CS199569B2

CS199569B2 - Method of producing vaccine against influenza

Info

Publication number: CS199569B2
Application number: CS748153A
Authority: CS
Inventors: Abraham S Beare; David A Tyrrell; David Mccahon
Original assignee: Wellcome Found; Nat Res Dev
Priority date: 1973-11-29
Filing date: 1974-11-28
Publication date: 1980-07-31
Also published as: FR2253535A1; NL7415614A; US3991179A; GB1488800A; ES432385A1; DK139807C; CA1044138A; DK139807B; ATA953774A; AT331980B; IE40221B1; BE822736A; ZA747602B; AU498810B2; SE7414918L; AU7587674A; SE422154B; DE2456636A1; CH616959A5; PL97723B1

Description

Vynález . se týká způsobu výroby vakcíny proti chřipce, zvláště očkovacích látek z · rekombinanty chřipkového viru, odvozené z dvou různých virových kmenů.

Chřipka je virové onemocnění horních dýchacích cest, které se projevuje zvýšenou teplotou, bolestivostí hlavy, zahleněním krku, svalovou bolestí a únavou. Na rozdíl od řady virových onemocnění dává chřipka je dočasnou specifickou imunitu osobě, která prodělala chřipku a proto onemocnění může nastat opakovaně, kdykoliv dojde k epidemii. V posledních., letech se proto . provádělo očkování proti chřipce, aby vytvořilo aktivní imunitu . proti převažujícím kmenům viru chřipky a aby se tak dosahovalo prevence nebo snížení výskytu chřipky během epidemií.

V roce 1940 se úspěšně použily neaktivované chřipkové očkovací . látky, ' aby snížily význačně výskyt nemoci, avšak tyto očkovací látky mají nevýhodu, že neškodný virus se nemůže namnožit v hostitelském organismu. . Potřebuje se proto relativně velké množství očkovací látky a v odpovídající míře se potřebuje vekého množství antigenního materiálu, který se musí vyrobit, zkoušet a distribuovat. Zvláště závažným problémem u očkovacích látek proti chřipce je, že doba potřebná pro jejich výrobu může snadno zabránit jejich přístupnosti a ' způsobuje to, že jsou k dispozici teprve po přechodu epidemie, i když jejich výroba začne jako bezprostřední reakce na vypuknutí epidemie. Kromě toho nepředvídatelnost některých antigenních variací u. kteréhokoliv budoucího kmene chřipky omezuje hodnotu připravených výrobků a“ jejich uskladnění ve velkém měřítku a naopak se požaduje rychlého přizpůsobení nové epidemii, která se šíří světem.

Aktivní . zeslabené očkovací látky proti chřipce byly ... proto navrhovány, u kterých virový kmen byl pasážován řadou buněčných systémů tak dlouho, až jeho způsobilost vyvolat nemoc je . ztracena, zatímco . je plně uchován imunogenní charakter. Jakmile je virus očkován hostiteli, nastane rozmnožení do určitého rozsahu tak, že je třeba jen malého počátečního množství očkovací látky, z čehož plyne úspora času a námahy při výrobě. . U těchto ' očkovacích látek je však důležité, aby zeslabené kmeny byly . neškodné a aby byla minimální možnost infekce vzniklé . stykem.

Genetická rekombinace mezi různými kmeny chřipkového viru k získání zdokonaleného antigenního materiálu s výhodnými vlastnostmi každého kmene pro použití v neaktivované nebo aktivní očkovací látce je známa. Například hybridní kmeny odvozené ze zeslabeného a virulentního kmenu byly již popsány a zkoumány, avšak až dosud žádná ze získaných variant rekombinanty nebyla přijatelná pro praktické účely. Soudilo se, že je výhodné použít chřipkového kmene zeslabeného pasážováním řadou buněčných systémů včetně i systémů různých savců, avšak vlastnosti vznikajících kmenů předpokládají za nevhodné z důvodu bezpečnosti se zřetelem k historii tohoto zeslabeného původního kmene.

Bylo nyní shledáno, že lze připravit vyhovující a přijatelné rekombinanty chřipkových virových kmenů z kombinace „vysoce zeslabeného” původního kmene chřipkového viru A, zvláště typu A-2, spolu s virulentním původním kmenem typu A, přičemž vybrané kmeny rekombinanty mají růstové vlastnosti vysoce zředěného kmene spolu s antigenními vlastnostmi virulentního kmene. Vysoce zeslabený kmen, jehož se použije, je kmen, který se pasážoval jen v kulturách slepičích vajec a projevuje se relativně vysokou množivou schopností viru v slepičích vejcích a zvýšenou schopností tvorby plaky na buňkách ledvin telat. Virulentní chřipkový kmen A naproti tomu se projevuje relativní nízkou množivou schopností viru, přičemž je v podstatě prost kontaminujících savčích virů.

