PL97723B1 - Sposob wytwarzania rekombinanta szczepu wirusa grypy - Google Patents

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarza¬ nia rekombinanta szczepu wirusa grypy, przezna¬ czonego zwlaszcza do szczepionek przeciwgrypo- wych.

Grypa jest choroba wirusowa górnych dróg od¬ dechowych, objawiajaca sie goraczka, bólem glowy, bólami gardla, bólem irniesni oraz zmeczeniem.

W odróznieniu od szeregu chorób wirusowych, wi¬ rus grypy pozostawia tylko krótkotrwala specy¬ ficzna odpornosc u osobnika, dlatego tez notuje sie ponowne zachorowania, gdy dochodzi do epi¬ demii. W ostatnich latach zaczeto przeto przepro¬ wadzac szczepienia pirzeciwgrypowe w celu wywo¬ lania odpornosci na panujacy szczep wirusa grypy, a przez to zapobiegac i ograniczac zachorowania m grype w czasie epidemii.

W latach 40-tych z powodzeniem stosowano in- aktywowane szczepionki przeciwgrypowe. Szcze¬ pionki te mialy jednak te niedogodnosc, ze wytwa¬ rzane byly w oparciu o zabite wirusy i dlatego tez dla uzyskania odpowiedniego stezenia przeciwcial musialy byc stosowane w duzych ilosciach. Ponie¬ waz poszczególne epidemie wywolywane sa anty- genowo róznymi typami wirusa grypy, nie jest mozliwe przewidzenie typu wirusa, który wywola nastepna epidemie, a co za tym idzie wyproduko¬ wanie odpowiedniego zapasu wlasciwej szczepion¬ ki. Wymaga to szybkiego adaptowania sie do no¬ wych epidemii wybuchajacych na swiecie. 2 Zaproponowano przeto szczepionki zywych szcze¬ pów wirusa o oslabionej zjadliwosci, w których szczep wirusa pasazowano w róznych ukladach ko¬ mórkowych, az do uzyskania utraty zdolnosci wy¬ wolywania choroby, a jednoczesnie zachowania w pelni zdolnosci antygenowych (immunogenicz- nych) szczepu. Z uwagi na utrzymane zdolnosci namnazania sie wirusa w organizmie zywym mo¬ zliwe jest stosowanie malej dawki szczepionki, co w konsekwencji zwalnia od koniecznosci produko¬ wania duzych ilosci szczepionki, oszczedzajac czas i prace. Dla szczepionek tych wazne jest jednakze,, zeby odzjadliwione szczepy byly nieszkodliwe i ze¬ by doinfekowanie bylo ograniczone do minimum.

Znana jest genetyczna rekombinacja miedzy róz¬ nymi szczepami grypy w celu uzyskiwania udosko¬ nalonego materialu antygenowego do inaktywowa- nych lub zywych szczepionek. Oplisano i przebada¬ no na przyklad szczepy hybrydy, pochodzace od odzjadliwionego oraz od w pelni zjadliwego szcze¬ pu, ale zadna z odmian rekombinanta nie zostala zaakceptowana do praktycznego stosowania. Przy¬ puszczano, ze korzystne bedzie uzycie szczepu wi¬ rusa grypy, odzjadliwionego przez pasazowanie w róznych ukladach komórkowych, z róznymi ssa¬ kami wlacznie, ale otrzymane szczepy uznano za nieprzydatne ze wzgledów bezpieczenstwa, z uwagi na droge, jaka przeszedl odzjadliwiony szczep ma¬ cierzysty. 97 72397 723 Obecnie stwierdzono, ze odpowiednie i akcepto¬ walne rekombinanty szczepów wirusa grypy mozna otrzymac z polaczenia wysoce odzjadliwionego szczepu macierzystego grypy A, zwlaszcza typu Aj2, ze zjadliwym szczepem macierzystym grypy A. Jako wysoce odzjadliwiony nalezy stosowac szczep, który byl pasazowany wylacznie w ho¬ dowlach z jaj kurzych i wykazuje stosunkowo wyso¬ kie namnazanie wirusa w jajach kurzych oraz zwiekszona zdolnosc tworzenia plytek w komór¬ kach nerkowych cielat. Jako zjadliwy szczep wi¬ rusa grypy A nalezy stosowac szczep, który z dru¬ giej strony wykazuje stosunkowo niskie miano ho¬ dowli, ale pozostaje zasadndczo wolny od zanie¬ czyszczen wirusami ssaków. Tak wyselekcjonowane szczepy rekomibinanta lacza charakterystyczny wzrost szczepu wysoce odzjadliwionego z w pelni zachowanymi wlasnosciami antygenowymi szczepu zjadliwego. ~ Wysokie odzjadliwienie, wymagane dla szczepu pierwszego, oznacza, ze ilosc pasazy dla odzjadli- wienia byla znacznie wieksza od ilosci normalnie potrzebnej do usuniecia cech patogennych. Otrzy¬ mane wirusy o zmniejszonej zjadliwosci po wielu pasazach zachowuja w pelni zdolnosc do wytwa¬ rzania przeciwcial, przy czym nie ulega uszkodze¬ niu system antygenowy, powodujacy powstawanie hemoaglutyniny (H) oraz neuroamidaz (N). T^kie szczepy nie wykazuja zadnych reakcji ubocznych, nawet po wprowadzeniu ich do osobników tak wrazliwych, jakimi sa dzieci i nalezy oczekiwac, ze odpowiednie próby w pelni wykaza bezpieczne stosowanie.

