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HINTERGRUND DER ERFINDUNG
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1. Gebiet der Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung betrifft Gewebezüchtung und insbesondere die
Schaffung eines dreidimensionalen Konstrukts aus Zellen und die
mechanische Konditionierung des Konstrukts.
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2. Beschreibung des Stands der Technik
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Bindegewebezellen
aus Muskel, Knochen, Sehne, Band und Knorpel sprechen auf mechanische
Belastung an. Viele Arten von Vorrichtungen wurden entwickelt, um
statische oder zyklische Belastung auf Zellen zu applizieren. Diese
Vorrichtungen beinhalten Kolbenarme, welche an ein Matrixsubstrat
angeklemmt sind, Gewichte, welche auf Zellen platziert sind, die
auf einer dehnbaren Membran gewachsen sind und einen Druckrahmen
[forcing frame], in welchem Zellen auf einem dehnbaren Substrat
statisch gestreckt werden.
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Eine
besondere Vorrichtung, erdacht vom Erfinder der vorliegenden Erfindung,
appliziert statische oder zyklische Spannung oder Kompression auf kultivierte
Zellen, die auf einem verformbaren Substrat gewachsen sind. Die
Deformation des Substrats wird durch Druck reguliert, welcher kontrolliert
wird durch ein Magnetventil und einen Timer. In einer Ausführungsform
der Vorrichtung wird Vakuum genutzt, um eine Polystyrol-Oberfläche, auf
welcher Sehnenzellen anhaften, abwärts zu verformen. Die Zellen antworten
durch Veränderung
ihrer Synthese von Cytoskelettproteinen. Diese Vorrichtung entwickelte sich
zu einer Computerkontrollierten Vorrichtung, die Belastungsregmine,
welche definierte Dauer, Frequenz und Amplitude aufweisen, die entweder
statisch oder zyklisch sind, bereitstellt. Eine Kulturplatte, welche
leichtes Wachstum von Zellen auf einer flexiblen Grundkulturplatte
erlaubt, wird mit der Vorrich tung verwendet. Diese Vorrichtung ist
als eine Flexercell
® Strain Unit (FSU) bekannt,
welche von Flexcell International Corporation bereitgestellt wird.
Die FSU kontrolliert Vorrichtungen, die geregelte Belastung in Form
von Spannung, Kompression und Fluid-induzierter Scherbeanspruchung
für Zellen
bereitstellen. Diese Arten der Belastung umfassen die weiten Bereiche
von Belastungsarten, welche eine Vielzahl von Zellen in natürlichen
Umgebungen des Körpers
erfahren. Diese Vorrichtung schuf ein neues Studienfeld, bekannt
als Cytomechanik, und hat ein Standardinstrument und eine Kulturplatte
für breite
Anwendung am Mark bereitgestellt. Als Referenz vergleiche
U.S. Patent Nummern 6,218,178 ;
6,048,721 und
5,518,909 .
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Die
Forschung der Flexcell International Corporation zeigt, dass Zellen,
welche einem besonderen Regime von zyklischer Belastung, gefolgt
von einer Pause (beispielsweise 1 Hz, 1% Substratelongation, 8 Stunden/Tag
für 3 Tage)
unterworfen wurden, mit einer verstärkten Fähigkeit zur Anhaftung und Ausbreitung
auf einem Substrat antworten und der Entfernung durch Flüssigkeitsströmung widerstehen. Flexcell
International Corporation bezeichnet diese Zellbasierende Trainings-Antwort
als „mechanische Konditionierung". Es wird angenommen,
dass verschiedene Trainings-Regime
verschiedene Trainings-Antworten in Zellen ergeben werden, beinhaltend
die Fähigkeit
von Zellen auf einer Matrix anzuhaften, sich auszubreiten und anzuwachsen;
Organisation einer orientierten dreidimensionalen Matrix; Expression
einer natürlichen
Matrix; Aufrechterhaltung eines Grades der Zellteilung und im allgemeinen Aufrechterhaltung
eines nativen Phenotypen, welcher biochemisch und biomechanisch
normal ist.
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Zellen
in Gewebeumgebungen im Körper
liegen in dreidimensionalen Matrices vor. Diese Matrices weisen
ihre eigene besondere Anatomie, Materialstruktur und biochemische
Eigenschaften auf. Während
sich ein Gewebe entwickelt, benötigen
seine Zellen einen passenden Grad mechanischer Deformation ebenso
wie Nahrung, bereitgestellt entweder durch Diffusion aus extrazellulären Flüssigkeiten oder
durch Lieferung von Nährstoffen
durch das Blutgefäßsystem.
Für die
Entwicklung und Verwendung gewebegezüchteter, biokompatibler Materialien,
welche Zellwachstum in vitro aufrechterhalten können und den Härten der
biomechanischen Umgebung standhalten, muss ein passendes Strukturdesign ebenso
wie Mittel zur Bereitstellung von Nährstoffverfügbarkeit geschaffen werden.
Die Struktur muss: 1) Zellanhaftung und Wachstum unterstützen; 2)
leicht mit Zellen infiltrierbar sein; 3) biokompatibel sein, d. h.
von geringer Immunogenität
oder Antigenität
sein, falls sie in ein Tier oder einen Menschen implantiert werden
soll; 4) eine Struktur aufweisen, welche mit Zellteilung, gefolgt
von Differenzierung, Matrixexpression und differenzierter Funktion
kompatibel ist; 5) eine Struktur aufweisen, die Sammeln eines Bioprodukts
und/oder von Zellen erlaubt; 6) chemisch stabil sein; 7) leicht
zu erhalten, auszubilden, herzustellen und zu sterilisieren sein
und 8) kostengünstig sein.
