FI117899B - Solujen kasvatusalusta ja sen käyttö - Google Patents

Description

117899

Solujen kasvatusalusta ja sen käyttö

Keksintö kohdistuu solujen kasvatusalustaan, joka käsittää toisistaan erillisiä kuoppamaisia kasvatuskohtia. Keksintö kohdistuu erityisesti ns. 5 kuoppalevyyn. Keksintö kohdistuu myös kasvatusalustan käyttöön.

Soluviljelyjä käytetään yleisesti mm. erilaisissa solubiologian ja biolääketieteen tutkimuksissa. Tyypillisesti tutkittava solumateriaali kasvatetaan petrimaljassa tai kuoppalevyllä, joka on sijoitettu niin lämpötilan, 10 ympäröivän kaasun kuin valaistuksen suhteen sopivaan ympäristöön. Tutkimuksen eri vaiheissa näytteitä tutkitaan esimerkiksi mikroskoopilla ja tunnetuissa ratkaisuissa kuoppalevy järjestetään mikroskoopille tutkittavaksi, joka mikroskooppi voi olla varustettu kameralla. Useissa tutkimuksissa samoja näytteitä tutkitaan määrävälein, jotta voidaan seu-15 rata solun kehitystä.

Patenttikirjallisuudesta tunnetaan lukuisia laitteistoja, jotka on rakennettu siten, että kasvatusalustalla, esimerkiksi kuoppalevyssä, kasvatettavat solut voidaan pitää halutussa kasvuympäristössä (lämpötila, 20 elatusväliaine, ilmakehä). Haluttaessa seurata solujen kehitystä, esimerkiksi niiden kasvua ja/tai sitä, miten tietyt elatusväliaineeseen lisätyt aineet vaikuttavat soluihin, on tarpeen ottaa kasvatusalustan eri koh- :·. dista kuvia siten, että samat kohdat (esimerkiksi erilliset kuopat) tulevat • ·· kuvatuiksi tietyn aikataulun mukaan määrävälein.

• · · 25 • · *··;* Yksinkertaisimmassa muodossaan kuvaus suoritetaan siten, että kas- •••j vatusalusta otetaan ulos elatuskammiosta (esim. inkubaattorista) ja si- joitetaan erityiselle mikroskooppialustalle, jossa kuvaus voidaan suorittaa automatisoidusti manipulaattorien liikutellessa alustaa mikro-30 skoopin objektiivin suhteen. Näin otetut kuvat tallennetaan muistiin ja niitä voidaan käsitellä myöhemmin. Automatisoidumpi versio on se, ./ missä kasvatusalustat siirretään automaattisesti pois inkubaattorista ennalta määrätyn ohjelman mukaan kuvattaviksi. Laitteisto tämän to- • · *·;·’ teuttamiseksi on esitetty mm. US-patentissa 5,106,584.

: ·: 35 ♦ # ·:··: Kasvatusalustojen otto pois inkubaattorista kuvausta varten voi olla häiriötekijä, koska kasvatusalusta soluineen joutuu pois ympäristöstä, 2 117899 jonka olosuhteet on säädetty optimaalisiksi, ja siihen voi kohdistua myös tärähdyksiä siirrettäessä sitä alustalta toiselle. Tämän johdosta tunnetaan myös laitteistoja, joissa kuvaus tapahtuu kasvatusalustan ollessa inkubaattorissa. Esimerkiksi US-patentista 6,271,022 tunnetaan 5 laitteisto, jossa kuvaus on järjestetty inkubaattorin sisälle siten, että voidaan kuvata vuoronperään päällekkäisissä hyllyissä olevia kasvatusalustoja, joskin menetelmässä ei saavuteta suurta kuvaustarkkuutta.

