NL1013649C2 - Celkweekinrichting. - Google Patents

Description

Celkweekinrichting.

De uitvinding heeft betrekking op een celkweekinrichting met ten minste een groeibasis voor de cellen, waaraan op ten minste een kant een ruimte met voedings-5 medium grenst, welke via toe- en afVoeropeningen bij voorkeur continu van een vloeibaar voedingsmedium kan worden voorzien.

Het is algemeen bekend dat cellen uit orgaanweefsels verwijderd kunnen worden en buiten het lichaam tot vermeerdering gebracht kunnen worden. Sommige celtypen ontwikkelen daarbij eigenschappen die qua tijd onbeperkte vermeerdering (door per-10 manente celdeling) vertonen, zogenaamde permanente cellijnen. Vers uit weefsels verwijderde cellen (b.v. uit chirurgische monsters of uit orgaanweefsels van proefdieren) vertonen deze eigenschappen daarentegen meestal niet. Cellen van dergelijke primaire kweken delen zich ofwel helemaal niet, ofwel slechts enkele malen, d.w.z. ze kunnen slechts gedurende korte tijd en onder vrelies van de meeste oorspronkelijke functiever-15 mogens (dedifferenciatie) in een kweek worden gehouden.

Het hechten van cellen aan hun groeibasis alsmede de differentiatie van de cellen zijn in hoofdzaak afhankelijk van de gesteldheid van de groeibasis (substraat).

De invoering van microporeuze substraten, meestal dunne foelies van verschillende organische of anorganische materialen (met of zonder bekleding door extracellu-20 laire matrixmoleculen) leidde tot een duidelijk betere differentiatie van cellen in een kweek. Dit geldt in het bijzonder voor die cellen (epitheel- en endotheelcellen), die in monolagen (Monolayer) groeien. De hiervoor gebruikte kweekvaten zijn meestal holle cilinders, waarvan de onderkant met een microporeus membraan is afgesloten, waarop de te kweken cellen worden aangebracht. Deze cilinders worden vervolgens in een 25 overeenkomstig groter kweekvat gebracht, zodat de verzorging van de cellen of mono-laag van beide kanten, de apicale of basolaterale, plaatsvindt (US-A-4608342). Bij deze kweekmethoxen wordt het voedingsmedium met bepaalde tussenpozen vervangen, men spreekt van statische kweekvoorwaarden. Daarbij kunnen in het kweekmedium door cellen geproduceerde stoffen accumuleren, die de groei en de differentiatie negatief 30 beïnvloeden.

Deze werkwijze werd derhalve verschillende malen verbeterd. Aldus kunnen b.v. microporeuze substraten in een desbetreffende houder van twee concentrische ringen (celdragers) worden geklemd en kunnen cellen voor het groeien op het membraan wor- 1 Π 1 Qft A n 2 den gebracht. Deze celdragers worden vervolgens in een kweekvat overgebracht, dat de gescheiden apicale en basolaterale continue omstroming (per(i)fusie) van celdragers met kweekmedia met een verschillende samenstelling, of gestapelde celdragers met slechts een voedingsmedium, mogelijk maakt (DE-A-3923279). Deze celkweeksyste-5 men kunnen eenvoudig worden gehanteerd en maken het mogelijk primaire celkweken gedurende langere perioden dan met gebruikelijke vaste kunststofsubstraten of micro-poreuze substraten onder statische omstandigheden te bewaren. Ze vertonen echter het nadeel dat slechts kweekkamers voor celdragers met een zeer klein groei-oppervlak, ongeveer 0,9 cm2, verkregen kunnen worden. Deze per(i)fusie-celkweekinrichting, 10 waarin celdragers gestapeld kunnen worden teneinde voldoende materiaal voor bio-chemisch-celbiologische analysen te verkrijgen, heeft het nadeel van een onvoldoende oxygenering van het medium tussen de celdragers. Beide inrichtingen vertonen verder menginhomogeniteiten bij de continue vervanging van voedingsmedium door middel van per(i)fusie.

15 Het doel van de uitvinding is het verschaffen van een celkweekinrichting die de groei van cellen gedurende lange perioden onder omstandigheden die in hoofdzaak overeenkomen met de situatie in het intacte organisme mogelijk maakt.

