WO2005087912A2 - Erfindung betreffend bioreaktoren und bioreaktorsysteme - Google Patents

Erfindung betreffend bioreaktoren und bioreaktorsysteme Download PDF

Info

Publication number
WO2005087912A2
WO2005087912A2 PCT/DE2005/000199 DE2005000199W WO2005087912A2 WO 2005087912 A2 WO2005087912 A2 WO 2005087912A2 DE 2005000199 W DE2005000199 W DE 2005000199W WO 2005087912 A2 WO2005087912 A2 WO 2005087912A2
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
pressure
base plate
bioreactor
tissue culture
cells
Prior art date
Application number
PCT/DE2005/000199
Other languages
English (en)
French (fr)
Other versions
WO2005087912A3 (de
Inventor
Peter Czermak
Dirk Nehring
Christian Weber
Stephanie Gokorsch
Original Assignee
Fachhochschule Giessen-Friedberg
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Fachhochschule Giessen-Friedberg filed Critical Fachhochschule Giessen-Friedberg
Publication of WO2005087912A2 publication Critical patent/WO2005087912A2/de
Publication of WO2005087912A3 publication Critical patent/WO2005087912A3/de

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M35/00—Means for application of stress for stimulating the growth of microorganisms or the generation of fermentation or metabolic products; Means for electroporation or cell fusion
    • C12M35/04—Mechanical means, e.g. sonic waves, stretching forces, pressure or shear stimuli
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M23/00—Constructional details, e.g. recesses, hinges
    • C12M23/02—Form or structure of the vessel
    • C12M23/12—Well or multiwell plates