Sposobem wedlug wynalazku rekombinant szcze¬ pu wirusa grypy wytwarza sie z odzjadliwionego szczepu macierzystego wirusa grypy A, który inak- tywuje sie, pozbawiajac go pierwotnej infektyw- nosci, zaszczepia pojedyncza hodowle razem ze zjadliwym szczepem macierzystym, hodowle inku- buje sie, a nastepnie (rozsiewa klony dla usuniecia pozostalosci szczepów macierzystych, po. czym po¬ zadany szczep rekombinant izoluje sie.

W sposobie wedlug wynalazku korzystnie stosuje sie szczep taki, jak wirus A-2, który zostal wyizo¬ lowany 10, a nawet 20 lat temu, aby mogla byc pewnie .ustalona dostateczna róznica antygenowa miedzy ostatnio wystepujacym szczepem zjadliwym a szczepem bezpiecznym. W rzeczywistosci powinna wystepowac róznica antygenowa miedzy szczepami macierzystymi o co najmniej 1 antygen, np. wirus H2 i H8, przy czym wyzsza liczba powinna odpo¬ wiadac ostatnio wystepujacemu szczepowi zjadli¬ wemu.

Oslabienie zjadliwosci szczepu mozna otrzymac przez pasazowanie, np. na zarodkach jajka kurze¬ go, technika; opisana w japonskim opisie patento¬ wym nr 310.662. W opisie tym przedstawiono wy¬ twarzanie szczepu A/OKUDA)57 (H^N2)> który otrzymano ze szczepu typu A-2, wyizolowanego w Osaka, Japonia, w czasie epidemii w roku 1957.

Szczep ten wykazal oslabiona zjadliwosc. W wyzej wymienionym opisie patentowym opisano ponadto inny szczep typu A-2, szczep A(KINUQASA)57.

Jeszcze innym odpowiednim szczepem jest szczep A(JAPAN) 305/57,który zdeponowany zostal w Ame¬ rican Type Culture Collection (ATCC) pod nume¬ rem VR-100.

Szczep OKUDA, o oslabionej zjadliwosci jest szczepem wirusa, korzystnie stosowanym w spo- sobie wedlug wynalazku i mozna go ewentualnie otrzymac z World Health Organisation, WorldInflu- enza Centre, National Institute of Medical Research, Mili Hill, gdzie szczep ten, uzyskany w wyniku 280 pasazy na jajach jest zdeponowany i ogólnie dostepny.

Drugi szczep, potrzebny do rekombinacji sposo¬ bem wedlug wynalazku, moze byc otrzymany droga selekcji z szeregu szczepów wirusa grypy typu A, które zachowaly swoja zjadliwosc w stosunku do czlowieka. Hodowle prowadzi sie na zarodkach jaja kurzego lub innych, zaakceptowanych przez wladze kontrolne, np. National Institute for Biological Standards, Holly Hill, Hampstead. Korzystnie jest, aby szczep jednak byl mozliwie niedawno wyizolo¬ wany przed okresem produkcji szczepu rekombi- nanta. Podobienstwo antygenowe miedzy stosowa¬ nymi wirusami grypy do produkcji szczepionek a wirusami, aktualnie powodujacymi infekcje, daje mozliwosc uzyskania odpornosci u szczepionych osobników.

Na przyklad w dacie pierwszenstwa niniejszego zgloszenia zastosowano z powodzeniem zjadliwy szczep wirusa A(ENGLAND/42/72) (H8N2). Ostatnio wyizolowano wirus A(FINLAND)4/74 (H3N2) i stwierdzono, ze jest on przydatny do wlaczenia go do replikacji w celu otrzymania szczepionki aktualnie wystepujacej grypy. Obydwa szczepy zo¬ staly zdeponowane w wyzej wspomnianej miedzy- narodowej kolekcji w National Institute of Medical Research w Mili Hill i obecnie sa ogólnie dostepne.

Korzystnie sposobem wedlug wynalazku otrzy¬ muje sie z replikacji szczep wirusa grypy, pocho¬ dzacy z odzjadliwego szczepu A grypy, korzystnie 40 szczepu A-2, takiego jak A(OKUDA)57, który pa- sazowano wylacznie w hodowlach na zarodkach jaja kurzego, gdzie stosunkowo silnie namnaza sie, dajac jednoczesnie zwiekszona zdolnosc tworzenia plytek w komórkach nerkowych cielaka oraz ze 45 zjadliwego szczepu wirusa A grypy, który wyka¬ zuje stosunkowo niska zdolnosc namnazania w ho¬ dowli wirusa i zasadniczo jest wolny od zanie¬ czyszczajacych wirusów ssaków.