Vysoké zeslabení požadované pro první kmen značí skutečnost, že řada pasáží pro zeslabení byla podstatně větší, než je normálně používaná řada, nezbytná pro odstranění pathogenických vlastností. Zeslabená virová složka si zachovává svou antigenní schopnost po této řadě pasáží, to jest, že jak její heamaglutininový antigen (H) a neuraminidasový antigen (N) jsou neporušeny a tím není ani dotčena její imunogenní schopnost. Tyto kmeny prakticky neprodukují žádné symptomy nebo postranní účinky při podávání citlivým hostitelům jako dětem a lze očekávat, že mají spolehlivý bezpečnostní koeficient opřený o odpovídající zkoušení. Může být výhodné používat kmenu jako 'kmenu A-2, který byl izolován před 10 nebo dokonce 20 lety, aby se dosáhlo dostatečné antigenní rozlišitelnosti mezi tímto kmenem a mezi novým virulentním kmenem a aby tak se pevně zjistila bezpečnost použití kmene. Očekává se, že je zde rozdílnost alespoň jedné jednotky mezi haemaglutininovými typy protilátek ze dvou původních ' kmenů, například H2 a H3, přičemž vyšší číslo odpovídá novějšímu virulentnímu kmenu.

Takové zeslabené kmeny se mohou získat například pasážováním vejci, jek popsáno v japonském patentu č. 310 662. V tomto patentu se popisuje zvláště výroba A/OKUDA/ /57(H2N2), který je odvozen z kmene A-2, izolováno v Osace v Japonsku během epidemie v r. 1957 a který byl zeslaben postupem tam popsaným, a nadto se tam popisuje' další kmen typu A-2 jako kmen A(KINUGASA)

57. Další kmen, který může být vhodný je kmen A-2/JAPAN/ 305/57, který je uložen v americké sbírce typových kultur (ATCC) pod číslem VR-100.

Kmen OKUDA, kterému se dává přednost jako zeslabenému virovému kmenu pro použití v tomto vynálezu, se může alternativně získat od světové zdravotnické organizace, světové středisko pro chřipku v Národním ústavu pro lékařský výzkum, Milí Hill, kde tento kmen, pasážovaný na úrovni 280. pasáže vejci je uložen a bude veřejně přístupný.

Druhý kmen požadovaný pro rekombinaci podle vynálezu se může volit z řady virových kmenů typu A, které si zachovaly svou virulenci u člověka a které byly kultivovány jen v kultuře obsahující vejce nebo v jiných kulturách, schválených kontrolními orgány, například Národním ústavem pro biologické normy (National Institute for Biological Standarts) Holly Hill, ' Hampstead. Je výhodné ovšem, když jde o kmen, který byl nedávno izolován ve vztahu k době výroby očkovací látky obsahující rekombinantu. Pravděpodobnost, že očkovací látka vytvoří požadovanou imunitu proti infekci budoucím kmenem, bude v odpovídající míře zvýšena se zřetelem na antigenní podobnost mezi těmito kmeny.

Například při přihlášení tohoto vynálezu bylo úspěšně používáno kmene viru A/ENGLAND/42/72(HsN2). Krátce předtím byl izolován virus A/FINLAND/4/74 (H3N2) a bylo shledáno, že se zvláště hodí pro použití do očkovací látky proti chřipce obsahující rekombinantu. Oba tyto kmeny byly uloženy u výše uvedené mezinárodní organizace v National Institute of Medical Research, Milí Hill a jsou veřejně přístupné.

Předmětem vynálezu je tedy způsob výroby vakcíny proti chřipce, odvozené z vysoce zeslabeného kmene A chřipky, který byl pasážován výlučně na slepičích embryích s relativně vysokým výtěžkem viru a při poměrně zvýšené schopnosti tvorby plak na ledvinových buňkách telat a z virulentního kmene A chřipky s relativně nízkou schopností rozmnožování viru, přičemž vakcína je v podstatě prostá kontaminujících savčích virů, vyznačující se tím, že se původní vysoce zeslabený kmen inaktivuje ozářením nebo zahřátím za současného podstatného snížení jeho původní infekčnosti a' pak se ' spolu s původním kmenem očkuje do téže kultury, rekombinanta . mající požadované antigenní vlastnosti se vybírá pomocí haemaglutinnového a neuramididazového inhibičního testu, klonuje se metodou limitního ředění a zpracuje se na vakcínu smíšením s ředidlem jako fosfátem pufrovaným sodným roztokem.

