NL1011981C2

NL1011981C2 - Werkwijze voor het verrichten van chemische en biologische reacties.

Info

Publication number: NL1011981C2
Application number: NL1011981A
Authority: NL
Inventors: Sebastian Schmidt; Nanni Jelinek; Manfred Dr Biselli
Original assignee: Forschungszentrum Juelich Gmbh
Priority date: 1998-05-16
Filing date: 1999-05-06
Publication date: 2000-05-22
Also published as: NL1011981A1; DE19822050A1

Description

Werkwijze voor het verrichten van chemische en biologische reacties.

5 De uitvinding heeft betrekking op een werkwijze voor het verrichten van chemische of biologische reacties, die in een kamer wordt uitgevoerd, die van een roerinstallatie voorzien is en gevuld is met een vloeibaar medium, dat vaste deeltjes bevat. De uitvinding heeft eveneens betrekking op een houder om de werkwijze uit te voeren.

10 Werkwijzen die uitgevoerd worden in een vloeibaar, vaste deeltjes bevattend medium, dat zich in een kamer met roerinstallatie bevindt, zijn in de techniek tamelijk gangbaar. Tot nu toe hadden weliswaar werkwijzen de voorkeur, die in een volledig homogeen systeem kunnen verlopen, zoals bijvoorbeeld in een vloeistof, die zowel de uitgangsprodukten als de eindprodukten in opgeloste vorm bevat, omdat het in een dergelijk homogeen systeem het 15 eenvoudigst is, om konstante en gelijkmatige condities van de reactie in het reactiesysteem te kontroleren en te sturen. Het is echter een probleem bij veel reacties, dat noodzakelijkerwijze produkten gebruikt moeten worden, die onder de specifieke omstandigheden van de reactie onvoldoende oplosbaar zijn. Vele grotere moleculen, zoals bijvoorbeeld eiwitmolekulen of antilichamen, plaatsen de onderzoeker voor zulke problemen, terwijl het bij reacties, die niet in 20 een celvrij systeem maar daarentegen in een celllen omvattend systeem uitgevoerd moeten worden, uiteraard inherent aan zulke reacties is, dat het reactiesysteem niet homogeen is.

Er zijn in de praktijk verschillende mogelijkheden beschikbaar, om reacties met onoplosbare bestanddelen te verrichten. Het is bijvoorbeeld mogelijk, om de onoplosbare bestanddelen in 25 de vloeistof te laten zweven, zodat feitelijk een suspensie aanwezig is. Daarbij is het noodzakelijk, om de vloeistof konstant in beweging te houden, aangezien een ontoereikende beweging tot een gradient van bepaalde ingrediënten in de vloeistof kan leiden, zoals bijvoorbeeld een door diffusieverschijnselen veroorzaakte gradient van oplosbare bestanddelen of een gradient van de onoplosbare bestanddelen in de vloeistof die door de zwaartekracht 30 wordt veroorzaakt. Bij roercondities, die volledig ontoereikend zijn, zullen de deeltjes zich zelfs op de bodem van het reactievat kunnen afzetten, wat tot een volstrekt onvoldoende beheersing leidt. Deze methode, meer in het bijzondere de aanwezigheid van een roerinstallatie, leidt regelmatig tot ongewenste bijverschijnselen.

ί U i & · 2

Er bestaan veel reacties, die buitengewoon hoge eisen aan de reactiecondities stellen en waarbij speciaal de niet opgeloste bestanddelen in het systeem betrekkelijk ongestoord moeten blijven. Reeds geringe krachten van buitenaf leiden tot een onvoldoende resultaat. Het is duidelijk, dat 5 de schuifkrachten (shear-forces) die bij een roerproces kunnen worden opgewekt, reeds tot zulke krachten van buitenaf te rekenen zijn, waarbij dan nog niet gesproken is van het direkte contact, dat tussen roerinstallatie en niet opgeloste bestanddelen kan optreden, aangezien dit contact bij kwetsbare onoplosbare bestanddelen regelmatig tot hun vernietiging leiden kan.

10 Een verder nadeel is het feit, dat aan het einde van de reactie een scheiding van de bestanddelen moet worden uitgevoerd. Het ligt in de aard van de zaak, dat het noodzakelijk is, een scheiding tussen uitgangsprodukten en eindprodukten uit te voeren, aangezien normaal gesproken een zuiver eindprodukt verlangd wordt en het is net zo goed noodzakelijk, om in zulke gevallen, waar niet een enkel produkt, maar een mengsel van verschillende produkten 15 ontstaat, ook hier een reiniging uit te voeren, opdat wederom als resultaat een zuiver eindprodukt beschikbaar is. In werkwijzen, waarbij onoplosbare bestanddelen een rol spelen, is het noodzakelijk een scheiding van de oplosbare en de onoplosbare bestanddelen uit te voeren. Hoewel, zoals bekend, de techniek van het filtreren van oudsher in de techniek wordt benut en de deskundige de beschikking heeft over een reeks van bruikbare technieken, zijn de 20 nadelen, die bij het gebruik daarvan kunnen optreden, veelvuldig en deze zijn de deskundige eveneens bekend. Ook de eenvoudigste filtertechnieken vormen een extra stap in de werkwijze, en gaan met verliezen aan tijd en materiaal gepaard.

Een bijzondere manier, om een reactie met een systeem uit te voeren, dat deeltjes in een 25 vloeibaar medium omvat, heeft betrekking op het kweken van menselijke cellen. Daarbij worden de cellen in een kamer gehouden, die een groeimedium bevat en voorzien is van een roerinstallatie, en zijn zij aan een dragermateriaal bevestigd.

Er bestaan in de research en in de therapeutische geneeskunde veel redenen, om menselijke 30 cellen buiten het menselijk lichaam in leven te houden of zelfs te kweken, waarbij in dit verband met kweken een vermeerdering van de cellen onder laboratoriumomstandigheden bedoeld wordt.

101 1981 3

Er bestaat bijvoorbeeld een concrete vraag in de humane therapie, waar er behoefte is aan beenmerg of aan uit bloed gewonnen perifere beenmergcellen: (1) bij de autologe beenmergtransplantatie wordt bij een patient beenmerg ontnomen en dit wordt hem in het kader van een latere therapie of bijvoorbeeld na een met succes verrichte 5 chemotherapeutische behandeling geherimplanteerd, (2) bij ziekten van de bloedcellen zou men een genezing van zulke cellen buiten het lichaam tot stand kunnen brengen, om aansluitend deze genezen cellen te herimplanteren, welke mogelijkheid bijvoorbeeld bij leukemie in aanmerking zou kunnen komen, (3) bij de allogene beenmergtransplantatie wordt bij een leukemiepatient in plaats van diens 10 eigen beenmerg beenmerg van een gezonde donor geïmplanteerd.

Bij de hierboven opgevoerde voorbeelden is de oorzaak van de aandoening een storing op het niveau van het beenmerg en stelt een behandeling met beenmergcellen in zoverre een causale therapie van de ziekte voor.

15

Een gebruikelijke mogelijkheid met betrekking tot de implantatie van een mengsel van beenmergcellen is de implantatie van zogenaamde stamcellen. Zulke stamcellen zijn de precursors van alle bloedcellen en zij worden zowel in het ruggemerg als in het perifere bloed aangetroffen. Speciaal het feit, dat stamcellen in het bloed aangetroffen worden, maakt ze tot 20 een aantrekkelijke mogelijkheid, aangezien hierdoor een weinig belastende winning mogelijk wordt en zich door een gerichte winning van de gewenste stamcellen bij de donor geen verlies van andere bloedcellen voordoet.

Hierdoor wordt de stamcel voor veel toepassingen in de menselijke geneeskunde als waardevol 25 uitgangsmateriaal voor een causale therapie gezien en zijn er dienovereenkomstig veel pogingen geweest, om stamcellen na afname zo lang mogelijk in leven te houden en een werkwijze te ontwikkelen, om de stamcellen in vitro te vermeerderen, om zo voor de therapie een onbeperkte of in ieder geval een grote bron van homogeen materiaal ter beschikking te hebben.

