ES2252927T3 - Dispositivo de cultivo y procedimiento para cultivar celulas o componentes tisulares. - Google Patents
Dispositivo de cultivo y procedimiento para cultivar celulas o componentes tisulares.Info
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Abstract
Dispositivo de cultivo con al menos un recipiente de cultivo (12), que presenta al menos una conexión (22) para la alimentación y evacuación de medio de cultivo (30), respectivamente con un inserto para cultivo celular (15; 122) para cada uno de los recipientes de cultivo (12), que está sujeta en el interior del mismo, y con un mecanismo de provisión (24 a 28; 24¿, 48, 50) para la alimentación de medio de cultivo (30) a los recipientes de cultivo (12) y/o para la evacuación del medio de cultivo de estos, caracterizado porque a los recipientes de cultivo (12) está/n asignado/s uno o dos sensores de nivel (38; 98) dirigido(s) al nivel del medio de cultivo (30) y porque el mecanismo de provisión (24 a 28; 24¿, 28, 48, 50) se controla en función de la señal de salida de un sensor de nivel o de dos sensores de nivel (38; 98), de modo que es posible tanto un cultivo de células sumergido como también basal.
Description
Dispositivo de cultivo y procedimiento para
cultivar células o componentes tisulares.
La invención se refiere a un dispositivo de
cultivo según el preámbulo de la reivindicación 1 y a un
procedimiento para el cultivo de células o componentes de
tejidos.
Los dispositivos de cultivo conocidos de este
tipo sirven para el cultivo de células aisladas o componentes de
tejidos. Estos dispositivos de cultivo conocidos están limitados al
uso en sistemas de cultivos sumergidos, es decir, sobre la membrana
de un inserto para cultivo celular se proveen las células cultivadas
mediante cubrimiento de una solución de cultivo con las sustancias
alimenticias correspondientes.
Para la mayoría de los estudios experimentales,
por ejemplo estudios con células epiteliales del párpado o pulmón
diferenciadas, sería deseable que para la solución de requerimientos
especiales se pudiera variar las condiciones de crecimiento del
tejido. Con los dispositivos de cultivo usuales no se puede llevar a
cabo, por ejemplo, un cultivo de células del tracto respiratorio en
una capa límite aire/líquido (Air-Liquid), aunque se
usen membranas porosas, que son ofrecidas por distintas compañías
como los denominados sistemas transpocillo.
Mediante la presente invención se debe
reconstruir un dispositivo de cultivo según el preámbulo de la
reivindicación 1 de modo que sea posible una pluralidad de distintas
condiciones de cultivo y exposición.
Este objetivo se consigue de acuerdo con la
invención mediante un dispositivo de cultivo con las características
indicadas en la reivindicación 1.
En el dispositivo de cultivo de acuerdo con la
invención se puede fijar la altura del nivel del medio de cultivo
en el interior del recipiente de cultivo, especialmente de modo que
este se encuentre sobre la parte superior de la membrana del
inserto para cultivo celular (cultivo sumergido) o que contacte
justo con la membrana (o se encuentre aproximadamente entre los
mismos), con lo que se tiene una provisión de sustancia alimenticia
basal, que se realiza desde
abajo.
abajo.
El cambio de cultivo sumergido a cultivo basal se
puede realizar con el dispositivo de cultivo de acuerdo con la
invención de forma sencilla mediante control del mecanismo de
provisión, que suministra cantidades predeterminadas de medio de
cultivo al recipiente de cultivo y/o las extrae de este, hasta que
la señal de salida del sensor de nivel emite un valor nominal
respectivamente regulado.
Esta regulabilidad del nivel del medio de cultivo
en el recipiente de cultivo se puede efectuar claramente de forma
muy práctica y sencilla sin lectura de marcas o similares. Las
partes del equipo necesarias para la puesta en práctica de las
distintas condiciones de cultivo son sencillas y económicas.
Se dan en las reivindicaciones subordinadas
variantes ventajosas de la invención.
Con la variante de la invención según la
reivindicación 2 se consigue que la diferencia entre la alimentación
sumergida y basal sea muy finamente regulable. Las distintas zonas
de un cultivo celular soportado por un inserto para cultivo celular
crecen bajo exactamente las mismas condiciones.