Před rekombinaci virulentních a zeslabených kmenů může být radno v některých případech provádět klonování tak, aby každý kmen byl odvozen z jediné původní virové částice. Kromě toho je obvyklé, aby de199569 ponované kmeny byly k dispozici v liofylizované formě a tedy aby jako další předběžná akce byl každý kmen viru v tomto případě rekonstituován ve vhodném prostředí, jako je fosforečnanem pufrovaná živná půda s obsahem chloridu sodného a tryptózofosfátová živná půda, přičemž je žádoucí aby byla přítomna antibiotika, která by usmrtila všechny bakterie pokud by byly přítomny. Po očkování do allantoidního vaku vajec, přičemž je žádoucí aby se jednalo o vejce specificky bez pathogenních - složek (vejce SPF), a po inkubaci je možno extrahovat kapalinu allantoidního vaku a uskladnit za nízké teploty až do doby potřeby.

Aby se dva kmeny vyhovujícím způsobem rekombinovaly, je nutné, aby rozdílnost mezi schopností virů ke množení slepičích vajec nebyla příliš veliká. Virus zeslabený s vysokou schopností ke množení se proto ozáří ultrafialovým světlem nebo zářením gama nebo se.zahřeje, aby se přibližně dosáhlo 99¹% inaktivace celkové infekčnosti viru a aby se tedy jeho schopnost ke množení uvedla v soulad s relativně nízkou schopností množení u virulentního virového kmene. Tento postup jakož - i následující rekombbinační postup, kde vzorky kmenů viru se nechají množit společně v jednotné vaječné živné půdě, je popsán v Postgreduate Medical Journal (1973) 49, 195 až 199.

Je třeba . zdůraznit, že stejné kmeny viru, když se provádí rekombinace na stejném typu buněk za shodných podmínek avšak v oddělených kulturách, nevytváří rekombinaci ve zcela reprodukovatelné míře a může docházet k malým .rozdílům ve vlastnostech, například ve schopnosti viru ke množení. Existuje . ovšem velmi omezený počet možných rekombinací a přiměřené zkoušky nebo pokusy mohou zjistit kmen viru, který vyhovuje požadavkům vynálezu. Jestliže se použije výhodný kmen OKUDA jako zeslabený původní virový kmen, bylo zjištěno, že téměř všechny možné rekombinanty jsou vhodné k použití ve vakcíně.

V souladu s výhodným postupem, používaným pro výrobu vakcíny podle vynálezu, se zeslabené původní kmeny ozařují ultrafialovým světlem a pak se rekombinují s virulentním původním kmenem za současného očkování do kultur allantoidního vaku ve vejci (kultury AOS), odvozených z 10 dní starých vajec SPF. Po inkubaci do každé kultury se přidá - hyperimunní sérum, s výhodou z králíka nebo fretky, připravené za působení vysoce vyčištěného viru, jehož haemaglutinin je úzce antigenně příbuzný nebo shodný se zeslabeným původním kmenem. Tímto způsobem se může redukovat schopnost viru ke množení a zeslabeného původního kmene, takže po rekombinaci zbývá ’ velmi malé množství původního kmene. Poněvadž schopnost viru ke množení u virulentního původního kmene - je relativně nízká, není třeba potlačovat tento virus stejným způsobem.

Kultury vykazující haemaglutinaci po další inkubaci se shromáždí a části se vyjmou ke zkouškám haemaglutininové a neuraminidázové inhibice, aby se vybraly ty rekombinanty, jež mají antigenní skladbu původního virulentního chřipkového viru typu A a jsou proto potenciálně použitelné v očkovacích látkách. Takto vybrané kultury se klonují, aby se odstranily zbytky původních virů a ty rekombinanty, u kterých bylo zjištěno, že se nehodí pro další zkoušky, se odstraňují. Klonování se provádí limitní zředovací metodou, popsanou ve výše citovaném Postgreduste Medical Journal. . Každý vybraný kmen rekombinanty se pak může pasážovat ve vhodné veječné kultuře, jako jsou vejce SPF nebo kulturý AOS, z nich odvozené a pasážování se provádí jednou nebo dvakrát, aby se zvýšila produkce a aby se připravila zásoba sterilní a prostá antibiotik ve vejcích SPF pro testování dobrovolníků. Tyto testy jsou- formulovány tak, aby se zjistilo, že kmen rekombinantu je geneticky stabilní a způsobilý vyvolat imunizaci při očkování člověka.