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US-A-4839280 offenbart
eine Vorrichtung und ein Verfahren für Züchtung von Zellkulturen, umfassend
eine Zellkulturplatte mit einer Vielzahl von offenen Vertiefungen
[open topped wells], wobei jede Vertiefung eine zylindrisch geformte
Seitenwand beinhaltet und in einer substanziell flachen Vertiefungsbasis
angeschlossen an die Seitenwand endet. Die Vertiefungsbasis beinhaltet
einen Verankerungsring und eine elastomere Membran, welche sowohl
den Verankerungsring bedeckt, als auch die Öffnung ausfüllt, welche durch den Verankerungsring
definiert wird. Die elastomere Membran ist in der Vertiefungsbasis
an der Stelle gesichert. Eine geeignete Methode zur Elongation eines
elastomeren Zellsubstrats wie die Vertiefungsbasis beinhaltet selektive
Unterwerfung eines eingeschlossenen Bereichs direkt unterhalb der
Vertiefungsbasis unter eine kontrollierte Vakuumquelle [subjecting
to a vacuum source]. Eine solche Vakuumelongation kann ergänzt werden durch
einen individuellen Vakuumanschluss, befestigt unterhalb jeder Vertiefungsbasis.
Zellen, welche an der Vertiefungsbasis anhaften, sind einer gleich großen Belastung,
wie sie auf die Vertiefungsbasis selbst ausgeübt wird, unterworfen. Das Verfahren kann
für das
in vitro Durchbiegen von Zellkultursubstraten verwendet werden.
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ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
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Eine
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung der Instrumentation,
Technologien und Methodiken für
mechanische Zellkonditionierung in vitro, um einen trainierten Zell-Phänotyp zu
erhalten und um Zellen zu stimulieren, ihre eigene organisierte
Matrix in vitro oder ex vivo zu synthetisieren, so dass: 1) ein
gezüchtetes
Zellkonstrukt in den Körper als
ein funktionaler Teil eines Organs oder als voll funktionales Organ
eingebracht werden kann und 2) Zellen zum Aussähen in ihre eigene Matrix oder
eine synthetische oder biosynthetische Matrixstruktur hergestellt
werden können,
so dass existierende Gewebe im Körper
vermehrt oder repariert werden können.
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Die
vorliegende Erfindung beinhaltet Verfahren und Vorrichtungen, um
Zellkonstrukte zu züchten und
mechanisch zu konditionieren, einschließlich steriler Vorrichtungen
für die
Inkubation, Ernährung und
mechanische, elektrische und/oder biomechanische Konditionierung
von Zellen, Matrices oder Konstrukten.
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Eine
Vorrichtung zur Züchtung
von Zellkulturen gemäß der vorliegenden
Erfindung beinhaltet eine flexible Membran. Eine Verankerung ist
an einer Peripherie der flexiblen Membran angebracht [potted]. Ein
Verankerungsvorbau erstreckt sich von der Verankerung und beinhaltet
einen freien Bereich, an dem Zellen anhaften können. Eine Schablone [jig] wird
angrenzend zu der flexiblen Membran positioniert. Die Schablone
beinhaltet eine Mulde, positioniert neben der flexiblen Membran
und mindestens einen Durchgang. Ein Mittel zum Biegen der flexiblen Membran,
wie eine Vakuumquelle in flüssigkeitsleitender
Verbindung [fluid communication] mit dem mindestens einen Durchgang,
wird ebenfalls bereitgestellt.
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Vorzugsweise
ist die flexible Membran eine flexible Membran einer Kulturplatte
vom Vertiefungs-Typ. Die Vertiefung beherbergt die flexible Membran,
die Verankerung, den Verankerungsvorbau und die Schablone. Die Schablone
ist so positioniert, dass ein Raum zwischen ihr selbst und dem Boden
der Vertiefung ausgebildet wird, beispielsweise einer abgedichteten
Membran. Die Vakuumquelle steht in flüssigkeitsleitender Verbindung
mit dem Raum, welcher wiederum in flüssigleitsleitender Verbindung
mit dem mindestens einen Durchgang steht.
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Die
Vorrichtung wird für
Züchtung
und mechanische Konditionierung dreidimensionaler Konstrukte von
Zellkulturen verwendet. Die flexible Membran und somit der Verankerungsvorbau
werden durch Anwendung eines Vakuums von der Vakuumquelle in die
Mulde gezogen. Zellen werden zu der flexiblen Membran zugegeben,
wo die flexible Membran in die Mulde gezogen worden ist. Sobald
die Zellen an dem Verankerungsvorbau anhaften, wird das Vakuum abgeschaltet
und die flexible Membran wird von innerhalb der Mulde freigesetzt.
Das Ergebnis ist eine dreidimensionale Struktur von Zellen, die an
dem Verankerungsvorbau anhaftet. Den Zellen der Struktur wird erlaubt,
in ein dreidimensionales Konstrukt zu wachsen.
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Die
Struktur und/oder das Konstrukt werden einem Belastungsregime unterworfen,
um die Struktur und/oder das Konstrukt mechanisch zu konditionieren.