30

Wat hiervoor als voorbeeld voor de stamcel beschreven werd, geldt vanzelfsprekend op dezelfde wijze voor andere celtypes die voor een causale therapie in aanmerking komen. Daarbij valt bijvoorbeeld te denken aan myocardcellen, aan hersencellen, aan oogcellen, aan U>1 1931 4 levercellen, aan niercellen, enz. Daarbij moet de behoefte ook niet tot het menselijke domein beperkt gezien worden, dezelfde eisen kunnen zich voordoen binnen de diergeneeskunde of in het kader van een gerichte ontwikkeling van kweekprodukten in het domein van de ontwikkeling van nieuwe plantengewassen.

5

Een groot probleem in het kader van veel ontwikkelingsstudies is het feit, dat bij veel soorten cellen een uitgesproken kwetsbaarheid aanwezig is. Deze kwetsbaarheid verhindert al een zinvolle toepassing onder omstandigheden, waarbij de cellen alleen maar gehouden worden en heeft ook tot gevolg, dat noodzakelijke studies naar de optimale omstandigheden om ze te 10 houden en zich te laten vermeerderen niet kunnen worden uitgevoerd.

Speciaal bij de hematopoetische cellen, daaronder inbegrepen de stamcellen zijn de praktische problemen bij de ontwikkeling van nieuwe therapieprincipes aanzienlijk. De cellen vertonen een bijzonder grote kwetsbaarheid ten opzichte van elke afwijking van de ideale situatie, 15 waarbij een geringe mechanische belasting al tot een afname van de vitaliteit van de cellen leidt. Dit is bij de cellen van dit celtype zeker gedeeltelijk op het feit terug te voeren, dat ze geen celwand bezitten, en om die reden slechter tegen mechanische belastingen bestand zijn. Al een relatief kleine belasting door schuifkrachten is voldoende, om bij deze cellen een hoge sterfelijkheid te veroorzaken.

20

Vroegere pogingen hebben het probleem van de grote kwetsbaarheid niet in voldoende mate kunnen oplossen.

In de Duitse aanvrage P 195 05 109.2 wordt een werkwijze beschreven, om menselijke of 25 dierlijke cellen in een wervelreaktor (,,Wirbelschichtreaktor“) als gemengde populatie’s op microporeuze microdragers vast te hechten. Bij deze werkwijze uit de stand van de techniek worden de microdragers als suspensie in een groeimedium gehouden, waarbij de stromingssnelheid van het groeimedium gering wordt gehouden, om eventuele verliezen te vermijden.

30 De werkwijze heeft ondanks voordelen de problemen niet geheel kunnen oplossen. Het was bij bepaalde celtypes, en speciaal bij de voor onderzoek en therapie uiterst waardevolle stamcellen, niet mogelijk, om onder routine-omstandigheden in het laboratorium experimenten 1011981 5 uit te voeren, waarbij de cellen in de gewenste hoeveelheid overleefden en een celvermeerdering kon onder zulke omstandigheden helemaal niet worden vastgesteld.

Het is nog een probleem bij researchinspanningen van dit type, dat de hoeveelheid van het 5 beschikbare materiaal gering is. Het kan van de donoren, om het even of het een patient of een vrijwilliger betreft, niet gevergd worden, om veelvuldig een afname van grotere hoeveelheden bloed of ruggemergmateriaal te moeten verdragen en om die reden moet bij de onderzoeken met een kleine hoeveelheid uitgangsmateriaal worden gewerkt, die slechts in beperkte mate opnieuw uit dezelfde bron kan worden aangevuld. Dit is een groot bezwaar in de fase, waarin 10 zich de research op het huidige moment bevindt, aangezien de noodzakelijke werkzaamheden om veel parameters van de werkwijze te optimeren, alleen in het kader van een omvangrijk screeningprogramma zinvol voltooid kunnen worden. Voorwaarde voor een dusdanig screeningprogramma is de beschikbaarheid van een grotere hoeveelheid homogeen uitgangsmateriaal.

15

Met de uitvinding wordt beoogd een werkwijze voor der verrichting van reacties te verkrijgen, waarbij vaste deeltjes in een vloeibaar medium betrokken zijn, die eenvoudig in de handhaving is en in de praktijk goed uitvoerbaar is en waarbij speciaal dusdanige omstandigheden in het systeem aanwezig zijn, dat de relatief kostbare en tot verliezen leidende filtrermethode op 20 eenvoudiger manier kan worden verricht. Door de werkwijze moet een verbetering van het kweken van menselijke of dierlijke cellen mogelijk worden, waarbij het kweken onder bijzonder behoedzame wijze uitgevoerd wordt. Het wordt speciaal beoogd, een werkwijze te verkrijgen, die met kleine hoeveelheden materiaal uitkomt.

25 Volgens de uitvinding wordt dit bereikt door een werkwijze met de eigenschappen volgens het kenteken van de conclusie 1.

Het betreft dus een werkwijze om chemische of biologische reacties te verrichten, die in een vloeibaar medium met vaste deeltjes uitgëvoerd wordt. De chemische en biologische reacties 30 omvatten in beginsel de gebruikelijke standaardchemie, waarbij uit een of meer uitgangsprodukten een eindprodukt of meerdere eindprodukten gevormd wordt of worden. Daarbij is het in het kader van de uitvinding mogelijk, dat één of meer uitgangsprodukten als vaste deeltjes worden aangeboden, en evengoed is het mogelijk, dat niet de uitgangsprodukten, 10110S1 6 maar de bij de reactie benodigde katalysator als vaste deeltjes of gebonden aan vaste deeltjes aanwezig is. Daarbij kan de katalysator van anorganische aard of, wat in het kader van de uitvinding zeer belangrijk is, een enzyme zijn. Speciaal enzymen als produkten met een hoog molecuulgewicht zijn bijzonder geschikt voor de uitvoering van de werkwijze volgens de 5 uitvinding. De enzymen kunnen als verbinding apart of gekoppeld aan het een of andere dragermateriaal aanwezig zijn. Het is speciaal de laatstgenoemde toepassing, waarbij het enzyme door middel van een chemische reactie of door een ander proces aan deeltjes, die zich in de werkwijze neutraal gedragen, bevestigd wordt, die in het kader van de uitvinding een bijzonder aantrekkelijke uitvoeringsvorm vormt. Even goed uitvoerbaar is de werkwijze voor 10 biologische reacties, die met behulp van een reactie met een antilichaam uitgevoerd worden. Het antilichaam kan daarbij bijvoorbeeld als hulpmiddel bij de zuivering of voor een willekeurige andere toepassing gebruikt worden.

De reactie wordt in een kamer uitgevoerd, die van een roerinstallatie is voorzien. Daarbij 15 speelt de bijzondere vorm van de kamer verder geen rol, bedoeld is alleen een willekeurige geometrie van de kamer, waardoor hij een vloeistof kan bevatten. Welke vorm de kamer bezit, uit welk materiaal hij bestaat, of hij afgesloten kan worden of open is uitgevoerd, of hij is voorzien van bepaalde aanvoer- of afvoerleidingen, of gas kan worden toegevoerd, hoe groot het volume van de vloeistof is dat kan worden opgenomen, hangt principieel af van van het 20 soort van chemische of biologische reactie, dat zal worden uitgevoerd.

Het moet in het kader van de werkwijze volgens de uitvinding geenszins uitgesloten worden, dat hij in het kader van een toebereiding op grote technische schaal uitgevoerd wordt. Ook bij toebereidingen in grotere omvang kan de werkwijze volgens de uitvinding op een wenselijke 25 manier toegepast worden, misschien zelfs wel speciaal bij een dusdanige grotere omvang, aangezien het speciaal bij een industriële toepassing op vereenvoudiging en besparing aankomt, en reeds relatief kleine voordelen in industrieel verband een aanzienlijke uitwerking hebben.