Při výrobě vakcíny podle vynálezu tedy dochází k inaktivací původního vysoce zeslabeného kmenu, aby- se v podstatě redukovala jeho původní infektivnost, dále se očkuje tento - kmen spolu s původními virulentními kmeny do téže kultury, kultura se inkubuje a pak se klonuje k odstranění původních kmenů a izolují se sledované kmeny rekombinanty. Vhodné potlačení původního zeslabeného kmene se může dosáhnout přidáním přiměřeného hyperimunního séra do kultury. Vhodné . rekombinanty se pak . mohou vybírat testováním kultur takto získaných s hlediska haemaglutinační a antigenní schopnosti běžnými postupy a požadovaný rekombinant se izoluje klonováním.

Sterilní zásoba připravená z vybrané rekombinanty se znovu izoluje . od dobrovolníků, například očkováním do nosu a sbíráním výtěrů z nosu. Takto získaný vírový materiál se může pak znovu pasážovat, s výhodou dvakrát, ve vaječných kulturách a očkovací látka z nich připravená se vnáší do ředidla, jako je roztok chloridu sodného pufrovaný fosfátem za přítomnosti stabilizátorů, s výhodou hydrolyzované želatiny a sorbitu. Vznikající očkovací látka, která se může sušit vymrazováním a pak rekonstituovat podle potřeby, se může podávat člověku s výhodou očkováním do nosu.

Tímto způsobem se získá očkovací látka, obsahující výše definovanou - rekombinantu chřipkového viru.

Vynález je dále popisován s poukazem na následující příklady, které nemají omezující význam.

Příklad 1

Rekombinanta A/OKUDA/57(H3№) a A/ENGLAND/42/72(H3N2)

A) Příprava původních kmenů [a) zeslabený virový kmen A/OKUDA/57 (H2N2)

Kmen OKUDA A-2, který byl pasážován jen ve vaječných kulturách a podáván desítkám tisíc dětí v Japonsku v aerosolové formě bez jakýchkoliv účinků se získal při 280. pasážování s haemaglutininovém titru 1 : 1280 v lyofilizované formě. Byl rekonstituován v 1,5 ml směsi fosfátem pufrovaného solného roztoku a v 10% tryptozové živné půdě spolu s 1 500 mezinárodních jednotek jednak penicilinu a jednak streptomycinu, očkoval se do allantoidního vaku 1Ó-denních vajec SPF a inkuboval při 35 °C tři dni Allantoidní kapalina z 1 vejce se vybírala a uskladnila v malých objemech při — 60 °C. Pro rekombinační pokus se nechal roztát malý podíl a zředil se v poměru 1 : 100 v normálním solném roztoku a ozařoval 30 vteřin ultrafialovým světlem, což postačilo k vyvolání přibližně 99% inaktivace celkové infektivnosti viru.

(b) Virulentní kmen viru A/ENGLAND/42/ 72(H3N2)

Tento kmen se získal jako lyofilizovaný vzorek allantoidní kapaliny od Dr. G. C. Schilda v National Institute of Medical Research, Milí . Hill. Virový kmen byl izolát z vejce, který byl pasážován třikrát přes vejce s haemaglutininovým titrem 1 : 128. Lyofilizovaný materiál se rekonstituoval ve směsi fosfátem pufrovaného solného roztoku a 10% tryptozofosfátové živné půdě spolu s 1 000 mezinárodních jednotek jednak penicilinu, jednak streptomycinu. 0,2 ml získané látky se očkuje do allantoidního vaku 10-denních vajec SPF a inkubuje se 3 dni při 35 °C. Allantoidní kapalina z 1 vejce se vybere a uskladní v malém objemu při - —60 °C.

