JP6682443B2 - ウイルスベクターの作製 - Google Patents
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Description
ないと理解される。
VACV−COPはCHO細胞で増殖できない
材料および試薬
・VACV−COP、VSS02、SEM120213、力価:1.6×10(8)pfu/mL
・Vero:WHO−VERO−MCB継代数141、08/08/2005、Virax Holdings Limited
・CHO:SA−Pathology 7.05.2004
・増殖培地:RPMI、10%FBS、Pen/Strep
・維持培地:RPMI、2%FBS、Pen/Strep
CHOとVero−CP77におけるVACV+PH22[CP77]の多段階増殖はVACVにおいて有効である
CP77をコードする牛痘ウイルスBR025L遺伝子を発現する組換えVACV−COP(VACV−PH22[CP77])のCHOでの増殖能を、多段階増殖試験でVero細胞と比較して決定した。
・VACV−COP、VSS02、SEM120213、力価:1.6×108pfu/mL
・VACV−PH22[CP77]、力価:8×106pfu/mL
・Vero:WHO−VERO−MCB継代数141、08/08/2005
・CHO:SA−Pathology 7.05.2004
・増殖培地:CHOおよびVero用としてRPMI、10%FBS、Pen/Strep
・維持培地:CHOおよびVero用としてRPMI、2%FBS、Pen/Strep
p−LL07−CHO(CP77を発現するポリクローナル細胞株)の構築
CHO細胞株を、CP77タンパク質を発現するように構築した。緑色蛍光タンパク質(EGFP)を発現するVACV−COP組換えウイルスは、感染数日以内にコンフルエント感染に発達するプラークを形成する。
CHO細胞を6ウェルプレートの壁面に、一晩インキュベーション後に50%前後の集密度となるように播種した。QiagenからのEffecteneトランスフェクション試薬を用い、製造者の説明に従って、1μgのpLL07を1ウェルの50%コンフルエントのCHO細胞にトランスフェクトした。次に、トランスフェクト細胞を増殖培地で一晩インキュベートした。翌日、培地を、形質導入細胞を選択するために、500μg/mLハイグロマイシンBを含有する増殖培地に交換した。選択培地は2〜3日毎に交換し、形質導入細胞の数が増え始めたらそれらをTrypLE Select(Life Technologies)を用いて回収し、さらなる細胞の拡大培養のためにT25フラスコに播種した。
ウサギ抗CP77血清の作製:
ウサギに、CP77タンパク質の短い内部アミノ酸配列を表すKHLタンパク質に連結された15アミノ酸のペプチドを注射した。このアミノ酸配列は、UniProtKBSwiss−Prot P12932.1[025LBR CP77タンパク質]配列番号2の481〜495番のアミノ酸SGSDVNIRSNNGYTCであった。
2本のT25フラスコにCHOおよびp−LL07−CHOを播種し、各フラスコ内で細胞単層が100%コンフルエントに達するまで培養した。各フラスコから細胞を採取し、PBSで洗浄した後、200μL中に再懸濁させた。これに、50μLの5×SDS−PAGEローディングバッファーを再懸濁細胞の各試験管に加えた後、98℃で5分間インキュベートした。15μLの各細胞タンパク質抽出液を2枚の10%SDS−PAGEゲルにロードし、電気泳動を行った後、エレクトロブロッティングによりHybond ECLニトロセルロースにブロットした。
CHO細胞およびp−LL7−CHO細胞を複数の6ウェルプレートに播種し、細胞単層が100%コンフルエントになるまで培養した。
多段階増殖試験
多段階増殖動態試験をp−LL07−CHOで行った:
宿主域遺伝子CP77を発現するCHO細胞株のワクシニアウイルス感染に対する許容性を評価し、ウイルス生産レベルを天然許容性ヒト細胞株−143Bで達成された生産レベルと比較した。
細胞株の準備
CHOの準備:
1枚の6ウェルプレート(6WP)にCHO細胞を播種し、増殖培地(RPMI+10%FBS)中でコンフルエントまで培養した。
1枚の6ウェルプレート(6WP)に143B細胞を播種し、増殖培地(RPMI+10%FBS)中でコンフルエントまで培養した。
6ウェルプレート(6WP)にp−LL07−CHO細胞を播種し、増殖培地(RPMI+10%FBS+500μg/mlハイグロマイシンB)中でコンフルエントまで培養した。
各6WPの各ウェルに総容量500μLで0.01pfuを感染させた。100%コンフルエントでウェル当たりの細胞総数は4×106細胞である推定された。感染率0.01pfu/ウェルのためには、4×104pfu/ウェルが必要とされ、従って、ウイルス原液を維持培地(RPMI/2%FBS)で8×104pfu/mLに希釈した。
各プレートの各ウェルから培養培地を除去し、500μLの希釈ウイルスを加え、室温で1時間インキュベートして細胞にウイルスを吸着させた。次に、ウイルス接種物を除去し、各感染ウェルを1mLの無菌PBSで1回洗浄し、その後、2mLのMM/ウェル中、37℃/5%CO2でインキュベートした。
各プレートから2セットのウェルを感染後下記の時点で採取した:24時間、48時間、および72時間。採取当日、細胞を培養培地中で破砕し、各細胞株からの2セットのウェルを合わせ、1000gで5分間の遠心分離により細胞をペレットとした。各細胞ペレットを1mLの10mM TrisHCl pH8に再懸濁させた。次に、再懸濁した細胞ペレットに凍結融解を3回行い、力価測定まで−80℃で保存した。
冷凍庫からウイルス抽出液を取り出し、解凍し、音波処理を施して目に見える塊をホモジナイズした。ウイルス抽出液を維持培地で10−8まで連続希釈した。
各ウェルから増殖培地を除去し、1mLの各希釈液(各希釈率につき4ウェル、10−2希釈から始め、各ウイルスにつき1プレート)を用いて室温で1時間感染させた。インキュベーション後、各プレートをインキュベーターに移し、37℃/5%CO2で3日間インキュベートしてプラークを発達させた。
希釈液は20〜50プラークを含み、これらのプラークを数えた後に平均を求めた。この平均総数に希釈率の逆数を掛け、1mLの感染を用いたので、得られた数値が力価(pfu/mL)となる。
95%信頼区間での標準誤差(SE)は、平均値を構成した4つの力価測定値から下式:1.95×(SD/√n)(式中、SDは小規模サンプルからの標準偏差であり、nは力価測定の反復回数である(この場合4))を用いて計算した。
これは力価が決定されたウイルス抽出液内のウイルス総量である: 平均力価測定値(pfu/mL)×ウイルス抽出液の容量=pfu。
この数値は接種物として使用した量に対する増幅倍率を表す: 収量(pfu)/接種物量(pfu)。
CHO−CP77細胞におけるMVA増殖
CHO、143Bおよびp−LL07−CHOにおけるMVA+GFP増殖
材料および方法
10%FBS、2mM L−グルタミン、ペニシリンおよびゲンタマイシンを添加したRPMI−1640、Hepes
2%FBS、2mM L−グルタミン、ペニシリンおよびゲンタマイシンを添加したRPMI−1640、Hepes