Die Belastung simuliert Belastungen, welche innerhalb eines Körpers angetroffen
werden. Das Belastungsregime wird unter Verwendung der Vakuumquelle
appliziert. Durch Anwenden und Abschalten eines Vakuums wird die
flexible Membran Belastung ausgesetzt, wodurch die Zellen auf der
flexiblen Membran Belastung unterworfen werden. Die angewandte Belastung
kann biaxial oder uniaxial sein, abhängig von der Konfiguration
der Schablone.
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Die
vorliegende Erfindung kann zur Züchtung
und mechanischen Konditionierung von Zellen verwendet werden, welche
dafür vorgesehen
sind, ein Bindegewebekonstrukt zu werden wie Haut, Muskel, Knochen,
Bandscheibe, Sehne, Band; ein Konstrukt aus nicht-Bindegewebe wie
Darm, Leber, Pankreas, Milz, Thymus; oder ein Konstrukt eines inneren
Organs wie ein Auge, ein Reproduktionsorgan, ein Lymphknoten oder
anderen Organen oder Teilen davon.
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Beispielsweise
können
Endothelzellen oder glatte Muskelzellen, welche dafür vorgesehen
sind, in eine Gefäßprothese,
umfassend ein Blutgefäß, eingebracht
zu werden, gezüchtet
und mechanisch konditioniert werden, um schnell auf einem modifizierten
Substrat [engineered substrate] anzuhaften und sich auszubreiten
und der Abtrennung durch angewandte Kräfte in vivo, wie die Belastung
von angewandten Muskelkräften,
reaktiven Grundkräften [ground
forces], Vibration oder Flüssigkeitsströmung zu
widerstehen.
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Als
ein weiteres Beispiel können
kultivierte Chondrozyten konditioniert werden, so dass sie eine Matrix
ausbil den, die in ein Hostgewebe integriert werden kann und den
Widrigkeiten zusammendrückender
Belastung im Gelenkknorpel im Knie, der Hüfte oder anderen Gelenkstücken widersteht.
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Die
vorliegende Erfindung kann in Kerneinheiten in Krankenhäusern verwendet
werden, wo Zellen eines Patienten gesammelt, kultiviert, mechanisch
konditioniert und direkt in ein Organ, welches einer Reparatur oder
eines Ersatzes bedarf, oder in eine Matrix, welche in ein Organ
implantiert werden soll, eingebracht werden können.
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KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
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1 ist
eine perspektivische Ansicht von Vorn einer Vorrichtung zur Züchtung und
mechanischen Konditionierung von Zellkulturen gemäß der vorliegenden
Erfindung;
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2 ist
eine Draufsicht der Vorrichtung, welche in 1 gezeigt
ist;
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3 ist
ein Schnitt entlang der Linie III-III in 2;
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4 ist
eine Draufsicht einer zweiten Ausführungsform einer Vorrichtung
zur Züchtung
und mechanischen Konditionierung von Zellkulturen gemäß der vorliegenden
Erfindung;
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5 ist
eine Draufsicht einer dritten Ausführungsform einer Vorrichtung
zur Züchtung
und mechanischen Konditionierung von Zellkulturen gemäß der vorliegenden
Erfindung;
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6 ist
eine perspektivische Ansicht von Vorn einer Schablone in der Vorrichtung
gezeigt in 1;
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7 ist
ein Flussdiagramm, welches das allgemeine Verfahren gemäß der vorliegenden
Erfindung illustriert;
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8 ist
eine Fortsetzung des Flussdiagramms, welches in 7 gezeigt
ist;
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9 ist
ein Schnitt entlang der Linie III-III in 2 und weist
eine flexible Membran, welche in eine Mulde gezogen ist, auf;
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10 ist
ein Schnitt entlang der Linie III-III in 2 und weist
eine Zellstruktur anhaftend an ein Gewebesegment, auf; und
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11 ist
ein Schnitt entlang der Linie III-III in 2 und zeigt
einen schematischen Kreislauf.
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DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN
AUSFÜHRUNGSFORMEN
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Ein
vollständiges
Verständnis
der Erfindung wird aus der folgenden Beschreibung in Verbindung mit
den begleitenden Zeichnungsfiguren, worin gleiche Referenzzeichen
durchweg gleiche Teile identifizieren, erhalten.
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Für die Zwecke
der nachfolgenden Beschreibung sollen die Begriffe „obere", „untere", „rechts", „links", „vertikal", „horizontal", „oben", „Boden" und deren Ableitungen
sich auf die Erfindung beziehen, wie sie in den Zeichnungsfiguren
orientiert ist. Jedoch sollte verstanden werden, dass die Erfindung verschiedene
alternative Variationen und Schrittsequenzen annehmen kann, es sei
denn, das Gegenteil ist ausdrücklich
angegeben. Es sollte ebenfalls verstanden werden, dass die spezifischen
Vorrichtungen und Verfahren, welche in den anliegenden Zeichnungen
illustriert sind und in der folgenden Beschreibung beschrieben sind,
lediglich exemplarische Ausführungsformen
der Erfindung sind. Daher sollen spezifische Dimensionen und andere
physikalische Charakteristika bezüglich der hierin offenbarten
Ausführungsformen
nicht als limitierend angesehen werden.
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Bezüglich der 1–3 beinhaltet
eine Vorrichtung 10 zur Züchtung von Zellkulturen gemäß der vorliegenden
Erfindung eine flexible Membran 12, eine Verankerung 14,
ei nen Verankerungsvorbau 16, eine Schablone 18 und
Mittel 20, um die flexible Membran 12 zu biegen.
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Die
flexible Membran 12 weist eine erste oder obere Fläche 22 und
eine zweite oder untere Fläche 24 auf.