Dit wordt volgens de uitvinding bereikt doordat de celkweekinrichting ten minste een met een gedefinieerd gas of gasmengsel te vullen gasruimte bevat, die via een geen 20 vloeistof doorlatend, maar gas doorlatend membraan op de ruimte voor voedingsmedium is aangesloten.

Daarmee is het mogelijk in het voedingsmedium, dat in onmiddellijk contact staat met de gekweekte cellen, gedefinieerde partiële drukken (p) voor zuurstof (O2), stikstof (N2), kooldioxide (CO2) of willekeurige andere gassen die van biologische of toxicolo-25 gische betekenis zijn in stand te houden.

Dit is van bijzondere betekenis, daar de tot nu toe toegepaste celkweekinrich-tingen met continue vervanging van voedingsmedia niet waarborgen dat op alle posities bovend e cellen of cellagen dezelfde partiële drukken voor biologisch beslissende gassen, zoals bijvoorbeeld zuurstof en kooldioxide, heersen.

30 Verdere voordelen en bijzonderheden van de uitvinding worden nader toegelicht aan de hand van de volgende figuurbeschrijving:

Figuur 1 toont in een schematische verticale doorsnede een uitvoeringsvoorbeeld van een celkweekdeel van een celkweekinrichting volgens de uitvinding; 1013649 3

Figuur 2 toont een desbetreffend bovenaanzicht;

Figuur 3 toont in een verticale centrale doorsnede een begassingsdeel van een celkweekinrichting volgens de uitvinding;

Figuur 4 toont dit begassingsdeel in bovenaanzicht; en 5 Figuur 5 toont in een schematische verticale doorsnede de opbouw van twee cel- kweekdelen en drie begassingsdelen van een celkweekinrichting volgens de uitvinding.

Het getoonde uitvoeringsvoorbeeld van de celkweekinrichting volgens de uitvinding bestaat uit een celkweekdeel (fig. 1 en 2) en een begassingsdeel (fïg. 3 en 4), die bijvoorbeeld, zoals getoond in fïg. 5, opgebouwd kunnen worden.

10 Het celkweekdeel (CKD) is een ringvormige houder voor een microscopische groeibasis 1, die voor een optimale materiaaluitwisseling tussen celkweekmedium (voedingsoplossing) en cellen 2 (hier twee monolagen) zorgt en aldus de speciale differentiatie van cellen verbetert. De toe- resp. afvoer van voedingsmedia in de bovenste (4a) en de onderste (4b) ruimte voor voedingsmedium van het celkweekdeel CKD vindt 15 plaats via kanelen 3, die gescheiden zijn voor iedere kant van de groeibasis, waarbij de toe- en afVoeropeningen zodanig zijn ontworpen, dat ze voor een homogene vervanging van media zorgen, het dus niet tot zones met een ongelijke menging komt. Daardoor is het mogelijk boven (apicaal) en beneden (basaal) verschillende voedingsmedia te gebruiken en organotypische kweekomstandigheden te scheppen.

20 Het celkweekdeel CKD is door een gasdoorlatend, echter geen voedingsmedium doorlatend membraan 5, bij voorkeur van PTFE, van het begassingsdeel GD gescheiden.

Het begassingsdeel GD is als afzonderlijke component uitgevoerd, die dezelfde cilindrische buitenafmetingen heeft als het celkweekdeel CKD van figuur 1 en 2. Het 25 begassingsdeel van figuur 3 heeft boven en beneden telkens een gasdoorlatend membraan 5, die gasdicht in een houder 12 wordt gehouden. De eigenlijke gasruimte 13 bevindt zich tussen de beide membranen 5 en wordt via verticale kanalen 8 uit een niet weergegeven gasvoorraad via eveneens niet weergegeven leidingen van het gewenste gas in de gewenste concentratie voorzien, waarbij het gas via de verticale kanalen kan 30 stromen die ook in het op een lijn daarboven resp. daaronder liggende celkweekdeel aanwezig zijn.