p−LL07−CHO細胞株の一般増殖および維持はGMおよび500μg/mLのハイグロマイシンBで行ったが、播種および感染前の100%コンフルエントまでの培養については、細胞はハイグロマイシンBを含まないGM中で培養した。
143B細胞、CHO細胞およびP−LL07−CHO細胞を複数の6ウェルプレートに播種し、細胞単層が100%コンフルエントとなるまで37℃/5%CO2にて増殖培地(GM)中で培養した。各細胞株につき1プレートを培養した。
・GFP発現カセット(緑色蛍光タンパク質)を保持する組換えMVAを用いて、6ウェルプレートで培養した細胞を感染させた。MVA−GFPの力価が未知であるので、ウイルスを下記のように維持培地(MM)で連続希釈した。
・Dil 1: 20μlのウイルス原液を2mlのMM培地で希釈し(1:100希釈)、激しいボルテックス撹拌により混合した。
・Dil 2: 500μlのDil 1を4.5mlのMM(1:103希釈)に加え、激しいボルテックス撹拌により混合した。
・Dil 3:500μlのDil 2を4.5mlのMMに加え(1:104希釈)、激しいボルテックス撹拌により混合した。
・Dil 4:500μlのDil 3を4.5mlのMMに加え(1:105希釈)、激しいボルテックス撹拌により混合した。
・各プレートの1ウェルに500μlの下記ウイルス希釈液Dil 2、Dil 3、およびDil 4を感染させた。
・プレートを5日間インキュベートし、蛍光細胞巣の発生および拡散を調べた。本研究では、Dil 4は、3日間で、識別可能な蛍光細胞巣を生成した。各プレートの非感染ウェルを自家蛍光の対照とした。
ウイルス感染は蛍光顕微鏡(Olympus IX51)下でGFPフィルター(Cat#U−MGFPHQ、Olympus)を用いて観察した。画像はcellSensデジタルイメージングソフトウエア(Olympus)を用いて取り込んだ。
これらの結果は、緑色蛍光タンパク質(GFP)を発現するMVAは予想されたようにCHO細胞および143B細胞では増殖しないことを示した。緑色蛍光を発する単細胞はウイルスが細胞に侵入し、GFPを含むその遺伝子を発現するが、感染性ウイルス粒子は生産できず、従って、隣接する細胞に感染が拡散できない結果である。しかしながら、CP77を発現するCHO細胞株では、MVAは新たな感染性ウイルスを生産することができ、隣接する細胞に拡散し、感染後1日目までに感染巣を形成し、3日までにさらに発達する。
p−LL07−CHO感染から採取されたMVAの宿主域制限の確認
細胞の準備
143B細胞、CHO細胞およびBHK−21細胞を複数の6ウェルプレートに播種し、細胞単層が100%コンフルエントとなるまで37℃/5%CO2にて増殖培地(GM)中で培養した。各細胞株につき1プレートを培養した。
実施例5のDil 3感染P−LL07−CHOウェルからのMVA+GFPを次のように感染5日後に採取した。
・上清および細胞の両方をウェルから採取し、1000gで5分間遠心分離して感染細胞をペレットとした。
・細胞ペレットを500μlの100mM Tris−HCl pH8バッファーに再懸濁した。
・再懸濁細胞ペレットを少なくとも3回凍結および融解し、感染細胞からウイルスを放出させた。
・粗ウイルス抽出液の力価が未知であるために、実施例5と同様に、ウイルスをMM培地で連続希釈した。
・各プレートの1ウェルに500μlの以下のウイルス希釈液Dil 2、Dil 3、およびDil 4を感染させた。
・各プレートを5日間インキュベートし、蛍光細胞巣の発生および拡散を調べた。本研究では、Dil 3は、3日間で、識別可能な蛍光細胞巣を生成した。
ウイルス感染は蛍光顕微鏡(Olympus IX51)下でGFPフィルター(Cat#U−MGFPHQ、Olympus)を用いて観察した。画像はcellSensデジタルイメージングソフトウエア(Olympus)を用いて取り込んだ。
CP77を発現するCHO細胞株から採取されたMVAは、非許容細胞株CHO(ハムスター)および143B細胞(ヒト)において増殖できないことによりその制限宿主域をなお維持した。CHO細胞および143B細胞の感染後3日間緑色蛍光巣がないことは、これらの細胞株では感染性後代ウイルスが生産されなかったことを示す。しかしながら、緑色蛍光感染巣が感染後1日目までに見られ、その後3日にわたってサイズを増したことから、このMVAは、BHK21細胞(ハムスター)に対するその宿主域をなお維持していた。
・宿主域タンパク質CP77を発現するCHO細胞は、親(天然)CHO細胞とは異なりMVA感染に対して許容性である。
・CP77を発現するCHO細胞株で増殖したMVAは、その宿主域をCHOおよび143B(ヒト)などの非許容細胞株に拡大しなかった。
pLL07の構築
バックグラウンド情報:
pPH51 DNA鋳型からのCP77(CHOコドン最適化)CDS PCR産物を、Clontech社のInFusionクローニングシステムによりpJ507−2(Hyg+)PiggyBacシステムにクローニングしてpLL07を作出した。フラッグタグを有するCP77配列をpJ507−2のBsaIに挿入し、それにより、comet GFP配列(配列番号3)を除去した。
哺乳動物細胞におけるG1LおよびI7Lの発現
フラッグタグG1LまたはフラッグタグI7Lをコードする発現プラスミドを構築し、それらを用いて、これらのタンパク質を発現するトランスジェニック143B細胞株を作出した。これらの細胞を、形質導入細胞を陽性選択するためのジェネティシンの存在下で増幅され、PCR分析によりこれらの細胞株のゲノム内にこれらのタンパク質コード配列の存在が確認されたものの、ウエスタンブロット解析では、抗DDDDK抗体でプロービングした場合に、発現されたフラッグタグタンパク質の存在は検出できなった。
必須の構造成熟またはアセンブリタンパク質の一例としてのD13Lが哺乳動物細胞から発現され、D13L遺伝子が欠失したワクシニアをレスキューし、D13L欠損ワクシニアは感染細胞でタンパク質を発現する
アセンブリ/成熟プロセスの遮断による弱毒ワクシニアの一例として、コペンハーゲン株のD13L ORFを欠失のために標的化した。そうする上で、このタンパク質を発現する細胞株をまず、COP−D13L欠損ウイルスが増殖可能なように構築しなければならない。レスキュー細胞株の構築のため、チャイニーズハムスター卵巣細胞株(しばしばCHOと呼ばれる)が「バイオテクノロジー」適合性であることから、この細胞株を選択した。COP−D13Lが欠失した感染性ワクシニアウイルスをレスキューするためには、この細胞株は、ワクシニアウイルスではなく細胞の転写機構を用いてその核ゲノムからD13タンパク質を発現しなければならない。細胞により発現された、C末端タグアミノ酸配列DYKDDDDK(フラッグタグ、Hopp et al. 1988)を含有するD13タンパク質のタンパク質アミノ酸配列をCHOコドンについて最適化し、対応するヌクレオチド配列を作成した。この、哺乳動物プロモーターおよび哺乳動物ポリアデニル化シグナル配列からなるタグ含有D13L−CHOコドン最適化発現カセットの核DNAへの安定組み込みは、Urschitz et al. 2010およびMatasci et al. 2011により報告されているタイプのトランスポゾン組み込み技術によって達成した。CHOの形質導入は、DNA2.0 Inc(USA)から購入したpiggy Bacベクターシステムを用いて達成した。
