dizi tanimlayicilarinin özeti
DIZI ID AÇIKLAMA
4 pPH51 plazmidinden CP77-CHO geni için ileri primer
pPH51 plazmidinden CP77-CHO geni için geri primer
6 Vaksiniya Kopenhag K1L geninin nükleotid dizisi (Genbankasi M35027.1'den
ekstrakte edilmistir)
7 SEQ ID NO: 6 ile kodlanan vaksiniya Kopenhag K1 L'nin amino asit dizisi
(Genbankasi M35027.1'den ekstrakte edilmistir)
8 VACV-COP-D1 3L-O RF
9 C-ucu bayrak-etiketi (DYKDDDK) ile hamster hücresi ekspresyonu için kodon
optimize edilmis SEQ ID NO: 1'i kodlayan nükleotid dizisi
Inf-LL19-D13LC'nin ileri primeri
11 Inf-LL19-D13LC'nin geri primeri
12 Bayrak-etiket proteini
13 D13L protein peptidi
14 Inf-PCR-D13L-F1'in ileri primeri
lnf-PCR-D13L-F1'In geri primeri
16 lnf-PCR-D13L-F2'nin ileri primeri
17 Inf-PCR-D13L-F2'nin geri primeri
18 CP77+DsRed ekspresyon kaseti 2903bp
19 CP77+DsRed ekspresyon kaseti
ID_D12L-LL04'ün ileri primeri
22 CP77/DsRed seleksiyonu ile VACV-COP D13L'nin silinmesi için pLL09
homolog rekombinasyon vektörü
23 Hücresel nükleer genomik DNA'ya kararli entegrasyon için pLL19 Etiketli-
D13L-CHO kodon optimize edilmis transpozon aracili aktarma vektörü
Titrasyon Sonuçlari
24 saat 48 saat 72 saat
CHO 53pfu/mL 0 0
Viral verimler (çikti)
Enfeksiyon için kullanilan virüsün miktari (Girdi), 4x104 pfu/mL'dir. Karsilastirma için,
verimler, 104'Iü degerleri olarak ifade edilir. Degerler, her bir zaman noktasi için
ortalama verimi, yani, 3 mL (2 göze bölünmüs 6 mL) hasattan elde edilen verimi, sunar.
24 saat 48 saat 72 saat
Asagidaki tablo, yukarida üretilen virüsün verimini, her bir hasat zaman noktasinda her
bir hücre hattindan elde edilen girdi düzeyini, yani, ÇIKTI/GIRDI oranini, gösterir.24 saat 48 saat 72 saat
pfuImL cinsiden titrasyon sonuçlari
Virüs/Hücre hatti Seyreltme Sayim Titre
VACV-COPICHO 10'1 0 OpfulmL
pfulmL cinsiden titrasyon sonuçlari
Virüs/Hücre hatti Seyreltme
Ortalama
VACV-COPNero
Ortalama
VACV-PH22Nero
Ortalama
VACV-PH22/CHO
Ortalama
Sayim Titre
4 2.8x107pfulmL +I- %34
8 7,3x107pfuImL +/- %20
Her bir göz için enfeksiyondan elde edilen ortalama virüs çiktisi (verim)
Her bir balon için virüs ekstrakt hacmi, 1 mL'dir. Titrasyon için plakalama hacmi, 1
mL'dir. Bundan dolayi, virüs verimi, 1 mL (plakalama haCmi) ile çarpilmis pfu/mL
cinsinden titrasyona esittir.
Hücre hatti Her bir balon için verim
Vero 2.8x107pfu
Vero 0.75x107pfu
CHO 7.3x107pfu
Her bir pfu inokülüm için verim, yani, 1 pfu inokülümden üretilen toplam pfu
Her bir balon için inokülüm boyutu: 1x105pfu
Her bir pfu inokülüm için verim
0 pfu/girdi pfu
280 pfu/girdi pfu (inokülasyon için kullanilan her pfu için
üretilen 280pfu)
75 pfu/girdi fpu (inokülasyon için kullanilan her pfu için üretilen
75pfu)
730 pfu/girdi pfu (inokülasyon için kullanilan her pfu için
üretilen 730pfu)
Bu, her bir 1 mL viral ekstraktin titrasyonudur.
substrati
Indikatör Hücre hatti
143B Vero
Titrasyon SE SE Titrasyon SE SE
pfuImL %'si pfulmL %'si
Indikatör Hücre hatti
Hücre 143B Vero
s“bSI'at' Titrasyon SE SE Titrasyon SE SE
pfulmL %'si pfulmL %'si
Tablo 4, her bir 1 mL viral ekstrakt içinde virüsün toplam miktarini saglar.