Definitions

  • the present invention relates to a device for mechanical program-controlled pressure loading of cells, cell matrix composites and / or tissue cultures under sterile conditions, and to bioreactors and bioreactor systems constructed therewith.
  • the production of autologous cell implants as a homogeneous cell-biomaterial composite is a promising approach for the reconstruction of destroyed tissue parts in the body. For this it is necessary to bring autologous cells, for example cartilage cells, into a three-dimensional shape and to further cultivate the composite.
  • the aim is to produce reimplantable tissues with particularly biocompatible properties and high stability. For this it is necessary to examine the matrix synthesis of the tissue cultures under different mechanical loads and supply conditions.
  • Saini et. al. (Saini S, Wick M, Kenneth W, Concentric cylinder bioreactor for production of tissue engineered cartilage, 2002 Nethew International Symposium on Tissue Engineering, Atlanta GA, Oral Presentation) use a reactor similar to a concentric cylinder viscometer to stimulate pressure.
  • an outer cylinder rotating around an inner stationary cylinder with a conical bottom.
  • the shear stress depends on the rotational speed of the outer cylinder and the size of the composites.
  • the gap between the inner and outer cylinder is 3 mm and thus determines the diameter of the composite.
  • the disadvantage of this arrangement is that it can only be operated in a batch process and not continuously.
  • Kasra et al. cultivate and stimulate the cells in one Reactor in which the pressure is transferred to the medium via a stamp.
  • the composites in a tissue culture plate are placed together with this in the medium-filled hydraulic chamber.
  • the desired force is transferred to the stamp with a drive and thus leads to the pressure build-up in the medium.
  • This type of reactor also offers no possibility for continuous operation.
  • the medium cannot be conditioned by placing the reactor in an incubator, since the hydraulic chamber is sealed off from the environment.
  • the bioreactor used consists of a petri dish that functions as a batch reactor.
  • the composites in the Petri dish are mechanically stimulated by a stamp, which is cyclically deflected by an eccentric camshaft.
  • the frequency of the load is therefore dependent on the speed of rotation of the camshaft.
  • the reactor is placed in an incubator, whereby the medium is conditioned (oxygen input, pH regulation for carbonic acid / hydrogen carbonate buffered media, temperature).
  • tissue culture plates with the composites are placed in a working chamber (max. 6 tissue culture plates) and a defined gas mixture is applied.
  • the gas pressure is transferred to the composites through the medium in the cavities of the cell culture plates.
  • the gas mixture is led into the working chamber by opening a valve. When the target pressure in the working chamber is reached, the valve is closed.
  • the gas mixture is pumped from the working chamber into the storage chamber with the valve open.
  • the gas mixture flows back into the working chamber through a valve. Pressure losses are registered by the pressure sensor in the working chamber and eliminated by supplying the gas mixture until the setpoint is reached. A water bath at the bottom of the working chamber ensures a constant temperature.
  • the intermittent hydrostatic pressure load device and the regulation of the pressure are controlled by a computer program. However, with this system it is not possible to continuously exchange the medium in the cavities of the tissue culture plates.
  • the syringe contains the medium and the test specimen.
  • the pressure vessel is pressurized with nitrogen gas.
  • the pressure is transferred via the water to the syringe plunger and through this to the medium.
  • This apparatus is not easy to sterilize and overall has a very complex structure. Furthermore, continuous operation is not possible with this apparatus.
  • Nehring et al. (Nehring D, Adamietz P, Meeren NM, Pörtner R, Perfusion cultures and modeling of oxygen uptake with three dimensional chondrocyte pellets, 1999 Biotechnology techniques 13, 701-706) use a system in which the samples are in a culture chamber with 10 wells , similar to a tissue culture dish, are continuously supplied with conditioned medium. Pressure stimulation is not possible with this system.
  • the object of the present invention is to provide a bioreactor system and a device for pressure stimulation which is suitable for the cultivation (production) and mechanical pressure stimulation of cells and cell-matrix composites under sterile conditions, a high degree of variability in terms of stimulation, Has cultivation and handling and is easy to clean.
  • bioreactor system according to claims 10 to 16 and the device for pressure stimulation according to claims 1-9 are particularly simple in construction, easy to sterilize and suitable for the cultivation and mechanical pressure stimulation of cells and cell matrix composites.
  • the bioreactor system consists of a bioreactor and a device for pressure stimulation. It is characterized by a high degree of variability in terms of stimulation, cultivation and handling: -
  • the stimulation of the composites takes place with defined or undefined pressure -
  • the mechanical pressure stimulation takes place with pistons or stamps -
  • the stimulation is optionally carried out statically and dynamically - Frequency
  • the pressure and duration of the pressure load are freely programmable -
  • the exchange of medium and sampling takes place with the system closed - Easy cleaning and sterilization -
  • Optional setting for perfusion or jba c / 7 operation Measurement of the stress relaxation behavior and / or the load capacity of the Composites take place in the reactor during cultivation - the composites are supplied separately with medium
  • tissue culture plates (Techno Plastic Products, Trasadingen, Switzerland; Nunc, Wiesbaden, Germany; Böttger Bodenmais; etc.) serve as the basis of the bioreactor, which, depending on the type, has 6, 12 or 24 cavities.
  • a device according to the invention for pressure stimulation with stamps or pistons is placed on this tissue culture plate. This arrangement has the advantage that several composites and / or cell samples and / or tissue samples can be cultivated and pressure-stimulated simultaneously in the tissue culture plate.
  • Perforated disks (20), preferably made of VA steel or Teflon, ensure a precisely defined compression of the composites and / or in the tissue culture plates Cell samples and / or tissue samples, because the perforated disks determine the distance between the "support" of the construct (bottom of the cavity of the tissue culture plate) and the stamp (4-6). Furthermore, the perforated disks prevent the. In the holes from Float the disc (19 and / or 41) of the composites out of the area of the stamp and thereby escape the pressure load.
  • the device for pressure stimulation placed on the tissue culture plates also offers the possibility of exchanging medium and taking samples of the medium when the system is closed.
  • the process is carried out alternatively in batch mode, but preferably continuously in perfusion mode.
  • an external conditioning vessel is also connected, in which e.g. the oxygen content and the pH value are measured and regulated. As a result, constant conditions prevail in the bioreactor and inhibiting metabolic products are flushed out.
  • the device for pressure stimulation consists of a preferably rectangular base plate (1) which is placed on a tissue culture plate (2). There are holes in the base plate (1), arranged so that there is a hole directly above each well (well) of the tissue culture plate underneath. Approximately T-shaped pistons (3) with spring elements (7) are inserted into the bores and protrude like a stamp (4-6) into the cavity of the tissue culture plate (2) underneath.
  • a cover (8) with a connection (9) for pressurization e.g. B. placed through a compressed air hose.
  • the rectangular base plate (1) and the cover (8) are placed on top of one another in such a way that a cavity is created between the rectangular base plate (1) and the cover (8), which forms a pressure chamber and which is pneumatically pressurized by the connection (9) is applied.
  • the pressure application at connection (9) deflects the pistons against the spring force of the spring elements (7).
  • the compression springs enable the stamps (4-6) to be returned when the pressure is released.
  • connection (9) is designed for the passage of electrical lines and in the cavity between the rectangular base plate (1) and the cover (8) there is at least one winding connected to the electrical lines for generating an electromotive force which is connected to a / magnets / winding attached to the stamp (4-6) or piston (3) interact in such an electromagnetic way that when electrical energy is supplied via the electrical lines via the connection (9) the stamp (4-6) or piston (3 ) is moved up or down.
  • the device is used for the dynamic pressure loading of tissue cultures, cells, explants or implants of any kind; it is completely sterilized without a tissue culture plate. It is apparent to the person skilled in the art that the principle of the device for pressure stimulation can also be readily transferred to commercially available tissue culture plates with 12, 24, 48 and 96 cavities (wells).
  • test specimens sample, tissue, cells, composites, etc.
  • the tissue culture plate can be further cultivated together or independently of the bioreactor as a batch culture in the incubator, or by providing heating and / or cooling elements as part of the device, for example integrated in or on the feed and / or Leakage lines of the media, the test specimens (samples, tissue, cells, composites etc.) can also be further cultivated in the device.
  • piezoresistive pressure transducers based on silicon are preferably used, since they have a number of advantages:
  • a subtracting amplifier can be used to amplify the pressure sensor signal.
  • intervertebral disc cells are isolated and immobilized in agarose.
  • the nuclei pulposi and anuli fibrosi are taken, for example, from pigs or sheep, taken up in digestion medium (approx. 10 ml per gram of tissue) and at 40 rpm and 37 ° C. on a vibrator (Certomat R / H, B.Braun, Melsungen) to separate the cells.
  • the medium consists of 25 mg hyaluronidase and 7.5 mg type II collagenase dissolved in 100 ml PBS (Phosphate Buffered Saline) with calcium, mixed with 125 U / ml penicillin and 125 ⁇ g / ml streptomycin. After 24 hours, the cells are centrifuged with 240 ⁇ g (Labofuge 400, Heraeus-Instruments, Hanau), resuspended in medium and in a tissue culture flask at a density of approx.
  • PBS Phosphate Buffered Saline
  • intervertebral disc cells for example, sterile-filtered (Steritop (0.2 ⁇ m), Millipore, Eschborn) Ham's F12 (Biochrom, Berlin) 10% non-heat-inactivated fetal calf serum (PAA Laboratories), 50 mg / l ascorbic acid, 4 mM L-glutamine, 100 u / l penicillin and 100 mg / l streptomycin.
  • the buffer solution for washing the cells before the passages (subculturing) is free of calcium and magnesium in this case and consists, for example, of a 10-fold concentrated stock solution (80 g sodium chloride, 2 g potassium chloride, 2 g di-sodium hydrogen phosphate and 15 g potassium dihydrogen phosphate dissolved in 1 l ultrapure water with pH 7.4), which is diluted with ultrapure water before use and then autoclaved (121 ° C, 20 min.) or sterile filtered.
  • a 10-fold concentrated stock solution 80 g sodium chloride, 2 g potassium chloride, 2 g di-sodium hydrogen phosphate and 15 g potassium dihydrogen phosphate dissolved in 1 l ultrapure water with pH 7.4
  • a commercially available tissue culture plate with, for example, 6 cavities is used as the bioreactor.
  • the bioreactor is autoclaved before use and the cell-matrix composites are then used with 4 ml of medium (without antibiotics) per cavity under sterile conditions.
  • the pressure chamber of the bioreactor is continuously subjected to a pressure of 1.5 x 10 5 Pa and a frequency of 0.1 Hz.
  • Syringe filters (0.2 ⁇ m, 0 25 mm) with screw cap are connected to the hose connections for changing the medium and taking samples. These filters are used to exchange 0.5 ml of medium per cavity per disposable syringe.
  • the pressure equalization and ventilation channels are protected against contamination with sterile air filters (Schleicher & Schuell).
  • incubate for 4 days. After the incubation period of four days, the reactor is separated from the cell culture plate and this is incubated for a further 3 days in the incubator. The medium is then examined microscopically for any contamination. In addition, smears are made on casein peptone soy flour peptone agar (CASO agar) and incubated for 3 days in the incubator.
  • casein peptone soy flour peptone agar CASO agar
  • the procedure is as follows: the medium is alternately circulated for pressure stimulation via peristaltic pumps.
  • the medium is thus fed to the conditioning vessel, where a wide variety of parameters can be measured and regulated, but also the conditioning of the medium takes place in the incubator and stimulants such as cytokines and others can be added.
  • the core of the reactor does not have to be opened, and this significantly reduces the risk of contamination.
  • the cells in the bioreactor are mechanically pressure-stimulated with the pressure apparatus according to the invention with one or more Teflon stamps.
  • the rams (4-6) are deflected pneumatically.
  • a pressure is built up in the pressure chamber, which acts on the punches (4-6) and deflects them against the spring force of pressure springs.
  • a 3/2-way solenoid valve e.g. type 6014, Bürkert, Ingelfingen
  • the valve is connected to a programmable control unit (type 1078, Bürkert), which enables pressure stimulation of the composites at the desired frequency.
  • the duration of the stimulation is controlled by a timer (ML (P5) 1007P, Malon; Shanghai, China) by switching the valve on and off.
  • Compression springs enable the punches (4-6) to be returned when the pressure is released.
  • a stainless steel (VA steel) cell culture plate (from Gerber-Feinmechanik, Mücke-Bernsfeld) with integrated pressure sensors is used as the bioreactor, so that the increase in pressure stability through synthesized extracellular matrix or the stress-relaxation behavior of the composites is measured becomes.
  • the composites are cultivated on the piezoresistive pressure sensors surrounded by a stainless steel housing.
  • a thin, non-directional membrane transfers the force to silicone oil, which is located between the membrane and the pressure measuring cell.
  • the bioreactor is supplemented by a pressure measurement system, which enables the composites to be subjected to precisely defined pressure and the increase in the resilience of the cell-matrix composites and the stress-relaxation behavior of the composites to be measured online.
  • the composites are cultivated in a stainless steel tissue culture plate with integrated pressure sensors.
  • the pressure stimulation apparatus placed on the stainless steel tissue culture plate compresses the composites by a certain amount.
  • the resulting pressure acting on the sensors generates a voltage signal, which is amplified and sent to a display apparatus is performed.
  • Pressure sensors, voltage amplification and signal display form the measuring system.
  • the stainless steel tissue culture plate with pressure sensors is shown in FIG. 3.
  • the tissue culture plate (24) made of VA steel has six holes, each of which is offset in three diameters.
  • the upper diameters (25) form the sterile space (26) for receiving the samples and the nutrient medium.
  • the middle bores (27) serve as guides for the height-adjustable receptacles (29) of the pressure sensors (28).
  • the pressure sensor receptacles (27) are preferably made of PEEK (polyether ether ketone).
  • O-rings (30) seal the sterile areas from the outside area.
  • the third bores (31) allow the connection lines for the pressure sensors to be passed through.
  • the height of the recordings with the pressure sensors can be adjusted using two M2 screws (32) so that the compression of the samples can be defined.
  • the stamp deflection is through the steps
  • the height-adjustable sensor mounts also enable a defined pressure application. As a rule, the stability of the composites increases with cultivation. If the pressure should remain constant during cultivation, the compression must be readjusted using the height-adjustable sensor mounts.
  • the sensitivity of the sensors is greatest in the middle of the non-directional membrane and decreases continuously in the radial direction. A reproducible pressure measurement of elastic test bodies is therefore only possible if the force resulting from the pressure load always acts on the membrane at the same point. The test specimens or composites are therefore recorded
  • the pressure sensor plate can be connected to the bioreactor using M3 screws (36).
  • the time course of the output variable of a measuring system in the event of a sudden change in the input variable is called the step response.
  • the output or measurement variable approaches a stationary value.
  • the step response can be, for example, a delay element of the first or higher order, depending on the size and number of the energy stores (capacities) of the system.
  • step response To measure the stress-relaxation behavior of cell-matrix composites or cartilage tissues, a step response with a relatively small time constant is necessary, since the inertia of the system would otherwise falsify the measurement of dynamic input variables.
  • the ideal step response would be a function in which the output variable reaches a stationary value at the same time as the input variable.
  • a 3% agarose disc was compressed 17-22% to investigate the step response of the measuring system.
  • the resulting pressure was measured over a period of approximately 50 seconds.
  • 2%, 4% and 5% agarose discs were compressed 17-22% and the resulting pressure over a period of time of about 5 minutes.
  • FIGS. 1 and 2 show the device for mechanical pressure loading in a preferred embodiment.
  • the device is made of a rectangular base plate (1), preferably of VA steel, which is placed on a tissue culture plate (2), preferably a 6-, 12-, 24-, 48 - or 96-well plate, is placed.
  • a tissue culture plate (2) preferably a 6-, 12-, 24-, 48 - or 96-well plate
  • the bore can be offset in several diameters, for example with 33 mm at the upper edge of the base plate (37), with 27 mm in the middle (38) and with 21 mm at the lower edge of the base plate (39), which creates three steps.
  • the lower step (40) serves as an abutment for cylindrical spring elements (7, here compression springs) enclosing the piston (3).
  • the piston of the cylindrical stamp (3) is guided into the bore, ie in this embodiment in the upper and lower region of the bore.
  • a cover (8) preferably made of stainless steel, particularly preferably made of VA steel, with a connection (9) for pressurization by gases or liquids is provided on the base plate (1), for example with the aid of a screw connection on the base plate (1) is attached.
  • the cover (8) is attached to the base plate (1) with the aid of four M3 screw connections (10) located in the corners.
  • the cavity created between the cover (8) and the base plate (1) is designed as a pressure chamber (e.g.
  • connection (9) By attaching seals and pressure-resistant connections between the base plate (1) and cover (8)), which are pneumatically connected to gases or liquids via the connection (9) under pressure and thus can be pressurized.
  • the pistons (3) By applying pressure to the connection (9), the pistons (3) are deflected against the corresponding pre-tensioned spring elements (7) and press on the tissue culture plate (2) located under the base plate (1) and below the holes.
  • tissue culture plate (2) In order to be able to exert particularly high pressure on the cells, there is a pressure-tight but detachable connection (not shown) between the tissue culture plate (2) and the base plate (1) placed thereon.
  • This can e.g. in that elastic seals are attached to the outer edge of the tissue culture plate (2), so that when the tissue culture plate is pressurized by the pistons (3) and the associated pressure build-up within the area between the piston and tissue culture plate, the lateral edges of the tissue culture plate extend outwards bend and thus press the elastic seals (41) attached to the outside on the side edges against the part of the base plate (1) protruding beyond the edge, so that a seal and holder of the tissue culture plate is created.
  • a very particularly preferred base plate (1) - not shown - has sides of the base plate which are elongated in an L-shape on the sides ( 1), which are fixed or detachably connected to the base plate (1), the extensions being designed such that the shorter or longer leg of the approximately L-shaped extension engages under the tissue culture plate (2) so that the piston (3) presses the tissue culture plate (2) and thus the contents of the cavities against a firmer abutment.
  • an elastic seal (41) is provided between the extensions and the base plate (1), so that the seal increases the gap between the approximately L-shaped extensions and the base plate (1), such as occurs due to the pressure exerted on the tissue culture plate and thus on the L-shaped extensions, without significant pressure loss.
  • brackets are not shown, e.g. in the form of screw clamps with a stop on the cover (8) and the second stop under the tissue culture plate (2) in order to avoid the "pressing apart" of the parts of cover, base plate and tissue culture plate.
  • the above-mentioned elastic seals can between the respective parts are replaced by tough ones such as Teflon or copper ring seals.
  • an elastic membrane (1) e.g. attached in the form of a silicone film in the transition area between the cover (8) and base plate (1), so that the pressurizing medium, such as gas or air, does not penetrate into the sterile area (13).
  • the elastic membrane (12) separates the pneumatic part of the pressure chamber (11) from the sterile part (13) of the tissue culture plate and thus prevents pressurized medium such as e.g. Air or inert gas flows from the pressure chamber (11) past the piston (3) into the cavities of the tissue culture plate (2).
  • pressurized medium such as e.g. Air or inert gas flows from the pressure chamber (11) past the piston (3) into the cavities of the tissue culture plate (2).
  • connections (14) on the side of the base plate (1) in particular hose connections and corresponding pressure compensation and / or gassing channels (16), for example in the form of bores
  • the channels are designed so that supply media supplied via the connections (14) can be introduced into the assigned cavity or cavities or liquids can be removed from there.
  • a bioreactor is thus created by connecting the device for mechanical pressure loading with channels for feeding / removing media to / from the cavities and the tissue culture plate.
  • two lateral connections (14), preferably hose connections, are attached to the base plate (1), which are each connected to a medium or sample channel (15) in the base plate.
  • Media can be exchanged via these channels (15) and samples can be taken from the cavities when the system is closed.
  • the channels end in tube-like extensions (23) of the sample channels, onto which short (silicone) hoses can be attached in order to be able to adjust the liquid level of the medium in the cavities when the device is operated continuously.
  • Pressure equalization in the cavities in the event of stamp deflection is ensured by a pressure equalization or gassing channel (16) in the central web of the base plate (1) (see B direction in Fig. 2).
  • this longitudinal channel (16) connects e.g.
  • hose connections (18) for the connection of sterile filters are provided at the two openings of the pressure compensation or gassing channel (16) from the base plate (1).
  • a silicone seal (19) between the base plate (1) and the tissue culture plate (2) is a preferred embodiment.
  • the wells of the tissue culture plate (2) have perforated disks (20) which prevent the samples (21) located below or in the holes of the disks - when pressure is exerted - from the area of the pistons (3), for example laterally swim out and are therefore not under pressure.
  • perforated disks of different thicknesses, ie perforated disk walls the pressure can advantageously be varied further, for which purpose the individual pressure control of the pistons (3), which is also provided and is not shown, is used.
  • samples or composites or pellets are prevented from floating out by placing a net or a gauze made of commercially available biocompatible materials.
  • filters for the sterilization or general cleaning of the supplied / discharged media (ports 15) or the media for pressurization (ports 9) are in the feeds to the ports (14) and / or (15). intended. These prevent contamination of the sterile area with microorganisms.
  • the device has approximately in the sterile area (13), on the surface of the tissue culture plate (2), in the area between the lid (8) and the base plate (1) or / and in operative connection with each cavity , at least one pressure or / and temperature sensor, so that in connection with a computing and storage unit, also not shown, a regulation of pressure and / or temperature in the device or - in interaction with a tissue culture plate or composite plate (2nd ) - in the bioreactor system.
  • the cover (8) has dividing walls for delimiting one or more stamps (4-6) or pistons (3) from one another.
  • the resulting chambers can also be opened or closed individually or together by a control unit by means of valves provided in the partition walls of the cover (8), so that all possible combinations of pressurization of pistons (3) or stamps (4-6) are possible ,
  • the channels (14) and (18) can also be used as an inlet for the perfusion operation (continuous operation) of the device or the bioreactor system. NEN, so that two channels and connections (14) are not necessary for each cavity.
  • connection (9) is alternatively or additionally designed to carry media for pressurizing or also to carry out electrical lines and is furthermore in the cavity between the rectangular base plate (1) and the cover (8) at least one winding connected to the electrical lines is provided for generating an electromotive force which interacts electromagnetically with a magnet / winding attached to the plunger (4-6) or piston (3) such that when electrical Energy is moved up or down via the electrical lines via the connection (9), the plunger (4-6) or the piston (3).
  • cover (8) and base plate (1) can also be made in one piece.
  • the spring elements - with a different gradation of the bore in the base plate (1) can also be preloaded in such a way that the pistons (3) at normal pressure in the chamber (13) permanently on the samples or cells (21 ) and a reduction in pressure is not applied until vacuum is applied.
  • Elastic membrane e.g. silicone film
  • Seal e.g. silicone packing