BJ Rekombinace a izolace rekombinant

Kultury AOS se - připraví z 10-denních vajec SPF a dávkují do důlků na desce pro haemaglutinaci. Do každé kultury se přidává 0,3 ml každého viru a to kmen A/OKUDA se zředí 1 : 100 před - ozářením a aktivní kmen A/ENGLAND se zředí 1 : 30 v normálním solném roztoku. Deska pro haemaglutinaci se umístí do sáčku z plastické hmoty a inkubuje se na třepačce . (přibližně 100 kmitů za minutu J při 37 °C. Po 4 hodinách inkubace se přidá - hyperimunní králičí sérum do každého důlku s finálním zředěním 1 : 3000, aby se potlačil růst zeslabeného původního kmene a pokračuje se v . inkubaci. Toto sérum, které se připravilo působením vysoce vyčištěného kmenu viru A/SINGAPORE/57 (H3N2], který je velmi úzce příbuzný z . antigenického hlediska s kmenem - OKUDA, se 100 x zředí normálním - solným roztokem před použitím a vystaví účinku ultrafialového světla 2 minuty jako zvláštní opatření, aby se zničily všechny cizí látky, které by mohly být přítomny. Po celkové inkubaci trvající 48 hodin při 37 °C se přidá 5% suspenze červených krvinek kuřat z vajec SPF do každého důlku s. výslednou koncentrací 0,5 %. 22 kultur ze 77 kultur vykazuje haemaglutinaci a jednotlivě se oddělí jako v úvahu přicházející rekombinanty. 0,1 ml každé v úvahu přicházející rekombinanty se očkuje do 10-denních SPF vajec, jež se - inkubují 3 dni při 37 °C. Na konci této doby -se vejce zkoumají - na přítomnost haemaglutininu a typ haemaglutininu se identifikuje ve zkouškách haemaglutininové inhibice. V - těchto předběžných zkouškách se identifikují čtyři isoláty, které vykazují vysokou schopnost viru ke množení a které mají haemaglutininovou komponentu virulentního viru kmene A/ENGLAND. Jeden z těchto produktů se pak odstraní, protože zkouška na neuraminidasovou inhibici ukazuje, že tato rekombinanta má neuraminidasovou složku původního zeslabeného kmene A/OKUDA a nikoliv požadovaného virulentního kmenu A/ENGLAND. Každý ze zbývajících produktů těchto kultur AOS takto vybíraných se pak třikrát klonuje k odstranění zbytkových původních virů a ty z rekombinant, u kterých se zjistilo podle výše uvedených - zkoušek, že se nehodí pro použití v klinickém zkoušení. Virová kultura se rozlučovala v předběžném stupni -v ultrazvukové lázni (dávka 80 kilocyklů/vte- řin) po dobu 30 vteřin. Klonování se tak provádí tak, že se kultura zředí ve - dvojí nebo trojí operaci a pak se očkuje do 10-denních vajec obsahujících embrya, nebo - do kultur AOS, přičemž se použije nejméně osm opakovaných kultur pro každé zředění. Limitní zředěné klony se isolují z kultur, ve kterých se použilo virového zřeďování a zahrnují jen přibližně 10 % ze zmíněných osm opakovaných kultur podle positivní haemaglutinace při - testování červenými krvinkami kuřat z vajec SPF. Každá vybíraná klona se pak pasážuje jednou nebo dvakrát ve vejcích SPF 9 až 12 dní starých a sterilní zásoba každé vybírané rekombinanty se připraví bez použití antibiotik v 10 dní - starých vejcích - SPF. Tato zásoba se pak zkoumá - testy - na haemaglutininovou a neuramidasovou -inhibici, aby se ověřilo antigenní složení a - pokud je to potřebné, se postoupí ke klinickému testování.

P ř í k 1 a d 2

Rekombinanta A/OKUDA/57 (H2N2) s - -A/FINLAND/4/74 (H3N2)

A) Příprava -původních kmenů (aj Zeslabený kmen viru A/OKUDA/57(H2N2)

Malé množství allantoidní kapaliny očkované - kmenem OKUDA podle příkladu 1 A(aJ se nechá roztát a klonuje dvakrát ve vejcích SPF. Pak se zředí v poměru 1 : 100 - v normálním solném roztoku a ozařuje 30 vteřin ultrafialovým světlem.

(b) Virulentní kmen A/FINLAND/4/74(H3N2)

Tento kmen se izoluje ve vejcích z krčního výtěru dodaného Dr. Cantellem v Laboratoři veřejného zdraví, Helsinki, Finsko · a má haemaglutininový titr 1 : 2560. Kmen viru se pak pasážoval jednou přes člověka a jednou přes vejce SPF a pak se dvakrát klonoval v těchto vejcích. Allantoidní kapalina z · jednoho vejce se vybírala a uskladnila v malých objemech při —60 °C.

B) Rekombinace a izolace rekombinant

Původní kmen A/OKUDA se míchá s „A kmenem FINLAND za zředění 1 : 30 v kulturách AOS na haemaglutinační desce a deska se inkubuje v plastickém sáčku na třepačce při 36 °C. Po jedné hodině se přidá antisérum do každého důlku k finálnímu zředění 1 : 2 000, aby se potlačil r.ůst zředěného původního kmene a pokračuje se v inkubaci. Antisérum zde použité je hyperimunní fretkové sérum, připravené testováním na A/OKUDA/57 a před použitím se ozáří vystavením zředěného séra v poměru 1 : 20 ultrafialovým světlem 2 minuty. Po celkem 31 hodinách inkubace se přidá 0,5% suspenze červených krvinek kuřat z vajec SPF do každého důlku ke zjišťování haemaglutinační aktivnosti. 19 kultur ze 64 vykazuje haemaglutinaci a tyto se individuálně shromáždí. 0,1 ml každé předpokládané rekombinanty se naočkuje do vajec SPF, jež se inkubují tři dni při 37 °C. Vejce se pak zkoumají podle typu haemaglutininu testy na haemaglutininovou inhibici, na infektivnost v kulturách AOS a s hlediska haemaglutininového titru ve vejcích. Na bázi těchto výsledků se 11 z 19 získaných kultur 2x klonuje v kulturách AOS a jednou ve vejcích SPF postupem popsaným v příkladu 1B).