US-patentissa 6,008,010 on esitetty laitteisto, jossa suljetun inkubaat-10 torikammion läpinäkyvän pohjan päälle on sijoitettu kuoppalevy. Myös inkubaattorikammion kansi on läpinäkyvä, jolloin kuvaus voidaan suorittaa pystysuunnassa inkubaattorikammion läpi siten, että koko kammiota liikutellaan vaakatasossa manipulaattorin avulla kuvausoptiikan suhteen. Tällä järjestelmällä on jo mahdollista suorittaa kuvaus ”in situ” 15 ottamatta kasvatusalustaa pois kammiosta. Ongelmana on kuitenkin se, että koko kasvatuskammiota joudutaan siirtämään. Tämän johdosta elatuskammio eli ’’biokammio” on tehty suhteellisen pieneksi (pituus x leveys x korkeus 6 x 5 x 2”). Läpinäkyvän, kuoppalevyn pohjan alla olevan lisälevyn käyttö on myös ongelmallista suuria suurennoksia 20 käytettäessä, koska objektiivi on saatava hyvin lähelle kohdetta.

On siis tunnettua sijoittaa kuoppalevyjä inkubaattoriin, jossa ympäristön :·. olosuhteet (kosteus, lämpötila, kaasukoostumus) on haluttu. Esimer- .*·:·. kiksi US-patentin 6,271,022 mukainen useita kasvatusalustoja hyllyissä *... 25 sisältävä inkubaattorikammio on järjestetty ilmatiiviiksi halutun C02-ta- ’·"* son aikaansaamiseksi kammion sisälle. Tällaisten olosuhteiden saarni- II* ·»; nen kaikille kasvatusalustoille yhtenäiseksi on vaikeaa. Yhtenä ongel- mana on esim. kosteuden säätö. Lisäksi kasvatusalustan ottaminen pois inkubaattorista altistaa sen vieraille olosuhteille, mistä voi olla 30 haittaa, jos kasvatusalusta joudutaan jostain syystä ottamaan ulos.

» · · • · o · » « :

Keksinnön tarkoituksena on poistaa em. epäkohdat ja esittää kasva- • · · tusalusta, joka muodostaa kompaktin kokonaisuuden ja jossa voidaan pitää paremmin halutut olosuhteet. Tämän tarkoituksen toteuttamiseksi • V 35 keksinnön mukaiselle kasvatusalustalle on pääasiassa tunnusomaista :*·: se, että kasvatusalusta on suljettu ylhäältä ilmatiiviisti kannella, joka rajaa alustan kanssa kasvatuskohdille yhteisen ilmatilan, johon on 117899 3 tuotu kaasun tulo- ja lähtöyhde, ja että kasvatusalustan pohjalle kas-vatuskohtien ulkopuolisille alueille on lisätty vettä kosteuden ylläpitämiseksi ilmatilassa. Kosteudella ehkäistään kuoppien kuivumista.

5 Näin kasvatusalustasta voidaan muodostaa eräänlainen mini-inku-baattori kiinnittämällä siihen kansi, jossa on valmiina tulo- ja lähtöyhteet kaasua varten. Tuloyhteen kautta voidaan syöttää haluttua kaasu-koostumusta, esimerkiksi koostumus, jonka happi- ja/tai hiilidioksidi-taso on haluttu. Syötettävässä ilmassa käytetään yleisimmin 5 % hiili-10 dioksidipitoisuutta. Lähtöyhde voidaan yhdistää takaiskuventtiiliin, joka päästää kaasua läpi vain yhteen suuntaan, pois ilmatilasta. Voidaan käyttää normaalia kuoppalevyä, joka on keksinnön avulla helposti muodostettavissa mainitunlaiseksi mini-inkubaattoriksi.

15 Mini-inkubaattori voidaan sijoittaa omana kaasukoostumuksen ja kos teuden ylläpidon puolesta itsenäisenä yksikkönä suurempaan inku-baattorikammioon. Haluttaessa kuvata kasvatusalustalla olevia soluja inkubaattoriympäristössä tietyin väliajoin voidaan kuvausoptiikkaa ja yksikköä liikutella toistensa suhteen inkubaattorikammiossa, jolloin eri 20 kasvatuskohdat (kuopat) tulevat kuvatuiksi.