Vorzugsweise ist die flexible Membran 12 der flexible Boden
einer Kulturplatte vom Vertiefungs-Typ. Eine typische Kulturplatte
mit sechs Vertiefungen würde
sechs flexible Membranen 12 aufweisen, eine in jeder Vertiefung 42.
Die flexible Membran 12 und die Vertiefung 42 sind
vorzugsweise transparent. Beispielsweise kann die flexible Membran 12 eine
flexible Bodenmembran in einer BioFlex®-Kulturplatten-Vertiefung (von Flexcell
International Corporation) sein, welche nicht mit Reagentien behandelt
wurde, um Zellen das Anwachsen zu erlauben, wie es typisch ist.
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Die
Verankerung 14 ist bei 21 befestigt oder an die
erste Fläche 22 der
flexiblen Membran 12 geputtet [potted]. Die Verankerung 14 kann
unter Verwendung einer Silikongummi-Formulierung oder eines anderen ähnlichen
Adhäsivs
oder Bindungsmaterials an der flexiblen Membran 12 befestigt
sein. Vorzugsweise beinhaltet die Verankerung 14 ein erstes
Bauteil 28 und ein zweites Bauteil 30. Jedes von dem
ersten Bauteil 28 und dem zweiten Bauteil 30 ist an
der ersten Fläche 22 der
flexiblen Membran 12 befestigt, vorzugsweise an diametral
entgegengesetzten Stellen.
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Der
Verankerungsvorbau 16 erstreckt sich von der Verankerung 14 und
ist nicht an die flexible Membran 12 geputtet. Daher hat
der Verankerungsvorbau 16 einen freien Teil 32,
an welchen Zellen als eine Struktur 34 anhaften können (vgl. 10)
und in ein Konstrukt wachsen können. Ähnlich der
Verankerung 14 beinhaltet der Verankerungsvorbau 16 vorzugsweise
eine erste Sektion 38 und eine zweite Sektion 40,
welche einander diametral gegenüberliegen.
Die erste Sektion 38 des Verankerungsvorbaus 16 erstreckt
sich von dem ersten Bauteil 28 der Verankerung 14 und
die zweite Sektion 40 des Verankerungsvorbaus 16 erstreckt
sich von dem zweiten Bauteil 30 der Verankerung 14.
In dieser Konfiguration werden die Zellen, welche an den gegenüberliegenden
Sektionen 38 und 40 des Verankerungsvorbaus 16 anhaften,
aufeinander zu wachsen und sich danach vermischen, um ein kontinuierliches
Konstrukt auszubilden.
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Bezüglich der 4 und 5 können die Verankerung 14' und der Verankerungsvorbau 16' alternativ
ringförmig
sein. Ein oder mehrere Bauteile können die Verankerung 14' ausbilden.
Desgleichen können
eine oder mehrere Sektionen den Verankerungsvorbau 16' ausbilden.
Beispielsweise kann die Verankerung 14' vier Bauteile beinhalten, welche
in Quadranten konstruiert sind, die, wenn an die flexible Membran
gepottet, die ringförmige
Form ausbilden. Der Verankerungsvorbau 16' wäre ähnlich konstruiert. In diesem
Fall, ist die Verankerung 14' an
einer äußeren Peripherie
der kreisförmigen
flexiblen Membran 12 befestigt. In dieser Konfiguration
haften die Zellen im Wesentlichen in einem Kreis an. Die Zellen werden
sich mit benachbarten Zellen vermischen und zum Zentrum hin wachsen
und sich anschließend
im Zentrum mit anderen Zellen vermischen, um ein kontinuierliches
Konstrukt auszubilden.
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Die
Verankerung 14 und/oder der Verankerungsvorbau 16 können aus
Materialien wie Nylon, Seide, Baumwolle, Polyester, Urethan oder
anderen ähnlichen
Materialien konstruiert sein. Das Material kann fest sein und/oder
in Maschenform vorliegen. Die Verankerung 14 und/oder der
Verankerungsvorbau 16 können
eine geschichtete Serie verschiedener Materialien sein. Der Verankerungsvorbau 16 kann
mit sauren oder basischen Reagentien behandelt sein, um das Zellanhaften
zu verbessern. Der Verankerungsvorbau 16 kann weiterhin
mit Matrixpeptiden und/oder Proteinen behandelt werden, welche absorbiert
oder kovalent an den Verankerungsvorbau 16 gebunden sind.
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Ein
Gewebesegment 36 (vgl. 10) kann an
den Verankerungsvorbau 16 gebunden sein. Das Gewebesegment 36 kann
jedwedes natürliches
Gewebe, beispielsweise Knochen, Sehne, Band, Muskel oder Blutgefäss sein.
Die Zellen können
dann an dem Gewebesegment 36 anstelle dem Verankerungsvorbau 16 anhaften.
Diese Konfiguration erleichtert die Konstruktion eines gesamten
Gewebes oder eines Teils eines Gewebes. Das Gewebesegment 36 kann
multiple Gewebe beinhalten. Beispielsweise kann ein Knochen-Band-Knochen-Transplantat
verwendet werden, um ein Konstrukt zu züchten, um ein beschädigtes älteres Kreuzband
zu ersetzen. Ebenso kann beispielsweise ein Knochensegment an eine
der Sektionen 38 oder 40 des Verankerungsvorbaus 16 gebunden
werden, ein Muskelsegment kann an die andere der Sektionen 38 oder 40 des Verankerungsvorbaus 16 gebunden
werden und Sehnenzellen können
als zugegebene Zellen verwendet werden. So kann ein Konstrukt aus
Knochen-Sehne-Muskel gezüchtet
und mechanisch konditioniert werden um eine beschädigte Beuger-
oder Streckersehne in der Hand, dem Fuß, dem Bein, der Schulter oder
anderswo zu ersetzen.