Abstract

Es wird ein Bioreaktorsystem zur Druckstimulation von Zellen, Zell-Matrix­Kompositen oder anderen biologischen Proben bereitgestellt, bestehend aus einem Bioreaktor und einer Vorrichtung zur Druckstimulation, das vielseitige Anwendungsmöglichkeiten bezüglich der optimalen Versuchsparameter zur Kultivierung bzw. Züchtung von Zellen oder Zell-Matrix-Kompositen aufweist. Es zeichnet sich dadurch aus, dass die Stimulation der Zellen oder Komposite mit definiertem oder undefiniertem Druck erfolgen kann und Dauer und Fre­quenz der Druckstimulation frei programmierbar sind. Der Mediumwechsel und Probennahme erfolgen bei geschlossenem System und eine einfache Reini­gung ist möglich. Das erfindungsgemäße Bioreaktorsystem weist zu dem Heiz­- oder/und Kühlelemente und Pumpmittel, sowie Sensoren und Regeleinheiten für pH-Wert, Temperatur und Druck auf und läuft wahlweise im Perfusions­- (kontinuierlichen) oder batch-Betrieb.

Description

Patentanmeldung
Erfindung betreffend Bioreaktoren und Bioreaktorsysteme
Die vorliegende Erfindung betrifft eine Vorrichtung zur mechanischen programm- gesteuerten Druckbelastung von Zellen, Zell-Matrix-Kompositen und/oder Gewebekulturen unter sterilen Bedingungen sowie damit aufgebaute Bioreaktoren und Bioreaktorsysteme. Die Herstellung von autologen Zellimplantaten als homogenes Zell-Biomaterial-Komposit ist ein vielversprechender Ansatz zur Rekonstruktion von zerstörten Gewebeteilen im Körper. Dazu ist es erforderlich, autologe Zellen beispielsweise Knorpelzellen in eine dreidimensionale Form zu bringen und das Komposit weiter zu kultivieren. Ziel ist es, reimplantierbare Gewebe mit besonders biokompatiblen Eigenschaften und hoher Stabilität herzustellen. Dazu ist es erforderlich, die Matrixsynthese der Gewebekulturen bei unterschiedlichen mechanischen Belastungen und Versorgungsbedingungen zu untersuchen.
Stand der Technik
Für die Druckstimulation von Zellen und Geweben sind bereits verschiedene Systeme im Stand der Technik bekannt. Dies sind z.B. die von Buschmann et al. (Buschmann MD, Gluzband YA, Grodzinsky AJ, Hunziger EB, Mechanical compression modulates matrix biosynthesis in chondrocyte/agarose culture 1995 Journal of Cell Science Vol. 108; 1497-1508), Mauck et al. (Mauck RL, Soltz MA, Wang CCB, Wong DD, Valhmu WB, Hung CT, Ateshian GA Influence of seeding density and dynamic deformational loading on the developing structure/function relationships of chondrocyte-seeded agarose hydrogels 2002 Annais of Biomedi- cal Engineering Vol. 30, 1446-1456), Davisson et al. (Davisson T, Kunig S, Chen A, Sah R., Ratcliffe A, Static and dynamic compression modulate matrix metabo- lism in tissue engineered cartilage, 2002 Journal of Orthopaedic Research Vol.20; 842-848) und Bonassar et.al. (Bonassar LJ, Grodzinsky AJ, Frank EH, Cavila SG, Bhaktav NR, Trippel SB, The effect of dynamic compression on the response of articular cartilage to insulin-like growth factor-l, 2001 Journal of Orthopaedic Research Vol. 19; 11-17) beschriebenen Apparaturen zur Druckstimulation, bei denen ein Kolben die Proben direkt belastet. Alternativ wird von Carver et al. (Carver SE, Heath CA, Increasing extracellular matrix production in regenerating cartilage with intermittent physiological pressure 1999 Biotechnology and Bioengineering Vol. 62; 166-174) eine Apparatur zur Druckstimulation verwendet, bei der ein Kolben auf das Medium wirkt und der Druck auf die Probe übertragen wird.
Folgende Bioreaktoren zur Kultivierung und Druckstimulation von Zell-Matrix-
Kompositen sind bekannt:
Saini et. al. (Saini S, Wick M, Kenneth W, Concentric cylinder bioreactor for pro- duction of tissue engineered cartilage, 2002 Nethew International Symposium on Tissue Engineering, Atlanta GA, Oral Presentation) verwenden zur Druckstimulierung einen Reaktor, der einem konzentrischen Zylinder-Viskosimeter ähnelt, wobei ein äußerer Zylinder um einen inneren stationären Zylinder mit konischem Boden rotiert. Zwischen den Zylindern befinden sich die Zell-Matrix-Komposite, auf die eine Scherbelastung ausgeübt wird. Die Scherbelastung ist von der Rotationsgeschwindigkeit des äußeren Zylinders und der Größe der Komposite abhängig. Der Spalt zwischen innerem und äußerem Zylinder beträgt 3 mm und bestimmt so den Durchmesser der Komposite. Nachteilig ist bei dieser Anordnung, dass es nur im batch-Verfahren und nicht kontinuierlich betrieben werden kann.
Kasra et al. (Kasra M, Goel V, Martin J, Wang ST, Choi W, Buckwalter J, Effect of dynamic hydrostatic pressure on rabbit intervertebral disc cells, 2003 Journal of Orthopaedic Research Vol. 21 ; 597-603) kultivieren und stimulieren die Zellen in einem Reaktor, bei dem der Druck über einen Stempel auf das Medium übertra- gen wird. Die in einer Gewebekulturplatte befindlichen Komposite werden zusammen mit dieser in die mediumgefüllte Hydraulikkammer gegeben. Mit einem Antrieb wird die gewünschte Kraft auf den Stempel übertragen und führt so zu dem Druckaufbau im Medium. Auch dieser Reaktortyp bietet keine Möglichkeit für einen kontinuierlichen Betrieb. Außerdem ist keine Konditionierung des Mediums durch Platzierung des Reaktors in einem Inkubator möglich, da die Hydraulikkammer gegenüber der Umgebung abgedichtet ist. Sehr nachteilig ist, dass das Medium bei diesem Typ häufiger gewechselt werden muss. Der von Mauck et al. (Mauck RL, Soltz MA, Wang CCB, Wong DD, Valhmu WB, Hung CT, Ateshian GA, Functional tissue engineering of articular cartilage through dynamic loading of chondrocyte-seeded agarose gels, 2000 Journal of Biomecha- nical Engineering Vol. 122; 252-260) eingesetzte Bioreaktor besteht aus einer Pet- rischale, die die Funktion eines batch-Reaktors hat. Die in der Petrischale befindlichen Komposite werden durch einen Stempel mechanisch stimuliert, wobei der Stempel durch eine exzentrische Nockenwelle zyklisch ausgelenkt wird. Die Frequenz der Belastung ist somit von der Drehgeschwindigkeit der Nockenwelle abhängig. Der Reaktor wird in einem Inkubator platziert, wodurch das Medium kondi- tioniert wird (Sauerstoffeintrag, pH-Regulierung bei Kohlensäu- re/Hydrogencarbonat-gepufferten Medien, Temperatur).
Diese Apparatur weist den Nachteil auf, dass durch den mechanischen Antrieb mittels einer Nockenwelle erhebliche Dichtungsprobleme auftreten, deren Lösung den gängigen Anforderungen an Sterilität kaum oder nur mit sehr hohem apparativen Aufwand gerecht werden. Darüber hinaus ist kein Perfusionsbetrieb möglich. Im System von Domm et al. (Domm C, Fay J, Schünke M, Kurz B, Die Redifferen- zierung von dedifferenzierten Gelenkknorpelzellen in Alginatkultur, 2000 Der Orthopäde Vol. 29; 91-99) und Hansen et al. (Hansen U, Schünke M, Domm C, lo- annidis N, Hassenpflug J, Gehrke T, Kurz B, Combination of reduced oxygen ten- sion and intermittent hxdrostatic pressure: a useful tool in articular cartilage tissue engineering, 2001 Journal of Biomechanics Vol. 34; 941-949) werden Gewebekulturplatten mit den Kompositen in eine Arbeitskammer gegeben (max. 6 Gewebe- kulturplatten) und mit einem definierten Gasgemisch beaufschlagt. Der Gasdruck wird durch das in den Kavitäten der Zellkulturplatten befindliche Medium auf die Komposite übertragen. Das Gasgemisch wird durch Öffnen eines Ventils in die Arbeitskammer geleitet. Ist der Solldruck in der Arbeitskammer erreicht, wird das Ventil geschlossen. Am Ende der Belastungsphase wird das Gasgemisch bei geöffnetem Ventil mit einer Pumpe aus der Arbeitskammer in die Vorratskammer gepumpt. Am Ende der Entlastungsphase strömt das Gasgemisch wieder durch ein Ventil in die Arbeitskammer. Druckverluste werden durch den Drucksensor in der Arbeitskammer registriert und durch Zuleitung von Gasgemisch bis zum Erreichen des Sollwertes beseitigt. Ein Wasserbad am Boden der Arbeitskammer sorgt für eine konstante Temperatur. Die intermittierende hydrostatische Druckbelas- tung und die Regelung des Druckes werden durch ein Computerprogramm gesteuert. Allerdings ist bei diesem System kein kontinuierlicher Mediumaustausch in den Kavitäten der Gewebekulturplatten möglich.
Die von Handa et al. (Handa T, Ishihara H, Oshima H, Osada R, Tsuji H, Obata K, Effects of hydrostatic pressure on matrix synthesis and matrix metalloproteinase production in the human lumbar intervertebral disc, 1997 Spine Vol. 22; 1085- 1091) und Hutton et al. (Hutton WC, Eimer WA, Boden SD, Hyon S, Toribatake Y, Tomita K, Hair GA, The effect of hydrostatic pressure on intervertebral disc meta- bolism, 1999 Spine Vol 24; 1507-1515) beschriebenen Apparaturen werden zur statischen Druckapplikation eingesetzt. Ein mit Wasser gefülltes Druckgefäß enthält eine Plastik-Spritze, die als batch-Reaktor dient. In der Spritze befinden sich Medium und die Testkörper. Das Druckgefäß wird mit Stickstoffgas beaufschlagt. Der Druck wird über das Wasser auf den Spritzenkolben und durch diesen auf das Medium übertragen. Am Deckel der Apparatur befindet sich ein Manometer zur Messung des aufgebauten Druckes. Diese Apparatur ist nicht einfach zu sterilisieren und weist insgesamt einen sehr komplexen Aufbau auf. Weiterhin ist mit dieser Apparatur kein kontinuierlicher Betrieb möglich.
Nehring et al. (Nehring D, Adamietz P, Meeren NM, Pörtner R, Perfusion cultures and modelling of oxygen uptake with three dimensional chondrocyte pellets, 1999 Biotechnology techniques 13, 701-706) setzten ein System ein, bei dem die Proben in einer Kulturkammer mit 10 Wells, ähnlich einer Gewebekulturschale, kontinuierlich mit konditioniertem Medium versorgt werden. Eine Druckstimulation ist mit diesem System nicht möglich.
Aufgabe