Indikatör hücre hatti
Hücre substrati 143B Vero
Verim pfu SE Verim pfu SE
Sus ORF Genom Protein
Sus ORF Genom Protein
BIBLIYOGRAFYA
Wils› & .9005. NCW York
Kihlsir H (:1. (
Sumhmnk N a!. (1989) Moicculai' (Ilnniiig: A Laburulory Manual. 2nd cd.. Cold Spring
1-1arhoi' Press. Pluiiisx-icxx--z NY`,
Werdcn SJ. er a!. (2008) Chapter 3: vairus Hml Range Gunes. In: Admnccs in Virus'
Research. 71
DIZI LISTESI
<110> Sementis Limited
<120> VIRAL VEKTÖR IMALATI
<160> 11
<170> Patentln versiyonu 3.5
<210> 1
<211> 2031
<212> DNA
<213> Yapay
<220>
< ekspresyon için kodon optimize edilmis CP77'nin
nükleotid dizisi
<400> 1
tq99699can
qtqaoqtch
gatgctchq
<210> 2
<211> 676
<212> PRT
<213> Yapay
<220>
<223> SEQ ID NO: 1 ile kodlanan CP77'nin amino asit dizisi
<400> 2
Met. Phe Asp Tyr Leu Giu han Giu Giu Vai Ala Leu Asp Glu Leu Lys
Gin Mit Liu Arq Asp Arg Asp Pro Asn Asp Thr Arg Asn Gln Phi Lys
Asn Asn Ala Leu His Ala Tyr Leu Phe Asn Glu His Cya Aan Asn Val
40 45
Glu Val Val Lya Iieu `ben Leu Asp Ser Gly Thr Ran Pro Lou HLS Lys
50 55 60
Asn Trp Arg Gln Leu Thr Pro Leu Gly Glu Tyr Thr Aan Set Arg His
65 70 75 BG
Gly Ly: Val Asn Lys Asp 11. Ali: Mit Val Liu Liu Glu Ala Thr Gly
85 90 95
Tyr Ser &an [19 Asn Asp Phe Asn 119 Pha Thr Tyr Met Lya Ser Lys
Pro Giu Leu Arg Ala Ty: Ty: Giu Ser
6l0 615
Glu Val Tyr Asp Ile Ile Ser Asn Ala
625 630
His Lys Asn Ile Giu Ser Vai Asp Asp Ann
Pro Ty: Thr Ile Lys Ty: Lya Ile Phe
660 665
<210>3
<211>11742
<212> DNA
<213> Yapay
<220>
<223> pLL07'nin nükleotid dizisi
<400> 3
QBCOBQGQQÖ
C991C999Cl
ggCRaLLauL
LuchguuLt
999C99t599
955C599t99
CtaQCCCOQB
tLLgctuaca
Lagunaaaai
tçatchgft
ttqgcigtac
aqqacqigit
acatqngcac
qnaîqhtcfq
gunqcglqdt
attcgizttc
ccagaiztac
qatqaLach
cttnganqqc
qucntgsaqc
9C39393C99
aaqaLsüLcL
aantaetgtc
caitgcqgta
gaatgigcaq
LCaLCGQCQE
tgqtqi:gac
CCQLÇCQQÄB
acaiqctgac
fqqrqrcnra
5999C99C9t
audgaigguc
çqgaqcacia
aqtqtciccg
QBLCQCQGEQ
cqccgtqiqa
qaictggga:
Lnlgqcculg
Ltcltqaaat
rncqnnaaga
tqccagagzt
Lgtaoccatt
acgaqtçctg
gattqcçtcq
Ctgcgcçacg
qaatgqçccg
999C91C991
LgünugduLL
ugacutugLa
CIÖQQQUJQQ
QCÇQQQCtgc
lzLuuuiJuîaa
catciqqtcg
açntaîtnct
Lçccagtgat
UCCQCqaan
cctzgantta
chggüßllg
QBQCQGBGOQ
uccicnctga
catttaißet
aaniargtgg
Lacqaquaco
gaqtcannna
çtgattctcq
GtCCÜQGQaÜ
çgccaqcttq
GOGCQGQCLQ
çcrqnfgnrq
Çqchigßic
çtgcgngang
çatcaicgac
QIGCQQCLGC
aaqqqcnttr
guncttgnlg
CQQQQLBSÄC
ciqaacizag
tciaqtgcct
cggzgaçatc
uaazntutgu
ini-:::umigLq
qiacitcgaq
daüaLuuguL
ÜQCOBCECCJ
Lgaatahgct
99°C9C99°3
qgcctictac
gcaatgntaq
qangtqntgc
dluuLânLvU
Cfgccctata
9999933C93
uudLLanuga
10020
10080
10140
10200
10260
10320
10380
10440
agaLtgach
<210>4
<211> 54
<212> DNA
<213> Yapay
<220>
qnaaaagatc
<223> pPH51 plazmidinden CP77-CHO geni için ileri primer
<400> 4