De groeibases 1 voor de te kweken cellen 2 zijn gemakkelijk te verwisselen, zodat noodzakelijke biochemische of moleculair-biologische meetgrootheden op eenvou- 1013649 4 dige wijze kunnen worden vastgesteld. Het gasdoorlatende membraan 5 kan eveneens op eenvoudige wijze worden vervangen. Het begassingsdeel GD (inclusief de verticale gaskanalen 8) en de houder 12 voor het gasdoorlatende membraan 5 zijn met O-ringen 6 tegen het CKD afgedicht. GD en CKD kunnen worden gestapeld, zoals dit wordt ge-5 toond in figuur 5, zodat het gelijktijdig kweken van (willekeurig) veel celsubstraten onder continue vervanging van voedingsmedium mogelijk is. De opbouw vindt plaats in de richting van de pijlen 11, waarbij niet getoonde schroeven door de op lijn liggende boringen 9 alle delen kunnen samenpersen. Het oppervlak van het afzonderlijke celsubstraat (groeibasis) bedraagt hierbij ongeveer 5 cm2.

10 Alle begassingsdelen GD zijn via een kanaal 8 met elkaar verbonden, zodat slechts een gastoevoer 14 en een gasafVoeropening 15 noodzakelijk is. Vanaf kanaal 8 gaan zijkanalen 8a in de gasruimten. De afdichting van het gas-stroomkanaal tussen GD en CKD vindt eveneens plaats door middel van O-ringen 6.

De beide uiteinden van de celkweekinrichting zijn afgesloten met gasdelen, die 15 slechts een, naar het CKD toegekeerd, gasdoorlatend membraan bevatten. De rest is op de plaatsen 10 dicht afgesloten.

Omdat de afstand tussen membraan 5 van het GD en de celkweekdrager (groeibasis 1) zeer klein is en daardoor het volume van het apicale resp. basolaterale vloeistof-compartiment (ruimten 4a, 4b voor voedingsmedium) telkens zeer klein is wordt zeer 20 snel een evenwicht tussen de gassen in het GD en de in het voedingsmedium opgeloste gassen bereikt en constant gehouden.

De celkweekinrichting volgens de uitvinding maakt verder de eenvoudige verandering van partiële gasdrukken in het kweekmedium alsmede het eenvoudig mengen van mogelijk de werking van cellen beïnvloedende gassen (b.v. gasvormige verdo-25 vingsmiddelen of stikstofmonoxide) met het voedingsmedium mogelijk.

De partiële drukken van de toegepaste gassen kunnen naar behoefte zowel in het GD alsook in het CKD, in het bijzonder door middel van in de handel verkrijgbare elektroden, worden gemeten (O2, Clark-elektroden, CO2 of NO). Hiervoor kunnen desbetreffende (b.v. met een O-ring afgedichte) openingen zijn aangebracht (niet getoond). 30 In een voorkeursuitvoeringsvorm van het CKD, in het bijzonder bij het kweken van epitheel- en endotheelcellen of het gelijktijdig kweken van beide cellen op hetzelfde substraat, zijn aan beide kanten van het celsubstraat elektroden voor de stroominjec-tie alsmede elektroden voor de continue meting van over de cellagen ontstane poten- 1013649 5 tiaalverschillen, die vanwege het vectoriële transport van geladen deeltjes (meestal ionen) ontstaan, aangebracht. Stroominjectie en potentiaalmeting kan met daarvoor verkrijgbare, in de handel verkrijgbare inrichtingen worden uitgevoerd. Uit de zich bij de stroominjectie veranderende potentiaalverschillen kan de transepietheelweerstand 5 resp. het transpeithele elektrische geleidingsvermogen (ionengeleidingsvermogen) van epitheel- en endotheel-monolagen worden bepaald (principe van de Ussing-kamer).

CKD en GD zijn bijvoorbeeld van polysulfon gemaakt en kunnen volgens de voor medische inrichtingen voorgeschreven normen door middel van een autoclaaf worden gesteriliseerd. Alle delen zijn op gunstige wijze vaker toepasbaar, hoewel ook 10 eenmalige voorwerpen mogelijk zijn. Voor het afdichten worden O-ringen van Viton of polysiloxaan gebruikt. Als microporeuze groeibases kunnen in de handel verkrijgbare foelies, die b.v. voor de bereiding van membraanfilters worden gebruikt, worden toegepast.

De uitvinding is natuurlijk niet tot de weergegeven uitvoeringsvoorbeelden be-15 perkt. In het bijzonder kand e vorm van de ruimten voor voedingsmedium en van de gasruimten resp. van de desbetreffende celkweekdelen resp. begassingsdelen van de weergegeven vormen afwijken. In principe kan de uitvinding ook bij slechts aan een kant van medium voorziene groeibases worden toegepast. De verbinding van CKD en GD tot stapels kan in plaats van met schroeven ook met andere verbindingsmiddelen, 20 b.v. klemmen, plaatsvinden.