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Bezüglich der 1–3 und 6 wird eine
Schablone 18 benachbart zu der zweiten Fläche 24 der
flexiblen Membran 12 positioniert. Die Schablone 18 kann
zylindrisch sein, um mit der Vertiefung 42 der Kulturplatte
zusammenzupassen, so dass die flexible Membran 12 auf der
oberen Fläche 44 der Schablone 18 liegt.
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Eine
Mulde 46 ist in der Schablone 18 benachbart zur
zweiten Fläche 24 der
flexiblen Membran 12 definiert. Die Mulde 46 kann
jede gewünschte Form
haben, um eine gewünschte
Form der Struktur 34 zu ergeben, sobald die Zellen an dem
Verankerungsvorbau 16 anwachsen. Beispielsweise kann die Mulde 46 so
geformt sein, dass eine Struktur 34 ausgebildet wird, welche
beispielsweise ein Rechteck 46, ein Kreis 46' (vgl. 4),
eine Helix 46'' (vgl. 5),
ein longitudinales Band, ein Quadrat, eine Röhre, eine Kugel oder eine Scheibe
ist. Als spezifische Beispiele kann ein Verlängerungsband [elongate band]
verwendet werden, um eine Sehne oder ein Band zu züchten, eine
Röhre kann
verwendet werden um ein Blutgefäß zu züchten oder
eine Kugel oder Scheibe kann verwendet werden um ein Segment der
Haut oder Kornea zu züchten.
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Bezüglich der 1 und 3 beinhalten die
Mittel 20 zum Biegen der flexiblen Membran 12 vorzugsweise
die Vertiefung 42 der Kulturplatte, die die flexible Membran 12 und
die Schablone 18 aufnimmt. Die Vertiefung 42 befindet
sich auf einer abgedichteten Membran 48, wodurch ein Raum 50 definiert
wird zwischen der abgedichteten Membran 48 und der Schablone 18.
Die Schablone 18 beinhaltet mindestens einen Durchgang 52,
vorzugsweise eine Vielzahl an Durchgängen 52, in flüssigleitender
Verbindung mit der Mulde 46 und dem Raum 50. Der Raum 50 ist
ebenso in flüssigleitender
Verbindung mit einer Vakuumquelle 54. Vakuum von der Vakuumquelle 54 wird
unterhalb der Schablone 18 angelegt, um bei der Ausformung
der Zellstruktur 34 zu helfen und die Zellen oder das Konstrukt
mechanisch zu konditionieren. Die Mittel 20 zum Biegen
der flexiblen Membran 12 können durch eine Steuereinheit 56 kontrolliert
werden (vgl. 11).
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In
Bezug auf die 7 und 8 beginnt
ein Verfahren zum Züchten
und mechanischen Konditionieren dreidimensionaler Konstrukte aus
Zellkulturen gemäß der vorliegenden
Erfindung mit Anbringen der Verankerung 14, von welcher
sich der Verankerungsvorbau 16 erstreckt, an die erste
Fläche 22 der
flexiblen Membran 12 in Schritt 110. Ein Gewebesegment 36 kann
an den Verankerungsvorbau 16 in Schritt 111 gebun den
werden. Die Schablone 18, welche die Mulde 46 und
den mindestens einen Durchgang 52 aufweist, wird benachbart
zu der zweiten Fläche 24 der
flexiblen Membran 12 in Schritt 112 platziert,
so dass die Mulde 46 sich benachbart zu der flexiblen Membran 12 befindet
(vgl. 3). Die flexible Membran 12 und somit
der Verankerungsvorbau 16 werden in Schritt 114 in
die Mulde 46 gezogen (vgl. 9). In Schritt 116 werden
Zellen zu der flexiblen Membran 12 dort zugegeben, wo die
flexible Membran in die Mulde 46 gezogen wurde. Den Zellen
wird es in Schritt 118 erlaubt, an den Verankerungsvorbau 16 oder
das Gewebesegment 36 anzuhaften (einige Zellen können an
der flexiblen Membran 12 anhaften). Sobald die Zellen an
dem Verankerungsvorbau 16 anhaften, wird die flexible Membran 12 in
Schritt 120 aus dem Inneren der Mulde 46 freigesetzt.
Das Ergebnis ist eine dreidimensionale Struktur 34 aus Zellen,
welche an dem Verankerungsvorbau 16 oder dem Gewebesegment 36 anhaften
(vgl. 10).