Desondanks is het eerste doel van de uitvinders, om een werkwijze ter beschikking te stellen, 30 die in de maatstaf van het laboratorium toegepast kan worden en daar zijn voordelen optimaal ontvouwt, waarbij de onderzoeker, die de werkwijze volgens de uitvinding toepast, noodgedwongen met uiterst kleine hoeveelheden uitgangsmateriaal moet werken.

1011981 7

Dit eerste doel heeft de uitvinders aangezet, om de werkwijze in het bijzonder voor dusdanige reactieomstandigheden te voorzien, waarbij de hoeveelheden materiaal uiterst gering zijn en de onderzoeker er voortdurend op let, de reactiecondities op deze geringe hoeveelheid materiaal af te stemmen.

5

Het probleem van de geringe hoeveelheden uitgangsmateriaal wordt bijvoorbeeld in zeer sterke mate ervaren, als het een werkwijze voor het kweken van menselijke of dierlijke cellen, zoals bijvoorbeeld hematopoietische stamcellen, betreft, zoals hierna in het kader van een gefavoriseerd uitvoeringsvoorbeeld nog in meer uitvoerige vorm wordt voorgesteld.

10

Het is aldus een gefavoriseerde uitvoeringsvorm van de werkwijze volgens de uitvinding, dat de kamer, die voor de uitvoering van de werkwijze is voorzien, een volume van minder dan 20 ml bezit. Een reactievolume van 0,37 tot 16,8 ml wordt verkozen, bijzonder verkozen wordt een volume van ongeveer 6 ml. Een dusdanig volume is eveneens bruikbaar voor 15 experimenten, waarbij slechts uiterst geringe hoeveelheden uitgangsmateriaal beschikbaar zijn, aan de andere kant staat een dergelijk volume ook een toepassing in een zuiver routinebedrijf toe. Zoals later nog nader wordt uitgevoerd, is het een van de aantrekkelijke mogelijkheden bij een gefavoriseerde uitvoeringsvorm van de werkwijze volgens de uitvinding, om deze voor screeningdoeleinden in het kader van gespecialiseerde onderzoekingen ter optimering van 20 groeiomstandigheden voor menselijke bloedcellen te gebruiken.

Zoals hierna aan de hand van de beschrijving van concreet uitgevoerde reeksen van experimenten nog uitvoeriger wordt voorgesteld, is het nog een bijzonder gafavoriseerde uitvoeringsvorm van de werkwijze volgens de uitvinding, als kamer voor de uitvoering van de 25 reactie een putje of well in een kweekplaat te gebruiken.

Een zulke aanduiding definieert weliswaar niet zonder meer de afmetingen van een dergelijke putje (welletje), het is echter ook geenszins noodzakelijk een bepaald formaat uit te kiezen, aangezien de uitvoering van de werkwijze volgens de uitvinding in beginsel met feitelijk elk soort van putje uitvoerbaar is. Aan de andere kant is het beslist een gefavoriseerde uitvoering 30 van de werkwijze, om kweekplaten te nemen, die commercieel verkrijgbaar zijn. Zeer goed bruikbaar zijn de zogenaamde „Coming® Multiple well plates" van de firma Coming Costar Corporation (Cambridge, MA 02140). Dergelijke platen hebben in de biologische research vanwege hun uitstekende eigenschappen een vooraanstaande plaats verworven en vormen ook H> i b Λ b s 8 in het kader van deze uitvinding een arbeidsmiddel dat de voorkeur heeft. „Coming® Multiple well plates" zijn als platen met een verschillend aantal putjes (of welletjes, naar de oorspronkelijke term „wells") beschikbaar. Welke uitvoeringsvorm bij de uitvoering van de werkwijze nu speciaal verkozen wordt, wordt in de eerste plaats door de hoeveeelheid 5 beschikbaar materiaal en het doel van de testserie bepaald. In principe kan de werkwijze volgens de uitvinding met elke beschikbare uitvoeringsvorm van de „Coming® Multiple well plates" worden uitgevoerd.

De werkwijze volgens de uitvinding wordt in een vloeibaar medium uitgevoerd. Het medium 10 kan elke denkbare samenstelling bezitten. Hier zijn aan de theoretische mogelijkheden geen grenzen gesteld. Elke denkbare mogelijkheid, variërend van een scheikundige werkwijze in een organisch ooplosmiddel tot een biologische techniek met behulp van een waterige bufferoplossing kan in aanmerking komen, waarbij er echter steeds op moeten gelet, dat het uitgekozen vloeibare medium zich met de andere bestanddelen in de werkwijze verdraagt.

15

De vaste deeltjes zijn niet aan een bepaalde uitvoeringsvorm gebonden. Ook met betrekking tot deze vaste deeltjes bestaat een willekeurige variatie aan mogelijkheden. Enige voorwaarde voor de uitvoering van de werkwijze volgens de uitvinding is het vereiste, dat de vaste deeltjes in het uitgekozen vloeibare medium niet oplosbaar zijn. Afgezien hiervan is bij het materiaal 20 van de deeltjes en bij hun precieze geometrie alleen op hun doel in de werkwijze te letten. In het kader van de uitvinding zal het zeker een gefavoriseerde variant vormen, om van min of meer kogelvormige deeltjes uit te gaan. Deze bieden een relatief grote oppervlakte, laten zich op voortreffelijke wijze tot een dichte pakking stapelen en maken desondanks een ongestoorde doorstroming van vloeibaar medium mogelijk.

25

Zoals hierna in het kader van de uitvoeringsvoorbeelden nader uitgelegd wordt, is het een gefavoriseerde uitvoeringsvorm van de werkwijze volgens de uitvinding, om hem in het kader van het kweken van menselijke lichaamscellen te gebruiken. Bij dergelijke experimenten bleken bepaalde deeltjes buitengewoon goed bruikbaar te zijn. Bijzonder doelmatig zijn 30 poreuze lichamen met een diameter van 200 - 1500 pm en een dichtheid van tenminste 1,1 kg/1, van wie de poriën met medium gevuld zijn.

1011981 9

Om te beginnen werden gunstige ervaringen met Siran® kogels (firma Schott, Mainz) gemaakt. Dergelijke Siran® kogels zijn poreuze dragers uit glas met ongeveer 50 % poreusheid en een deeltjesgrootte van 200- 1500 pm, bij voorkeur van 400 - 700 pm. De dragers uit glas kunnen, alvorens ze bij de werkwijze gebruikt worden, met een verdunde 5 gelatine-oplossing voorbehandeld worden. De Siran® kogels hebben zich in experimenten met menselijke en dierlijke cellen steeds weer door hun uitstekende eigenschappen met betrekking tot aanhechting en stabiliteit onderscheiden.

Een verdere variant, die eveneens bij voorkeur in het kader van experimenten met celmateriaal 10 toegepast wordt, zijn dragers uit collageen. Ook deze dragers zijn in verschillenden afmetingen en uitvoeringen beschikbaar. Dragers in microformaat uit collageen tonen vergelijkbaar goede eigenschappen, bezitten echter in vergelijking met kogels uit glas een bijzondere eigenschap, die hen afhankelijk van de behoefte een beslissend voordeel verschaffen kan. Het komt namelijk bij de toepassing van deeltjes met daaraan vastgehechte componenten 15 vaak voor, dat gewenst wordt, dat deze component aan het aan het eind van de reactie teruggewonnen wordt, zodat hij naderhand weer hergebruikt kan worden of beschikbaar is voor een verdere behandeling. Het kan zich daarbij om chemische moleculen zoals bijvoorbeeld enzymen of antilichamen handelen, vaak zal deze wens ook bij experimenten die met cellen zijn uitgevoerd aanwezig zijn, zoals wanneer de deeltjes gebruikt worden, om een 20 kweek van menselijke of dierlijke cellen in te leiden. Bij zulke kweken vormen de aangegroeide cellen het doel van het experiment en is het daarom niet te vermijden, ze van de deeltjes, bijvoorbeeld de Siran® kogels of de dragers in mikro-formaat uit kollageen, los te weken. Vooral dan toont zich het voordeel van de laatstgenoemde deeltjes, omdat men de dragers in micro-formaat uit collageen eenvoudigweg in een systeem met collagenase kan 25 brengen, met het gevolg, dat de dragers zich oplossen en de cellen, die door het enzyme niet aangevallen worden, uit de oplossing kunnen worden geïsoleerd.