W pewnych przypadkach przed replikacja zjad- 50 liwych i o oslabionej zjadliwosci szczepów, wska¬ zane jest przeprowadzenie rozsiewu klonów, tak aby kazdy szczep wywodzil sie z pojedynczego pierwotnego wirusa. Ponadto ze wzgledu na to, ze deponowany szczep dostepny jest zwykle w formie 55 zliofilizowanej, na wstepie kazdy szczep wirusa nalezy odtworzyc w odpowiednim srodowisku, ta¬ kim jak sól fizjologiczna buforowana fosforanem oraz na pozywce fosforowanej z tryptoza, korzystnie wobecnosci antybiotyków, które zabijaja ewentual- 60 nieobecne bakterie. Po zaszczepieniu doomoczniowo zarodka kurzego jaja SPF, tj. pozbawionego spe¬ cyficznych chorobotwórczych bakterii i po inku¬ bacji, plyn omoczniowy mozna ekstrahowac i do czasu zuzytkowania przechowywac w niskiej tem- 65 peraturze.\ Aby zadawalajaco odtworzyc obydwa szczepy na¬ lezy zwrócic uwage na zróznicowanie ioh zdolnosci namnazania wirusa w zarodkach jaj kurzych, któ¬ re nie moze byc za. duze. Wirus o oslabionej zjad¬ liwosci z duza zdolnoscia namnazania poddaje sie dzialaniu promieni ultrafioletowych lub promieni gamma, ewentualnlie ogrzewa, w ten sposób in- aktywujac w okolo 99% jego infektywnosc, dopro¬ wadzajac zdolnosc namnazania do równej stosun¬ kowo niskiej zdolnosci namnazania szczepu wi¬ rusa zjadliwego. Opisany wyzej sposób oraz inne sposoby replikacji, w których próbki szczepów wi¬ rusa sa inkubowane razem w jednej hodowli na jednym zarodku jaja, zostaly opisane w Post- graduate Medical Journal, 49, 195^199 (1973).

Nalezy zwrócic uwage, ze tych samych szczepów Wirusa, które poddano replikacji na tego samego typu komórkach, w tych samych warunkach, ale w oddzielnych hodowlach, nie mozna calkowicie odtworzyc, bowiem wykazuja nieco rózne wlasci¬ wosci, takie jak np. zdolnosc namnazania wirusa.

Jednakze ilosc mozliwych replikacji jest ograni¬ czona i przy wlasciwym sposobie postepowania mozna uzyskac odpowiednie szczepy wirusa.

Jesli zastosuje sie szczep Okuda jako szczep wi¬ rusa macierzystego o oslabionej zjadliwosci, stwierdzono, ze prawie wszystkie mozliwe szczepy rekombinanty sa odpowiednie do wytwarzania szczepionek.

W sposobie wytwarzania rekombinantów szcze¬ pów wedlug wynalazku, szczep macierzysty o osla¬ bionej zjadliwosci poddaje sie dzialaniu promieni ultrafioletowych, a nastepnie replikuje ze zjad¬ liwym szczepem macierzystym z równoczesnym zaszczepieniem doomoczniowo hodowli (AOS), otrzymanych z dziesieciodniowych zarodków jaj SPF. Po inkubacji do kazdej hodowli dodaje sie odpornosciowo surowice, korzystnie surowice kró¬ lika lub lasicy lesnej, przygotowana przeciw szcze¬ powi wirusa, o wysokim stopniu czystosci, którego hemoaglutynina jest antygenowe bardzo zblizona albo identyczna ze szczepem macierzystym o osla¬ bionej zjadliwosci. Tym sposobem namnazanie wi¬ rusa szczepu macierzystego o zmniejszonej zjadli¬ wosci moze byc tak zmniejszone, ze po replikacji pozostaje bardzo malo szczepu macierzystego. Ze wzgledu na to, ze zdolnosc namnazania wirusa szczepu macierzystego wirusa zjadliwego jest sto¬ sunkowo mala, tym samym nie zachodzi potrzeba zmniejszania jego zdolnosci namnazania.

Po dalszej inkubacji, hodowle, w których zacho¬ dzi hemoaglutynacja, zbiera sie i porcjami poddaje badaniu nia hamowanie hemoaglutyniny i neuroaimi- nidazy w celu wybrania tych rekombinantów, któ¬ re maja antygenowy skladnik zjadliwego szczepu macierzystego A grypy i sa potencjalnie przydatne do szczepionek. Tak wybrane hodowle nastepnie rozsiewa sie i izoluje klony w celu usuniecia pozo¬ stalosci wirusów macierzystych. Rekombinanty z pozostaloscia wirusów macierzystych odrzuca sie jako nieodpowiednie do dalszego badania. Roz¬ siewanie klonów prowadzi sie metoda ograniczo¬ nego rozcienczania sposobem, opisanym w Post- graduate Medlical Journal (patrz wyzej). Kazdy 723 6 wybrany szczep rekombinant mozna nastepnie pa- sazowac w odpowiedniej hodowli na jaju, takim jak zarodki jaja SPF lub z niej wywodzonych ho¬ dowli AOS. Prowadzi sie jeden lub dwa pasaze, w czasie których zwieksza sie namnazanie szczepu rekombinanta, po czym przygotowuje sie do ba¬ dan na ochotnikach sterylnych, bez antybiotyku zapas, otrzymany z hodowli zarodków jaj kurzych SPF. Badania te prowadzi sie w celu sprawdzenia stabilnosci genetycznej i odpornosci szczepu re¬ kombinanta, który ma byc zaszczepiony czlowie¬ kowi.