<210> 5
10500
10560
10620
10680
10740
10800
10860
10920
10980
11040
11100
11160
11220
11280
11340
11400
11460
11520
11580
11640
11700
11742
<211> 65
<212> DNA
<213> Yapay
<220>
<223> pPH51 plazmidinden CP77-CHO geni için geri primer
<400> 5
<210> 6
<211> 855
<212> DNA
<213> Yapay
<220>
ekstrakte edilmistir)
<400> 6
gciataqata
<210> 7
<211> 284
<212> PRT
atctgqaaan
<213> Yapay
<220>
QQGCÜthQQ
<223> SEQ ID NO: 6 ile kodlanan vaksiniya Kopenhag K1L'nin amino asit dizisi
(Genbankasi M35027.1'den ekstrakte edilmistir)
<400> 7
Met Asp Leu Ser Arg Ile Asn Thr Trp Lys Ser Lys Gln Leu Lys Ser
<210>8
<211> 551
81'.:
61'.:
Tyr Val Asn Cys Val Lys Lys Asn
<212> PRT
<213> Yapay
<220>
< 223> VACV-COP-D13L ORF
<400> 8
1.61]
(1111
8.1.::
Aan hap Vai Leu Tyr Ser Giu Asn Giy Pro Ile Ser Arg Ile Ty: Aan
450 455 460
Giu Leu Leu Thr Lys Ser Asn Asn Giy Thr Axg rh: Leu Thr Phe Asn
Phe Thr Pro Lys Ile Phe Phe Arq Pro Thr Thr Ile Thr Ala Asn Val
485 490 495
Ser Atg Gly Lys Asp Lys Leu Ser Val Arg Val Val Tyr Ser Thr Met
500 505 5i0
Asp Val Asn His Pro Ile Tyr Tyt Val Gln Lys Gln Leu Val Val Val
515 520 525
Cys Asn Asp Leu Tyr Lys Vai Ser Tyr Asp Gln Giy Vai Ser Ile Thr
530 535 540
545 550
<210> 9
<211> 1680
<212> DNA
<213> Yapay
<220>
<223> SEQ ID NO:1'i kodlayan CHO kodon optimize edilmis nükleotid dizisi
<400> 9
<210> 10
<211> 44
<212> DNA
<213> sentetik primer
<400> 10
<210> 11
<211> 40
<212> DNA
<213> sentetik primer
<400> 11
<210> 12
<211>8
<212> PRT
<213> Yapay
<220>
< 223› Bayrak-Etiket proteini
<400> 12
<210> 13
<211> 16
<212> PRT
<213> Yapay
<220>
<223> D13L peptidi
<400> 13
Cys Ty:: Asp Gln Giy Val Ser Ile Thr Lys Ile Met Giy Asp Asn han
1 5 10 15
<210> 14
<211> 35
<212> DNA
<213> sentetik primer
<400> 14
<210> 15
<211> 38
<212> DNA
<213> sentetik primer
<400> 15
<210> 16
<211> 36
<212> DNA
<213> sentetik primer
<400> 16
<210>17
<211> 36
<212> DNA
<213> sentetik primer
<400> 17
<210> 18
<211> 668
<212> PRT
<213> Yapay
<220>
<223> CPXV-125L Brighton Red'in dizisini içeren CP77 proteini
<400> 18
Mat Phe Asp Tyr Lou Glu Asn Glu Glu Val Ala Leu Asp Glu Lou Lys
141.:
1.4: 11
<210> 19
<211> 2903
<212> DNA
<213> Yapay
<220>
<223> CP77+DsRed ekspresyon kaseti dizisi
<400> 19
nttqtacaag
aatcaqoaqv
nqqatacgcq
UdaiLuugaL
qccattgcai
Lggaahatgq
LgauLdeLa
duaLLLnuru
deLignlaL
<210> 20
<211> 25
<212> DNA
<213> sentetik primer
<400> 20
tquqachcq
<210> 21
<211> 29
<212> DNA
<213> sentetik primer
<400> 21
<210> 22
<211> 6809
<212> DNA
<213> Yapay
<220>
ochtqvtqa
<223> VACV-COP D13L with CP77/DsRed seleksiyonu ile VACV-COP D13L'nin
silinmesi için pLL09 homolog rekombinasyon vektörü
<400> 22
9919C999CC
cciizaqiat
Lcaiggaatc
ggcizattca
acanqggtgg
Lataqstaca
aziciitgaa
aziciagact
afacqngfar
aqtatzacnt