In de beschrijving werd er tot nu toe van uit gegaan, dat een bepaald aantal deeltjes aanwezig is, waarbij er stilzwijgend vanuit is gegaan, dat bij zeer kleine deeltjes dit aantal navenant groot 30 kan zijn. Het is aan de andere kant echter ook niet uitgesloten, de werkwijze volgens de uitvinding met een klein aantal deeltjes uit te voeren. Het is zelfs denkbaar, dat slechts één enkel, relatief groot deeltje aanwezig is. Een dergelijke variant is het best denkbaar met een deeltje, dat een sponsachtige structuur bezit, zodat hierdoor een voldoende groot oppervlak lol ij 3 ) 10 voor het bevorderen van de reactie, zoals bijvoorbeeld de aanhechting van menselijke of dierlijke cellen, beschikbaar is. Het deeltje met de sponsachtige structuur kan een natuurlijke spons zijn of een synthetisch, bijvoorbeeld geschuimd materiaal.

5 Het is een beslissende eigenschap van de huidige uitvinding, dat de vaste deeltjes niet vrij in het vloeibare medium zweven, zoals het in de stand van de techniek gebruikelijk is, maar door een houder afgeschot worden, die zich binnen de kamer in het vloeibare medium bevindt. Dit afschotten is zo te verstaan, dat binnen de kamer een aparte ruimte is ingericht en de deeltjes in de kamer slechts binnen deze ruimte en helemaal niet buiten deze ruimte worden aangetroffen.

10

De houder kan elke denkbare vorm aannemen en verschillend zijn uitgevoerd. Goed denkbaar is een houder, die volledig kan worden afgesloten en ofwel in het medium drijft ofwel vast opgesteld is. Een dergelijke oplossing is bijvoorbeeld dan aan te raden, wanneer het om deeltjes gaat, die een zeer geringe dichtheid bezitten of onder elkaar een uiterst geringe adhesie 15 vertonen. Bij een dergelijke stand van zaken zou het gevaar kunnen bestaan, dat de werking van de roerinstallatie die eveneens volgens de werkwijze van de uitvinding is voorzien een dusdanige opwerveling van het vloeibare medium veroorzaakt, dat de vaste deeltjes opgewerveld worden en daardoor in de kamer buiten de houder geraken. Dit is volstrekt ongewenst, aangezien het nu net een voordeel van de werkwijze volgens de uitvinding is, dat 20 de houder, die de vaste deeltjes als kenmerk van de werkwijze omvat, een zeer eenvoudige toepassing van de werkwijze mogelijk maakt. Hij kan willekeurig in de kamer gebracht en er weer uit verwijderd worden, hetgeen een optimale regeling van de werkwijze mogelijk maakt. Aan het einde van de werkwijze kan de houder in zijn geheel uit de kamer verwijderd worden, waarbij de door de houder omvatte deeltjes dadelijk voor verdere toepassingen ter beschikking 25 zijn en hierdoor een omslachtig proces ter scheiding of isolering overbodig is.

In tegenstelling tot de zojuist geschilderde variant van de houder, waarbij deze volledig kan worden afgesloten, bestaat de verdere variant, waarbij dit volledige afsluiten niet noodzakelijk is. Bij vele reacties zullen de vaste deeltjes een dusdanige dichtheid bezitten of onder elkaar 30 een dusdanige adhesie vertonen, dat het afsluiten vervallen kan, aangezien het in de praktijk niet tot een ongewenste opwerveling van de deeltjes komen kan. In zulke gevallen is natuurlijk aan de variant zonder afsluiten de voorkeur te geven, omdat het in het algemeen een eenvoudigere en goedkopere uitvoering zal vormen en vermoedelijk ook minder handelingen 1011381 11 van de gebruiker vergt, omdat uit de aard der zaak het afsluiten en daarna weer openen vervalt. Daarbij bestaat bij de niet-afsluitbare houders nog de mogelijkheid, dat ze in vergelijking met de dimensie van de kamer een dusdanige constructie bezitten, dat hun opening buiten de kamer uit steekt of zich tenminste boven de oppervlakte van het vloeibare medium bevindt, alsmede de 5 alternatieve mogelijkheid, dat de houder zich in zijn geheel in het vloeibare medium bevindt en de opening van de houder zich dientengevolge onder de oppervlakte van het vloeibare medium bevindt.

Van beslissende betekenis voor het functioneren van de houder in de zin van de uitvinding is 10 het feit, dat hij doorlatend voor het vloeibare medium is. Dat betekent, dat de houder een dusdanige constructie bezit, dat een vrije en ongestoorde uitwisseling van vloeistof binnen en buiten de houder mogelijk is. Denkbaar is de toepassing van een semipermeabel membraan als volledig of gedeeltelijk omhulsel van de houder, waarbij hierdoor een vrije uitwisseling van moleculen tot een bepaalde grootte kan plaatsvinden. Een dergelijk semipermeabel membraan 15 kan van voordeel zijn, als het om zeer kleine en moeilijk beheersbare vaste deeltjes gaat. Normaal gesproken wordt echter niet een dergelijke uitvoeringsvorm gebruikt, maar één waarbij de houder openingen heeft, met een dusdanige afmeting, dat ze door de vaste deeltjes niet gepasseerd kunnen worden. Theoretisch kan de houder een enkele opening bezitten, maar normaal gesproken zullen het er meer zijn, omdat het voor de meeste chemische en biologische 20 reacties noodzakelijk is, dat de verschillende bestanddelen van de reactie met elkaar in een intensief contact kunnen treden en dit intensieve contact met één opening onvoldoende tot stand komt. Het is een gefavoriseerde uitvoeringsvorm van de werkwijze volgens de uitvinding, om een serie van verschillende openingen in de houder te realiseren. Dit kan bijvoorbeeld heel goed daardoor worden uitgevoerd, dat men in de houder een zeef aanbrengt 25 of de houder een dusdanige constructie bezit, dat hij geheel of gedeeltelijk uit een zeefmateriaal is opgebouwd. Er zal hierna een verder aspect van de uitvinding beschreven worden, waarbij een bepaalde houder ter beschikking wordt gesteld, die op grond van zijn eenvoudige en praktische constructie optimaal voor de toepassing van de werkwijze volgens de uitvinding geschikt is.

30

Het werd al bij de inleidende opmerkingen aangevoerd, hoe schadelijk een functionerende roerinstallatie kan zijn. Het is duidelijk, dat het één van de grootste voordelen van de werkwijze volgens de uitvinding is, dat op heel eenvoudige manier een ruimtelijke scheiding 101 1931 12 van de bewegende delen van de roerinstallatie en de vaste deeltjes bewerkstelligd kan worden. De roerinstallatie, die elke denkbare uitvoering bezitten kan, brengt op een willekeurige positie in de kamer het vloeibare medium in beweging. Eeveneens in de kamer bevindt zich de houder die de vaste deeltjes omvat. Het is volledig duidelijk, dat de roerinstallatie zodanig 5 gepositioneerd is, dat haar bewegende delen alleen met het vloeibare medium buiten de houder in beroering komt. Deze positionering verhindert hierdoor volledig de hierboven geschetste nadelen, dat de roerinstallatie belangrijke storingen in het systeem teweegbrengt en ofwel beschadigingen van de deeltjes zelf ofwel een verslechtering van de aanhechting van de molecule of cellen aan de deeltjes veroorzaakt. Weliswaar leidt elke roermethode tot 10 beweging en kan hierdoor theoretisch een storing in het systeem worden geïnduceerd, maar het is een van de grote voordelen van de werkwijze van de uitvinding, dat met de allereenvoudigste roermiddelen zonder bijzondere inspanning een uitvoering van een reactie mogelijk wordt, die de componenten van de reactie ontziet.