W sposobie wedlug wynalazku otrzymywania rekombinanta szczepu do wytwarzania szczepionki przeciwgrypowej w pierwszym etapie inaktywuje sie odzjadliwiony szczep macierzysty dla zasadni¬ czego zmniejszenia jego poczatkowej infekcyjnosci, zaszczepia tym szczepem razem z macierzystymi szczepami zjadliwymi jedna hodowle, inkubuje, na- stepnie rozsiewa klony dla usuniecia szczepów ma¬ cierzystych, po czym izoluje pozadany szczep re¬ kombinant. Eliminowanie szczepu macierzystego o oslabionej zjadliwosci mozna wygodnie przepro¬ wadzic, dodajac do hodowli odpowiednia surowice odpornosciowa. Wlasciwe rekombinanty nastepnie selekcjonuje sie, stosujac rutynowe metody testo¬ wania tak otrzymanych hodowli na hemoagluty- nacje i wlasnosci antygenowe, po czym pozadany rekombinant izoluje sie przez rozsiewanie klonów.

Sterylny zapas, otrzymany z wyselekcjonowanego szczepu rekombinanta jest .ponownie izolowany, np. przez podanie ochotnikom do nosa i zbieranie po¬ pluczyn. Tak otrzymany posiew ponownie pasazuje sie, korzystnie dwukrotnie, na hodowli zarodka jaja i stosuje do przygotowania z niego szczepionki w rozcienczalniku, takim jak sól fizjologiczna, bu¬ forowana fosforanem w obecnosci stabilizatorów, korzystnie hydrolizowanej zelatyny i sorbitolu.

Otrzymana szczepionke, która mozna liofilizowac 40 i w razie potrzeby odtworzyc, podaje sie ludziom, korzystnie donosowo.

Nastepujace przyklady ilustruja wynalazek, nie ograniczajac jego zakresu. 45 Przyklad I. Rekombinant szczepu A(OKUDA) 57 (H^Nj) ze szczepem A(ENiGIiAND) 42/72 (H8N2). 1. Otrzymywanie szczepów macierzystych. Otrzy¬ mywanie szczepu wirusa A(OKUDA) 57 (H2N2) o oslabionej zjadliwosci. Szczep OKUDA A-2, któ- 50 ry pasazowano tylko na hodowlach jaja i poda¬ wano w formie aerozolu dziesiatkom tysiecy dzieci w Japonii bez skutków dzialania toksycznego, otrzymano po 280 pasazach z mianem w odczynie hemoglutyniny 1:1280, w postaci zliofilizowanej. 55 Szczep ten namnazano w 1,5 ml mieszaniny roz¬ tworu soli fizjologicznej, buforowanej fosforanem, pozywki z zawartoscia 10% tryptozy oraz penicy¬ liny i streptomycyny w ilosci po 1500 jednostek miedzynarodowych, po czym wszczepiono doomocz- 60 niowo do trzech dziesieciodniowych zarodków jaj SPF, a nastepnie inkubowano w temperaturze 35°C w czasie 3 dni. Z jednego jaja pobrano plyn omocz- niowy i przechowywano w malej ilosci w tempe¬ raturze —60°C. Do replikacji odmrazano mala ilosc 65 i rozcienczano w soli fizjologicznej w stosunku97 723 8 1:100, a nastepnie dzialano promieniami ultrafio¬ letowymi w ciagu 30 sekund, co wystarczalo dla inaktywacji w przyblizeniu 99% calkowitej infek- tywnosci wirusa.

Otrzymywanie szczepu A(ENGLAND)4272 (H8N2) wirusa zjadliwego. Szczep w postaci' zliofilizowanej próbki plynu omoczniowego otrzymano z National Institute of Medical Research, Mili Hill. Wyizo¬ lowany z zarodnika jaja szczep wirusa pasazo- wano trzykrotnie na jaju z mianem w odczynie hemoaglutyniny 1:128. Liofilizat namnazano w mie¬ szaninie soli fizjologicznej, buforowanej fosfo¬ ranem, pozywki z zawartoscia 10% fosforanu tryp- tozy oraz penicyliny i streptomycyny w ilosci po 1000 jednostek miedzynarodowych. Nastepnie 0,2 ml mieszaniny wszczepiono doomocznioiwo,do trzech dziesieciodniowych zarodników jaj SPF, po czym inkubowano w temperaturze 35°C przez okres 3 dni. Z jednego jaja pobrano plyn omoczniowy i przechowywano w malej objetosci w tempera¬ turze ^60°C. 2. Replikacja oraz izolowanie szczepów rekombi- nantów. Z dziesieciodniowych jaj SPF otrzymano hodowle AOS i przygotowano próbe na hemoa- glutynacje. Do kazdej hodowli dodano 0,03 ml kazdego ze szczepów wirusa, przy czym szczep A Okuda przed poddaniem dzialaniu promieniami, rozcienczono w stosunku 1:100, natomiast zywy szczep A England rozcienczono w soli fizjolo* gicznej w stosunku 1:30. Próbe umieszczono w pla¬ stikowym ipojemniczku i inkubowano na trzesawce (okolo 100 wahan na minute) w temperaturze 37°C.