LLÖQCÄCELB
tiachigta
LOLtLLLQüa
gaticcçatt
ttqzntacct
Ltcattçaga
giatquuaaL
nttcgnçcaa
cctacqiggq
CUBBQUCCOE
993C99C99C
QQCCGCUÖQI
rtcatcqch
agtchLtLa
dddLaLnugL
ctuqtcuaot
aqcggtntca
iicqggnugc
aqataiigtc
ttnnatagqc
L808L88CL8
cqcigiaqtg
ticqgagcta
gtcctqciac
CCOCLCâclc
acgqtzatcc
GGGQQCCBOQ
fqacqagnar
çcttaccggn
acgctqiiqq
çgtaaqacac
tctaliicgi
QQQCtLGCCO
tnchcaang
qaiccacLag
Lnlctc4glt
UUtötCîîCQ
atqttaczag
attgttitzc
QQQQIQCStG
8QQCCQCQIC
cqqtqtnugt
rnacnqrtqq
<210> 23
atcacqugqc
<211> 11161
<212> DNA
<213> Yapay
<220>
<223> Hücresel nükleer genomik DNA'ya entegrasyon için pLL19 Etiketli-D13L-CHO
kodon optimize edilmis transpozon aracili aktarma vektörü
<400> 23
Claims (1)
- ISTEMLER . Bir modifiye edilmis memeli hücresi olup, özelligi hücrenin genomunun, bir konstitütif promotör kontrolü altinda CP77'yi kodlayan bir diziyi içermesi için modifiye edilmesidir, böylece modifiye edilmis hücre hatti, modifiye edilmemis hücrede daha az çogalabilen veya hiç çogalamayan bir çiçek virüsünün propagasyonunu sürdürür ve burada hücrenin genomu ilaveten, bir konstitütif promotör kontrolü altinda D13L'yi kodlayan bir dizi içerir. . istem 1'e göre hücre olup, özelligi hücrenin genomunun ilaveten, bir promotör kontrolü altinda K1L'yi kodlayan bir dizi içermesidir. . istem 1'e veya istem 2'ye göre hücre olup, özelligi hücrenin, bir sürekli hücre hatti olmasidir. . Istemler 1 ila 3'ten herhangi birine göre hücre olup, özelligi hücrenin, bir CHO hücresi olmasidir. . Istemler 1 ila 4iten herhangi birine göre hücre olup, özelligi hücrenin, bir insan hücresi, bir primat hücresi, bir hamster hücresi veya bir tavsan hücresi olmasidir. . Istemler 2 ila 5`ten herhangi birine göre hücre olup, özelligi K1L geninin ekspresyonunun, bir konstitütif memeli promotörü kontrolü altinda olmasidir. . Istemler 1 ila 6'dan herhangi birine göre hücre olup, özelligi CP77 geninin ekspresyonunun, bir permisif hücre hattinda gözlenene es-deger virüs verimleri üretmek için virüsün propagasyonunu desteklemesidir. . Istemler 1 ila 7'den herhangi birine göre hücre olup, özelligi CP77 geninin ekspresyonunun, 500'den büyük olan bir virüs replikasyon amplifikasyon oranini desteklemesidir. Istemler 1 ila 8'den herhangi birine göre hücre olup, özelligi CP77 geninin, memeli hücrelerinde ekspresyon için kodon optimize edilmis nükleotidlerin bir bitisik dizisi tarafindan kodlanmasidir. 