15 De roerinstallatie volgens de werkwijze volgens de uitvinding kan zoals hiervoor beschreven elke willekeurige vorm bezitten. Speciaal de voorkeur heeft echter een roerinstallatie met een magneetroerder, speciaal dan, als volgens een speciaal gefavoriseerde uitvoeringsvorm van de werkwijze volgens de uitvinding met een kweekplaat gewerkt wordt en nog meer gefavoriseerd, als in verscheidene putjes (wells) van de kweekplaat gelijktijdig een reactie 20 plaatsvindt, hetgeen immers een van de aantrekkelijke mogelijkheden van de werkwijze volgens de uitvinding vormt. Toepassing van een magneetroerder en in overeenstemming daarmee gebruik van een aantal roermagneten in elk putje waar een reactie plaatsvindt, is vast en zeker de eenvoudigste en minst bewerkelijke manier om de werkwijze volgens de uitvinding volgens de speciaal gefavoriseerde uitvoeringsvorm met een kweekplaat uit te voeren. Daarbij 25 wordt de kweekplaat op een meervoudige magneetroerder geplaatst, waardoor met een enkel mageneetroerder alle roermagneten gelijktijdig aangedreven worden.

Het is een verdere variant van de werkwijze volgens de uitvinding, om een verwarming aan te brengen, als het bij de methode op een bepaalde temperatuur aankomt, die niet in 30 overeenstemming is met de omgevingstemperatuur of de temperatuur in de kweekstoof Ook is al vaker gebleken, als volgens de in de vorige paragraaf beschreven methode met een magneetroerder gewerkt wordt, dat het uitvoeren van de reactie met een dergelijk magneetroerder tot een ongewenste plaatselijke verwarming kan leiden. Deze verwarming 1 .Π ' 1 <1 © ί J V» i ' . · ) · 13 wordt speciaal dan bemerkbaar, als de reactie langere tijd duurt. Langere reactietijden zijn bijvoorbeeld bij reacties met menselijke of dierlijke cellen, bijvoorbeeld bij kweekexperimenten met dergelijke cellen, geen zeldzaamheid. Een reactieduur van meer als 24 uur is daarbij volledig normaal. Aangezien de verhitting tot temperaturen in het vloeibare medium van meer 5 dan 50 °C kan leiden, was het niet te vermijden, het systeem van een koelinrichting te voorzien, aangezien speciaal bij de uitvoering van biologische reacties een afwijking van de optimale temperatuur al spoedig het aflopen van de reactie negatief beïnvloedt en bij uitvoering van de reacties met menselijke of dierlijke cellen zelfs het overleven van deze cellen in gevaar kan brengen. Het betreft daarom een bij uitstek gefavoriseerde uitvoeringsvorm, om bij het 10 uitvoeren van de werkwijze met een magneetroerder gelijktijdig een koeling in de werkwijze te voorzien, waarbij deze koeling practisch het eenvoudigst is, als tussen de magneetroerder en de kweekplaat een koelinstallatie is aangebracht. Deze koelinstallatie kan als een tamelijk vlak reservoir zijn uitgevoerd, dat permanent met water van 36 °C wordt doorstroomd. Reeds een dergelijke eenvoudige uitvoering is volstrekt voldoende, om een toename van de temperatuur 15 van het reactiemengsel in de kamer te verhinderen.

Het is bij de beschrijving van de werkwijze volgens de uitvinding al meerdere malen uiteengezet, dat het volgens gefavoriseerde uitvoeringsvormen op eenvoudige wijze mogelijk is, om meerdere testen gelijktijdig uit te voeren. Deze mogelijkheid bestaat in zeer konkrete 20 vorm, als er kweekplaten gebruikt worden, aangezien het bij deze toepassing van voordeel is, om de reactie in een aantal verschillende putjes te laten plaatsvinden, waarbij het vanzelfsprekend in beginsel om het even is, of een aantal identieke reacties parallel verloopt zoals bijvoorbeeld bij meervoudige experimenten, of als door variaties in de reactieparameters in elk putje een verschillende reactie plaatsvindt. Het is echter een van de beslissende 25 voordelen van de werkwijze volgens de uitvinding, dat de werkwijze in een klein volume kan worden uitgevoerd. Dit is immers dan van groot voordeel, als de hoeveelheden materiaal niet voldoende zouden zijn, om experimenten met een groter volume uit te voeren. Ook bij kleine hoeveelheden uitgangsmateriaal, bijvoorbeeld als het uitgangsmateriaal van een mens of van een dier gewonnen moet worden, biedt de werkwijze volgens de uitvinding de mogelijkheid, 30 speciaal wanneer de gefavoriseerde variant met de kweekplaat met putjes met een klein volume benut wordt, om een groter aantal op zichzelf staande reacties parallel te laten verlopen. Ook dit vormt een van de zeer aantrekkelijke facetten van de werkwijze volgens de uitvinding, aangezien dit parallelle verloop van een grotere serie experimenten een screeningprogramma in 1011981 14 grotere omvang mogelijk maakt. Dergelijke screeningprogramma’s zijn veelvuldig bij experimenten met menselijk of dierlijk celmateriaal nodig, bijvoorbeeld in verband met de vraag, hoe bepaalde soorten cellen gekweekt kunnen worden. Dergelijke experimenten waarbij een grote serie van aparte parameters gevarieerd moet worden, kunnen alleen door 5 omvangrijke screeningprogramma’s begonnen worden. De werkwijze volgens de uitvinding is gewoonweg daartoe voortbestemd, om bij dergelijke screeningprogramma’s te worden ingezet. Dit is in die zin een verder facet van de werkwijze volgens de uitvinding om in het kader van het verrichten van screeningprogramma’s te worden gebruikt.

10 De toepassing van de werkwijze volgens de uitvinding in het kader van experimenten met menselijke of dierlijke cellen is niet tot bepaalde typen cellen beperkt. In beginsel kunnen alle soorten cellen ingezet worden. Het is daarbij een uitdrukkelijk aspect van de uitvinding, dat de cellen zelf vaste deeltjes volgens de definitie van conclusie 1 zijn en zich in die zin een celcultuur binnen de houder bevindt. Een dergelijke toepassing is echter voor vele celtypen 15 niet denkbaar, aangezien zij zonder een drager niet overleven kunnen. Voor zulke cellen hebben werkwijzen de voorkeur, die in een aanhechting van de onderzochte cellen aan bepaalde dragers voorzien, zoals bijvoorbeeld op de al eerder besproken Siran® kogels of aan collageen mikrodragers. Het is in zulke gevallen en bij andere typen van dragers zeker mogelijk, om alleen de onderzochte cellen zelf op de dragers te brengen, aangezien cellen een 20 eigen aanhechtingsvermogen bezitten. Het is evengoed mogelijk, voor de aanhechting hulpmiddelen zoals bijvoorbeeld adhesiemoleculen te gebruiken.

Het is nog een vaak gebruikte mogelijkheid, om de cellen niet alleen, maar als cocultuur met een ander type cellen of met meer dan één type cellen op dragers te brengen. Een dergelijke 25 combinatie van verschillende typen cellen noemt men een cocultuur. Een cocultuur kan vele voordelen hebben. In de eerste plaats is het mogelijk, dat de eigenlijk onderzochte cellen door de op het zelfde tijdtstip of op een vroeger tijdstip plaatsvindende aanhechting met bepaalde andere cellen een betere basis voor de aanhechting vinden, met als gevolg, dat de aanhechting van de onderzochte cellen in een cocultuur gunstiger verloopt, omdat eenvoudigweg een 30 betere basis aanwezig is. Een ander aspect kan het feit zijn, dat het andere type cel een eigen invloed op de omstandigheden van de reactie uitoefent, waarbij een dergelijke invloed heel concreet de productie en uitscheiding van stoffen kan zijn, die bij de stofwisseling of bij de groei van de onderzochte cellen een rol spelen.