D13Lタンパク質コード配列は、LifeTechnologies社のGeneArtにより、ワクシニアウイルス・コペンハーゲン株のD13L ORFによりコードされているD13アミノ酸からDNA配列を再構築することによって合成作製し、CHO細胞での発現のためにコドンを最適化した。VACV−COP D13L ORFのタンパク質コード配列を配列表に示す。
pLL17由来のコドンを最適化したD13タンパク質コード配列(D13LchoTagged)をPCR増幅し、DNA2.0 Inc(Cat#pJ503−2)から購入したトランスポゾンpiggyBacベクターpJ503−2(CometGFPおよびNeo+を有するpHULK piggyBac哺乳動物発現ベクター)のBsaIクローニング部位にサブクローニングし、pLL19を作出した。In−Fusionクローニング(Clontech:リガーゼ不含クローニング)によるBsaI間のクローニングは、in vitro相同組換えにより、comet GPFコード配列を除去してそれをタグD13タンパク質コード配列に置き換える。この時、D13Lchoタグタンパク質コード配列はヒト延長因子1αプロモーター(EF1a)の制御下となり、両方がトランスフェクト細胞のゲノムに安定に組み込まれた場合にネオマイシン耐性遺伝子と共発現される。宿主ゲノムへの安定組み込みは、piggyBacベクターのレフトトランスポゾンボーダーとライトトランスポゾンボーダーによって挟み込まれたDNA配列のトランスポゾン組み込みにより媒介される。
フォワードプライマー配列:
p−LL19−CHO−CHO細胞を、一晩のインキュベーション後に50%前後のコンフルエントとなるように、6ウェルプレートのウェルに播種した。QiagenからのEffecteneトランスフェクション試薬(Cat#301425)を用い、製造者の説明書に従って、1μgのpLL19を1ウェルの50%コンフルエントCHO細胞にトランスフェクトした。次に、トランスフェクト細胞を増殖培地(RPMI 1640/10%FBS/2mM Glutamax/Pen−Strep)中で一晩インキュベートした。翌日、培地を形質導入細胞を選択するための1000μg/mLジェネティシンを含有する増殖培地に交換した。選択培地は2〜3日毎に交換した。形質導入細胞が90〜100%コンフルエントまで増殖した際に、TrypLE Select(Gibco−Invitrogen Corp、Cat#12563−029)を用いてそれらを回収し、さらなる細胞拡大培養のためにT25フラスコに播種した。
ウサギ抗D13抗血清の作製:
ウサギに天然D13タンパク質のC末端アミノ酸に相当する16アミノ酸のペプチドにKLHタンパク質を連結させたものを注射した。このアミノ酸配列は、CYDQGVSITKIMGDNNであった。1か月あけて合計3回の注射を行い、このアミノ酸配列の抗体を生成させた。注射したウサギからの血清を、以下の細胞抽出液に対してウエスタンブロット解析により調べた:143B全細胞抽出液、フラッグタグD13Lを発現する143B トランスジェニック細胞株(p−LL06−143b)からの全抽出液およびVACV−COP感染143B細胞抽出液。これらの結果は、ウサギ抗D13血清が明確にD13タンパク質を特異的に認識できることを明らかに示した。
D13Lchoタグ形質導入CHOポリクローナル拡大培養細胞株(p−LL19−CHO)を、通常のCHO細胞と同様にT25フラスコ中で 100%コンフルエントまで培養した。各フラスコからの細胞をTrypLE Select(Gibco−Invitrogen Corp、Cat#12563−029)で採取し、低速遠心分離(300g 5分間)によりペレットとし、PBSで洗浄し、200μLのPBSに再懸濁させた。
50μLの5×SDS−PAGEローディングバッファーを各細胞懸濁液に加えた後、98℃で5分間インキュベートした。15μLの各細胞タンパク質抽出液を2枚の10%SDS−PAGEゲルにロードし、電気泳動を行い、その後、エレクトロブロッティングによりHybond ECLニトロセルロースにブロットした。次に、エレクトロブロット膜をTween 20を含有するTris緩衝生理食塩水(TBST)に溶かした5%脱脂粉乳で室温にて1時間処理し、膜上の利用可能な総ての非特異的抗体結合部位をブロッキングした。次に、これらの膜をTBST中で数回洗浄した後、抗体でプロービングした。膜1は5000希釈のHRPコンジュゲート抗DDDDKタグ抗体[M2](Abcam、Cat#ab49763)で4℃にて一晩プロービングした。膜2は、1:2000希釈のウサギD13抗血清で4℃にて一晩プロービングし、TBSTで3回洗浄した後、二次抗体として1:5000希釈のHRPコンジュゲート抗ウサギ抗体(Abcam、Cat#ab97069)で2時間プロービングした。その後、両方の膜をTBST中で3回洗浄し、ユーザーマニュアルにより指示されているように、ECLウエスタンブロッティング検出試薬(GE Healthcare)で処理し、X線フィルムに露光した。
D13L ORF欠失によるVACV−COPの弱毒化
ワクシニアウイルスを弱毒化するために、保存されている後期プロモーター配列をCOP−D13L ORFのタンパク質コード配列の大部分とともに、相同組換えによる欠失の目印とし、その代わりに選択/リポーターカセットを挿入し、これにより、相同組換えによる欠失に成功したものはD13タンパク質を発現するCHO細胞株に関して選択でき、ここで、感染は赤色蛍光によって可視化することができる。選択/リポーターカセットは、ワクシニアプロモーターの制御下のCP77を発現するCHO宿主域遺伝子とDsRed−Express2配列からなる。
相同組換えによるVACV−COPからのD13L ORFの欠失のために、COP−D13L ORFの両側に隣接する2つの相同組換えアームを設計した。しかしながら、COP−D12L ORFのプロモーター配列はCOP−D13L ORFの3’末端内にあり得ることから、COP−D13L ORFの3’末端およそ200bpはそのまま残した。
相同組換えアームをVACV−COPゲノムDNAから、以下に示すプライマー対を用いてPCR増幅した。太字で下線のテキストは、F1およびF2アームと選択/リポートカセットおよびClontechからのIn−Fusionキットに供給されている線状pUC19を連結するためのIn−Fusionアームを表す。In−Fusion連結の結果、pLL09と呼ばれる環化プラスミドが形成される。
太字で下線のテキスト(15bp)は、ClonTech In−Fusionキットによって供給される線状pUC19プラスミドに左末端と相同な配列を表す。
太字で下線のテキスト(15bp)は、選択/リポーターカセットの5’末端と相同な配列を表す。予想されるPCR産物サイズは657bpである。
太字で下線のテキスト(15bp)は、選択/リポーターカセットの3’末端と相同な配列を表す。
太字で下線のテキスト(15bp)は、ClonTech In−Fusionキットによって供給される線状pUC19プラスミドの右末端と相同な配列を表す。予想されるPCR産物サイズは621bpである。