Keksintöä selostetaan seuraavassa lähemmin viittaamalla oheisiin pii-:·. rustuksiin, joissa » «I * * • · m · · • · · 25 • · *··;* kuva 1 esittää kasvatusalustaa sivulta, • · * • · · · ·* kuva 2 esittää kasvatusalustaa ylhäältä, 30 kuva 3 esittää kasvatusalustan käyttöä suuremmassa inkubaattorikammiossa, • · * * * • · ... * * \..φ kuvat 4 ja 5 esittävät yhtä kasvatusalustan kiinnitysmahdollisuutta, ja · * * * : 35 kuvat 6 ja 7 esittävät toista kasvatusalustan kiinnitysmahdollisuutta.

• · . ·;.··· 117899 4

Kuvassa 1 on esitetty kasvatusalustana toimiva kuoppalevy 3, joka käsittää sen tasossa vierekkäisiä kuoppia 10, jotka muodostavat erilliset kasvatuskohdat solujen viljelemiseksi. Kuopissa on elatusväliainetta, jonka koostumus riippuu viljeltävästä solusta. Kuopat on yleisimmin 5 järjestetty levyn tasossa nxm matriisiksi, eli n riviin ja m sarakkeeseen.

Kuvassa 2 on 6x8 -levy, eli 48-kuoppainen levy, mutta voidaan käyttää myös muunkaltaisia levyjä.

Kuoppalevy 3 suljetaan ylhäältä ilmatiiviisti kannella 3b. Kannessa 3b 10 on alaspäin suuntautuvat reunukset (laippa), jonka avulla kansi voidaan kiinnittää painamalla levyyn ja tiivistämällä liitos saada aikaan ympäristöstä eristetty mini-inkubaattori. Kanteen on tehty myös tulo-yhde ja lähtöyhde, joiden kautta kaasua voidaan tuoda kannen 3b alapuolella olevaan suljettuun ilmatilaan ja vastaavasti poistaa siitä. Kaa-15 sun tulokanavaa on merkitty viitenumerolla 7 ja poistokanavaa numeroilla 8. Poistokanavassa 8 on venttiili 9, joka estää ilman virtauksen ympäristöstä mini-inkubaattoriin mutta päästää kaasua ulos. Tulokana-van 7 alkupäässä on pumppu tai kaasupullo ja säädettävät venttiilit, jonka avulla koostumukseltaan haluttua kaasua voidaan syöttää vä-20 liajoin mini-inkubaattoriin.

Yleisimmin kaasu on ilmaa, jonka hiilidioksidipitoisuus on normaali-il- > • · man hiilidioksidipitoisuutta korkeampi, jolla voidaan puskuroida kuopis- |.;Γ sa 10 olevaa elatusväliainetta. Tavallisimmin käytetään 5 % pitoisuutta.

*;].* 25 On mahdollista, että hiilidioksidin asemesta tai sen lisäksi halutaan jon- • · *···* kin muun kaasukomponentin pitoisuus saada halutuksi, esimerkiksi happipitoisuus.

» · * « * « · ··*

Kuoppien väliseen tilaan kuoppalevyn pohjan päälle on lisätty vettä.

:* 30 Tämän veden tarkoituksena on pitää mini-inkubaaattorin ilma kostea- na. Tällöin vältetään kuoppien kuivuminen ja syötettävän ilman kos- • · ./ teussäätö ei ole tarpeen. Kuvassa 1 on havainnollistettu veden pintaa •*..7 kuoppien 10 ulkopuolisessa tilassa. Veden käyttö edellyttää kuoppa- • · *·;·’ levyltä sellaista rakennetta, että levyn pinta (pohja) kuoppien 10 ulko- :*·]: 35 puolella on matalammalla kuin kuoppien 10 yläreunat.