10. CHO hücrelerinde çogalmayan bir orto-çiçek virüsünü çogaltmak için bir proses olup, özelligi prosesin, çiçek virüsünün bir memeli hücre hattinda in vitro çogaltilmasini içermesidir, burada hücre hatti, CP77'yi kodlamasi ve bir konstitütif promotör kontrolü altinda eksprese etmesi için ve bir konstitütif promotör kontrolü altinda D13L'yi eksprese etmesi için modifiye edilir. Istem 10'a göre proses olup, özelligi modifiye edilmis hücre hattinin, K1L'yi kodlamasi ve bir promotör kontrolü altinda eksprese etmesi için modifiye edilmesidir. istem 10'a veya istem 11'e göre proses olup, özelligi modifiye edilmis hücre hattinin, bir insan hücresi, bir primat hücre hatti, bir hamster hücre hatti veya bir tavsan hücre hatti olmasidir. istem 12'ye göre proses olup, özelligi hücre hattinin bir CHO hücre hatti olmasidir.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| AU2013904242A AU2013904242A0 (en) | 2013-11-01 | Viral vector manufacture | |
| AU2014900370A AU2014900370A0 (en) | 2014-02-07 | Orthopox vectors and propagation |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| TR201807128T4 true TR201807128T4 (tr) | 2018-06-21 |
Family
ID=53003022
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| TR2018/07128T TR201807128T4 (tr) | 2013-11-01 | 2014-11-03 | Viral vektör imalatı. |
Country Status (24)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US10544397B2 (tr) |
| EP (2) | EP3375882B1 (tr) |
| JP (2) | JP6682443B2 (tr) |
| KR (1) | KR102047030B1 (tr) |
| CN (1) | CN106255758B (tr) |
| AU (1) | AU2014344738B2 (tr) |
| CA (1) | CA2931518C (tr) |
| CY (1) | CY1121414T1 (tr) |
| DK (2) | DK3063278T3 (tr) |
| ES (1) | ES2670034T3 (tr) |
| HK (1) | HK1223395A1 (tr) |
| HR (1) | HRP20180789T1 (tr) |
| HU (1) | HUE037718T2 (tr) |
| LT (1) | LT3063278T (tr) |
| NO (1) | NO3063278T3 (tr) |
| NZ (1) | NZ720241A (tr) |
| PL (1) | PL3063278T3 (tr) |
| PT (1) | PT3063278T (tr) |
| RS (1) | RS57290B1 (tr) |
| RU (1) | RU2658487C2 (tr) |
| SG (1) | SG11201603919XA (tr) |
| SI (1) | SI3063278T1 (tr) |
| TR (1) | TR201807128T4 (tr) |
| WO (1) | WO2015061858A1 (tr) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN109862909A (zh) * | 2016-08-19 | 2019-06-07 | 赛门蒂斯有限公司 | 病毒疫苗 |
| JP2018081568A (ja) * | 2016-11-17 | 2018-05-24 | グローリー株式会社 | 紙幣収納装置および紙幣処理機 |
| WO2024003346A1 (en) * | 2022-06-30 | 2024-01-04 | Bavarian Nordic A/S | Mammalian cell line for the production of modified vaccinia virus ankara (mva) |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2604183B1 (fr) * | 1986-09-23 | 1988-12-30 | Transgene Sa | Sequence d'adn, vecteurs, virus recombinants et procede mettant en oeuvre des virus de la vaccine recombinants capables de se multiplier dans les cellules cho |
| AU694519B2 (en) | 1994-04-29 | 1998-07-23 | Immuno Aktiengesellschaft | Recombinant poxviruses with foreign polynucleotides in essential regions |
| CA2489301A1 (en) * | 2002-08-07 | 2004-02-19 | Bavarian Nordic A/S | Vaccinia virus host range genes to increase the titer of avipoxviruses |