選択/リポーター発現カセットは、牛痘ウイルス 025L ORF(ブライトンレッド株)由来のCP77 CHO宿主域遺伝子およびDsRed−Express2の赤色蛍光タンパク質コード配列からなる。この発現カセットを、CP77タンパク質コード配列がその天然プロモーター(CP77 ATG開始コドンの上流100bp配列)の制御下にあり、かつ、ポックスウイルス初期転写終止配列(T5NT)で終わるように、Life Technologies GeneArtにより、合成作製した。DsRedタンパク質コード配列はワクシニアウイルス初期/後期プロモーターの制御下にあり、また、ポックスウイルス初期転写終止配列で終わる。
D13L−F1およびD13L−F2 PCR産物を選択/リポーターカセットとともに、ClonTechからのInFusionキットに供給されるpUC19中に、製造者の説明書に従うIn−Fusionクローニングによってアセンブルし、pLL09を作出した。
COP−D13L ORFを、タンパク質コード配列の大部分と保存されている後期プロモーターエレメント「TAAAT」を欠失させることによって不活性とした。COP−D13L ORFはワクシニアウイルス後期プロモーターの制御下にあり、ここで、保存されている後期プロモーターエレメントはプロモーター活性に極めて重要である(Moss, 2007) −これの欠失はCOP−D13L ORFのサイレント化をもたらす。タンパク質コード配列および保存されているプロモーターエレメントの欠失は、VACV−COPとpLL09の間の相同組換えによって達成され、相同組換えの結果、欠失した領域にCP77/DsRed発現カセットが挿入される。この発現カセットの挿入は、この際にSCV104と呼ばれる組換えウイルスを、CHO細胞で、ただし、p−LL19−CHOなどの機能的D13タンパク質を発現する細胞でのみ増殖可能とする。相同組換え後、混入している「持ち越し」の親ウイルス(VACV−COP)は、複数回の連続的プラーク精製によって除去された。混入親ウイルスの存在は挿入部位のPCR分析によってモニタリングした。
増殖培地(RPMI−1640/10%FCS/2mM Glutamax/Pen−Strepおよび1000μg/mLジェネティシン)を含有する3本のT25フラスコにp−LL19−CHOを播種し、100%コンフルエントまで37℃/5%CO2で培養した。感染当日、2本のフラスコにmoi 0.01pfu/細胞でVACV−COPを感染させ、他のフラスコは非感染とした(非感染対照)。フラスコ1および2を室温で45分間感染させた後、ウイルス接種物を除去し、細胞単層をPBSで2回洗浄した。洗浄後、4mlの維持培地(MM:RPMI−1640/2%FCS/2mM Glutamax/Pen−Strep)を、同じ洗浄工程を経たフラスコ3を含め、各フラスコに加えた。
原理は、相同組換え抽出液を連続希釈し、各希釈液を用いて、48ウェルプレート中で培養した1列のp−LL19−CHO細胞に感染させるというものである。この目的は、1pfu感染/ウェルまでウイルスを希釈し、次に、感染のおよそ30時間後に蛍光プラークを1つだけ含むウェルを探し、その後採取することである。
相同組換えおよびプラーク精製後に、D13L ORFが実際にCP77/DsRed発現カセットで置換されていたかどうかを判定するためにPCR分析を行った。PCRプライマー対は、それらが「導入された」DNAではなく「天然」DNA配列に結合するよう、2つのフランキング相同組換えアームの領域の外側に結合するように設計した。このような方法でのプライマー対の設計は、このプライマー対がPCR増幅のDNA鋳型としてVACV−COPおよびSCV104を使用することができ、PCR産物のサイズが発現カセットのD13L ORFへの挿入、または挿入のないウイルス、すなわち、VACV−COPの検出の指標となることを意味する。このPCRアッセイは挿入の存在を示すだけでなく、複数回のプラーク精製の後に残留する混入親ウイルス(VACV−COP)がなお存在するかどうかを確認することもできる。VACV−COPの望まない微量混入の存在は、この混入がSCV104にトランスでのD13ヘルプを提供する可能性があり、それによりSCV104の弱毒生が低下することから、極めて望ましくない。
ウイルスDNAは、200μLの上記SCV104増幅ウイルスからDNeasy Tissueキットを製造者の説明書に従って用いて抽出した。簡単に述べれば、これは、20μlのプロテイナーゼKを200μLのウイルス抽出液に加えてよく混合することにより行った。これに、200μlのバッファーALを加え、十分に混合し、その後、56℃(加熱ブロック)で10分間インキュベートした。インキュベーション後、200μlの100%エタノールを加え、よく混合し、次いで、全内容物をスピンカラムに加えた。製造者のユーザーハンドブックによって指示されているように、遠心分離によって液体をスピンカラムに通した後、スピンカラムをAW1およびAW2バッファーで洗浄した。スピンカラムに結合したDNAを2回の100μL AEバッファーで溶出させた。溶出したDNAを1本の試験管に合わせ、PCR分析用とするか、またはPCR分析まで4℃で保存した。
SCV104から抽出したDNA(上記の第4.2.3.1節参照)をPCR増幅の鋳型として使用し、D13L ORF内で挿入が起こったかどうかを判定した。下記のPCRプライマーは、SCV104 DNAからの増幅が、親ウイルスVACV−COPから増幅された2881bpのPCR産物とは対照的に4360bpのPCR産物を増幅するように、D13L ORFの外側に隣接する配列に結合する。PCR分析は、SCV104の6回目のプラーク精製クローンが初めて4000bpより大きく5000bpより小さいものに相当する産物を増幅することを示し、このことはSCV104がD13L ORF内にCP77/DsRedカセットを含むことを示す。3000bp前後のPCR産物が存在しないことは、このSCV104増幅原液には検出可能なレベルの親ウイルスの混入がないことを意味する。
プラーク感染力アッセイによるSCV104の弱毒化に関する試験
D13L ORFによりコードされるタンパク質はウイルスアセンブリに必須であるので、SCV104によりレスキューされたウイルスが細胞に侵入しても、ワクシニアウイルスに対して許容性の通常細胞では感染性後代ビリオンを生産できず、従って、初期感染が隣接する細胞へ拡散して絶えず拡大する感染巣を形成することができないと予想される。これがその通りであることを確認するために、感染ウイルスの細胞から細胞への拡散が数日の期間でモニタリングできるように、本明細書に記載されるD13L欠損ウイルス(SCV104)を、少数のプラーク形成単位が6ウェルプレートで培養された細胞を感染させるために使用できる点まで連続希釈した。本研究では3種類の細胞株を検討した:ワクシニアウイルスに対して許容性である143B細胞、ワクシニアウイルスに対して非許容性であるが、ワクシニアウイルスがCP77タンパク質を発現する場合には可能となるCHO細胞およびD13Lタンパク質を発現する組換え細胞株であるp−LL19−CHO。非機能性D13−タンパク質が発現され得るようにD13L ORF内にCP77/DsRed発現カセットが挿入された本発明に記載のウイルスが唯一、p−LL19−CHO細胞株で感染力のある感染巣を形成するはずである。143B細胞単層内の感染巣の存在は、ウイルス集団混合物内に混入ワクシニアウイルスが存在することを示し、これは混入がD13Lヘルプをトランスで提供するからである。CHO単層内の感染巣の存在は、CP77/DsRedカセットの挿入がD13L ORFを不活化していなかったことを意味する。