101 1381 15

De mogelijkheid, een cocultuur van verschillende typen van cellen toe te passen, wordt in het kader van de uitvinding bijvoorbeeld dan benut, als het om experimenten met menselijke plasmacellen gaat. Het is reeds in vroeger uitgevoerde experimenten gebleken, dat een 5 cocultuur met menselijke stromacellen of fibroblasten van groot voordeel is, waarbij de betekenis van de stromacellen voor de stamcellenkweek daarin bestaat, dat de met de stromacellen beklede deeltjes aan de plasmacellen een verbetering van de mechanische stabiliteit bieden en de stromacellen verder vermoedelijk door de synthese van cytokines een bijdrage aan de verbetering van de functionaliteit van de stamcellen leveren. Het is overigens 10 in principe te overwegen, dat ook in de natuurlijke situatie in het lichaam de cellen niet volledig geïsoleerd en onafhankelijk van andere cellen worden aangetroffen, maar zich daarentegen in voortdurend contact en uitwisseling met bepaalde andere cellen bevinden. Een cocultuur met andere cellen vormt op die manier een betere nabootsing van de natuurlijke situatie en door de hierbij ontstaande structuur wordt de toestand in het ruggemerg beter nagevolgd. Het is op die 15 manier ook uitdrukkelijk een facet van de huidige uitvinding om de onderzochte cellen tezamen met andere cellen op het dragermateriaal te immobiliseren, speciaal menselijke stamcellen met stromacellen op de vaste dragers te fixeren.

Het is mogelijk, de deeltjes zonder voorbehandeling in de houder te brengen en de handelingen 20 in zijn geheel in de houder te verrichten. Het behoort anderzijds ook tot de mogelijkheden, om al van te voren een behandeling van de deeltjes uit te voeren en ze als behandelde deeltjes in de houder te brengen. Deze laatstgenoemde methode kan soms voordelen hebben, zij heeft aan de andere kant altijd als nadeel, dat zij met meer inspanning gepaard gaat.

25 Er is nog een facet van de huidige uitvinding, namelijk om van een houder uit te gaan, die speciaal geschikt is, om de werkwijze volgens de uitvinding uit te voeren. Volgens de werkwijze van de uitvinding is het een voorwaarde voor de toepassing van de houder in de werkwijze volgens de uitvinding, dat deze voor een vloeibaar medium doorlaatbaar is, maar zodanig uitgevoerd is, dat de vaste deeltjes in de houder duurzaam door deze omvat worden, 30 d w z. het moet uitgesloten zijn, dat de vaste deeltjes uit de binnenste ruimte van de houder weggespoeld worden.

tü11981 16

Een dergelijke gefavoriseerde houder bestaat uit een cylindervormig lichaam, dat bij voorkeur uit edelstaal is gemaakt. Deze cylindervormige mantel heeft twee openingen, een aan de onderkant en een aan de tegenoverliggende zijde, waarbij de aanduidingen „onderkant” en „tegenoverliggende zijde” gebruikt worden, omdat de houder in staande toestand wordt 5 gebruikt, d.w.z. de centrale symmetrie-as van de cylinder bevindt zich meer of minder loodrecht t.o.v. de oppervlakte van het vloeibare medium in de kamer. De onderkant van de houder is met een zeef afgesloten. De afmeting van de poriën van de zeef kunnen naar behoefte worden uitgekozen, zij wordt naar gelang de grootte van de vaste deeltjes, die van de houder worden omvat, vastgelegd. De zeef kan uit elk willekeurig materiaal vervaardigd 10 worden, aangezien de mantel bij voorkeur uit edelstaal bestaat, is het een eveneens gefavoriseerde variant, om de zeef eveneens uit het materiaal edelstaal te vervaardigen. Er worden hulpmiddelen aangebracht om mogelijk te maken, dat onder of naast de houder zonder storing een roerproces kan plaatsvinden. Zulke hulpmiddelen kunnen bijvoorbeeld kleine haken zijn, die aan de buitenkant van de cylindervormige mantel aangebracht zijn en die op de 15 buitenste rand van de kamer rusten. De voorkeur heeft echter een uitvoering met met pootjes die eveneens aan de buitenste rand van de houder zijn bevestigd en waarmee de houder een positie op de bodem van de kamer innemen kan. Als de bodem echter niet vlak is, maar bijvoorbeeld een concave vorm bezit, kan een uitvoering van de houder met pootjes een zekere instabiliteit veroorzaken en is de voorkeur aan een uitvoering van de houder met haken te 20 geven. Aangezien niet alleen de stabiliteit maar ook de prijs van de houder een facet bij deze overweging is, wordt het als optimale oplossing aangezien, om de houder van drie haken of pootjes te voorzien.

Op de afmetingen van de houder in verhouding tot de afmetingen van de kamer komt het niet 25 speciaal aan. Ook bij een zeer smalle spleet tussen de houder en de wand van de kamer zal de werkwijze nog functioneren, evenzeer als bij een houder, die in verhouding tot de kamer relatief klein is. De voorkeur heeft echter een bandbreedte, die met die uit de Duitse patentaanmelding P 195 05 109.2 overeenstemt, namelijk een verhouding van het volume van de bestanddelen van het vaste bed tot het totale volume van het vloeibare medium van 0,1 tot 30 0,6.

Beschrijving van de uitvinding aan de hand van afbeeldingen.

101 1381 17

Figuur 1 stelt van boven af gezien een houder voor de toepassing van de werkwijze voor (leeg).

Figuur 2 stelt van boven af gezien een houder voor de toepassing van de werkwijze voor (gevuld).

5 Figuur 3 stelt in dwarsdoorsnede een schematische afbeelding van een houder voor de toepassing van de werkwijze voor.

Figuur 4 stelt in dwarsdoorsnede een schematische afbeelding van een houder voor de toepassing van de werkwijze voor.

Figuur 5 stelt het het resultaat van een serie experimenten met een stromale cellijn voor.

10

In figuur 1 is een houder van bovenaf in perspectief voorgesteld. De houder bezit een cylindervormige mantel 1, die uit edelstaal bestaat. Aan de onderkant van de cylindervormige mantel zijn drie pootjes 2 bevestigd. In de houder is een zeef 3 zichtbaar, die op uitstekende delen 4 rust, die aan de binnenzijde van de cylindervormige mantel aangebracht zijn.

15

In figuur 2 is de zelfde houder afgebeeld als in figuur 1. Hier is deze houder niet meer in lege toestand, maar is met bolvormige deeltjes 5 gevuld,

In figuur 3 is het putje 6 van een kweekplaat in dwarsdoorsnede afgebeeld. Dit putje bezit een 20 vlakke bodem 7. In de kamer bevinden zich een houder 8 en een roermagneet 9.

De houder 8 is hier eveneens in dwarsdoorsnede afgebeeld. Zichtbaar zijn de cylindervormige mantel 1 en de twee pootjes 2. In de houder zijn de bolvormige deeltjes 5 zichtbaar.

Terwijl figuur 3 de uitgangspositie in de werkwijze volgens de uitvinding voorstelt, wordt 25 daarentegen in figuur 4 afgebeeld, welke stromingsbeweging begint, als het vloeibare medium (in de figuur niet apart afgebeeld) door de roermagneet 9 in beweging gezet wordt. Zoals in figuur 4 wordt afgebeeld, bevindt zich de roermagneet 9 midden onder de houder. Door de draaiende beweging van de roermagneet 9 wordt het vloeibare medium van boven af aangezogen. Dat betekent bij de aanwezige situatie in de kamer, dat het vloeibare medium uit 30 het met vaste deeltjes 5 gevulde vaste bed 10 in neerwaartse richting bewogen wordt, door de beweging van de roermagneet in radiale richting verder bewogen wordt en langs de wand in de richting van de pijlen II en 12 in opwaartse richting verplaatst wordt en door de open ingang van de houder door het vaste bed geleid wordt.