• · 5 117899

Sekä kuoppalevyn pohja 3a että kansi 3b ovat läpinäkyvää materiaalia, esim. optisesti kirkasta muovia, jolloin mikroskooppikuvaus pystysuunnassa kuoppalevyn läpi on mahdollista.

5 Mini-inkubaattorin lämpötila saadaan halutuksi sijoittamalla se suurempaan kammioon, jonka lämpötila on säädetty.

Kuvassa 3 on esitetty yksi mahdollisuus käyttää kuoppalevyn ja kannen avulla saatua mini-inkubaattoria kasvatuslaitteistossa. Lämpötilalle) taan säädetyn elatuskammion 1 sisään on järjestetty X-Y-tasossa liikkuvan manipulaattorivarren 2 välityksellä liikkuvaksi kannella suljettu kuoppalevy eli mini-inkubaattori 3. Kuvassa mikroskooppia, joka on järjestetty yhdessä digitaalikameran 5 kanssa moottorin avulla liikuteltavaksi kasvatusalustan X-Y-liikuttelutasoa vastaan koh-15 tisuorassa suunnassa Z, on merkitty viitenumerolla 4. Valaisulaitetta, joka aikaansaa valaisun vastakkaisesta suunnasta (ylhäältä) on merkitty viitenumerolla 6. Mikroskooppi 4 on putkimikroskooppi, jonka tarkennus tapahtuu mikroskooppia Z-suunnassa siirtämällä.

20 Elatuskammio 1 muodostaa ympäristön valolta suojatun pimeän kammion, jonka lämpötila on myös säädettävissä halutulle tasolle ympä-ristön lämpötilasta riippumatta. Varsi 2 on tuotu kammion sivussa ole-van läpivientiaukon läpi, joka on tiivistetty esimerkiksi joustavilla eli-:T: niillä, jotta raon kautta ei pääse valoa tai lämpöä, mutta varsi 2 voi liik- .**·. 25 kua raossa. Samoin mikroskooppi 4 on myös tuotu tiivistetyn aukon (tiivistysrengas 11) kautta elatuskammion 1 sisään.

*··♦ ··· • * **“’ Edellä mainitun periaatteen mukaan mini-inkubaattoriin 3 on järjestet tävissä haluttu kaasukoostumus elatuskammion 1 sisätilan kaasu- ••jj’ 30 koostumuksesta riippumatta.

# · • · «··

Kuvaus suoritetaan normaaliin tapaan kuoppalevyn kuoppa 10 kerral-.··*. laan, jolloin yhdestä kuopasta voidaan kuvata useita kohtia. Kuvattava kuoppalevyn kuoppa 10 määräytyy X-Y-tasossa mini-inkubaattoria 3 ♦ · · : ·] 35 liikuttelevan manipulaattorin avulla. Lisäksi kussakin kuopassa voidaan ottaa kuvia eri kohdista Z-suunnassa liikuttelemalla mikroskooppia X,Y-tasoa vastaan kohtisuorassa suunnassa, esimerkiksi haluttaessa ottaa 6 1 1 7899 eri fokusointitasoissa sarja kuvia samasta kuopasta. Kuvauksen aikana valaisuun voidaan käyttää kestoltaan tarkasti asetettavaa valaisua järjestelmällä, jota on tarkemmin esitetty samaan aikaan jätetyssä toisessa patenttihakemuksessa ’’Mikroskoopin valaisujärjestelmä”.

5

Itse kuvan tallennukseen ja käsittelyyn liittyvät vaihtoehdot eivät kuulu tämän keksinnön piiriin, ja sen vuoksi niitä ei ole esitetty sen tarkemmin.