Mogelijke toepassingen van de celkweekinrichting volgens de onderhavige uitvinding (hierna kamer van Pfaller, in het kort PK, genoemd): • Kweek van menselijke, dierlijke, plantaardige en insektencellen, alsmede organen en orgaandelen van allerlei species onder statische alsmede dynamische (continue 25 en pulsvormige stroming van kweekmedia, gassen en lichaamsvloeistof) kweek-omstandigheden.

• Co-kweken van verschillende cellen en/of organen/delen onder statische alsmede dynamische (continue en pulsvormige stroming van kweekmedia, gassen en lichaamsvloeistof) kweekomstandigheden.

30 · Co-kweken van verschillende cellen en/of organen/delen onder statische alsmede dynamische (continue en pulsvormige stroming van kweekmedia, gassen en lichaamsvloeistof) kweekomstandigheden met cel-cel-contact.

1 01 36 49 6 • Co-kweken van verschillende cellen en/of organen/delen onder statische alsmede dynamische (continue en pulsvormige stroming van kweekmedia, gassen en lichaamsvloeistof) kweekomstandigheden zonder wederzijds celcontact (kweek in gescheiden kamers, celinteractie via geconditioneerd medium).

5 Verdere toepassingsmogelijkheden van de celkweekinrichting volgens de uitvinding omvatten de ontwikkeling van kunstmatige organen en/of equivalenten onder toepassing van de hierboven genoemde cellen en/of organen resp. delen daarvan: • Kweken en/of co-kweken van astrocyten, gliacellen, epitheel-, zwaan- en zenuwcellen, zowel in een afzonderlijke als een co-kweek voor onderzoeken van de 10 bloed-hersenbarrière, prikkelgeleiding en groei-onderzoeken.

• Kweken en/of co-kweken van comea-epitheelcellen met spiercellen, en/of fibro-blasten, melanocyten, cellen van Langerhans, endotheel- en microvasculaire endo-theelcellen alsmede zenuwcellen.

• Kweken en/of co-kweken van endotheelcellen met spiercellen en/of keratinocyten, 15 fibroblasten, melanocyten, cellen van Langerhans, endothee- en microvasculaire endotheelcellen alsmede zenuwcellen.

• Kweken en/of co-kweken van keratinocyten, fibroblasten, melanocyten, cellen van Langerhans, dendritische-, endotheel- en microvasculaire endotheelcellen alsmede zenuwcellen.

20 · Kweken en/of co-kweken van epitheelcellen van de longen met keratinocyten, fi broblasten, melanocyten, dendritische cellen, endotheel- en microvasculaire endotheelcellen alsmede zenuwcellen.

• Kweken en/of co-kweken van epitheelcellen van het maagdarmkanaal met lymfatische en/of spiercellen, fibroblasten, melanocyten, dendritische cellen, endotheel- en 25 microvasculaire endotheelcellen alsmede zenuwcellen.

• Kweken en/of co-kweken van hepatocyten met fibroblasten, melanocyten, dendritische cellen, endotheel- en microvasculaire endotheelcellen, zenuwcellen alsmede andere in de lever voorkomende cellen (stercellen van Kupfer enz.).

• Kweken en/of co-kweken van nierepitheelcellen van vasculaire en tubulaire oor- 30 sprong met lymfatische en/of spiercellen, fibroblasten, dendritische, endotheel- en microvasculaire endotheelcellen alsmede zenuwcellen.

1 0 1 36 4 9 7 • Kweken en/of co-kweken van lymfatische epitheelcellen met lymfatische en/of spiercellen, fibroblasten, melanocyten, dendritische cellen, endotheel- en microvas-culaire endotheelcellen alsmede zenuwcellen.