Sterilní zásoba každé vybírané rekombinanty prosté antibiotik se připraví v 10-denních vejcích SPF a získaný produkt se zkoumá ke zjištění antígenního složení. Osm z nich obsahovalo antigeny kmene A/FINLAND/4/74 a tři z nich byly podobné kmenu A/OKUDA/57 ve svých rozmnožovacích vlastnostech a tyto se vybraly pro použití ke klinickému zkoušení.

Klinické zkoušky

Klinické zkoušky se prováděly za použití tří vybíraných kmenů rekombinanty - označených čísly WRL 55, 65 a 68 v příkladu 1 a tři kmeny WRL 94, 100 a 105 v příkladu 2, přičemž příslušné schopnosti při množení jsou uvedeny v tabulkách 1 a 2.

Vybraný kmen viru se pasážoval jednou přes slepičí vejce a zřefl na odpovídající titr. 1,0 ml tohoto viru se pak podává nosem každému z řady dobrovolníků. Výtěry z nosu se shromáždí třetí a čtvrtý den po očkování virem a očkují se do allantoidní dutiny 11-denních slepičích vajec obsahujících embrya. Tato se zkoumají na virový haemaglutinin po dvou dnech inkubace při 33 °C. Séra shromážděná před zkoušením a 14 dní po· očkování se zkoumala na hodnotu protilátek inhibujících haemaglutinaci (HAI) za použití normalizovaných postupů, jako například je postup popsaný v Br. Med.

J. 1968, iv, 36, 385.

V tabulkách 3 a 4 jsou tyto údaje: použitý kmen rekombinanty, infektivní dávka vyjádřená hodnotou EIDso (účinná infektivní látka) virové očkovací látky, počet dobrovolníků, počáteční HAI titr · v séru, reakce jak uvedeno výskytem a délkou trvání - horečnatého stavu rýmy a subjektivní nevůle nebo zvýšeným používáním kapesníku, počet dobrovolníků, u nichž dochází k exkreci - viru v nosních výtěrech 3 až 5 dní po očkování a dále frakce těch, u kterých sérum (a) vykazovalo vzrůst v titru, HAI (b) podstatný vzrůst v titru HAI, tj. alespoň čtyřnásobný vzrůst. Prováděly se další pokusy ke zjištění genetické stability kmenů rekombinanty, například první nosní výtěr u dobrovolníků očkovaný kmenem rekombinanty WRL 55 se zředí v poměru 1:5a očkuje se do nosu pěti dobrovolníků. Výsledky ukazují, že WRL 55 je - v exkreci ve velmi malých množstvích.

Prováděly se také pokusy s WRL 105 a 100, kde rekombinanta byla - znovu - izolována z výtěru z nosu očkovaného jedince, který předtím dostal dávku 3x klonované rekombinanty a pak se provádělo pasážování ve vejcích SPF k připravení velké zásoby očkovací látky.

Tato zásoba očkovací látky se pak může zkoušet na větším množství dobrovolníků a stanovit genetickou stabilnost kmenu rekombinanty. Je patrné, že WRL 105 má větší genetickou stabilnost než WRL 100 a proto se mu dává přednost.

9 9 S 6 9

Tabulka 1

Kmeny viru	haemaglutinin	Antigeny neuraminidasa	množivá schopnost viru (hemaglutininové jednotky/0,25 ml)
původní kmeny	A/OKUDA/57	H2	N2(1957)	1000
viru	A/ENGLAND/42/72	Нз	N2(1972)	96
rekombinační	WRL 55	Нз	N2(1972)	256
kmeny viru	WRL 65	Нз	N2(1972)	512
	WRL 65	Нз	N2(1972)	512

Tabulka 2

Kmeny viru	haemaglutinin	Antigeny neuraminidasa	množivá schopnost viru (haemaglutininové jednotky/0,25 ml)
původní kmeny	A/OKUDA/57	H2	N2(1957)	941
viru	A/FINLAND/4/74	Нз	N2(1974)	445
rekombinační	WRL 105	Нз	N2(1974)	920
kmeny viru	WRL 100	Нз	N2(1974)	1080
	MRL 94	Нз	N2(1974)	993