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In
einer bevorzugten Ausführungsform,
in welcher die Mittel 20 zum Verformen der flexiblen Membran 12 die
Vakuumquelle 54 beinhalten, wenn Vakuum unterhalb der Schablone 18 angelegt
ist, wird die Atmosphäre
durch den mindestens einen Durchgang 52 evakuiert und die
flexible Membran 12 und der Verankerungsvorbau 16 verformen
sich in Schritt 114 zur Mulde 46 hin. Wenn ausreichend
Vakuum angelegt ist, wird die flexible Membran 12 in die Mulde 46 gezogen
und nimmt eine Konfiguration ähnlich
der Form der Mulde 46 an (vgl. 9). In diesem
Stadium bildet die flexible Membran 12 ein Gefäß aus, welches
geeignet ist, die Zellen in Schritt 116 aufzunehmen und
die Zellen zu halten, bis sie in Schritt 118 an den Verankerungsvorbau 16 anhaften. Die
Zellen können
zu dem Verankerungsvorbau 16 an vorbestimmten Stellen zugegeben
werden, um verschiedene Strukturen 34 auszubilden. Sobald
die Zellen eine Struktur 34 erzeugen, welche in Schritt 18 in
der Lage ist, sich selbst zu tragen, wird das Vakuum in Schritt 120 abgeschaltet
und die flexible Membran 12 kehrt in ihren ursprünglichen
Zustand zurück mit
der gewünschten
dreidimensionalen Struktur 34 von Zellen, angewachsen an
den Verankerungsvorbau 16 (vgl. 10).
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Die
initiale Anwendung und Dauer des angelegten Vakuums können variiert
werden in Abhängigkeit
davon, wie lange die Zellen in Schritt 118 zum Anhaften
an den Verankerungsvorbau 16 benötigen. Die Dauer und der Grad
des Vakuums, welches an der flexiblen Membran 12 eingeführt wird,
können
mit einer Flexercell® Strain Unit (FSU) oder
einer ähnlichen
Steuereinheit 56 reguliert werden. Der Grad des angelegten
Vakuums bestimmt, wie weit in die Mulde 46 die flexible
Membran 12 und der Verankerungsvorbau 16 in Schritt 114 hineingezogen
werden. Die Platzierung des mindestens einen Durchgangs 52 in der
Schablone 18 definiert, welcher Bereich der flexiblen Membran 12 deformiert
wird, beispielsweise wird ein Durchgang 52, welcher nahe
einer Seite der Schablone 18 lokalisiert ist, die flexible
Membran 12 in diesem Bereich verformen. Die Größe des mindestens
einen Durchgangs 52 hilft dabei, die Form der Struktur 34 zu
definieren. So können
die Architektur, die Größe und das
Volumen der dreidimensionalen Zellstruktur 34 reguliert
werden.
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Zellen
können
allein oder in einer Gelmatrix in Schritt 116 zu der flexiblen
Membran 12 zugegeben werden, um die dreidimensionale Zellstruktur 34 auszubilden.
Alternativ kann eine Gelmatrix allein in Schritt 122 zu
der gezogenen flexiblen Membran 12 zugegeben werden. Wenn
anfänglich
eine Gelmatrix ohne Zellen zugegeben wird, wird es der Gelmatrix
in Schritt 124 erlaubt, auszuhärten oder zumin dest teilweise
zu verfestigen (d. h. zu polymerisieren), bevor die flexible Membran 12 in
Schritt 126 aus dem Inneren der Mulde 46 freigesetzt
wird. Dann werden Zellen in Schritt 128 zu der Gelmatrix
zugegeben.
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Die
Matrix von jedem Gewebe kann als Ausgangsquelle für die Gelmatrix,
in welche Zellen gesät werden
können,
verwendet werden. Die Gelmatrix kann ein Säureextrakt aus einem Bindegewebe,
wie Sehne, Band, Haut, Knochen, Knorpel oder anderem ähnlichen
Gewebe sein. Andere Materialien können als Gelmatrix verwendet
werden, beinhaltend ein Kollagengel, eine Polyglykolsäure, eine
Polymilchsäure,
Agarose, Alginat, ein Silikongel oder ein Urethangel.
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Sofern
eine Säureextraktion
genutzt wird, kann die saure Lösung
mit einer Base neutralisiert werden, so dass die finale Ionenstärke proportional zum
Zellüberleben
und zur Matrixpolymerisation in Fibrillen ist, wo gewünscht. Wenn
die Gelmatrix ein Säureextrakt
aus einem Bindegewebe ist, ist die Säurezusammensetzung vorzugsweise
0,5 M Essigsäure
in Wasser; jedoch können
andere Konzentrationen und Säureformulierungen
verwendet werden. Andere Extraktionslösungen können verwendet werden, welche
Salzlösungen
beinhalten. Die Konzentration der Matrixlösung kann durch einen Anwender
kontrolliert werden, um ein mehr lockeres oder kompaktes Gel auszubilden.
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In
Schritt 130 wird es den Zellen erlaubt zu wachsen, um ein
dreidimensionales Konstrukt auszubilden. Zellen, welche eine Gelmatrix
besiedeln, können
die Gelmatrix reorganisieren und ihre eigene Matrix produzieren,
wodurch zur Stärke
der Matrix beigetragen wird. Zusätzlich
zum Binden an die Matrix können
die Zellen ebenso direkt an die Verankerung 14 und/oder
den Verankerungsvorbau 16 binden. In dieser Situation haften
die Zellen an und applizieren Kraft auf die Verankerung 14 und/oder
den Verankerungsvorbau 16. In dem sie dies tun, restrukturieren
oder remodellieren die Zellen die Gelmatrix, was zu einen Konstrukt
mit höherer
Integrität
und Stärke,
als wenn nur die Gelmatrix an dem Verankerungsvorbau 16 anhaftet,
führt.