En un dispositivo de cultivo según la
reivindicación 3 se puede analizar el medio de cultivo que se
encuentra en los recipientes de cultivo individuales durante la
fase de crecimiento y a partir de la composición del medio de
cultivo evitar la finalización del crecimiento de los cultivos
celulares por sus productos de metabolismo.
En un dispositivo de cultivo según la
reivindicación 4 se puede criar una gran número de cultivos
celulares en exactamente las mismas condiciones. Igualmente es
sencillo el diseño del equipo de un dispositivo de cultivo de este
tipo para un gran número de cultivos celulares. Asimismo el
dispositivo de cultivo necesita poco espacio.
Con la variante de la invención según la
reivindicación 5 se consigue que para los distintos recipientes de
cultivo sólo sea necesario un sensor de nivel único para la
regulación del nivel.
La variante de la invención según la
reivindicación 6 permite que el nivel se fije dentro del recipiente
de cultivo de forma sencilla desde el exterior. Con ello los
recipientes pueden presentar una superficie lisa y están libres de
piezas complementarias, que influirían negativamente en la limpieza.
También se pueden esterilizar los recipientes de cultivo de modo
sencillo a temperaturas elevadas.
La variante de la invención según la
reivindicación 7 permite también ajustar de forma manual el nivel
nominal para el medio de cultivo.
Según la reivindicación 8 es posible emprender el
ajuste del nivel nominal eléctricamente de forma sencilla. El
propio sensor de nivel mide sobre un gran intervalo de altura del
recipiente de cultivo y la especificación de nivel se realiza
mediante ajuste de la señal de valor nominal del nivel.
Se usa para la detección de nivel según la
reivindicación 9 barreras de luces, especialmente una barrera de
luz de gálibo, de modo que se pueden usar componentes que presentan
precios admisibles como constituyentes convencionales.
La variante de la invención según la
reivindicación 10 es ventajosa respecto a una ampliación más del
número de cultivos celulares que se pueden llevar a cabo de forma
conjunta. El coste en equipos para un dispositivo
multi-cultivo de este tipo es bajo. Este se compone
de componentes estándar (módulos) que se pueden montar en grandes
series.
La variante de la invención según la
reivindicación 11 permite en caso deseado, también una retirada
libre de residuo del medio de cultivo uniforme de todos los módulos
del dispositivo de cultivo.
Con un dispositivo de cultivo según la
reivindicación 12 se puede criar en los distintos módulos diferentes
cultivos celulares, sin embargo con todo se tiene la posibilidad de
estudiar por separado el progreso del crecimiento mediante los
productos del metabolismo para los distintos cultivos (los distintos
módu-
los).
los).
La variante de la invención según la
reivindicación 13 es ventajosa respecto a un templado idéntico de
los distintos cultivos.
Con la variante de la invención según la
reivindicación 14 se asegura, sin uso de agitadores, que no se forma
dentro de los recipientes templados individuales gradiente de
temperatura alguno.
En un dispositivo de cultivo según la
reivindicación 15 la conexión entre los módulos individuales del
dispositivo de cultivo es especialmente sencilla. También se puede
lograr de forma sencilla una disposición modular de este tipo.
En un dispositivo de cultivo según la
reivindicación 16 el espacio interior de los recipientes de cultivo
está separado de la atmósfera circundante.
En un dispositivo de cultivo de este tipo se
puede rellenar según la reivindicación 17 el espacio interior de la
carcasa exterior también con otro medio en estado gaseoso y estudiar
la influencia sobre el crecimiento de los cultivos.
La variante de la invención según la
reivindicación 18 es ventajosa respecto a la puesta en práctica de
condiciones de partida sin gérmenes y sin coste para los cultivos
celulares. Se usa a este respecto como material esterilizable
vidrio, de modo que se tiene también un buen contacto visual con los
cultivos celulares. También es ventajoso el vidrio como material
respecto a una solubilización indeseable del material del recipiente
de cultivo.
En un dispositivo de cultivo según la
reivindicación 19 se realiza tanto la alimentación como también la
evacuación del medio de cultivo obligatoriamente mediante una
disposición de bomba para operar bidireccionalmente. Esto es
ventajoso respecto a una consecución rápida del valor del nivel
nominal, también en cuanto a evitar oscilaciones de nivel.