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein Bioreaktorsystem und eine Vorrich- tung zur Druckstimulation bereitzustellen, das zur Kultivierung (Herstellung) und mechanischen Druckstimulation von Zellen und Zell-Matrix-Kompositen unter sterilen Bedingungen geeignet ist, ein hohes Maß an Variabilität hinsichtlich der Stimulation, Kultivierung und Handhabung aufweist und einfach zu reinigen ist. Lösung der Aufgabe
Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst durch die Bereitstellung einer Vorrichtung zur Druckstimulation, die auf eine Gewebekulturplatte gesetzt ein neuartiges Bioreaktorsystem darstellt. Das Bioreaktorsystem gemäß der Ansprüche 10 bis 16 und die Vorrichtung zur Druckstimulation gemäß der Ansprüche 1-9 sind besonders einfach aufgebaut, leicht sterilisierbar und zur Kultivierung und mechanischen Druckstimulation von Zellen und Zell-Matrix-Kompositen geeignet.
Das Bioreaktorsystem besteht aus einem Bioreaktor und einer Vorrichtung zur Druckstimulation. Es zeichnet sich durch ein hohes Maß an Variabilität hinsichtlich der Stimulation, Kultivierung und Handhabung aus: - Die Stimulation der Komposite erfolgt mit definiertem oder Undefiniertem Druck - Die mechanische Druckstimulation erfolgt mit Kolben bzw. Stempeln - Die Stimulation wird wahlweise statisch und dynamisch durchgeführt - Frequenz und Dauer der Druckbelastung sind frei programmierbar - Der Austausch von Medium und Probennahme erfolgt bei geschlossenem System - Einfache Reinigung und Sterilisierbarkeit - Wahlweise Einstellung auf Perfusions- oder jba c/7-Betrieb - Messung des Stress-Relaxations-Verhaltens und/oder der Belastbarkeit der Komposite erfolgt während der Kultivierung im Reaktor - Die Komposite werden getrennt mit Medium versorgt
Als Basis des Bioreaktors dienen handelsübliche Gewebekulturplatten (Fa. Techno Plastic Products, Trasadingen, Schweiz; Fa. Nunc, Wiesbaden, Deutschland; Fa. Böttger Bodenmais; etc.), die je nach Typ 6, 12 oder 24 Kavitäten besitzt. Auf diese Gewebekulturplatte wird eine erfindungsgemäße Vorrichtung zur Druckstimulation mit Stempeln oder Kolben aufgesetzt. Diese Anordnung hat den Vorteil, dass in der Gewebekulturplatte gleichzeitig mehrere Komposite und/oder Zellproben und/oder Gewebproben kultiviert und druckstimuliert werden können. In den Gewebekulturplatten sorgen Lochscheiben (20), vorzugsweise aus VA- Stahl oder Teflon, für eine genau definierte Kompression der Komposite und/oder Zellproben und/oder Gewebeproben, da durch die Lochscheiben der Abstand zwischen dem „Auflager" des Konstrukts (Boden der Kavität der Gewebekulturplatte) und dem Stempel (4-6) bestimmt wird. Weiterhin wird durch die Lochscheiben verhindert, dass die in den Löchern der Scheibe (19 und/oder 41) befindlichen Komposite aus dem Bereich der Stempel herausschwimmen und dadurch der Druckbelastung entgehen.
Die auf die Gewebekulturplatten aufgesetzte Vorrichtung zur Druckstimulation bietet darüber hinaus die Möglichkeit, bei geschlossenem System Medium auszutauschen und Proben des Mediums zu entnehmen. Die Prozessführung erfolgt alter- nativ im batch-Betrieb, bevorzugt jedoch kontinuierlich im Perfusionsbetrieb. Beim kontinuierlichen Betrieb ist zusätzlich ein externes Konditionierungsgefäß angeschlossen, in dem z.B. der Sauerstoffgehalt und der pH-Wert gemessen und reguliert wird. Dadurch herrschen im Bioreaktor konstante Verhältnisse, und inhibierende Stoffwechselprodukte werden ausgespült.
Die erfindungsgemäße Vorrichtung zur Druckstimulation besteht aus einer vorzugsweise rechteckigenGrundplatte (1), die auf eine Gewebekulturplatte (2) aufgesetzt wird. In der Grundplatte (1) befinden sich Bohrungen, so angeordnet, dass direkt über jeder Vertiefung (Well) der darunter liegenden Gewebekulturplatte eine Bohrung vorhanden ist. In die Bohrungen werden etwa T-förmige Kolben (3) mit diese umfassende Federelementen (7), eingesetzt, die wie ein Stempel (4-6) in die Kavität der darunter liegenden Gewebekulturplatte (2) ragen. Auf der rechteckigenGrundplatte (1) wird ein Deckel (8) mit einem Anschluss (9) für eine Druckbeaufschlagung, z. B. durch einen Druckluftschlauch aufgesetzt. Die rechte- ckigeGrundplatte (1) und der Deckel (8) werden so aufeinander gesetzt, dass zwischen der rechteckigenGrundplatte (1) und dem Deckel (8) ein Hohlraum entsteht, der eine Druckkammer bildet und der durch den Anschluss (9) pneumatisch mit Druck beaufschlagt wird. Die Druckapplikation am Anschluss (9) lenkt die Kolben gegen die Federkraft der Federelemente (7) aus. Die Druckfedern ermöglichen die Rückführung der Stempel (4-6) bei der Druckentlastung. Alternativ ist der Anschluss (9) zur Durchführung von elektrischen Leitungen ausgelegt und ist in dem Hohlraum zwischen der rechteckigenGrundplatte (1) und dem Deckel (8) mindestens eine mit den elektrischen Leitungen verbundene Wicklung zur Erzeugung einer elektromotorischen Kraft vorgesehen, welche mit einem/einer an dem Stempel (4-6) oder Kolben (3) angebrachten Magneten/Wicklung derart elektromagnetisch wechselwirkt, dass bei Zuführung von e- lektrischer Energie über die elektrischen Leitungen über den Anschluss (9) der Stempel (4-6) oder Kolben (3) nach oben oder unten bewegt wird.
Die Vorrichtung dient der dynamischen Druckbelastung von Gewebekulturen, Zellen, Explantaten oder Implantaten jeglicher Art; sie wird komplett ohne Gewebekulturplatte sterilisiert. Es ist dem Fachmann ersichtlich, dass das Prinzip der Vorrichtung zur Druckstimulation auch ohne weiteres auf handelsübliche Gewebekul- turplatten mit 12, 24, 48 und 96 Kavitäten (Wells) übertragbar ist.
Durch die gleichzeitige Kultivierung und Stimulation mehrerer Komposite ist eine statistische Aussage der Ergebnisse möglich. Es ist vorgesehen, jede Kavität über eigene Anschlüsse mit Medium zu versorgen, damit vergleichende Tests mit verschiedenen Medien und Zusätzen durchgeführt werden. Darüber hinaus können die Testkörper (Probe, Gewebe, Zellen, Komposite etc.) unterschiedlich stark komprimiert werden. Nach der kontinuierlichen Kultivierung kann die Gewebekulturplatte zusammen oder unabhängig vom Bioreaktor als batch-Kultur im Brut- schrank weiterkultiviert werden, oder durch die Vorsehung von Heiz- und/oder Kühlelementen als Teil der Vorrichtung, z.B. integriert in oder an den Zu- und/oder Abführleitungen der Medien, können die Testkörper (Proben, Gewebe, Zellen, Komposite etc.) auch in der Vorrichtung verbleibend weiter kultiviert werden. Während der Kultivierung von Zell-Matrix-Kompositen baut sich eine extrazelluläre Matrix auf, die die Druckbelastbarkeit der Komposite erhöht. Kultiviert man die Komposite direkt auf Drucksensoren, kann die Zunahme der Belastbarkeit mit der Kultivierungszeit online gemessen werden. Für diesen Einsatz werden piezore- sistive Druckaufnehmer vorzugsweise auf der Basis von Silizium verwendet, da diese eine Reihe von Vorteilen haben:
- hoher k-Faktor → hohe Empfindlichkeit - kurze Einstellzeiten → geeignet für dynamische und statische Messungen - lineare Kennlinie - geringe Abmessungen
Zur Verstärkung des Drucksensorsignals kann beispielsweise ein Subtrahierverstärker eingesetzt werden.
Ausführungsbeispiele
1. Isolierung und Vermehrung von Zell-Matrix-Kompositen
Zur beispielhaften Kultivierung und Druckstimulation von Zell-Matrix-Kompositen werden Bandscheibenzellen isoliert und in Agarose immobilisiert. Dazu werden die Nuclei pulposi und Anuli fibrosi beispielsweise aus Schweinen oder Schafen entnommen, in Verdauungsmedium (ca. 10 ml pro Gramm Gewebe) aufgenommen und bei 40 UPM und 37°C auf einem Rüttler (Certomat R/H, Fa. B.Braun, Melsungen) inkubiert, um die Zellen zu vereinzeln. Das Medium besteht aus 25 mg Hyaluronidase und 7,5 mg Typ-Il-Kollagenase in 100 ml PBS (Phosphate Buffered Saline) mit Calcium gelöst, mit 125 U/ml Penicillin und 125 μg/ml Streptomycin versetzt. Nach 24 Stunden werden die Zellen mit 240 x g zentrifu- giert (Labofuge 400, Fa. Heraeus-Instruments, Hanau), in Medium resuspendiert und in einer Dichte von ca. 5000 Zellen/cm2 in Gewebekulturflaschen (Fa. Techno Plastic Products, Trasadingen, Schweiz; Fa. Nunc, Wiesbaden; Fa. Böttger Bodenmais etc.) ausgesät, bei 37°C kultiviert und bei Erreichen von ca. 90 % Kon- fluenz passagiert. Als Medium zur Kultivierung weiterer Zell-Matrix-Komposite wird jeweils das für diese Zeil- bzw. Gewebesorte optimale Medium verwendet. Die Auswahl des geeigneten Mediums ist dem Fachmann anhand der Literatur leicht möglich. Zur Kultivierung von beispielsweise Bandscheibenzellen wird beispielsweise steril- filtriertes (Steritop (0,2 μm), Fa. Millipore, Eschborn) Ham's F12 (Fa. Biochrom, Berlin) 10% nicht hitzeinaktiviertem fetalem Kälberserum (Fa. PAA Laboratories), 50 mg/l Ascorbinsäure, 4 mM L-Glutamin, 100 u/l Penicillin und 100 mg/l Strepto- mycin eingesetzt. Die Pufferlösung zum Waschen der Zellen vor den Passagen (Subkultivierungen) ist in diesem Fall calcium- und magnesiumfrei und besteht beispielsweise aus einer 10-fach konzentrierten Vorratslösung (80g Natriumchlorid, 2g Kaliumchlorid, 2g di-Natriumhydrogenphosphat und 15g Kaliumdihydrogenphosphat in 1 I Reinstwasser gelöst mit einem pH-Wert von 7,4), die vor der Verwendung mit Reinstwasser verdünnt und anschließend autoklaviert (121°C, 20 Min.) oder steril- filtriert wird.
2. Kultivierung von Zell-Matrix-Kompositen im Bioreaktor
Als Bioreaktor wird eine handelsübliche Gewebekulturplatten mit beispielsweise 6 Kavitäten (Fa. Techno Plastic Products, Trasadingen, Schweiz) verwendet. Dazu wird der Bioreaktor vor der Verwendung autoklaviert und anschließend die Zell- Matrix-Komposite mit 4 ml Medium (ohne Antibiotika) pro Kavität unter sterilen Bedingungen eingesetzt. Nach einer Inkubationszeit von einem Tag im Brutschrank bei 37°C, 95% Luftfeuchte, 5% C02 wird die Druckkammer des Bioreaktors kontinuierlich mit einem Druck von 1,5 x 105 Pa und einer Frequenz von 0,1 Hz beaufschlagt. An den Schlauchanschlüssen für Mediumwechsel und Probennahme werden Spritzenvorsatzfilter (0,2 μm, 0 25 mm) mit Schraubverschluss angeschlossen. Über diese Filter werden per Einwegspritzen täglich 0,5 ml Medium pro Kavität ausgetauscht. Die Druckausgleichs- bzw. Belüftungskanäle werden mit Sterilluftfilter (Fa. Schleicher&Schuell) vor Kontaminationen geschützt.