143B細胞、CHO細胞およびp−LL19−CHO細胞を複数の6ウェルプレートに播種し、増殖培地(RPMI−1640/10%FBS/2mM Glutamax/pen−strep、およびp−LL19−CHOにのみ1000μg/mLジェネティシン)中、37℃/5%CO2で、細胞単層が100%コンフルエントとなるまで培養した。
増幅した、3回目のプラーク精製ウイルス抽出液を細胞の感染に用いた。このウイルスの力価は未知であるため、下記のように、ウイルス原液の10倍連続希釈を10−4まで行った:まず、60μlのウイルス原液を6mlのMM培地で希釈し(Dil 1; 1:100希釈)、次に、800μlの希釈液1を7.2mlのMM培地に加えることによりさらなる希釈液を作製し(希釈溶液2;10−3希釈)、その後、10−4希釈となるように繰り返した。感染については、500μLの各希釈液を6ウェルプレートの各ウェルに加え、各細胞株につき1プレートを使用した。ウイルス吸着は室温で45分間行い、その後、ウイルス接種物を各ウェルから除去し、各ウェルをPBSで洗浄し、その後、MMを2mL/ウェルで加えた。これらのプレートを37℃/5%CO2でインキュベートし、蛍光顕微鏡下で毎日観察した。10−2希釈液が観察に最良のウイルス感染率を生じた。
ウイルス感染は蛍光顕微鏡(Olympus IX51)下でDsRedフィルター(Cat#U−MRFPHQ、Olympus)を用いて観察した。CellSensデジタルイメージングソフトウエア(Olympus)を用いて画像を取り込んだ。
10−2希釈液による感染で、初期単細胞感染および隣接細胞への感染の拡散を観察するために最良の結果が得られた。143B細胞の観察では、1日目に単細胞感染が存在し、このウイルスは2日目および3日目までに隣接細胞に拡散できなかったことを示し、このことは、ウイルスの単細胞への侵入は起こったものの、2日目および3日目までに感染性ウイルス後代は生産されなかったことを示す。CHO単一感染細胞についても同じことが言え、すなわち、初期単細胞感染から感染性ウイルス後代は生産されなかった。
D13Lを発現するC11−LL19−HeLa細胞株の構築
D13L欠失を有する非蛍光SCVの力価を測定するために、溶菌斑の形成を支持するワクシニア許容細胞株からなるD13タンパク質発現レスキュー細胞株を作出した。CHO細胞では、CP77を発現するワクシニアウイルスまたはCP77の細胞株発現は、クリスタルバイオレットにより染色可能で目視で計数できる溶菌斑の形成を支持しない。力価測定細胞株を作出するために、HeLa細胞に、構成的哺乳動物プロモーター、開始コドンの前後にコザック配列を含むD13タンパク質コード配列からなりポリアデニル化シグナル配列で終わる発現カセットの安定組み込みによりD13タンパク質を発現するように形質導入を行った。次に、このカセットを、宿主細胞ゲノムDNAへの安定な遺伝子導入および抗生物質選択による組み込み成功の選択を可能とするプラスミドベクターにクローニングした。次に、形質導入細胞を、D13発現カセットを含む細胞を選択するための抗生物質選択を使用することにより増殖させ、その後、0.001pfu/細胞のmoiで細胞単層に感染させ、3日で最大のプラークサイズを生じた細胞株クローンを選択することにより、SCV104(D13L ORF欠失)でプラークアッセイを行った。SCV104は、そのD13L ORFが2つの発現カセット:一方はCP77タンパク質の発現のためのもの、他方は赤色蛍光タンパク質の発現のためのものに置き換わっている。D13タンパク質を発現するHeLa細胞株にSCV104を感染させると、赤色蛍光溶菌斑が生じる。
D13細胞形質導入ベクター:
pLL19の構築は上記されている。このプラスミドでは、C末端フラッグタグD13タンパク質(protrein)コード配列が構成的ヒト延長因子1αプロモーターの制御下にあり、細胞ゲノムDNAへの安定な遺伝子導入は転位により媒介される。転位はまた、増殖培地にG418/ジェネティシンを加えることにより形質導入細胞が陽性選択できるように、ネオマイシン抗生物質選択発現カセットも挿入する。
HeLa細胞をT25フラスコに播種し、RPMI−1640/10%FBS/2mM Glutamax/pen−strep増殖培地中でおよそ50%コンフルエントまで培養した。Qiagen(Cat#301425)からのEffecteneトランスフェクション試薬を用い、製造者の説明書に従って、1μgのpLL19をT25フラスコの50%コンフルエントHeLa細胞にトランスフェクトした。次に、トランスフェクト細胞を増殖培地(RPMI 1640/10%FBS/2mM Glutamax/Pen−Strep)中で一晩インキュベートした。翌日、培地を形質導入細胞を選択するための1000μg/mLジェネティシンを含有する新鮮な増殖培地に交換した。ほとんどの細胞が死滅した際に、残っている細胞を、TrypLE Select(Gibco−Invitrogen Corp、Cat#12563−029)を用いてそれらをフラスコ表面から剥がすことによって回収し、増殖培地および1000μg/mLジェネティシンを含有する96ウェルプレートで単細胞を選別した。これらのプレートを各ウェルに細胞のコロニーが見られるまで37℃/5%CO2でインキュベートした。選択培地は2〜3日毎に交換した。細胞の各コロニーを回収し、以下のように培養することにより連続的に拡大培養した:48ウェルプレートから24ウェルプレートへ、6ウェルプレートへ、T75フラスコへ、冷凍細胞原株を作製するまで1:5分割比でT75フラスコにて維持。
SCV104は、そのD13L ORFが牛痘ウイルス025LプロモーターおよびCP77タンパク質をコードするORFならびに赤色蛍光タンパク質発現カセット(DsRed Express2)に置き換えられているワクシニアウイルスである。CP77発現はHeLa細胞におけるプラーク形成には重要でないかまたは必要でないが、このウイルスはD13タンパク質の細胞株発現の不在下では増殖しない。しかしながら、D13タンパク質を発現するHeLa細胞株では、SCV104は増幅し、他の隣接細胞に拡散し、そうすることで細胞単層において赤色蛍光溶菌斑を形成することができるはずである。このウイルスを、プラーク形成を最良に支持するクローンを選択するために、クローンLL19−HeLa細胞株におけるプラーク形成試験で使用した。
LL19−HeLaのいくつかの細胞株クローンを6ウェルプレートのウェルに播種し、1000μg/mLのジェネティシンを含有する増殖培地中で100%コンフルエントまで37℃/5%CO2で培養した。