Po 4 godzinach inkubacji do kazdego pojemniczka dodano odpornosciowa surowice królika do konco¬ wego rozcienczania 1:3000, w celu zmniejszenia namnazania szczepu macierzystego o oslabionej zjadliwosci i dalej inkubowano.

Surowice o duzym stopniu czystosci, która przy¬ gotowano przeciw szczepowi wirusa ACSINGAPO- RE)57 i(H^N2)> który byl antygenowo zblizony bar¬ dzo do szczepu Okuda, przed uzyciem rozcienczono stukrotnie w soli fizjologicznej i poddano dzialaniu promieniami ultrafioletowymi w czasie 2 minut.

Naswietlanie traktowano jako srodek ostroznosci dla zniszczenia ewentualnie obecnych czynników z zewnatrz. Po zakonczonej 48^godzinnej inkubacji w temperaturze 3|7°C, do kazdego pojemniczka do¬ dano 5% zawiesine czerwonych cialek krwd zarod¬ ników jaj SPF do koncowego stezenia 0,5%. sposród 77 hodowli 22 dawaly hemoaglutynacje i te indywidualnie zbierano jako przypuszczalne szczepy rekombinanty. 0,1 ml kazdego przypusz¬ czalnego szczepu rekombinanta wszczepiano do dziesieciodniowych zarodników jaj SPF, po czym inkubowano w temperaturze 37°C w czasie 3 dni.

Przy koncu inkubacji zarodki jaj badano na obecnosc hemoaglutyniny i jej rodzaj identyfiko¬ wano w testach hamowania hemoaglutyniny.

Wstepne badania 4 wyizolowanych szczepów wy¬ kazaly wysoka zdolnosc namnazania wirusa i jak oczekiwano, skladnik hemoaglutyniny zjadliwego szczepu wirusa A England. Niektóre z nich odrzu¬ cono, jesli testy hamowania neuroaminidazy wyka¬ zywaly, ze szczep rekomibinant mial jako skladnik neuroaminidaze macierzystego, o oslabionej zjad¬ liwosci, szczepu A Okuda, a nie pozadanego zjadli¬ wego szczepu A England. Tak wyselekcjonowane wszystkie pozostale hodowle AOS rozsiewano trzy¬ krotnie i izolowano klony w celu usuniecia pozo- stalosci wirusów macierzystych oraz tych szczepów rekombinantów, które wedlug powyzszego testu byly nieodpowiednie do testowania klinicznego.

Na wstepie hodowle wirusa rozmnazano, dziala¬ jac ponaddzwiekami (moc wejsciowa 80 kH/se- io kunde) w ciagu 30 sekund. Nastepnie rozsiewanie klonów prowadzono przy dwu lub trzykrotnym rozcienczeniu, po czym wszczepiano 10-dniowym zarodnikujacym jajom lub hodowli AOS, stosujac na kazde rozcienczenie najmniej 8 replikacji ho- dowli. Posiewy klonów o ograniczonym rozcien¬ czeniu izolowano z hodowli, w której stosowane rozcienczenie wirusa infekowalo tylko 10% repli¬ kacji, jak wskazywala dodatnia hemoaglutynacja w badaniach czerwonych cialek krwi zarodników jaj kurzych SPF. Kazdy wyselekcjonowany roz¬ siew klonów pasazowano raz albo dwukrotnie na 9—fJ.2ndniiowych zarodnikach jaj SPF, natomiast sterylny zapas kazdego wyselekcjonowanego szcze¬ pu rekombinanta przygotowano na 10-dniowych za- rodnikach jaj SPF (bez stosowania antybiotyków).

Zapas ten badano w testach na hamowanie hemo¬ aglutyniny i neuroaminidazy dla skontrolowania skladu antygenowego i wlasciwe przekazywano do . badan klinicznych.

Przyklad II. Rekombinant szczepu A(OKU- DA)57 (HZN2) ze szczepem A(FINLAND)4/74 (H3N2). 1. Otrzymywanie szczepów macierzystych. Otrzy¬ mywanie szczepu wirusa A(OKUDA) 57 (H2N2) o oslabionej zjadliwosci Rozmrozona niewielka ilosc plynu omoczniowego zaszczepionego szczepem Okuda z przykladu I, rozsiewano dwukrotnie i izolowano klony na ho¬ dowli z jaj SPF. Pozywke rozcienczono sola fizjo¬ logiczna w stosunku 1:100 i dzialano promieniami ultrafioletowymi przez 30 sekund.