'5 n * *. 1 ; Vj i ·> vT' J- ] 18

De in figuur 4 afgebeelde stromingsdynamiek bezit een reeks van voordelen. In de eerste plaats wordt in de figuur duidelijk gemaakt, waarom de in de figuur 1 afgebeelde houder zonder afsluiting aan de bovenkant functioneren kan. Het is vanzelfsprekend, dat een 5 dergelijke afsluiting zonder veel moeite aangebracht zou kunnen worden, bijvoorbeeld als opklapbare zeef. Aan de andere kant zou deze maatregel tot een meer ingewikkelde vervaardiging en daardoor tot een verhoging van de prijs leiden en zou ook het werken met de houders een aantal handelingen extra vergen. Bij de werkwijze volgens de uitvinding is een dergelijke afsluiting overbodig, aangezien de stroming in de kamer het vaste bed als het ware in 10 de houder drukt en een ontsnappen van individule vaste deeltjes uit de houder praktisch niet voor zal komen. Ook een betrekkelijk geringe neerwaartse beweging van het vloeibare medium zal voldoende zijn, om het vaste bed intakt te houden.

De stroming die in figuur 4 afgebeeld wordt toont duidelijk aan, dat een belading van de vaste 15 deeltjes, bijvoorbeeld met bepaalde cellen, op eenvoudige wijze kan worden uitgevoerd door deze cellen op een willekeurige positie in de kamer te brengen. De stroming van het vloeibare medium leidt er dan onmiddellijk toe, dat de in de kamer gebrachte cellen van boven af door het vaste bed geleid worden, waarbij de gelijkmatigheid van de stroming van de vloeistof door het vaste bed een homogene verdeling garandeert. Natuurlijk geldt het zelfde in analoge wijze 20 voor andere componenten van de reactie die in de kamer gebracht worden. De stroming brengt automatisch met zich mee, dat dergelijke componenten snel en gelijkmatig naar het vaste bed geleid worden. Evengoed moet echter nota van het feit worden genomen, dat de beste belading van de deeltjes bereikt wordt, wanneer de toediening direkt op de samengepakte deeltjes verricht wordt.

25

Figgur 4 toont bovendien aan, hoe gering de belasting is, die door de stroom in de kamer op de vaste deeltjes uitgeoefend wordt. Niet alleen is een direct contact met de roermagneet uitgesloten, bovendien wordt het vloeibare medium gelijkmatig van boven af naar het vaste bed geleid en met regelmaat door het vaste bed aangezogen.

30

Tenslotte is de toepassing van de houder volgens de uitvinding ook van voordeel, omdat door het doorstroomde vaste bed een driedimensionaal bouwwerk met een grote oppervlakte ontstaat, dat een dichtheid vertoont, die met die in weefsels vergelijkbaar is.

101 1S81 19

Beschrijving van de uitvinding aan de hand van uitvoeringsvoorbeelden.

Voorbeeld 1.

5

Voor de experimenten met menselijke hematopoietische cellen was het de bedoeling, om een cocultivering samen met stromale cellen te verrichten, omdat bij een dergelijke cocultivering de aanhechting beter plaatsvindt en de overleving vam de hematopoietische cellen gunstiger is.

10 Voor een dergelijke cocultivering was het belangrijk, om de eigenschappen van de verschillende typen cellen voor wat betreft hun immobilisering te bepalen. Eerst hierdoor is men vervolgens in staat, om gericht de concentraties van de cellen op het dragermateriaal in te stellen.

15 Voor de karakterisering van de eigenschappen van de muizen-stroma-celllijn M2-10B4 (Lemoine et al., Exp. Hematol., 1988; 16:718-726) werden verschillende uitgangsconcentraties in parallele experimenten vergeleken.

Hiervoor werd de in figuur 1 afgebeelde houder uit edelstaal gebruikt. De houders werden samen met de bijpassende roermagneten en pincetten in een autoclaaf gesteriliseerd. In een 20 steriele kweekplaat met 12 welletjes (Coming Costar Corp., Cambridge) werd in elk putje eerst een roermagneet en een steriele houder geplaatst en vervolgens 3 ml kweekmedium toegevoegd. Als kweekmedium werd RPMI 1640 met 10 % foetaal kalfsserum (FCS) (allebei Gibco BRL, Eggenheim) gebruikt. In de houders werd steeds 1 ml steriel dragermateriaal gepipetteerd en de houder vervolgens geheel met medium afgedekt. De op deze manier 25 voorbereide kweekplaat werd in de kweekstoof (36,5 °C, 5% CO2) op een 12-voudige magneetroerder (Telesystem HP 12 p, Η + P Labortechnik, OberschleiBheim) geplaatst. Het experiment werd op steriele wijze 25 uur lang uitgeyoerd.

De cellen werden in kweekplaten voorgekweekt en met 80 Gy bestraald om de groei te 30 stoppen. Na afcentrifugeren werd de gewenste hoeveelheid cellen in 100 μΐ kweekmedium opgenomen en voorzichtig als laag op de dragers gebracht.

* q 4 < O, <3 i ! O i 1: -‘."l i 20

Om de immobiliseringseigenschappen van de stromale cellijn te onderzoeken, werden 4 verschillende uitgangsconcentraties (5 * 10^, 1 * 10^, 5 * 10^ en 1 * 107 cellen per test) steeds in triplo onderzocht. Na een kweektijd van 24 uur werden de verschillende aanzetten geoogst. Daartoe werden de houders met een steriele pincet uit het putje genomen en steeds in 5 een centrifugebuisje van 50 ml (Greiner, Frickenhausen) gebracht, waarin zich 5 ml PBS (phosphate buffered saline) bevond. Na 1 maal wassen met PBS werd het aantal geïmmobiliseerde cellen door middel van kemkleuring met kristalviolet (merck, Darmstadt) bepaald.

10 Het resultaat van de reeks experimenten is in figuur 5 afgebeeld.

Figuur 5 laat een onmiskenbaar lineair verband zien tussen het aantal opgebrachte cellen en het aantal cellen dat zich aan de drager gehecht had. Er volgt uit dit resultaat, dat in de onderzochte bandbreedte van de concentratie een constante relatieve immobilisering van de 15 stromale cellen op de collageendragers van ongeveer 45 % kan worden vastgesteld. De grote reproduceerbaarheid van deze resultaten kan gezien worden aan de uiterst geringe standaardafwijkingen van de drievoudig uitgevoerde experimenten, die in de figuur eveneens zijn afgebeeld.

20 Voorbeeld 2.

Er werd een verder experiment uitgevoerd, om de mogelijkheid van de cocultivering van hematopoetische cellen te onderzoeken. Bij dit experiment werden direct naast elkaar dragers in microformaat uit borosilicaatglas (Siran®, Schott Glaswerke, Mainz) en collageen (Cellex 25 Bioscience Ine., USA) onderzocht.

Het kweeksysteem werd zoals in voorbeeld 1 beschreven opgezet. De ene helft van de houders werd van dragers uit borosilicaat voorzien, de andere helft met dragers uit collageen gevuld. Als kweekmedium werd IMDM gebruikt, dat 12,5 % paardeserum (Boehringer 30 Mannheim GmbH, Mannheim), 10 ng/ml IL-3 (geproduceerd door middel van een Baculo-expressiesysteem, insecten-cellijn Sf9 en virus AcNPV, met recombinant humaan IL-3), 10 ng/ml G-CSF (Amgen, München) en 50 ng/ml muizen-SCF (geproduceerd door E. coli SG

1011981 21 13009, expressievector pDS(0), het extracellulaire gedeelte van de muizen Kit-ligand wordt tot uitdrukking gebracht) bevatte.

Na een test op steriliteit werden de dragers in elk putje van 2 * 10^ M2-10B4 cellen (stromale 5 cellijn) van wie de groei was gestopt voorzien. De condities waren gelijk aan die van voorbeeld 1.

Na een periode van 24 uur voor de immobilisering werden in elk putje 2 * 10^ CD34+ hematopoietische cellen uit navelstrengbloed gebracht en in de kweekstoof bij 36,5 °C en 5 % 10 CO2 gekweekt. Er werden op dag 3, 5 en 7 na de start van de cocultuur steeds twee kweken met dragers uit boro silicaat en twee met dragers uit collageen volgens de hiervoor beschreven werkwijze geoogst. Op dag 5 werd verder een uitwisseling van de helft van het medium uitgevoerd. Hiervoor werd met een injectiespuit met naald (Braun, Melsungen) uit de spleet tussen houder en de wand van het putje (positie 13 in figuur 3) medium opgezogen en op 15 dezelfde wijze vervangen door vers medium.