Alternativ wird 4 Tage lang inkubiert. Nach der Inkubationszeit von vier Tagen wird der Reaktor von der Zellkulturplatte getrennt und diese noch weitere 3 Tage im Brutschrank inkubiert. Anschließend wird das Medium mikroskopisch auf etwaige Kontaminationen untersucht. Zusätzlich werden Ausstriche auf Caseinpepton- Sojamehlpepton-Agar (CASO-Agar) angefertigt und 3 Tage im Brutschrank inkubiert.
Zur Perfusion (Kontinuierlicher Betrieb) des Zell-Matrix-Aggregates mit Medium wird wie folgt verfahren: Über Schlauchpumpen wird das Medium alternierend zur Druckstimulation umgewälzt. Damit wird das Medium dem Konditionierungsgefäß zugeführt, wo verschiedenste Parameter gemessen und geregelt werden können und aber auch die Konditionierung des Mediums im Brutschrank stattfindet sowie Stimulantien, wie Cytokine u.a. zugesetzt werden können. Dabei muss das Reaktor-Kernstück nicht geöffnet werden, und damit wird die Kontaminationsgefahr er- heblich verringert. 3. Druckstimulation
Die Zellen im Bioreaktor werden mit der erfindungsgemäßen Druckapparatur mit einem oder mehreren Teflonstempeln mechanisch druckstimuliert. Die Auslenkung der Stempel (4-6) erfolgt pneumatisch. Dazu wird in der Druckkammer ein Druck aufgebaut, der auf die Stempel (4-6) wirkt und diese gegen die Federkraft von Druckfedern auslenkt. Für die zyklische Druckapplikation wird ein 3/2-Wege- Magnetventil (z.B. Typ 6014, Fa. Bürkert, Ingelfingen) eingesetzt. Das Ventil ist mit einer programmierbaren Steuereinheit (Typ 1078, Fa. Bürkert) verbunden, die die Druckstimulation der Komposite mit der gewünschten Frequenz ermöglicht. Die Dauer der Stimulation wird über eine Zeitschaltuhr (ML(P5)1007P, Fa. Malon; Shanghai, China) durch Ein- bzw. Ausschalten des Ventils gesteuert. Druckfedern ermöglichen die Rückführung der Stempel (4-6) bei der Druckentlastung.
Alternativ wird als Bioreaktor eine Edelstahl-(VA-Stahl-) Zellkulturplatte (Fa. Gerber-Feinmechanik, Mücke-Bernsfeld) mit integrierten Drucksensoren verwendet, so dass die Zunahme der Druckstabilität durch synthetisierte extrazelluläre Matrix oder das Stress-Relaxations-Verhalten der Komposite gemessen wird. Die Komposite werden dabei auf den von einem Edelstahlgehäuse umgebenen piezore- sistiven Drucksensoren kultiviert. Eine dünne richtkraftlose Membran überträgt die einwirkende Kraft auf Silikonöl, das sich zwischen der Membran und der Druckmesszelle befindet.
4. Druckmesssystem
Der Bioreaktor wird durch ein Druckmesssystem ergänzt, das es ermöglicht, die Komposite mit genau definiertem Druck zu belasten und die Zunahme der Belastbarkeit der Zell-Matrix-Komposite sowie das Stress-Relaxations-Verhalten der Komposite online zu messen. Dazu werden die Komposite in einer Edelstahl- Gewebekulturplatte mit integrierten Drucksensoren kultiviert. Die auf die Edelstahl- Gewebekulturplatte aufgesetzte Apparatur zur Druckstimulation komprimiert die Komposite um einen bestimmten Betrag. Der auf die Sensoren wirkende resultierende Druck erzeugt ein Spannungssignal, das verstärkt und an eine Anzeige- apparatur geführt wird. Drucksensoren, Spannungsverstärkung und Signaldarstellung bilden das Messsystem.
Die Edelstahl-Gewebekulturplatte mit Drucksensoren ist in Fig. 3 dargestellt. Die Gewebekulturplatte (24) aus VA-Stahl besitzt sechs Bohrungen, die jeweils in drei Durchmessern abgesetzt sind. Die oberen Durchmesser (25) bilden den Sterilraum (26) für die Aufnahme der Proben und des Nährmediums. Die mittleren Bohrungen (27) dienen als Führung für die höhenverstellbaren Aufnahmen (29) der Drucksensoren (28). Die Drucksensoraufnahmen (27) sind vorzugsweise aus PEEK (Polyetheretherketon) gefertigt. O-Ringe (30) dichten die sterilen Bereiche gegenüber dem Außenbereich ab.
Die dritten Bohrungen (31) ermöglichen die Durchführung der Anschlussleitungen für die Drucksensoren. Die Aufnahmen mit den Drucksensoren lassen sich jeweils mittels zwei M2-Schrauben (32) in der Höhe verstellen, so dass die Kompression der Proben definiert werden kann. Die Stempelauslenkung wird durch die Stufen
(33) begrenzt. Die höhenverstellbaren Sensoraufnahmen ermöglichen auch eine definierte Druckapplikation. In der Regel nimmt die Stabilität der Komposite mit fortschreitender Kultivierung zu. Soll der Druck während der Kultivierung konstant bleiben, muss die Kompression mit den höhenverstellbaren Sensoraufnahmen nachreguliert werden.
Die Empfindlichkeit der Sensoren ist in der Mitte der richtkraftlosen Membran am größten und nimmt in radialer Richtung kontinuierlich ab. Eine reproduzierbare Druckmessung von elastischen Testkörpern ist daher nur möglich, wenn die aus der Druckbelastung resultierende Kraft immer an der gleichen Stelle auf die Membran wirkt. Die Testkörper bzw. Komposite werden deshalb in Aufnahmen
(34) aus PEEK aufgenommen, die die resultierenden Kräfte über einen zylindrischen Fortsatz (35) mit 1 ,5 mm Durchmesser mittig auf die Membran übertragen. Mit M3-Schrauben (36) kann die Drucksensorplatte mit dem Bioreaktor verbunden werden. Den zeitlichen Verlauf der Ausgangsgröße eines Messsystems bei einer sprunghaften Änderung der Eingangsgröße bezeichnet man als Sprungantwort. Die Ausgangs- oder Messgröße nähert sich einem stationären Wert. Die Sprungantwort kann z.B. ein Verzögerungsglied erster oder höherer Ordnung sein, abhängig von der Größe und Anzahl der Energiespeicher (Kapazitäten) des Systems. Für die Messung des Stress-Relaxations-Verhalten von Zell-Matrix-Kompositen oder Knorpelgeweben ist eine Sprungantwort mit relativ kleiner Zeitkonstante nötig, da die Trägheit des Systems ansonsten die Messung von dynamischen Eingangsgrößen verfälscht. Die ideale Sprungantwort wäre eine Funktion, bei der die Aus- gangsgröße zeitgleich mit der Eingangsgröße einen stationären Wert erreicht.
Zur Untersuchung der Sprungantwort des Messsystems wurde eine 3%-Agarose- Scheibe 17-22% komprimiert. Der resultierende Druck wurde über einen Zeitraum von ca. 50 Sekunden gemessen. Zur Simulation der Belastbarkeitszunahme durch synthetisierte extrazelluläre Matrix sowie der Messung des Stress-Relaxations- Verhaltens von Zell-Agarose-Kompositen wurden 2%-, 4%- und 5%-Agarose- Scheiben 17-22% komprimiert und der resultierende Druck über einen Zeitraum von ca. 5 Minuten gemessen.
Weitere Ausführungsbeispiele werden an Hand der Fig. 1 und Fig. 2 dargestellt. Fig. 1 und Fig. 2 zeigen dazu die Vorrichtung zur mechanischen Druckbelastung in einer bevorzugten Ausführungsform.
Die Vorrichtung ist - in der in Fig. 1 gezeigten Ausführungsform - aus einer rechteckigenGrundplatte (1), bevorzugt aus VA-Stahl, gefertigt, die auf einer Gewebe- kulturplatte (2), vorzugsweise eine 6-, 12-, 24-, 48- oder 96-Well-Platte, aufgesetzt wird. Über jeder Kavität ist eine Bohrung vorhanden, in die z.B. ein zylindrischer, T-förmiger Kolben (3) oder Stempel (4-6) eingesetzt wird, wobei der T-förmige Kolben oder Stempel bevorzugt aus Teflon besteht. Die Bohrung kann in mehrere Durchmesser abgesetzt sein, z.B. mit 33 mm an der Oberkante der Grundplatte (37), mit 27 mm in der Mitte (38) und mit 21 mm an der Unterkante der Grundplatte (39), wodurch drei Stufen entstehen. In dieser Ausführung der Erfindung dient die untere Stufe (40) als Widerlager für zylindrische, den Kolben (3) umschließende Federelemente (7, hier Druckfedern). Der Kolben des zylindrischen Stempels (3) wird in die Bohrung geführt, d.h. in diesem Ausführungsbeispiel im oberen und unteren Bereich der Bohrung. Auf die Grundplatte (1) ist ein vorzugsweise aus aus Edelstahl, besonders bevorzugt aus VA-Stahl gefertigter Deckel (8) mit einem Anschluss (9) für eine Druckbeaufschlagung durch Gase oder Flüssigkeiten vor- gesehen, der z.B. mit Hilfe einer Schraubverbindung an der Grundplatte (1) befestigt ist. In diesem Ausführungsbeispiel erfolgt die Befestigung des Deckels (8) an der Grundplatte (1) mit Hilfe von vier in den Ecken befindlichen M3- Schraubverbindungen (10). Der zwischen Deckel (8) und Grundplatte (1) entstehende Hohlraum ist als Druckkammer (z.B. durch Anbringung von Dichtungen und druckfesten Verbindungen zwischen Grundplatte (1) und Deckel (8)) ausgeführt, die über den Anschluss (9) pneumatisch mit Gasen oder Flüssigkeiten unter Druck und damit mit Druck beaufschlagt werden kann. Durch Druckapplikation am Anschluss (9) werden die Kolben (3) gegen die entsprechend vorgespannten Federelemente (7) ausgelenkt und drücken auf die unter der Grundplatte (1) und un- ter den Bohrungen angebrachte Gewebekulturplatte (2).
Um besonders hohen Druck auf die Zellen ausüben zu können, befindet sich zwischen der Gewebekulturplatte (2) und der darauf aufgesetzten Grundplatte (1) eine - nicht dargestellte - druckdichte, aber lösbare Verbindung. Diese kann z.B. dadurch hergestellt werden, dass am äußeren Rand der Gewebekulturplatte (2) elastische Dichtungen angebracht sind, so dass bei Druckbeaufschlagung der Gewebekulturplatte durch die Kolben (3) und den damit einhergehenden Druckaufbau innerhalb des Bereiches zwischen Kolben und Gewebekulturplatte sich die seitlichen Ränder der Gewebekulturplatte nach außen verbiegen und damit die außen an den seitlichen Rändern angebrachten, elastischen Dichtungen (41) gegen den über den Rand hinunterragenden Teil der Grundplatte (1) drücken, so dass eine Abdichtung und Halterung der Gewebekulturplatte entsteht.