Otrzymywanie szczepu A(FINLAND)4/74 (H8N2) wirusa zjadliwego Namnazano na jajach szczep z rozmazu gardla, 45 otrzymany z Central Public Health Laboratory, Helsinki, Finlandia, którego miano w odczynie he¬ moaglutyniny wynosilo 1:!2560. Szczep wirusa pa¬ sazowano fraz na wydzielinie ludzkiej i raz na ja¬ jach SPF, a nastepnie rozsiewano dwukrotnie i izo- 50 lowano klony na zarodkach jaj. Plyn omoczniowy, pobrany z jednego jaja, przechowywano w malej objetosci w temperaturze —60°C. 2. Replikacja i izolowanie szczepów rekombinantów Szczep macierzysty A Okuda mieszano ze 55 szczepem A Finland w rozcienczeniu 1:30 w ho¬ dowlach AOS do próby na odczyn hemoagluty- nacji, która w ipojemniczku plastikowym inkubo¬ wano na trzesawce w temperaturze 36°C. Po uplywie 1 godziny, do kazdego pojemniczka 60 dodano przeciwsurowice, doprowadzajac do kon¬ cowego rozcienczenia 1:2000 w celu oslabienia namnazania szczepu macierzystego o oslabionej zjadliwosci i inkubowano dalej. Przeciwsurowice otrzymano z wysoce odpornosciowej na szczep 65 A(OKUDA)57, surowicy lasicy. Surowice przed 4097 723 9 10 uzyciem poddano dzialaniu promieni ultrafioleto¬ wych w ciagu 2 minut. iPo 31 godzinnej inkubacja do kazdego pojem- niczka dodano 0,5% zawiesiny czerwonych cialek krwi zarodków kurzych SPF dla stwierdzenia aktywnosci hemoaglutynaoji. Z 64 hodowli 19 wy¬ kazalo hemoaglutynacje i te zbierano osobno. 0,1 ml kazdego z przypuszczalnych szczepów rekombi- nantów wszczepiono do zarodków jaj SPF i inku- bowano w temperaturze 37°C przez okres 3 dni.

Rodzaj hemoaglutyniiny badano na zarodkach jaj w testach hamowania hemoaglutynacji dla spraw¬ dzenia infekcyjnosci w hodowlach zarodków jaj AOiS oraz miana w odczynie hemoaglutyniny. Na podstawie wyników, 11 sposród 19 zebranych ho¬ dowli, rozsiewano dwukrotnie i izolowano klony na hodowlach AOS i raz na zarodkach jaj SPF, zgodnie ze sposobem, opisanym w przykladzie I.

Sterylny, bez antybiotyków zapas kazdego wyse¬ lekcjonowanego szczepu rekombinanta, otrzymane¬ go z dziesieciodniowych zarodków jaj SPF badano dla skontrolowania skladu antygenowego. 8 próbek wykazalo antygeny A(FIMLAND)4/74, a 3 podobne byly do szczepu A(OKUDA)57 pod wzgledem wlasciwosci namnazania. Te ostatnie poddano ba- dianioin klinicznym.

Badania kliniczne przeprowadzono, stosujac 3 wybrane szczepy rekombinanty, oznaczone nume¬ rami WRL 55, 65 oraz 68, z przykladu I oraz 3 szczepy WRL 94, 100 i 105 których odpowiednie zdolnosci do replikacji podano w tablicy 1 i 2 od¬ powiednio.

Wybrany szczep wirusa pasazowano 1 raz na jajach kurzych i rozcienczano do wlasciwego mia¬ na odczynu. Kazdemu z ochotników podawano 1,0 ml szczepu wirusa do nosa. W trzecim i czwartym dniu po zaszczepieniu wirusa popluczyny zebrano i wszczepiono do jamy omoczniiowej 11-dniowych embrionów jaj kurzych. Po dwu dniach inkubacji w temperaturze 33°C badano na odczyn hemoaglu¬ tyniny szczepu wirusa. Zebrane przed próba su¬ rowice badano 14 dni po zaszczepieniu na przeciw¬ ciala, hamujace hemoaglutynacje (HAI) znanym sposobem, np. opisanym w Br. Med. J. IV, 36, 385 (1968).

W tablicach 3 14 podano nastepujace dane: za¬ stosowany szczep wirusa rekombinanta, dawke in- fektywnosci szczepionki wirusa E.IJ350, ilosc ochot¬ ników poddanych badaniom, poczatkowe miano odczynu HI w surowicy, reakcje (wskazano przez wystepowanie i trwanie goraczki, kataru, zlego sa¬ mopoczucia, zwiekszonego zaipotrzebowania na chusteczki do nosa), ilosc ochotników, w których obserwowano obecnosc wirusa w popluczynach no¬ sa w 3-cim i 4-tym dniu po zaszczepieniu, ponadto ilosc ochotników, u których surowica wykazala wzrost miana w odczynie HAI, zasadniczy wzrost miana w odczynie HAI,* t.j. przynajmniej cztero¬ krotny.