Voor de analyse werden bij de dragers uit borosilicaat de cellen met behulp van trypsine losgeweekt.

20 De dragers uit collageen werden daarentegen enzymatisch opgelost. Te dien einde werd vrijwel de gehele vloeistof boven de dragers opgezogen en 1 ml collagenase-oplossing (2 mg/ml collagenase type IA, C 9891, Sigma, Deisenhofen) toegevoegd. Na een uur bij 37 °C waren de dragers gelyseerd en de enzymatische reactie werd door de toevoeging van 5 ml PBS/EDTA-oplossing (0,5 mM) beëindigd. De aldus in suspensie gebrachte cellen werden 25 afgecentifugeerd en in 1 ml vers kweekmedium opgenomen.

Een telling van de levende cellen met trypaan blauw (Sigma, Deisenhofen) werd in een Neubauer- telkamer verricht. Om het fenotype van de cellen in de flowcytometer (FACSalibur, Becton Dickinson, Heidelberg) te karakteriseren, werden ze met met PE-geconjugeerde 30 antilichamen tegen CD34 en met FTTC-geconjugeerde antilichamen tegen CD45 (allebei Dako, Hamburg) gekleurd. De biologische activiteit van de hematopoietische cellen werd door middel van de Methylcellulose-Assay (MC) ter vaststelling van Colony-Forming-Cells (kolonievormende cellen) en de Long-term Culture Initiating Cell-Assay (LTC-IC) ter analyse 1 n * 1f. s « 22 van vroege precursorcellen onderzocht. In de MC-Assay werden 500 CD34+ cellen per plaat gebruikt en MethoCult™ (Cellsystems, St. Katharinen) met 10 ng/ml IL-3 en 100 ng/ml SCF als medium gebruikt (producent zie hierboven). Na een kweektijd van twee weken werd de bepaling uitgevoerd. De LTC-IC werd in een kweekplaat met 96 wells uitgevoerd, waarbij per 5 putje 7 * 10^ M2-10B4 cellen (met 80 Gy bestraald) als groeilaag ingezaaid werden. In een 10-voudig uitgevoerd experiment werden 3, 6, 12, 24, 48 en 96 CD34+ cellen per putje geinoculeerd en gedurende een periode van 6 weken een maal per week van vers medium voorzien (IMDM, 12,5 % FCS, 12,5 % HS, 10 ng/ml IL-3 en 10 ng/ml G-CSF, producenten zie hierboven). Nadat aansluitend hierop de cellen met methylcellulosemedium waren 10 afgedekt, kon de bepaling na twee weken worden uitgevoerd.

Voorbeeld 3.

De keuze van de toegevoegde oplossingen is van beslissende betekenis bij het kweken van 15 hematopoietische cellen.

Bij een vergelijkend onderzoek werd de invloed van verschillende cytokines op de groei van CD34+ hematopoetische cellen in cocultuur onderzocht. Te dien einde werd de houder op de in voorbeeld 1 beschreven wijze van dragers uit collageen voorzien en de steriliteit onderzocht. 20 Al in deze fase van het experiment werden in de verschillende putjes van de kweekplaat verschillende vloeistoffen gepipetteerd. In beginsel wird IMDM als medium gebruikt, dat 12,5 % foetaal kalfsserum (allebei Gibco BRL, Eggenstein) en 12,5 % paardeserum (Boehringer Mannheim, Mannheim) bevatte.

25 Als cytokines werden gebruikt: • 10 ng/ml IL-3, • 100 ng/ml IL-6, • 50 ng/ml SCF, • 50 ng/ml GM-SCF en 30 * 100 ng/ml flt-3 (leverancier van alle cytokines: Genzyme, Rüsselsheuim).

1 j ·. t ^ 'i 23

In duplo werden steeds vier van deze cytokines aan het medium toegevoegd. Eén duplo bevatte alle vijf cytokines.

Na een test op steriliteit werden de dragers van elk putje van 2*1M2-10B4 cellen, 5 waarvan de groei was gestopt (stromale cellijn) voorzien (zoals in voorbeeld 1 beschreven).

Na een immobiliseringsperiode van 24 uur werden in elk putje 2 * 10^ CD34+ hematopoetische cellen uit navelstrengbloed gebracht en in de kweekstoof bij 36,5 °C en 5 % CO2 gekweekt. Na 4 dagen werd een uitwisseling van de helft van het medium uitgevoerd.

Na 7 dagen werden de cellen geoogst. Een telling van de levende cellen met trypaan blauw, 10 een karakterisering van het fenotype van de cellen in de flowcytometer, en MC- en LTC-IC-assays werden uitgevoerd (zoals in voorbeeld 2 beschreven).

1011981

Claims

1. Werkwijze voor het uitvoeren van chemische of biologische reacties in een kamer, die van een roerapparaat is voorzien en waarin zich een vloeibaar, vaste deeltjes bevattend medium bevindt, waarbij de reactie aan de vaste deeltjes plaatsvindt, met het kenmerk, dat deze vaste deeltjes door een voor het vloeibare medium doorlaatbare houder omvat worden en dat de kamer een volume van minder als 20 ml heeft.

2. Werkwijze volgens conclusie 1 met het kenmerk, dat de kamer het putje van een kweekplaat is.

3. Werkwijze volgens één van de conclusies 1 of 2, met het kenmerk, dat de deeltjes antilichaameigenschappen bezitten.

4. Werkwijze volgens één van de conclusies l of 2, met het kenmerk, dat de deeltjes enzymen bevatten.

5. Werkwijze volgens één van de conclusies 1 of 2 voor het kweken van cellen van menselijke of dierlijke oorsprong, met het kenmerk, dat de menselijke of dierlijke cellen zich aan de deeltjes gehecht hebben.

6. Werkwijze volgens conclusie 5, met het kenmerk, dat de cellen menselijke stamcellen zijn.

7. Werkwijze volgens één van de conclusies 5 of 6, met het kenmerk, dat de deeltjes dragers uit glas van 400 tot 700 pm of dragers in micro-formaat uit collageen zijn. 1011981 I 25

8. Werkwijze volgens één van de conclusies 5 tot 7, met het kenmerk, dat in alle kamers van de kweekplaat, bijvoorbeeld 6 of meer, een experiment met hetzelfde celmateriaal uitgevoerd wordt. •

9. Werkwijze volgens conclusie 8, met het kenmerk, dat het roerapparaat in elke kamer een roermagneet is, en alle roermagneten door één enkele magneetroerder aangedreven worden.

10. Werkwijze volgens één van de conclusies 5 tot 9, met het kenmerk, dat de onderzochte cellen samen met andere cellen op het dragermateriaal geïmmobiliseerd worden.

11. Toepassing van de werkwijze volgens één van de conclusies 5 tot 10 voor het opzetten van een screeningprogramma, om de reactie-omstandigheden voor het kweken van menselijke of dierlijke cellen, zoals bijvoorbeeld menselijke stamcellen, te onderzoeken.

12. Houder om vaste deeltjes op te nemen, die in een werkwijze volgens één van de conclusies 1 tot 11 gebruikt wordt, waarbij de houder een cylindervormige mantel, een zeef, waarmee de onderzijde van de cylindervormige mantel afgesloten wordt, en hulpmiddelen om tussen de bodem van de kamer en de onderzijde van de houder een vrije ruimte te laten ontstaan, omvat.

13. Houder volgens conclusie 12, met het kenmerk, dat zowel de houder als de zeef uit roestvrij staal bestaan.

14. Houder volgens één van de conclusies 12 of 13, met het kenmerk, dat de hulpmiddelen drie of meer aan de buitenrand van de houder bevestigde pootjes zijn. 1011981