Pokus kmen virové infektivní počet počáteční titr reakce exkrece viru vzestup 2 čtyřnásobný rekombinanty dávka dobrovolníků hemaglutininové 3. den 4. den v titru vzrůst účinná inhibice v séru HAI titru HAI infektivní [titr HAI) ’ф CM

Λ

VII in H H

LP rH O ’Ф CM tH

О» t—I H H rH τ—I CM ^Φ CM

CO LP CO H

Гн cm h 0

to	rH H	00		CM rH
ίο	H O	00	hH	t—1 tH

rH
rH CM	CO	LP	CO rH
l> CM	CM	CQ	cm Гн

lO Η H O Гн O

CQ CM rH тН O O *Φ CM rH

Γη ^{o O}

>7)

'Cd

>7)

'CQ

0)

'Cd

ti

Φ

•Λ

c

CJ

N

CJ

W

N

4tJ

£

>A

cd

4tí

>A

ca

N

cú

a

Λ

A

N

cd

N

cd

N

cd

CU

A

N

Φ

s

Φ

φ

Φ

φ

Φ

φ

0)

X)

ř-4

^s

a

>

£3

ρ

£1

A

£1

(-1

β

>

ID

rH

00

Φ

CM

rd

O O rH τ—I CM

CM

CQ tH CM τΗ Cm

CO LO CQ r-H ^{δ o} rH o

£
£CM	CO	LP
rH Cm	⁰	CM

CO r-H

Гн ^O

									'ca
	Φ	'Φ		Φ		Φ	'Φ	•1—1	ti
	CJ		CJ		CJ		N
	4*5	fi		4tí		4tí	β	>A	cd
N	cd	A	N	cd	N	cd	A	Ph	A
Φ	φ	c	Φ	φ	Φ	φ		Φ	'>4
£J	A	s.	£5	A	£2	(-1		β	>
rH		CM	CO		LP		CO	tH

C0 rH rH ’Φ CM O

CO rH

CM

10	ip	LP	IO	LP	00	0O
in	LP	LP	in	co	co	co
£	£1	£	£	£4	£	£
&	Cí	Ctí	Ctí	Ctí	Ctí	Pí
£	£	£	£	£	£	£

tH cm co ю co

Tabulka 4

Pokus kmen virové infektivní počet počáteční titr reakce exkrece viru Vzestup v titru čtyřnásobný rekombinanty a dávka dobrovolníku haemaglutininové 3. den 4. den HAI vzrůst v titru účinná inhibice v séru HAI dávka 50/mi [titr HAI)

CO r-i CO

CO H 03 ♦

Mi r-i

CO r-i

		'CÚ	'CÚ	45			'Φ
CD		й	Й		CD	Й
CD		t-l	t-i			CD	ÍH
JxS Cú		E	Ё		>CO '2	4tí cú	E
ω ř-<	'CÚ a	Ё	Ё	'CC Й	vD N JO	Φ Ch	E
N					Оч Сн гл Φ >>£ й > z	N
φ	'r-<		Φ	E	Φ	φ
42	Ё	>	>	42	>
CO	r-i	CO	ID	r-l	CM r-i	CO	CM

CM

A

Mi

CM

VII

CO cn

Mi	CO	CD	CO
\	/	\	/
I>x		in
		r-l

cú CÚ cú

&

£

CM

CM r-i 00 CM r-l см o cm cm Íh

Pokus kmen virové infektivní počet počáteční titr reakce exkrece viru Vzestup v titru ž čtyřnásobný rekombinanty a dávka dobrovolníků haemaglutininové 3. den 4. den HAI vzrůst v titru účinná inhibice v séru HAI infektivní (titr HAI) dávka 50/mi g24 >24 со

cq r-ι cm	т-Н т-Н	см	00 СО т-Н	т-Ч CM
r-Ч гЧ гЧ	Ϊη δ	δ	т-ч см δ	X СМ

СМ ГЧ cq

СМ ΐπ Ϊ4 гЧ СМ δ δ оо δ

тН δ

гЧ СМ гН СМ

Гы

РЧ ω s ’ф >

см о

X СМ х δ гЧ СМ δ см о

гЧ гЧ СМ

Í4 см 'cd (и X cd >

Ό

см

X

CM

X

rH

CM

5

00

rH

X

CM

δ

т-Ч

δ

-δ

x

δ

tH

Íh

δ

'cd

'CO

'Φ

Φ

a

φ

β

CD

β

O

ы

ω

CD

F-i

CD

ы

4X1 CO

'^a

4X1 ¢0

4X1 CO

a

4X1 CO

β

>J2

'Cd

Φ C-4 N

a

φ Ch N

CD ÍH N

a

'OD β A

'Φ 4d >N

φ £-< N

s

'cd β řn

>C a

β N od Ы

'Φ 4tí >N

Φ

φ

CD

ф

^C

>φ

Φ

φ

CD

'>

>Φ

X

>

X

>

^a

4->

XI

>

^s

β

>

+-»