Tablica 1 Ir |j Szczep wirusa I1 i Skczepy wirusa macierzystego Szczepy 1 rekombinanty [ Wirusa A A|(ENGLAiND)42/72 WRL 55 WRL 65 WEL 68 Antygeny Hemoaglutynina H2 H8 H, H8 H8 Neuroaminiidaza Na(1957) N2(1972) ^1972) N2(1972) N2(1972) Zdolnosc do replikacji wirusa (HAU/0,25 ml) 1000 96 256 512 512 HAU = Jednostki hemoaglutyniny Tablica 2 (Szczep wirusa Szczepy wirusa macierzystego Szczepy rekombinanty wirusa AKOKUDA)57 A(FI[NLAiND)4/74 WRL 105 WIRU 100 'WRL 94 Antygeny Hemoaglutynina H2 H, H, H8 H8 Neuroaminiidaza N2(1957) ^,1974) N*C1974) Ng Ng Zdolnosc do replikacji wirusa (HAU/0,25 ml) 941 445 920 1080 903 HAU = Jednostki hemoaglutyniny97 723 11 12 Tablica 3 Próba 1 2 3 4 6 7 Szczep rekom- binant iWRD 55 (WaD 55 WRD55 WRL 55 WRL/65 .WRL 68 WRL 68 cd ^h .aa cd*H "-i A .5 w 107'5 107,5 106'5 105>5 106>5 107.6 107,6 Nr ochotnika /6 7—1 8 4 z11 13\ 3 /5 9-3 Inicjuja odczyi w sur <24 1 0 7 2 3 3 1 2 1 1 1 ce miano iuHAI owicy >24 0 0 1 1 2 0 8 1 1 4 2 0 Reakcje brak 1 lagodna 1 umiar¬ kowana 8 brak 4 brak 2 brak 1 umiar¬ kowana 11 brak 2 lagodna 3 brak brak 3 lagodna 1 umiar¬ kowana Uwalniacie wirusa w ¦3-cim 4-tym dniu dniu 1/5 1/1 0/1 4/8 1/4 0/2 0/1 1/11 2/2 0/3 2/5 1/3 0/1 0/5 1/1 0/1 4/8 1/4 0/2 0/1 1/11 ¦ 2/2 0/3 3/5 1/3 0/1 Wzrost miana w odczynie /5 1/1 0/1 8/8 1/4 1/2 1/1 7/11 2/2 2/3 3/5 2/3 1/1 > 4-krotny wzrost miana w odczynie HAI /5 1/1 0/1 7/8 1/4 1/2 1/1 4/11 2/2 1/3 2/5 1/3 0/1 Tablica 4 Próba 1 1 2 Bzczep re^kom- binant 2 WRL. 105 aaa/1 WRL 105 /1/74 Dawka infekcyjna 3 7,0 7,5 Nr ochotnika 4 /4 7 \3 9 / \ 6 Inicjuja odczyi w sur <24 4 - — 9 ce miano iuHAI owicy > 24 6 — 3 f 6 Reakcje 7 3 brak 1 lagodna 3 b. la¬ godna b. la¬ godna 1 brak 2 umiar¬ kowana 1 NS 3 brak 2 b. la¬ godna 1 NS Uwal win i3-cim dniu 8 1/3 1/1 2/3 0/5 0/1 1/2 0/1 0/3 1/2 0/1 nianie isa w 4-tym dniu 9 1/3 1/1 2/3 0/5 0/1 1/2 1/1 0/3 ^ 1/2 0/1 Wzrost miana odczynu HAI 3/3 1/1 3/3 3/4* 1/1 2/2 0/1 2/3 2/2 1/1 > 4-krotny wzrost mia¬ na odczynu HAI 11 1 1/3 0/1" 2/3 2/4* 1/1 2/2 0/1 1/3 2/2 0/1 WRL105aaa/l — Szczep rekombinant po trzykrotnym kolejnym rozsiewie i izolacji klonów WRL 105/1/74 — Szczep rekombinant izolowany z popluczyn nosa i pasazowany na hodowli jaj APF, przeznaczony do przygotowania zapasu szczepionki * — Próba surowicy poinkulacyjnej niedostepna NS — niemozliwa do okreslenia97 723 13 14 Tablica 4 c.d. 1 1 3 4 2 WRL 100 aaa/1 WRL 100 /1/74 WRL 94 aa/l 3 7,3 ¦ 7,0 4 3 / \ 2 8 / 18 \ < X13 3 8 1 6 2 7 2 brak 1 b. la¬ godna 2 brak 1 brak 1 b. la¬ godna 2 lagodna 4 ostra 3 brak 3 b. la¬ godna 1 lagodna 1 umiar. 2 ostra 0 brak 8 brak bardzo 8 0/2 1/1 0/2 0/1 0/1 2/2 4/4 1/3 3/3 1/1 1/1 2/2 0/1 1/8 1/5 9 0/2 1/1* 0/2 0/1 0/1 2/2 4/4 0/3 1/3 1/1 1/1 2/2 0/1 1/8 0/5 2/2 1/1 1/2 1/1 0/1 2/2 4/4 3/3 3/3 1/1 1/1 2/2 0/1 6/8 4/5 11 | 1/2 1/1 1/2 1/1 1 0/1 ] 2/2 4/4 1/3 2/3 0/1 1/1 2/2 o/i 4/8 4/5 WRL 100 aaa/i — Szczep rekombinant po trzykrotnym kolejnym rozsiewie i izolacji klonów WRL 100/1/74 — Szczep rekombinant WRL 100/1 ponownie izolowany z popluczyn nosa d pasazowany dwukrotnie na hodowli jej SFF do przygotowania zapasu szczepionki. Szczepionke inko- lowano bezposrednio bez dalszych pasazy WRL 94 aa/ll — Szczep rekombinant po dwukrotnym kolejnym rozsiewie i izolacja klonów Dalsze badania prowadzono dla oznaczenia ge- 35 netycznej stabilnosci szczepów rekombinanta. Np. pierwsze popluczyny z nosa ochotnika szczepione szczepem irekombinanta WRL 55 rozcienczono, w sto¬ sunku 1:5 i podano donosowo ochotnikom. Otrzymane wyniki wykazaly, ze wydzielaja sie rzeczywiscie male *o ilosci WRL 55. Badania prowadzono równiez ze szcze¬ pem WRL 105 oraz 100, w których szczep rekombi¬ nant izolowany byl z popluczyn nosa, uprzednio szczepionych trzykrotnym posiewem klonów szcze¬ pu rekombinanta, a nastepnie pasazowany na ja- 45 jach iSPF w celu przygotowania duzej ilosci szcze¬ pionki. Zapas taki mozna bylo nastepnie przeba¬ dac na duzej ilosci ochotników i w ten sposób ustalona zostala genetyczna stabilnosc szczepu re¬ kombinanta. Okazalo sie, ze szczep WRL 105 wy- 50 kazuje wieksza stabilnosc genetyczna niz szczep WRL 100 i dlatego tez jest korzystniejszy.