Verdere toepassingen van de celkweekinrichting volgens de uitvinding omvatten de 5 toepassing daarvan met kunstmatige organen en/of equivalenten onder toepassing van de bovengenoemde cellen en/of organen resp. delen daarvan resp. de toepassing van de in de PK ontwikkelde kunstmatige organen en/of equivalenten onder toepassing van de bovengenoemde cellen en/of organen resp. delen daarvan: • Bloed-hersenbarrière-modellen 10 · Neuronale modellen (potentialen en prikkelgeleiding) • Medicamentafgifte • Toxiciteitstests • Inwerking van licht, UV-licht, microgolfstraling en straling met een hogere frequentie 15 · Celmigratie-onderzoeken • Kunstmatige organen • Gasuitwisseling • Implantaten 1013649

Claims (11)

1. Celkweekinrichting met ten minste een groeibasis voor de cellen, waaraan op ten minste een kant een ruimte met voedingsmedium grenst, welke via toe- en afvoer- 5 openingen bij voorkeur continu van een vloeibaar voedingsmedium kan worden voorzien, met het kenmerk, dat de celkweekinrichting ten minste een met een gedefinieerd gas of gasmengsel te vullen gasruimte (13) bevat, die via een geen vloeistof doorlatend, maar gas doorlatend membraan (5) op de ruimte (4a, 4b) voor voedingsmedium is aangesloten. 10

2. Celkweekinrichting volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat ten minste een celkweekdeel (CKD) en ten minste een afzonderlijk daarmee losmaakbaar te verbinden begassingsdeel (GD) zijn aangebracht, waarbij het celkweekdeel (CKD) ten minste een groeibasis (1) en ten minste een ruimte (4a, 4b) voor voedingsmedium bevat en waarbij 15 het begassingsdeel (GD) de gasruimte (13) en het gasdoorlatende membraan (5) bevat.

3. Celkweekinrichting volgens conclusie 1 of 2, met het kenmerk, dat aan iedere groeibasis (1) twee afzonderlijke van voedingsmedium te voorziene ruimten (4a, 4b) voor voedingsmedium grenzen, namelijk een apicale en een basale resp. basolaterale 20 ruimte voor voedingsmedium.

4. Celkweekinrichting volgens een der conclusies 1 tot en met 4, met het kenmerk, dat de celkweekdelen (CKD) en de begassingsdelen (GD) in afwisselende volgorde in een stapel verbonden kunnen worden, waarbij de middelste begassingsdelen 25 twee gasdoorlatende membranen bevatten, die telkens naar een aangrenzend celkweekdeel zijn toegekeerd en waarbij de begassingsdelen aan het uiteinde van de stapel aan een kant een gasdoorlatend membraan en aan het uiteinde een dichte afsluiting bevatten.

5. Celkweekinrichting volgens een der conclusies 2 tot en met 5, met het ken merk, dat de bij voorkeur in hoofdzaak als holle cilinder uitgevoerde celkweekdelen (CKD) en de bij voorkeur met dezelfde stralen eveneens in hoofdzaak als holle cilinders uitgevoerde begassingsdelen (GD) op een lijn liggende, as-parallelle boringen be- 101 36 4 9 vatten, via welke ze bijvoorbeeld door middel van ingevoerde schroeven dicht samengeperst kunnen worden.

7. Celkweekinrichting volgens een der conclusies 2 tot en met 6, met het ken-5 merk, dat voor de afdichting van de celkweek- en begassingsdelen O-ringen (6) zijn aangebracht.

8. Celkweekinrichting volgens een der conclusies 1 tot en met 7, met het kenmerk, dat het geen vloeistof doorlatende, gasdoorlatende membraan (5) uit polytetra- 10 fluoretheen (PTFE) bestaat.

9. Celkweekinrichting volgens een der conclusies 1 tot en met 8, met het kenmerk, dat de wanden van de celkweek- en begassingsdelen (CKD, GD) uit kunststof, bij voorkeur uit polysulfon, bestaan. 15

10. Celkweekinrichting volgens een der conclusies 1 tot en met 9, met het kenmerk, dat de gasruimte(n) (13) via bij voorkeur losmaakbaar aansluitbare leidingen met ten minste een voorraadvat met gas verbonden kunnen worden.

11. Celkweekinrichting volgens een der conclusies 1 tot en met 10, met het kenmerk, dat in de mediumruimte een inrichting voor het opnemen van de partiële drukken van de toegepaste gassen, bij voorkeur in de vorm van elektroden, is aangebracht.

12. Celkweekinrichting volgens een der conclusies 1 tot en met 11, met het kenmerk, dat aan ten minste een kant van de groeibasis elektroden voor de stroom-injectie en elektroden voor de continue meting van over de cellaag resp. over de cel-lagen ontstane potentiaalverschillen zijn aangebracht. 1 01 3649