Um noch höheren Druck auf die Proben (21) in den Kavitäten und damit auf die Gewebekulturplatte (2) ausüben zu können, weist eine ganz besonders bevorzugte Grundplatte (1) -nicht dargestellt- an den Seiten etwa L-förmig verlängerte Seitenteile der Grundplatte (1) auf, die mit der Grundplatte (1) fest oder lösbar verbunden sind, wobei die Verlängerungen so ausgeführt sind, dass der kürzere oder längere Schenkel der etwa L-förmigen Verlängerung unter die Gewebekulturplatte (2) greift, so dass der Kolben (3) die Gewebekulturplatte (2) und damit den Inhalt der Kavitäten gegen ein festeres Widerlager drückt. Im Falle der lösbaren Verbindung zwischen den etwa L-förmigen Verlängerungen an der Grundplatte (1) ist ei- ne elastische Dichtung (41) zwischen den Verlängerungen und der Grundplatte (1) vorgesehen, so dass die Dichtung eine eventuelle Vergrößerung des Spaltes zwischen der etwa L-förmigen Verlängerungen und der Grundplatte (1), wie sie etwa durch die Druckausübung auf die Gewebekulturplatte und damit auf die L- förmigen Verlängerungen auftritt, ohne wesentlichen Druckverlust aufnimmt.
Alternativ -nicht dargestellt- werden Klammern, z.B. in Form von Schraubzwingen mit einem Anschlag auf dem Deckel (8) und dem zweiten Anschlag unterhalt der Gewebekulturplatte (2) angebracht, um das „Auseinanderdrücken" der Teile Deckel, Grundplatte und Gewebekulturplatte zu vermeiden. In diesem Fall können die oben genannten elastischen Dichtungen zwischen den jeweiligen Teilen durch zähe, wie z.B. Teflon- oder Kupfer-Ring-Dichtungen ersetzt werden.
In einer weiteren Ausführungsform ist, wie in Fig. 1 auch dargestellt -zur Ausbildung eines sterilen Bereiches (13) im Bereich oberhalb der Gewebekulturplatte- eine elastische Membran (1 ), z.B. in Form einer Silikonfolie im Übergangsbereich zwischen Deckel (8) und Grundplatte (1) angebracht, so dass das druckbeaufschlagende Medium, wie Gas oder Luft, nicht in den sterilen Bereich (13) eindringt. Die elastische Membran (12) trennt den pneumatischen Teil der Druckkammer (11) vom sterilen Teil (13) der Gewebekulturplatte und verhindert somit, dass druckbeaufschlagtes Medium wie z.B. Luft oder inertes Gas aus der Druckkammer (11) an den Kolben (3) vorbei in die Kavitäten der Gewebekulturplatte (2) strömt. Bei Druckentlastung sorgen die Federelemente (7) für eine Rückstellung der Kolben (3) oder Stempel (4-6) in die Ausgangsposition.
Zur Versorgung der Proben oder Gewebekulturen in den Kavitäten oder zur Rückführung von Flüssigkeiten aus den Kavitäten sind an der Seite der Grundplatte (1) Anschlüsse (14), insbesondere Schlauchanschlüsse und damit korrespondierende Druckausgleichs- und/oder Begasungskanäle (16) z.B. in Form von Bohrungen vorgesehen, wobei die Kanäle so ausgeführt sind, dass über die Anschlüsse (14) zugeführte Versorgungsmedien in die zugeordnete Kavität oder die zugeordneten Kavitäten eingebracht oder Flüssigkeiten von dort entnommen werden können. Somit entsteht durch die Verbindung der Vorrichtung zur mechanischen Druckbe- lastung mit Kanälen zur Zuführung/Abführung von Medien zu/von den Kavitäten und der Gewebekulturplatte ein Bioreaktor.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform sind an der Grundplatte (1) pro Kavität zwei seitliche Anschlüsse (14), bevorzugt Schlauchanschlüsse, ange- bracht, die jeweils mit einem Medium- oder Probenkanal (15) in der Grundplatte verbunden sind. Über diese Kanäle (15) können Medien ausgetauscht und Proben aus den Kavitäten bei bei verschlossenem System entnommen werden. Die Kanäle enden in rohrartigen Verlängerungen (23) der Probenkanäle, auf die kurze (Sili- kon-)Schläuche aufgesteckt werden können, um bei kontinuierlicher Betriebswei- se der Vorrichtung den Flüssigkeitsstand des Mediums in den Kavitäten einstellen zu können. Ein Druckausgleich in den Kavitäten bei Stempelauslenkung wird durch einen Druckausgleichs- oder Begasungskanal (16) im Mittelsteg der Grundplatte (1) gewährleistet (siehe B-Richtung in Fig. 2). Dieser Längskanal (16) verbindet in der entsprechenden Ausführungsform jeweils z.B. Paarweise von einan- der getrennte sterile Bereiche, so dass z.B. über davon seitlich nach unten abzweigende, zu jeder oder einzelnen, oder in jede einzelne Kavität führende Quer- Kanäle (17), ein Druckausgleich zwischen den einzelnen Wells stattfinden kann. An den beiden Öffnungen des Druckausgleichs- oder Begasungskanals (16) aus der Grundplatte (1) sind in dieser bevorzugten Ausführungsform Schlauchan- Schlüsse (18) für den Anschluss von Sterilfiltern vorgesehen. Zur Abdichtung des sterilen Bereiches (13) befindet sich eine Silikondichtung (19) zwischen der Grundplatte (1) und der Gewebekulturplatte (2).
In einer weiteren Ausführungsform weisen die Wells der Gewebekulturplatte (2) Lochscheiben (20) auf, welche vermeiden, dass die unterhalb der oder in den Löchern der Scheiben befindlichen Proben (21) -bei Druckausübung- aus dem Bereich der Kolben (3) z.B. seitlich herausschwimmen und dadurch nicht druckbelastet werden. Durch verschieden starke Lochscheiben, d.h. verschieden hohe Loch- scheibenwandungen, kann vorteilhaft der Druck weiter variiert werden, wozu ansonsten die ebenfalls vorgesehene - nicht dargestellte - Einzel-Druckansteuerung der Kolben (3) eingesetzt wird.
In einer weiteren Ausführungsart wird das Herausschwimmen der Proben oder Komposite oder Pellets durch Auflegen eines Netzes oder einer Gaze aus handelsüblichen biokompatiblen Materialien verhindert.
In einer weiteren Ausführungsart -nicht dargestellt- sind in den Zuführungen zu den Anschlüssen (14) und/oder (15) Filter zur Sterilisierung oder generellen Reini- gung der zugeführten/abgeführten Medien (Anschlüsse 15) oder der Medien zur Druckbeaufschlagung (Anschlüsse 9) vorgesehen. Diese verhindern eine Kontamination des sterilen Bereichs mit Mikroorganismen.
In einer weiteren -nicht dargestellten- Ausführungsform weist die Vorrichtung et- wa im sterilen Bereich (13), auf der Oberfläche der Gewebekulturplatte (2), im Bereich zwischen Deckel (8) und Grundplatte (1) oder/und in Wirkverbindung mit jeder Kavität, mindestens einen Druck- oder/und Temperatursensor auf, so dass in Verbindung mit einer ebenfalls nicht dargestellten Rechen- und Speichereinheit eine Regelung von Druck und/oder Temperatur in der Vorrichtung oder - im Zu- sammenspiel mit einer Gewebekulturplatte oder Komposit-Platte (2) - im Bioreaktorsystem ermöglicht wird.
In einem weiteren -nicht dargestellten- Ausführungsbeispiel weist der Deckel (8) Trennwände zur Abgrenzung von einem oder mehreren Stempeln (4-6) oder Kol- ben (3) voneinander auf. Die dadurch entstehenden Kammern können durch e- benfalls in den Trennwänden des Deckels (8) vorgesehenen Ventilen von einer Ansteuerungseinheit einzeln oder zusammen geöffnet oder geschlossen werden, so dass alle Kombinationsmöglichkeiten der Druckbeaufschlagung von Kolben (3) oder Stempeln (4-6) möglich sind.
In einem weiteren -nicht dargestellten- Ausführungsbeispiel ist vorgesehen, dass die Kanäle (14) und (18) auch als Zulauf für den Perfusionsbetrieb (kontinuierlicher Betrieb) der Vorrichtung oder des Bioreaktorsystems verwendet werden kön- nen, so dass seitlich für jede Kavität nicht zwei Kanäle und Anschlüsse (14) notwendig sind.
In einer weiteren, besonders vorteilhaften - nicht dargestellten - Ausführungsform ist der Anschluss (9) alternativ oder zusätzlich zur Durchführung von Medien zur Druckbeaufschlagung oder auch zur Durchführung von elektrischen Leitungen ausgelegt und ist weiterhin in dem Hohlraum zwischen der rechteckigen Grundplatte (1) und dem Deckel (8) mindestens eine, mit den elektrischen Leitungen verbundene Wicklung zur Erzeugung einer elektromotorischen Kraft vorgesehen, welche mit einem/einer an dem Stempel (4-6) oder Kolben (3) angebrachten Magneten/Wicklung derart elektromagnetisch wechselwirkt, dass bei Zuführung von elektrischer Energie über die elektrischen Leitungen über den Anschluss (9) der Stempel (4-6) oder der Kolben (3) nach oben oder unten bewegt wird.
Weiterhin ist dem Fachmann unmittelbar ersichtlich, dass Deckel (8) und Grundplatte (1) auch einstückig gefertigt sein können.
Ebenso ist dem Fachmann unmittelbar ersichtlich, dass die Federelemente -bei anderer Stufung der Bohrung in der Grundplatte (1) auch so vorgespannt sein können, dass die Kolben (3) bei Normaldruck in der Kammer (13) permanent auf die Proben oder Zellen (21) drücken und erst bei Anlegung von Unterdruck eine Reduktion der Druckausübung erfolgt.
Bezugszeichenliste
Grundplatte
Gewebekulturplatte
Stempel oder Kolben
Obere Stempelführung
Mittlere Stempelführung
Untere Stempelführung
Federelemente
Deckel
Anschluss für Druckbeaufschlagung
M3-Schraube
Druckkammer
Elastische Membran, z.B. Silikonfolie
Sterilbereich
(Schlauch-)Anschluss
Seitliche Anschlüsse (Mediurr Probenkanal)
Druckausgleichs-/Begasungskanal
Verbindung des Druckausgleichs-/Begasungskanals mit den
Kavitäten
Schlauchanschluss für Sterilluftfilter
Dichtung, z.B. Silikondichtung
Lochscheibe
Bereich der Probenkörper
Zwingen
Rohrartige Verlängerung der Probenkanäle
Gewebekulturplatte aus VA-Stahl
Oberer Bohrungsdurchmesser
Sterilbereich der z.B. aus VA-Stahl bestehenden Gewebekulturplatte
Führung der Sensoraufnahme
Drucksensor
Sensor-Aufnahme O-Ring-Dichtung Durchführung der Sensoranschlussleitung M2-Schraube zur Höhenverstellung der Sensoren Begrenzung der Stempelauslenkung Aufnahme der Probenkörper Fortsatz zur Kraftübertragung der Sensormembran M3-Schrauben zur Verbindung der VA-Stahl- Gewebekulturplatte mit der Vorrichtung Oberkante der Grundplatte Mitte der Grundplatte Unterkante der Grundplatte Untere Stufe elastische Dichtung