SCV104を用い、ウイルスをMM(RPMI−1640/2%FBS/2mM Glutamax/pen−strep)で103pfu/mlに希釈することにより、0.001pfu/細胞で細胞に感染させた。1mlの希釈ウイルスを感染のために各ウェルに加えた。6ウェルプレートの各ウェルは、コンフルエントの際におよそ1×106細胞を含むので、1mlの103pfu/mlはmoi 0.001となる。moi 0.001は、1個の感染細胞からのプラーク形成を保証する。総てのプレートを室温で1時間インキュベートし、これによりウイルスは細胞に吸着でき、その後、1mLのMMを各ウェルに加え、次いで、総てのプレートを37℃/5%CO2でインキュベートして細胞へのウイルスの同時的侵入を促進し、その後、ウイルス増幅により細胞から細胞への拡散が経時的に起こった。赤色蛍光プラークの形成を蛍光顕微鏡下で毎日観察した。
3日間のウイルス感染およびプラーク形成を蛍光顕微鏡(Olympus IX51)下でDsRedフィルター(Cat#U−MRFPHQ、Olympus)を用いて観察した。CellSensデジタルイメージングソフトウエア(Olympus)を用いて画像を取り込んだ。
感染後1日目に、総ての感染が散在する小さな赤色蛍光巣を生じた。3日目までに、総てのクローン細胞株が相当な大きさの赤色蛍光溶菌斑を生じ、クローン11(C11)は試験した総てのクローンで有意に最大のプラークサイズを生じた。
これらの結果は、C11クローン(C11−LL19−HeLa)は、SCV104感染から、試験した総てのクローンで最大のプラーク形成を支持するのに十分なD13タンパク質を発現していたことを示す。この細胞株クローン(C11)は、ワクシニアウイルスの力価測定を行うために慣用される力価測定の溶菌斑計数法を用いてD13L欠失ワクシニアウイルスを定量するために優れている。
CP77およびD13Lを発現するp−LL07−LL29−CHO細胞株の構築
CHO細胞においてD13L ORF欠失を有するVACV−COPウイルスをレスキューするためには、D13およびCP77タンパク質を発現するCHO細胞株を構築しなければならないと思われた。これを、発現を駆動するための哺乳動物プロモーター、D13またはCP77タンパク質をコードする、CHOに好ましくコドンを最適化したDNA配列、続いてポリアデニル化シグナル配列からなるD13哺乳動物発現カセットおよびCP77哺乳動物発現カセットを構築することにより行った。次に、これらのカセットを、宿主細胞ゲノムDNAへの安定な遺伝子導入および抗生物質選択による組み込み成功の選択を可能とするプラスミドベクターにクローニングした。次に、形質導入細胞を、D13発現カセットとCP77発現カセットを含む細胞を選択するための抗生物質選択を使用することにより増殖させた。CP77の発現を確認するために、増強緑色蛍光タンパク質(SCV505)を発現するワクシニアウイルスを用いてトランスジェニック細胞株に感染させ、蛍光プラークの生成を4日間にわたってモニタリングした。4日わたって絶えず拡大する緑色蛍光プラークサイズにより、この細胞株によるCP77発現が確認された。D13タンパク質の発現を確認するために、CP77(SCV104)およびDs赤色蛍光タンパク質を発現するD13L欠損ワクシニアウイルスを用いてトランスジェニック細胞株に感染させ、プラークの生成を4日間にわたってモニタリングした。4日にわたって絶えず拡大する赤色蛍光プラークサイズにより、この細胞株によるD13タンパク質発現が確認された。
CP77タンパク質コード配列の構築:
CP77タンパク質コード配列は、GeneArt GmbH(ドイツ)により、牛痘ウイルス・ブライトンレッド株UniProtKB/Swiss−Prot:P12932.1の025L ORFによりコードされるCP77のアミノ酸配列からDNA配列を再構築(バックトランスレーションまたはリバーストランスレーション)することによって合成生成され、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞での発現のためにコドンが最適化された。
pPH51(コドンが最適化されたCP77タンパク質配列を保持するクローニングプラスミド)由来のコドンが最適化されたCP77タンパク質コード配列を、5’プライマーが開始コドン前後にコザック配列を付加するように設計され、3’プライマーが終止コドンの前にフラッグタグ配列を付加するように設計されたPCRプライマー対を用いてPCR増幅した。増幅されたPCR産物を、DNA2.0 Inc(USA)から購入したトランスポゾンpiggybacベクターpJ507−2(Hyg+)にBsaIクローニング部位を介してサブクローニングした。BsaI部位へのクローニングは、cometGPFコード配列をCP77タンパク質コード配列に効果的に置き換えてpLL07作出する。この時、CP77は構成的ヒト延長因子1αプロモーター(EF1a)の制御下となり、両者がトランスフェクト細胞のゲノムに安定に組み込まれれば、ハイグロマイシン耐性遺伝子とともに共発現される。宿主ゲノムへの安定組み込みは、piggyBacベクターのレフトおよびライトトランスポゾンボーダーが結合しているDNA配列のトランスポゾン組み込みにより媒介される。
フォワードプライマー配列:
フラッグタグ配列を下線で示し、これに終止コドンが続く(小文字)。
CHOコドン最適化D13タンパク質コード配列をpLL19(従前に記載)からPCR増幅してC末端フラッグタグ配列とHAタグ配列を交換し、その後、DNA2.0 Inc(Cat#pJ503−2)から購入したpJ503−02(CometGFPおよびNeo+を有するpHULK piggyBac哺乳動物発現ベクター)のBsaIクローニング部位にクローニングした。
C末端フラッグタグ配列を含まないコドン最適化D13タンパク質コード配列をpLL19からPCR増幅し、DNA2.0 Inc(Cat#pJ503−2)から購入したCometGFPおよびNeo+)を有するトランスポゾンpiggyBacベクターpJ503−2(pHULK piggyBac哺乳動物発現ベクターのBsaIクローニング部位にサブクローニングし、pLL29を作出した。In−Fusionクローニング(Clontech:リガーゼ不含クローニング)によるBsaI間のクローニングは、in vitro相同組換えにより、cometGPFコード配列を除去してそれを新たにHAタグD13タンパク質コード配列に置き換える。この時、D13LchoHAタグタンパク質コード配列は構成的ヒト延長因子1αプロモーター(EF1a)の制御下となり、両方がトランスフェクト細胞のゲノムに安定に組み込まれた場合にネオマイシン耐性遺伝子と共発現される。宿主ゲノムへの安定組み込みは、piggyBacベクターのレフトトランスポゾンボーダーとライトトランスポゾンボーダーによって挟み込まれたDNA配列のトランスポゾン組み込みにより媒介される。pLL29のプラスミドマップを以下に示す。
フォワードプライマー配列:
CHO細胞をT25フラスコに播種し、RPMI−1640/10%FBS/2mM Glutamax/pen−strep増殖培地中でおよそ50%コンフルエントまで培養した。Qiagen(Cat#301425)からのEffecteneトランスフェクション試薬を用い、1μgのpLL07および1μgのpLL29を、製造者の説明書に従って、T25フラスコの50%コンフルエントCHO細胞にトランスフェクトした。次に、トランスフェクト細胞を増殖培地(RPMI 1640/10%FBS/2mM Glutamax/Pen−Strep)中で一晩インキュベートした。翌日、培地を形質導入細胞を選択するための500μg/mLジェネティシンおよび250μg/mlハイグロマイシンBを含有する新鮮な増殖培地に交換した。選択培地はほとんどの細胞が死滅するまで2〜3日毎に交換し、単細胞に由来した細胞の残っているコロニーを剥がした。形質導入細胞が90〜100%コンフルエントまで増殖した際に、TrypLE Select(Gibco−Invitrogen Corp、Cat#12563−029)を用いてそれらを回収し、さらなる細胞拡大培養のためにT75フラスコに播種した。この新たなポリクローナル細胞株をp−LL07−LL29−CHOと呼称した。