| FR2884255B1 (fr) * | 2005-04-11 | 2010-11-05 | Vivalis | Utilisation de lignees de cellules souches aviaires ebx pour la production de vaccin contre la grippe |
| JP2009545309A (ja) * | 2006-08-04 | 2009-12-24 | ダブリン シティ ユニバーシティ | 組換え型生物学的製剤を製造する方法 |
-
2014
- 2014-11-03 SG SG11201603919XA patent/SG11201603919XA/en unknown
- 2014-11-03 CA CA2931518A patent/CA2931518C/en active Active
- 2014-11-03 PT PT148588023T patent/PT3063278T/pt unknown
- 2014-11-03 PL PL14858802T patent/PL3063278T3/pl unknown
- 2014-11-03 CN CN201480071836.9A patent/CN106255758B/zh active Active
- 2014-11-03 JP JP2016550897A patent/JP6682443B2/ja active Active
- 2014-11-03 RU RU2016121425A patent/RU2658487C2/ru active
- 2014-11-03 SI SI201430731T patent/SI3063278T1/sl unknown
- 2014-11-03 EP EP18154084.0A patent/EP3375882B1/en active Active
- 2014-11-03 NO NO14858802A patent/NO3063278T3/no unknown
- 2014-11-03 DK DK14858802.3T patent/DK3063278T3/en active
- 2014-11-03 US US15/033,541 patent/US10544397B2/en active Active
- 2014-11-03 LT LTEP14858802.3T patent/LT3063278T/lt unknown
- 2014-11-03 TR TR2018/07128T patent/TR201807128T4/tr unknown
- 2014-11-03 AU AU2014344738A patent/AU2014344738B2/en active Active
- 2014-11-03 DK DK18154084.0T patent/DK3375882T3/da active
- 2014-11-03 NZ NZ72024114A patent/NZ720241A/en unknown
- 2014-11-03 ES ES14858802.3T patent/ES2670034T3/es active Active
- 2014-11-03 KR KR1020167014693A patent/KR102047030B1/ko active IP Right Grant
- 2014-11-03 HU HUE14858802A patent/HUE037718T2/hu unknown
- 2014-11-03 EP EP14858802.3A patent/EP3063278B1/en active Active
- 2014-11-03 RS RS20180588A patent/RS57290B1/sr unknown
- 2014-11-03 WO PCT/AU2014/050330 patent/WO2015061858A1/en active Application Filing
-
2016
- 2016-10-04 HK HK16111526.2A patent/HK1223395A1/zh unknown
-
2018
- 2018-05-18 HR HRP20180789TT patent/HRP20180789T1/hr unknown
- 2018-05-22 CY CY20181100533T patent/CY1121414T1/el unknown
-
2019
- 2019-10-18 JP JP2019191435A patent/JP2020039340A/ja active Pending
- 2019-12-11 US US16/711,184 patent/US20200190482A1/en not_active Abandoned
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| AU2024216517A1 (en) | Enhanced systems for cell-mediated oncolytic viral therapy | |
| KR102362240B1 (ko) | 세포 면역요법을 위한 방법 및 조성물 | |
| KR102557818B1 (ko) | 키메라 폭스바이러스 조성물 및 이의 용도 | |
| CN109415687A (zh) | 嵌合抗原受体t细胞组合物 | |
| KR20210093862A (ko) | 유전자 요법 벡터를 제작하기 위한 조성물 및 방법 | |
| CN107849583B (zh) | 使用细胞分裂基因座控制细胞增殖的工具和方法 | |
| CN106544326B (zh) | 顺行跨多级突触、跨神经元的示踪系统 | |
| CN112739359A (zh) | Apmv及其用于治疗癌症的用途 | |
| JP2020039340A (ja) | ウイルスベクターの作製 | |
| TW201809273A (zh) | 病毒疫苗 | |
| CN107847612A (zh) | 递送Smad7基因作为治疗剂 | |
| JP2021533791A (ja) | ウイルスを生成する方法及び組成物 | |
| WO2023167025A1 (ja) | トランスジェニックマウス |