Claims

Ansprüche
1. Vorrichtung zur mechanischen Druckbelastung von Gewebekulturen, Zellen oder biologischen Proben bestehend aus
5 - einer Grundplatte (1) zur Auflage auf eine Gewebekuiturplatte (2), wobei sich in der Grundplatte (1) Bohrungen befinden, die so angeordnet sind, dass direkt über jeder Vertiefung (Well) der darunter befindlichen Gewebekulturplatte eine Bohrung vorhanden ist, in die Kolben (3), z.B. T-förmige Kolben mit Federelementen (7) eingesetzt werden, so dass sie wie ein o Stempel in das Well der darunter befindlichen Gewebekulturplatte einführbar sind - einem Deckel (8), mit einem Anschluss (9) für die Zu- oder Abführung von Medien, der auf der Grundplatte (1) so aufgesetzt wird, dass zwischen- Grundplatte (1) und Deckel (8) ein Hohlraum entsteht, der eine Druck- oder5 Vakuumkammer (11) bildet, die durch den Anschluss (9) mit Druck oder Unterdruck (z.B. durch Zu- oder Abführung von Medien in Form von Gasen oder Flüssigkeiten) beaufschlagt wird, so dass bei Zu- oder Abführung von Medien, die in die Bohrungen der Grundplatte (1) eingesetzten Kolben gegen die Vorspannung der Federelemente (7) nach oben oder unten ge-0 drückt werden.
2. Vorrichtung insbesondere nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet dass der Anschluss (9) für die Zuführung von elektrischer Energie etwa durch Leitungen ausgelegt ist und sich im Hohlraum zwischen Deckel (8) und Grund-5 platte (1) mindestens eine mit den elektrischen Leitungen verbundene Wicklung zur Erzeugung einer elektromotorischen Kraft vorgesehen ist, welche mit einem oder einer an dem Stempel (4-6) oder Kolben (3) angebrachten Magneten oder Wicklung derart elektromagnetisch wechselwirkt, dass bei Zuführung von elektrischer Energie etwa über die elektrischen Leitungen über den An-0 schluss (9) der Stempel (4-6) oder der Kolben (3) nach oben oder unten bewegt wird.
3. Vorrichtung zur mechanischen Druckbelastung von Gewebekulturen und Zellen nach Anspruch 1 oder 2 dadurch gekennzeichnet, dass sie z.B. im Bereich der Grundplatte (1) seitliche Anschlüsse (14) sowie seitliche Kanäle (16) aufweist, die eine Zu- oder Abführung von Medien zu den Proben oder Geweben in den Kavitäten der Gewebekuiturplatte (2) ermöglichen.
4. Vorrichtung zur mechanischen Druckbelastung von Gewebekulturen und Zellen nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass sie - im Falle von mehreren Kavitäten und zugeordneten Stempeln (4-6) oder Kolben (3) Längs- kanäle (16) oder/und Querkanäle (17), z.B. in Form von Bohrungen in der Grundplatte (1) zur Verbindung der Wells und zum Ausgleich von Druckunterschieden zwischen des Wells aufweist.
5. Vorrichtung zur mechanischen Druckbelastung von Gewebekulturen und Zel- len nach Anspruch 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet dass sie eine elastische Membran (12), vorzugsweise aus Silikon, aufweist, welche sich oberhalb der Stempel (4-6) oder Kolben (3) erstreckt und vorzugsweise im Bereich des Übergangs von Deckel (8) zu Grundplatte (1) seitlich befestigt ist, so dass sich unterhalb der Membrane ein nahezu steriler, d.h. von den Medien zur Druck- beaufschlagung abgetrennter Bereich ausbildet.
6. Vorrichtung zur mechanischen Druckbelastung von Gewebekulturen und Zellen nach Anspruch 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Grundplatte (1) aus Kunststoff, vorzugsweise aus Edelstahl gefertigt ist.
7. Vorrichtung zur mechanischen Druckbelastung von Gewebekulturen und Zellen nach Anspruch 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet dass die Bohrung für die Stempel (4-6) oder Kolben (3) in mehreren Durchmessern abgesetzt ist, so dass Stufen entstehen, vorzugsweise in nach innen hin kleiner werdenden Durchmessern, bevorzugt mit 33 mm an der Oberkante, mit 27 mm in der Mitte und mit 21 mm an der Unterkante.
8. Vorrichtung zur mechanischen Druckbelastung von Gewebekulturen und Zellen nach Anspruch 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Stempel (4-6) oder Kolben (3) zylindrisch und vorzugsweise T-förmig sind und aus zähem Material, vorzugsweise aus Edelstahl oder Metall, besonders bevorzugt aus Teflon oder PEEK, gefertigt sind.
9. Vorrichtung zur mechanischen Druckbelastung von Gewebekulturen und Zellen nach Anspruch 1 bis 8 dadurch gekennzeichnet, dass der Deckel (8) aus Metall, vorzugsweise Edelstahl gefertigt ist und mit einer druckdichten, lösba- ren, vorzugsweise einer Schraubverbindung oder Zwingen an der Grundplatte (1) befestigt ist.
10. Bioreaktorsystem umfassend einen Bioreaktor und eine Vorrichtung zur mechanischen Druckbelastung nach einem der Ansprüche 1 bis 9.
11. Bioreaktorsystem nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass der Bio- reaktor eine Gewebekulturplatte ist.
12. Bioreaktorsystem nach Anspruch 10 bis 11 dadurch gekennzeichnet, dass der Bioreaktor eine Gewebekulturplatte mit integrierten Drucksensoren oder/und Temperatursensoren ist oder der Bioreaktor oder die Vorrichtung nach Anspruch 1 bis 9 Heiz- oder/und Kühlelemente oder/und Pumpmittel und/oder Druckmess- oder/und Temperaturmesselemente oder/und pH-Messelemente und entsprechende Regelsysteme umfasst.
13. Bioreaktorsystem nach Anspruch 11 dadurch gekennzeichnet, dass die Gewebekulturplatte eine 6-, 12-, 24-, 48-, oder 96-Well- Gewebekulturplatte ist
14. Bioreaktorsystem nach Anspruch 10 bis 13 dadurch gekennzeichnet, dass es autoklavierbar ist.
15. Bioreaktorsystem gemäß Anspruch 10 bis 14 dadurch gekennzeichnet, dass es für den Perfusionsbetrieb oder batch-Betrieb ausgelegt ist.
16. Bioreaktorsystem gemäß Anspruch 12 dadurch gekennzeichnet dass es eine Rechner- oder eine Rechner- und Speicher-, sowie eine Ausgabeeinheit um- fasst, so dass der Betrieb etwa durch in den Rechner eingehende Signale von im System angebrachten Sensoren, z.B. für Druck, pH-Wert und Temperatur regelbar ausgeführt ist.
PCT/DE2005/000199 2004-03-10 2005-02-05 Erfindung betreffend bioreaktoren und bioreaktorsysteme WO2005087912A2 (de)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE102004012010.2 2004-03-10
DE200410012010 DE102004012010A1 (de) 2004-03-10 2004-03-10 Erfindung betreffend Bioreaktoren und Bioreaktorsysteme