SCV505は、増強緑色蛍光タンパク質(EGFP)を発現し、CHO細胞においてCP77タンパク質の存在下でのみ増殖するワクシニアウイルスである。このウイルスを、p−LL07−LL29−CHOにおいてこの細胞株によるCP77発現を確認するためのプラーク感染力試験で用いた。SCV104は、そのD13L ORFが牛痘ウイルス025LプロモーターおよびCP77タンパク質をコードするORFならびに赤色蛍光タンパク質発現カセット(DsRed Express2)に置き換えられているワクシニアウイルスである。このウイルスはD13タンパク質の細胞株発現の不在下では増殖しない。このウイルスをp−LL07−LL29−CHOにおいてこの細胞株によるD13発現を確認するためのプラーク感染力試験で使用した。
本試験では、SCV505(D13+ CP77− EGFP+)およびSCV104(D13− CP77+ DsRed+)による感染からのp−LL07−LL29−CHOによるD13およびCP77の発現を定性する助けとするために種々の細胞株を使用した。以下の細胞株で予測される結果は次の通りである。
この細胞株は、ワクシニアウイルス感染に対して通常許容性である。このウイルスはこの細胞株において通常感染性であるので、プラーク形成は、SCV505感染に関する緑色蛍光によって検出されるように、増殖したウイルスの細胞から細胞への経時的拡散を示す。しかしながら、SCV104感染に関する赤色蛍光が欠如しているかまたは単細胞に限られることで検出されるように、見られるべきプラーク形成がなく、これは細胞株またはウイルスによるD13タンパク質発現がないために、増殖したウイルスの細胞から細胞への経時的拡散がないことを示す。
これはpLL19形質導入を介してD13タンパク質を発現するワクシニアウイルス許容細胞株である。SCV505感染からのプラーク形成が予想され、D13の細胞株発現とは無関係に、緑色蛍光により検出される増殖したウイルスの細胞から細胞への経時的拡散を示す。このウイルスはD13タンパク質の細胞株発現のためにこの細胞株では増殖可能であるので、SCV104感染からのプラーク形成が予想される。
この細胞株は、ワクシニアウイルス感染に対して非許容性である。赤色または緑色蛍光が欠如しているかまたは単細胞に限られることにより検出されるように、SCV505感染およびSCV104感染からのプラーク形成は見られないと予想される。これは、このウイルスがCP77を発現できるとしてもSCV104をレスキューするために必要とされる細胞株によるD13タンパク質発現がないため、およびSCV505をレスキューするために必要とされる細胞株によるCP77タンパク質発現がないために、増殖したウイルスの細胞から細胞への経時的拡散は見られないことを示す。
これは、D13およびCP77の両タンパク質を発現するCHO細胞株である。SCV505感染からのプラーク形成が予想され、緑色蛍光により検出されるように、増殖したウイルスの細胞から細胞への経時的拡散を示すことは、CP77タンパク質の細胞株発現を示す。SCV104からのプラーク形成が予想され、赤色蛍光により検出されるように、増殖したウイルスの細胞から細胞への経時的拡散を示すことは、D13タンパク質の細胞株発現を示す。
Vero、CHO、C11−LL19−HeLa、およびp−LL07−LL29−CHO細胞株を複数の6ウェルプレート(1つはSCV505感染用および他はSCV104感染用)2セットに播種し、対応する増殖培地(下記の通り)中、37℃/5%CO2で100%コンフルエントまで培養した。
・Vero、CHO: RPMI−1640/10%FBS/2mM Glutamax/pen−strep
・C11−LL19−Hela: RPMI−1640/10%FBS/2mM Glutamax/pen−strep、および1000μg/mLジェネティシン
・p−LL07−LL29−CHO: RPMI−1640/10%FBS/2mM Glutamax/pen−strep、および500μg/mLジェネティシンおよび250μg/mlハイグロマイシンB
SCV104およびSCV505を用い、ウイルスをMM(RPMI−1640/2%FBS/2mM Glutamax/pen−strep)に103pfu/mlとなるように希釈することにより、0.001pfu/細胞で細胞に感染させた。1プレートにつき1ウイルス: 感染のために1mlの希釈ウイルスを各ウェルに加えた。6ウェルプレートの各ウェルは、コンフルエントの際におよそ1×106細胞を含むので、1mlの103pfu/mlはmoi 0.001となる。moi 0.001は、1個の感染細胞からのプラーク形成を保証する。総てのプレートを室温で1時間インキュベートし、これによりウイルスは細胞に吸着でき、その後、1mLのMMを各ウェルに加え、次いで、総てのプレートを37℃/5%CO2でインキュベートして細胞へのウイルスの同時的侵入を促進し、その後、ウイルス増幅により細胞から細胞への拡散が経時的に起こった。蛍光プラークの形成を蛍光顕微鏡下で毎日観察した。
4日間のウイルス感染およびプラーク形成を蛍光顕微鏡(Olympus IX51)下で、SCV104ウイルスにはDsRedフィルター(Cat#U−MRFPHQ、Olympus)を、SCV505にはGFPフィルター(Cat#U−MGFPHQ、Olympus)を用いて観察した。CellSensデジタルイメージングソフトウエア(Olympus)を用いて画像を取り込んだ。
moi 0.001でのSCV104およびSCV505によるCHO細胞の感染:
感染後1日目に、散在性の単細胞蛍光のみが見られ、これは両ウイルスが細胞に侵入したが、隣接細胞に感染を拡散するまでには増殖していなかったことを示す。しかしながら、これは感染後2日目から4日目にも同じ進行状態に留まり、すなわち、単細胞感染のみが見られ、ウイルスは時間が経っても隣接細胞に拡散しなかった。
SCV505による感染は、予想通り、感染後1日目に小さなプラークを形成し、これらは総て、4日目までに総てのプラークが合体して、細胞単層の1つのコンフルエント感染となる時点までサイズを増した。これは、感染の拡散に向かう1日目から感染後4日目までの全面化までウイルスが増殖したことを示した。しかしながら、これはSCV104感染とは全く異なる。感染後1日目に、散在性の単細胞蛍光のみが見られ、これはその後3日にわたって同じ状態に留まった。これは、SCV104は、このウイルスがD13L ORFを欠いており、ウイルスゲノム複製の後にウイルスのアセンブルを開始できないので増幅および増殖ができなかったこと、また、この細胞株はD13タンパク質を発現せず、ウイルス増幅のレスキューを補助しなかったことを示す。