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In
Schritt 132, während
die Zellen wachsen oder nachdem das dreidimensionale Konstrukt ausgebildet
wurde, wird die flexible Membran 12 deformiert, um ein
Belastungsregime auf die Zellen oder das Konstrukt, anhaftend an
der flexiblen Membran 12, anzuwenden. Das Belastungsregime
wird in Schritt 132 auf die flexible Membran 12 angewandt, um
die Zellen oder das Konstrukt mechanisch zu konditionieren. Mit
der Ausbildung der Zellstruktur 34 wird Vakuum von der
Vakuumquelle 54 unterhalb der Schablone 18 angelegt,
um die flexible Membran 12 zur Schablone 18 hin
zu ziehen. Das Vakuum wird abgeschaltet, um die flexible Membran 12 in
ihren ursprünglichen
Zustand freizusetzen. Die Deformation und das Freisetzen der flexiblen
Membran 12 setzt sich in Belastung, angewandt auf die Struktur
oder das Konstrukt (d. h. die Zellen), welche am dem Verankerungsvorbau 16 an
der flexiblen Membran 12 anhaften, um. Die angewandte Belastung
kann statisch (beispielsweise Deformation und Halten der flexiblen
Membran im deformierten Zustand) oder zyklisch (beispielsweise wiederholtes
Deformieren und Freisetzen der flexiblen Membran) sein, um Belastungen
zu simulieren, welche bei normalen Aktivitäten in einem Körper entstehen,
beispielsweise während
Pause oder Aktivität.
Das Belastungsregime kann vom Anwender wie gewünscht definiert und angepasst
werden.
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Um
die Zellen oder das Konstrukt mit einem uniaxialen Belastungsregime
zu deformieren, kann die Schablone 18 ein artcangularer
Belastungsstutzen [arctangular loading post] sein, welcher in Verbindung
mit der FSU verwendet wird. Das Äußere des artangularen
Belastungsstutzens, welches die zweite Fläche 24 der flexiblen
Membran 12 kontaktiert, ist ein Rechteck, bei welchem die
kürzesten
Seiten gewölbt
sind, um mit den Dimensionen der überlagernden flexiblen Membran 12 zusammenzupassen
(In der Kulturvertiefung 42). Die langen Seiten des artangularen
Belastungsstutzens lassen eine Lücke
zwischen den langen Seiten des Stutzens und dem Perimeter der Vertiefung 42 an
entgegengesetzten Polen. Wenn Vakuum auf die flexible Membran 12 angewandt
wird, verformt sich die flexible Membran 12 nach unten
an den zwei entgegengesetzten Polen. Das Ergebnis ist eine uniaxiale
Belastung, appliziert auf die flexible Membran 12 zwischen
den zwei Polen, welche umgewandelt wird in eine uniaxiale Belastung,
angewandt auf die Struktur oder das Konstrukt (d. h. die Zellen),
welche zwischen den beiden Polen anhaften. Die Fläche des
arctangularen Belastungsstutzens kann geschmiert sein, um das Gleiten der
flexiblen Membran 12 über
das Stutzenäußere zu erleichtern.
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Wenn
eine ringförmige
Verankerung 14' und Verankerungsvorbau 16' verwendet werden,
wird ein kreisförmiger
Belastungsstutzen verwendet. Der kreisförmige Belastungsstutzen ist
von geringeren Abmessungen als die flexible Membran 12.
In diesem Fall wird, wenn das Vakuum angelegt wird, equibiachsiale
Belastung auf die Zellen oder das Konstrukt appliziert.
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Die
flexible Membran 12 kann an spezifischen Stellen deformiert
sein, um ein Nährmedium um
die Struktur oder das Konstrukt herum absichtlich zu stören, um
Gasaustausch, Nährstoffmischung
und Diffusion von Medium und Gasen in die Struktur oder das Konstrukt
(d. h. die Zellen) zu erhöhen.
Dies kann durch Regulierung der Ab- und Aufwärtsbewegungen der flexiblen
Membran in einer zyklischen, stoßweisen oder kontinuierlichen
Art und Weise erreicht werden. Die Stelle des mindestens einen Durchgangs 52 in
der Schablone 18 und die Art, in welcher die Vakuumquelle 54 mit
der Vorrichtung 10 verbunden ist, bestimmen die Art, in
der die flexible Membran 12 deformiert wird. In diesem
Fall konstituiert eine Kammer, definiert durch eine Wand der Vertiefung 42,
eine Oberkante [top] (nicht gezeigt) der Vertiefung 42 und
die flexiblen Membran 12 einen Bioreaktor, wobei die flexible
Membran 12 als ein Ventil wirkt.
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Die
Verankerung 14 und/oder der Verankerungsvorbau 16 können aus
einem Material (oder Materialien) ausgebildet sein, welches den
Durchtritt elektrischer Signale erlaubt. Alternativ kann ein elektrisch
leitfähiges
Material 58 an der Verankerung 14 und/oder dem
Verankerungsvorbau 16 angebracht werden (vgl. 11).
in jedem Fall können
elektrische Pulse von einer Quelle 60 (vgl. 11)
in Schritt 134 auf die Verankerung 14 und/oder
den Verankerungsvorbau 16 in einer regulierten Art und
Weise appliziert werden und dadurch auf die Struktur oder das Konstrukt
(d. h. die Zellen). In gleicher Weise können in Schritt 134 magnetische
Pulse auf die Verankerung 14 und/oder den Verankerungsvorbau und
dadurch auf die Struktur oder das Konstrukt (d. h. die Zellen) in
einer regulierten Weise appliziert werden.