Publications (2)

Publication Number Publication Date
WO2005087912A2 true WO2005087912A2 (de) 2005-09-22
WO2005087912A3 WO2005087912A3 (de) 2006-03-16

Family

ID=34895251

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/DE2005/000199 WO2005087912A2 (de) 2004-03-10 2005-02-05 Erfindung betreffend bioreaktoren und bioreaktorsysteme

Country Status (2)

Country Link
DE (1) DE102004012010A1 (de)
WO (1) WO2005087912A2 (de)

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2009118141A2 (de) * 2008-03-25 2009-10-01 Novatissue Gmbh Perfundierbarer bioreaktor zur herstellung und/oder kultivierung eines menschlichen oder tierischen blutgefässes und/oder eines menschlichen oder tierischen gewebes
WO2009118140A2 (de) * 2008-03-25 2009-10-01 Novatissue Gmbh Perfundierbarer bioreaktor zur herstellung von menschlichen oder tierischen geweben
WO2009141163A2 (de) * 2008-05-23 2009-11-26 Greiner Bio - One Gmbh Bioreaktor und verfahren zum kultivieren von zellen und geweben
CN111518694A (zh) * 2020-05-07 2020-08-11 吉林大学 一种多项调节式细胞移动培养装置

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE102008058782A1 (de) * 2008-11-24 2010-05-27 Rheinische Friedrich-Wilhelms-Universität Bonn Vorrichtung zur physiologischen, dynamischen in-vitro Zelldehnung
DE102008059731A1 (de) * 2008-12-01 2010-06-02 Gottfried Wilhelm Leibniz Universität Hannover Verfahren und Vorrichtung zum Stimulieren von Zellen
DE102018221415B3 (de) * 2018-09-19 2020-03-05 Fraunhofer-Gesellschaft zur Förderung der angewandten Forschung e.V. Anordnung zur Durchführung von in-vitro Biokompatibilitätstests

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4839280A (en) * 1987-05-04 1989-06-13 Banes Albert J Apparatus for applying stress to cell cultures
US4940853A (en) * 1988-07-22 1990-07-10 Vandenburgh Herman H Method for growing tissue specimens in vitro
US5348879A (en) * 1990-08-24 1994-09-20 The General Hospital Corporation Cell stretching method
EP1380640A1 (de) * 2001-04-17 2004-01-14 TAKAGI INDUSTRIES CO., Ltd. Zell- und strukturinkubator

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6048723A (en) * 1997-12-02 2000-04-11 Flexcell International Corporation Flexible bottom culture plate for applying mechanical load to cell cultures
DE19962456A1 (de) * 1999-12-22 2001-07-12 Biotechnologie Ges Mittelhesse Verfahren und Apparatur zur Herstellung, Untersuchung und mechanischen Stimulation dreidimensionaler Gewebezellkulturen
DE10041988B4 (de) * 2000-08-26 2006-02-09 Artmann, Gerhard, Prof. Dr. Vorrichtung und Verfahren zur Messung von Kräften von belebtem Material
FR2821853B1 (fr) * 2001-03-09 2003-05-16 Natural Implant Sa Bioreacteur pour tissu cultive en couche mince et utilisations
DE10130512B4 (de) * 2001-06-25 2007-08-16 Bionethos Holding Gmbh Vorrichtung zur Druckperfusion für das Züchten und/oder für das Behandeln von Zellen
JP2003061642A (ja) * 2001-08-30 2003-03-04 Takagi Ind Co Ltd 細胞・組織培養装置
JP4451582B2 (ja) * 2001-12-21 2010-04-14 高木産業株式会社 細胞・組織培養装置
KR100452403B1 (ko) * 2002-11-19 2004-10-12 한국과학기술연구원 세포배양용 복합 생물반응기

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4839280A (en) * 1987-05-04 1989-06-13 Banes Albert J Apparatus for applying stress to cell cultures
US4940853A (en) * 1988-07-22 1990-07-10 Vandenburgh Herman H Method for growing tissue specimens in vitro
US5348879A (en) * 1990-08-24 1994-09-20 The General Hospital Corporation Cell stretching method
EP1380640A1 (de) * 2001-04-17 2004-01-14 TAKAGI INDUSTRIES CO., Ltd. Zell- und strukturinkubator

Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2009118141A2 (de) * 2008-03-25 2009-10-01 Novatissue Gmbh Perfundierbarer bioreaktor zur herstellung und/oder kultivierung eines menschlichen oder tierischen blutgefässes und/oder eines menschlichen oder tierischen gewebes
WO2009118140A2 (de) * 2008-03-25 2009-10-01 Novatissue Gmbh Perfundierbarer bioreaktor zur herstellung von menschlichen oder tierischen geweben
WO2009118141A3 (de) * 2008-03-25 2011-12-29 Novatissue Gmbh Perfundierbarer bioreaktor zur herstellung und/oder kultivierung eines menschlichen oder tierischen blutgefässes und/oder eines menschlichen oder tierischen gewebes
WO2009118140A3 (de) * 2008-03-25 2012-01-05 Novatissue Gmbh Perfundierbarer bioreaktor zur herstellung von menschlichen oder tierischen geweben
WO2009141163A2 (de) * 2008-05-23 2009-11-26 Greiner Bio - One Gmbh Bioreaktor und verfahren zum kultivieren von zellen und geweben
WO2009141163A3 (de) * 2008-05-23 2012-01-12 Greiner Bio - One Gmbh Bioreaktor und verfahren zum kultivieren von zellen und geweben
CN111518694A (zh) * 2020-05-07 2020-08-11 吉林大学 一种多项调节式细胞移动培养装置

Also Published As

Publication number Publication date
WO2005087912A3 (de) 2006-03-16
DE102004012010A1 (de) 2005-09-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
WO2005087912A2 (de) Erfindung betreffend bioreaktoren und bioreaktorsysteme
DE10130512B4 (de) Vorrichtung zur Druckperfusion für das Züchten und/oder für das Behandeln von Zellen
EP1675939A2 (de) Verfahren und bioreaktor zum kultivieren und stimulieren von dreidimensionalen, vitalen und mechanisch widerstandsf higen zel ltransplantaten
JP7257442B2 (ja) 組織の機能を模擬するためのオープントップマイクロ流体デバイスおよび方法
CN107532134B (zh) 用于三维细胞和/或组织构建体的产生和/或培养和/或成熟的微流体设备和相关方法
Orr et al. Design of a modular bioreactor to incorporate both perfusion flow and hydrostatic compression for tissue engineering applications
EP1857539B1 (de) Vorrichtung zum Züchten oder Kultivieren von Zellen in einem dosenartigen Behälter
WO2014019603A1 (de) Anschlussplatte für einen mikrofuidischen probenchip, mikrofluidischer probenchip und untersuchungsverfahren mit einem mikrofluidischen probenanordnungsbereich
EP2288688A2 (de) Perfundierbarer bioreaktor zur herstellung von menschlichen oder tierischen geweben
EP2254987B1 (de) Perfundierbarer bioreaktor zur herstellung und/oder kultivierung eines menschlichen oder tierischen blutgefässes und/oder eines menschlichen oder tierischen gewebes
AT506826B1 (de) Bioreaktor und verfahren zum kultivieren von zellen und geweben
WO2010057672A1 (de) Vorrichtung zur physiologischen, dynamischen in-vitro zelldehnung
WO2009047045A2 (en) Bioreactor for generation and complex mechanical stimulation of engineered biological tissue.
EP1996694B1 (de) Vorrichtung und verfahren zur kultivierung und generierung von biologischem material in einem nährstoffnebel
EP2184344B1 (de) Mikrofluidischer Bioreaktor
DE10053014A1 (de) Verfahren zur In-vitro-Herstellung von vitalem, biologischem Ersatzgewebe unter Verwendung von Zellkulturen und einem Trägermaterial
EP1311850B1 (de) Vorrichtung und verfahren zur messung von kräften von belebtem material
DE19808055B4 (de) Verfahren und Apparatur zur Herstellung von dreidimensionalen Gewebezellkulturen
DE102009057698A1 (de) Zweikammerkultivierungssystem mit elastischer, poröser Membran zur uniaxialen mechanischen Stimulation von Epithelzellen und Epithelzellverbänden für die Testung endogener und exogener Faktoren
DE19962456A1 (de) Verfahren und Apparatur zur Herstellung, Untersuchung und mechanischen Stimulation dreidimensionaler Gewebezellkulturen
EP2184347A2 (de) Neue Komponenten und neues Bioreaktorsystem für die Kultur und mechanische Stimulation von biologischem Material
DE102010026369B4 (de) Verfahren und Druck-Drehbett-Bioreaktor zur dynamischen Expansion und/oder Differenzierung von Stammzellen oder primären Zellen humanen und tierischen Ursprungs
DE10208311B4 (de) Vorrichtung und Verfahren zur Kultivierung von Gewebezellen
DE102015109087A1 (de) Versuchsanordnung zum Untersuchen einer Zellkultur unter dynamischer Krafteinwirkung
DE202019103387U1 (de) Bioreaktorsystem zur Simulation der in situ Regeneration von Gelenkknorpeln

Legal Events

Date Code Title Description
AK Designated states

Kind code of ref document: A2

Designated state(s): AE AG AL AM AT AU AZ BA BB BG BR BW BY BZ CA CH CN CO CR CU CZ DK DM DZ EC EE EG ES FI GB GD GE GH GM HR HU ID IL IN IS JP KE KG KP KR KZ LC LK LR LS LT LU LV MA MD MG MK MN MW MX MZ NA NI NO NZ OM PG PH PL PT RO RU SC SD SE SG SK SL SM SY TJ TM TN TR TT TZ UA UG US UZ VC VN YU ZA ZM ZW

AL Designated countries for regional patents

Kind code of ref document: A2

Designated state(s): BW GH GM KE LS MW MZ NA SD SL SZ TZ UG ZM ZW AM AZ BY KG KZ MD RU TJ TM AT BE BG CH CY CZ DE DK EE ES FI FR GB GR HU IE IS IT LT LU MC NL PL PT RO SE SI SK TR BF BJ CF CG CI CM GA GN GQ GW ML MR NE SN TD TG

121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application
122 Ep: pct application non-entry in european phase