10 Keksintöä voidaan kuitenkin soveltaa muuallakin kuin kuvan 3 esittämässä ympäristössä.

Kuvissa 4 ja 5 on esitetty ensimmäinen tapa kiinnittää kansi 3b ilmatiiviisti kuoppalevyyn ja niiden muodostama mini-inkubaattori manipu-15 laattorivarteen 2. Manipulaattorivarressa on aukko tai "kiinnitysikkuna”, johon mini-inkubaattori voidaan kiinnittää niin, että pohja 3a ei peity, vaan on suoraan kuvattavissa alhaalta päin aukon kautta. Tässä eriste 12, joka tiivistää kannen 3b ja kuoppalevyn saumakohdan, on sijoitettu kiinnitysaukon ympärille, jolloin se muodostaaa eräänlaisen tiivistävän 20 kehyksen. Eristeen 12 yläpuolella on mekaaniset kiinnityselimet 13, jotka voidaan kääntää kannen 3b päälle sen jälkeen, kun kansi 3b ja •:..i kuoppalevy on sijoitettu aukkoon (kuva 5).

»· • · • ·1 !·:·, Kuvissa 6 ja 7 on esitetty kiinnitysperiaate, jossa erona edelliseen on · · .1... 25 se, että kuoppalevyä kiertävä eriste 12 on sijoitettu mini-inkubaattoriin kannen 3b ja kuoppalevyn saumakohtaan valmiiksi ennen mini-inku- ··· ·“· baattorin sijoittamista aukkoon. Eristeen 12 pysyminen paikoillaan on **···: varmistettu vielä pitimellä 14.

* φφφ φ φ·φφ φφφ φ φ • φ ···..···· ·· • · • ·· ··· • · • · • · 1 «· φ • · • · ' i · · · • ·

Claims (6)

117899

1. Solujen kasvatusalusta, joka käsittää toisistaan erillisiä kuoppamai-sia kasvatuskohtia (10) ja joka on suljettu ylhäältä kannella (3b), joka 5 rajaa alustan kanssa kasvatuskohdille (10) yhteisen ilmatilan, tunnettu siitä, että kasvatusalusta on suljettu ilmatiiviisti kannella (3b), joka yhdessä kasvatusalustan kanssa saa aikaan ympäristöstä eristetyn mini-inkubaattorin, jolloin kanteen (3b) on järjestetty kaasun tuloyhde, joka on järjestetty syöttämään haluttua kaasukoostumusta tulokanavan 10 (7) kautta, ja kaasun lähtöyhde, ja että kasvatusalustan pohjalle kasvatuskohtien väliseen tilaan on lisätty vettä kosteuden ylläpitämiseksi ilmatilassa.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen kasvatusalusta, tunnettu siitä, 15 että tuloyhde on yhdistetty tulokanavan (7) välityksellä kaasulähtee- seen, jonka koostumus on säädetty halutuksi.

3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen kasvatusalusta, tunnettu siitä, että kaasulähteen hiilidioksidipitoisuus on säädetty ilman normaalia hii- 20 lidioksidipitoisuutta korkeammaksi, sopivimmin tasolle n. 5 %.

4. Jonkin edellisen patenttivaatimuksen mukainen kasvatusalusta, tunnettu siitä, että lähtöyhde on yhdistetty venttiiliin (9), joka sallii kaa- :'·· suvirtauksen vain poispäin ilmatilasta. :: : 25 :***: 5. Jonkin edellisen patenttivaatimuksen mukainen kasvatusalusta, • · · ··· tunnettu siitä, että kannen (3b) ja alustan välinen saumakohta on tii- • · · · .···. vietetty eristeellä (12). **♦

6. Jonkin edellisen patenttivaatimuksen mukaisen kasvatusalustan *:::’ käyttö laitteistossa solujen kuvaamiseksi, joka käsittää elatuskammion • · (1), jonka sisälle on sijoitettu kasvatusalusta, kuvausoptiikan (4, 6), sekä toimielimet kasvatusalustan ja kuvausoptiikan suhteellisen liik-keen aikaansaamiseksi siten, että kuvausoptiikalla kuvataan kasvatus- • * · \ 35 alustan eri kohtia liikuttamalla kuvausoptiikkaa (4, 6) ja kasvatusalustaa toistensa suhteen. • t · • · · • · 117899