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Sensoren 62 können in
Schritt 136 an der Verankerung 14, dem Verankerungsvorbau 16 und/oder
der Struktur oder dem Konstrukt (d. h. den Zellen) angebracht werden
(vgl. 11). Signale von diesen Sensoren 62 werden
in Schritt 138 gesammelt und in Schritt 140 verarbeitet
von der Steuereinheit 56 oder einer anderen Vorrichtung,
um die Entwicklung der Struktur oder des Konstruktes (d. h. der
Zellen) zu überwachen
(vgl. 11) – Entwicklung in dem Sinne,
dass die Zellen metabolische Veränderungen
und Aktivität
erleben, beinhaltend Zellmigration und Remodellierung, strukturelle
Reorganisation, Zellteilung, Matrixexpression, Signalmolekülsekretion,
Zell- und Matrixkontraktion, elektrisches Pulsieren, pH-Änderungen
und Zelltod.
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Die
verarbeiteten Signale können
in Schritt 142 interpretiert werden, beispielsweise unter
Verwendung eines Software-Programms. Die angewandte Belastung (Spannung,
Kompression und/oder Scherung), die elektrischen oder magnetischen
Pulse oder die Chemie des Mediums, welches die Struktur oder das
Konstrukt (d. h. die Zellen) umgibt, können adjustiert werden unter
Verwendung der Steuereinheit 56, basierend auf den interpretierten verarbeiteten
Signalen in Schritt 144. Diese Feedback-Überwachung
und Regulierung der Wachstumseigenschaften helfen, ein gewünschtes
Ergebnis in den wachsenden Zellen zu erreichen.
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Sobald
die Zellen in der Struktur zu einem geeigneten Konstrukt gewachsen
sind und wie gewünscht
mechanisch konditioniert worden sind, kann die Verankerung 14 von
der flexiblen Membran 12 in Schritt 146 entfernt
werden. Die Verankerung 14 kann genutzt werden, um anschließend das
resultierende Konstrukt zu handhaben, welches an der Verankerung 14 über den
Verankerungsvorbau 16 anhaftet. Beispielsweise kann das
Konstrukt unter Verwendung der Verankerung 14 in Schritt 148 in
eine Testapparatur überführt, wie
eine Zug- oder Kompressionsbelastungs-Testvorrichtung, werden. Eine Testprozedur
kann dann in Schritt 150 auf das Konstrukt angewandt werden.
Als ein weiteres Beispiel kann die Verankerung 14 in Schritt 152 in
einem Host angebracht werden nach Entfernung von der flexiblen Membran 12 (Schritt 146)
oder nach Testen der Zellen (Schritt 150). Um die Verankerung 14 und
den Verankerungsvorbau 16 in einem Host zu fixieren, muss
das Material der Verankerung 14 und des Verankerungsvorbaus 16 ein
spezielles resorbierbares Material sein. Dieses Material kann ausgebildet
sein, um die Integration des Konstrukts in das Hostgewebe zu erleichtern.
So bald im Host fixiert, können
die Verankerung 14 und/oder der Verankerungsvorbau 16 als
ein Träger
für weitere
Biofeedback-Kontrolle und Signalüberwachung
verwendet werden. Beispielsweise kann die Verankerung 14 und/oder
der Verankerungsvorbau 16 als ein Träger für Matrixmoleküle, Cytokine,
Wachstumsfaktoren, Virus-DNA mit Einfügungen, Plasmid-DNA, Oligonucleotide
oder ganze Gene für
Gentransfer verwendet werden, was den Verlauf der Entwicklung des
Konstrukts oder umgebenden Gewebes beeinflusst, um das Erreichen
von Integration in das Hostgewebe zu unterstützen.
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Als
ein spezifisches Beispiel in Verwendung wird eine BioFlex® Kulturplatte
in einer abgedichtete Basisplatte, angeschlossen an eine FSU, platziert. Die
FSU stellt regulierten negativen oder positiven Druck auf die Basisplatte
bereit, so dass das angelegte Vakuum die flexible Membran 12 nach
unten verformen kann, wobei Rückkehr
zum atmosphärischen
Druck die flexible Membran 12 zum nicht-deformierten Zustand zurückführt. Die
FSU ist ein Mikroprozessor mit Software, die Ventile kontrolliert
und folglich den Druck auf die BioFlex® Kulturplatte
kontrolliert. Ein Programm kann aufgestellt werden, welches das
aktive Biegen der flexiblen Membran 12 in einer spezifischen
Art und Weise ermöglicht,
so dass das Wachstumsmedium, in welchem die dreidimensionale Struktur 34 von
Zellen kultiviert wird, durch die Bewegung der flexiblen Membran 12 gepumpt
wird. Die dreidimensionale Struktur 34 von Zellen wird
in der Mitte des Mediumdurchflusswegs platziert. Wenn die flexible
Membran 12 nach unten gezogen wird, fließt das Medium
nach unten und durch die Matrix. Wenn die flexible Membran 12 nach
oben auslenkt, fließt
die Flüssigkeit
aufwärts
durch die Matrix. Dieses Programm kann mit einer vorgegebenen Frequenz
und Amplitude zyklisch wiederholt werden, um verstärkte Nährstoffdiffusion
zu den Zellen bereitzustellen, ebenso wie mechanische Störung, welche wichtig
sein kann, um die Zellteilung und Matrixepression zu stimulieren,
allein oder in Synergie mit dem verstärkten Nährstofffluss.
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Es
wird von Fachleuten verstanden, dass, obwohl die vorangegangene
Beschreibung im Detail bevorzugte Ausführungsformen der vorliegenden
Erfindung darlegt, Modifikationen, Additionen und Veränderungen
hierzu gemacht werden können,
ohne sich vom Geist und Umfang der Erfindung zu entfernen.