SCV505による感染は、予想されたように、感染後1日目に小さなプラークを形成し、これらは、4日目までに総てのプラークが合体して細胞単層の1つのコンフルエント感染となる時点までサイズを増した。これは、感染の拡散に向かう1日目から感染後4日目までの全面化までウイルスが増殖したことを示した。SCV104による感染も同じ結果をもたらし、この細胞株によって産生されたD13タンパク質がSCV104におけるD13L ORFの欠如を補足したこと、およびこの細胞株によって産生された量が、無傷のD13L ORFを有するSCV505に匹敵し得るウイルス増幅および感染拡散を支持するのに十分であったことを示す。
SCV104およびSCV505の両方について、感染後1日目に小さな感染巣が見られた。その後3日にわたって、これらの感染巣は拡大し、絶えず増殖するより大きなプラークとなり、感染後4日目までに最終的に合体してコンフルエント感染となった。これは、CP77が発現され(それがSCV505増幅および増殖を支持したため)、D13タンパク質も発現された(それがSCV104の増幅および増殖を支持したため)ことを示した。
これらの結果は、CP77およびD13タンパク質を発現するCHO細胞株がD13L欠損ワクシニアウイルスの生産および製造のための細胞基質として使用可能であることを実証する。通常の許容細胞の感染の際には、D13L欠損ウイルスは、ウイルスアセンブリを開始できず、従って、その感染生活環を全うできないので、それは安全性の点でヒトおよび動物のワクチン接種用の優れたウイルスワクチン送達ベクターとなる。しかしながら、バイオテクノロジー適合性CHO細胞株では、この細胞株がCHO宿主域タンパク質(CP77)およびミシングアセンブリタンパク質(D13タンパク質)を発現する場合には、この弱毒性の高いワクシニアベクターは製造できない。
ウエスタンブロット法によるp−LL07−LL29−CHO細胞株のD13およびCP77タンパク質発現分析
バックグラウンド情報
p−LL07−LL29−CHOにより発現されるD13およびCP77タンパク質はタグを持ち、D13およびCP77タンパク質のC末端上のアミノ酸タグ配列を特異的に認識する抗体を用いて検出することができる。D13およびCP77タンパク質を特異的に認識する抗体が存在しなくても、これらの抗タグ抗体を用いてウエスタンブロット分析を行い、p−LL07−LL29−CHO細胞株においてD13およびCP77タンパク質の発現を確認することができる。D13タンパク質のC末端はHAタグアミノ酸配列「YPYDVPDYA」を含み、CP77タンパク質のC末端はフラッグタグアミノ酸配列「DYKDDDDK」を含む。
以下の細胞株をT75フラスコに播種し、適当な選択抗生物質を含有する増殖培地(RPMI 1640/10%FBS/2mM Glutamax/Pen−Strep)中で100%コンフルエントまで培養した: 選択抗生物質無しのCHO、500μg/mLジェネティシンおよび250μg/mlハイグロマイシンBを用いるp−LL07−LL29−CHO、250μg/mlハイグロマイシンBを用いるp−LL07−CHO、および1000μg/mLジェネティシンを用いるC11−LL19−HeLa。コンフルエント細胞単層を剥がし、TrypLE Selectを含む単細胞懸濁液中、37℃で10分間消化した。各フラスコから細胞を回収し、300gで5分間の遠心分離によりペレットとし、PBSで2回洗浄した。最終洗浄後、細胞ペレットを500μLのPBSに再懸濁させた。このタンパク質抽出液に4x SDS−PAGEローディングバッファーを加えて終濃度を1xとし、98℃で2〜3分加熱した。変性したタンパク質サンプルをBiorad Mini−PROTEAN(登録商標)TGX Stain−Free(商標)プレキャストゲル(グラジェントゲル)にて200Vで30〜45分、電気泳動に付した。電気泳動後、分離されたタンパク質を、100Vで1時間のエレクトロブロッティングによりニトロセルロース膜に転写した。
HAタグ検出によるD13タンパク質の検出:
抗HAタグ抗体はp−LL07−LL29−CHOから調製した全細胞タンパク質抽出液から予想されたサイズのタンパク質を検出することができたが、CHO細胞から調製した全細胞タンパク質抽出液から検出できたタンパク質は無かった。これは、p−LL07−LL29−CHOがD13タンパク質を発現していたことを明らかに示した。
抗フラッグタグ抗体は、p−LL07−LL29−CHOおよびp−LL07−CHO(CHO細胞株はCP77のみ発現する)から調製した全細胞タンパク質抽出液から予想されたサイズのタンパク質を検出することができたが、CHO細胞から調製した全細胞タンパク質抽出液から検出できたタンパク質は無かった。これは、p−LL07−LL29−CHOおよびp−LL07−CHOがCP77タンパク質を発現していたことを明らかに示した。
C11−LL19−HeLaにより発現されたD13タンパク質は、C末端フラッグタグを有するD13タンパク質を発現し、この細胞株から作製した全細胞タンパク質抽出液のウエスタンブロットを行った場合、抗フラッグタグ抗体は予想されたサイズのタンパク質を検出することができた。これはC11−LL19−HeLaがD13タンパク質を発現していたことを明らかに示した。
感染に用いたウイルス量(インプット)は4×104pfu/mLであった。比較のため、収量は104値として表す。値は各時点での平均収量、すなわち、3mL(6mLを2ウェルで割ったもの)採取物からの収量に相当する。
下表は各時点で各細胞株からインプットレベルを超えて生産されたウイルスの収率、すなわち、アウトプット/インプット比を示す。
フラスコ当たりのウイルス抽出液容量は1mLであった。力価測定のためのプレーティング容量は1mLであった。従って、ウイルス収量は力価測定値(pfu/mL)に1mL(プレーティング容量)を掛けたものに等しい。
Claims (5)
- 改変されたチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞であって、この改変細胞が、非改変CHO細胞ではほとんど増殖できないかまたは増殖不能であるワクシニアウイルスの増殖を保持するよう、構成的プロモーターの制御下にあるCP77をコードする配列を含んでなるようにCHO細胞のゲノムが改変され、かつ、前記CHO細胞のゲノムが構成的プロモーターの制御下にあるD13Lをコードする配列をさらに含んでなる、細胞。
- CP77遺伝子の発現が、許容細胞株で見られるものと同等のウイルス収量を生成するようにワクシニアウイルスの増殖を維持する、請求項1に記載の細胞。
- CP77遺伝子の発現が、500を超えるウイルス複製増幅比を維持する、請求項1または2に記載の細胞。
- CP77が、哺乳動物細胞での発現のためにコドンが最適化された連続ヌクレオチド配列によりコードされている、請求項1〜3のいずれか一項に記載の細胞。
- CHO細胞では増殖しないワクシニアスウイルスを増殖させるための方法であって、in vitroでCHO細胞においてワクシニアウイルスを増殖させることを含んでなり、前記細胞株が構成的プロモーターの制御下にCP77をコードおよび発現するように、かつ構成的プロモーターの制御下にD13Lを発現するように改変されている、方法。
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