CM

rH

CM

rH

CM

CO

i—1

rH

CM

СО

со ctí cd cd о о со

см

со

Ьч* 'φ я cd > о >N 'са сл Ctí ctí O X j и 4 cd Я Ό S N а 'cd > о >N 'cd сл cd

О >Ы &

'Φ s

•rH 4-* a

Д cd >^N >

Я cd tí

X

S o Λ

Φ ř4 cd S >4 +-> *cd

4Ú о

N ω cd > о Μ Ю о

ctí +O.g g X 2 s M O θ'*!

g Φ 'cd ^N

1-3 X

Р4 &

199369

Pokus kmen virové a infektivní počet počáteční titr reakce exkrece viru Vzestup v titru 1 čtyřnásobný rekombinanty dávka dobrovolníků haemaglutininové 3. den 4. den HAI vzrůst v titru účinná inhibice v séru HAI infektivní (titr HAI) dávka 50/mi ^24 >24 r-l 00 in

O M< Mí r-j 00 Ю o δ Mí г-1 00 ID δ r—i δ

τ-d	00 m
δ	r-l тН

	'Φ
Φ	Φ	Й
CD	CD	ř-i
4tí	Jtí	rj
cú	CÚ
Φ	Φ
	řn	’α
N	N
Φ	Φ	φ
rQ	X2	>
O	oo	ID

199589

Claims

1. Způsob výroby vakcíny proti chřipce, odvozené z vysoce zeslabeného kmene A chřipky, který byl pasážován výlučně na slepičích embryích s relativně vysokým výtěžkem viru a při poměrně zvýšené schopnosti tvorby plak na ledvinových buňkách telat a z virulentního kmene A chřipky s relativně nízkou schopností rozmnožování viru, přičemž vakcína je v podstatě prostá kontaminujících savčích virů, vyznačující se tím, že se původní vysoce zeslabený kmen inaktivuje ozářením nebo zahřátím za současného podstatného snížení jeho původní infekčnosti a pak se spolu s původním kmenem očkuje do téže kultury, rekombinanta mající požadované antigenní vlastnosti se vybírá pomocí haemaglutinnového a neuramididazového inhibičního testu, klonuje se metodou limitního ředění a zpracuje se na vakcínu smíšením s ředidlem jako fosfátem pufrovaným sodným roztokem.

2. Způsob podle bodu 1, vyznačující se tím, že vysoce zeslabený kmen má antigenní složení H2N2.

3. Způsob podle bodu 2, vyznačený tím že vysoce zeslabený kmen je kmen A/OKUDA/57.

4. Způsob podle bodů 1 až 3, vyznačený tím, že virulentní kmen má antigenní složení H3N2.

5. Způsob podle bodu 4, vyznačený tím, že virulentním kmenem je khien A/ENGLAND/42/74.

6. Způsob podle bodu 4, vyznačený tím,

VYNÁLEZU že virulentním kmenem je kmen A/FINLAND/4/74.

7. Způsob podle bodů 1 až 6, vyznačený tím, že vysoce zeslabený kmen se inaktivuje ozařováním ultrafialovým světlem nebo zářením gama.

8. Způsob podle bodů 1 až 7, vyznačený tím, že se přidává hyperlmunní sérum připravené testováním proti viru antigenicky úzce příbuznému nebo shodnému s uvedeným vysoce zeslabeným kmenem během inkubace к potlačení uvedeného původního kmene.

9. Způsob podle bodu 8, vyznačený tím, že hyperimunní sérum se zředí v normálním solném roztoku a ozařuje ultrafialovým světlem к odstranění kontaminace.

10. Způsob podle bodů 8 a 9, vyznačený tím, že hyperimunní sérum je sérum králíka nebo fretky.

11. Způsob podle bodů 1 až 10, vyznačený tím, že se předpokládaná rekombinanta zjišťuje heamaglutinací ze přidávání červených krvinek kuřat do kultury.

12. Způsob podle bodů 1 až 11, vyznačený tím, že se na virovou kulturu působí ultrazvukem před klonováním.

13. Způsob podle bodů 1 až 12, vyznačený tím, žé se vybraný klon dále pasážuje přes kuřecí embrya.

14. Způsob podle bodů 1 až 13, vyznačený tím, že se do vakcíny včlení stabilizátor jako hydrolyzovaná želatina nebo sorbitol.