Claims (19)

1. Zastrzezenia patentowe 55 1. Sposób wytwarzania rekombinanta szczepu wirusa grypy, znamienny tym, ze odzjadliwiony szczep macierzysty wirusa grypy A inaktywuje sie, pozbawiajac go pierwotnej infekcyjnosci, zaszcze- 60 pia pojedyncza hodowle razem ze zjadliwym szcze¬ pem macierzystym, hodowle inikubuje, a nastepnie rozsiewa klony dla usuniecia pozostalosci szczepów macierzystych, po czym izoluje pozadany szczep rekombinant. 65

2. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze jako odzjadliwiony szczep grypy stosuje sie szczep A-a.

3. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze jako zjadliwy szczep grypy stosuje sie szczep, pa¬ sazowany tylko na hodowli jaj lub innych ho¬ dowlach uznanych przez wladze sanitarne.

4. Sposób wedlug zastrz. 3, znamienny tym, ze jako szczep zjadliwy stosuje sie szczep swiezo izo¬ lowany w czasie replikacji.

5. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze stosuje sie szczepy, których róznica antygenowa hemoaglutyniny szczepów macierzystych wynosi przynajmniej 1 antygen.

6. Sposób wedlug zastrz. 1, albo 2, albo 5, zna¬ mienny tym, ze stosuje sie odzjadliwiony szczep, który zawiera antygenowy HgN2.

7. Sposób wedlug zastrz. 6, znamienny tym, ze jako odzjadliwiony szczep stosuje sie szczep A(OKUDA)57.

8. Sposób wedlug zastrz. 1, albo 3, albo 5, zna¬ mienny tym, ze stosuje sie szczep zjadliwy, który zawiera skladnik antygenowy HsN2.

9. Sposób wedlug zastrz. 8, znamienny tym, ze jako zjadliwy szczep stosuje sie szczep A(ENG- LAND)42/72.

10. Sposób wedlug zastrz. 8, znamienny tym, ze jako szczep zjadliwy stosuje sie szczep A{FIN- LAND)4/74.97 723 15 16 11.

Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze odzjadliwiony szczep inaktywuje sie, poddajac dzialaniu promieni ultrafioletowych lub gamma, lub na drodze ogrzewania. 1,2.

Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze w czasie inkubacji dodaje sie odpornosciowa su¬ rowice, otrzymana na antygenowym szczepie wi¬ rusa bliskiego lub identycznego ze szczepem od- zjadliwionym dla zmniejszenia namnazania szcze¬ pu macierzystego. 18.

Sposób wedlug zastrz. 12, znamienny tym, ze surowice odpornosciowa rozciencza sie w soli fi¬ zjologicznej i poddaje dzialaniu promieni ultrafio¬ letowych w celu unikniecia zakazen.

14. Sposób wedlug zastrz. 12, znamienny tym, ze jako surowice odpornosciowa stosuje sie surowice królika lub lasicy.

15. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze przypuszczalny szczep rekombinant izoluje sie sprawdzajac uprzednio przez hemoaglutynacje w ho¬ dowli z dodatkiem czerwonych cialek krwi za¬ rodków kurzych.

16. Sposób wedlug zastrz. 15, znamienny tym, ze szczep rekombinant o wlasciwosciach antygeno¬ wych selekcjonuje sie w testach hamowania he- moaglutyniny i neuroaminidazy.

17. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze przed rozsiewem klonów hodowle wirusa poddaje sie dzialaniu ultradzwieków.

18. Sposób wedlug zastrz. 17, znamienny tym, ze hodowle rozsiewa sie i izoluje klony metoda ogra¬ niczonego rozcienczania.

19. Sposób wedlug zastrz. 18, znamienny tym, ze wybrane klony pasazuje sie dalej na jajach. LDA — Zaklad 2 — Typo, zam. 1146/78 — 100 egz. Cena zl 45.—