En un dispositivo de cultivo según la
reivindicación 20 se puede exponer los cultivos a determinadas
estimulaciones, de las que resulta un cambio de las condiciones de
crecimiento. Además se puede exponer de esta forma los cultivos a
determinadas sustancias que no se encuentran en la fase líquida de
los medios de alimentación, como sustancias en estado gaseoso o
sustancias sólidas que no se dispersan en la fase líquida.
En un dispositivo de cultivo según la
reivindicación 21 se cambia periódicamente la alimentación sumergida
y la alimentación basal.
Con una variante de la presente invención se
controla el dispositivo de cultivo mediante un programa. Este
programa funciona especialmente con el sistema operativo
MS-DOS.
El programa es adecuado para controlar todas las
funciones del sistema de bombeo. De forma típica el sistema de
bombeo está conectado mediante una interfaz en serie al equipo
informático. Además de lo anterior, el programa detecta y procesa
la señal de salida de las fotocélulas. En una forma de realización
especialmente preferida se protocoliza el desarrollo del
experimento.
A continuación se aclara detalladamente la
invención a partir de los ejemplos de realización con referencia a
los dibujos. Estos muestran:
Fig. 1: una vista esquemática de un dispositivo
de cultivo sencillo, que comprende sólo un recipiente de cultivo,
con altura de nivel del medio de cultivo controlable;
Fig. 2: una vista similar a la de la figura 1, en
la que se reproduce un dispositivo de cultivo modificado;
Fig. 3: una vista de otro dispositivo de cultivo
modificado, que presenta una pluralidad de módulos de cultivo
dispuestos unos junto a otros en paralelo, que por su parte
presentan cada uno una pluralidad de recipientes de cultivo;
Fig. 4: un vista longitudinal a través de uno de
los módulos de cultivo del dispositivo de cultivo según la figura
3;
Fig. 5: un corte transversal angulado a través
del módulo de cultivo según la figura 4 a lo largo de la línea de
corte V-V que se encuentra en el mismo;
Fig. 6: un corte longitudinal a través del
dispositivo de cultivo según la figura 3;
Fig. 7: un corte transversal a través del
dispositivo de cultivo según la figura 3 a lo largo de la línea de
corte IV-IV que se encuentra en el mismo; y
Fig. 8: un diagrama de bloques de un control de
altura de nivel, que es de uso en relación con los dispositivos de
cultivo según las figuras 1 a 6.
En la figura 1 se designa con 10 en conjunto una
unidad de cultivo. La unidad de cultivo 10 comprende un recipiente
de cultivo 12, que grosso modo responde a la forma de una botella
invertida, en donde en el fondo de la botella se está provista una
abertura 14 en forma en forma de círculo.
En el interior del recipiente de cultivo 12 se
emplaza un inserto para cultivo celular 15, que está fabricada un
material de plástico poroso, por ejemplo, de poli(tereftalato
de etileno). El inserto para cultivo celular 15 representa una
estructura soporte permeable a líquidos para una membrana 16, que se
puede fabricar, según cada requerimiento de las células que se van a
cultivar, de distintos materiales de plástico, por ejemplo,
igualmente poli(tereftalato de etileno). La membrana 16
porta, como se representa en la ampliación del detalle de la figura
1, un cultivo celular 18.
El recipiente de cultivo 12 está soportado por un
dispositivo de sujeción 20, que en la figura 1 sólo se indica de
forma esquemática.
La conexión 22 del recipiente de cultivo 12 que
se encuentra en la parte inferior se encuentra unida mediante un
conducto 23 con una conexión de trabajo de una bomba 24
bidireccional, que en la práctica puede ser una bomba peristáltica.
La otra conexión de la bomba 24 se encuentra unida mediante un
conducto 26 con el interior de un depósito de almacenamiento 28, que
contiene un líquido de cultivo 30. Este contiene aquellas sustancias
alimenticias, que deben estar a disposición del cultivo celular 18
para el crecimiento.
Los dos bornes de control de la bomba 24 están
unidos por amplificadores de potencia 32, 34 con las salidas de un
circuito de accionamiento 36. El circuito de accionamiento 36
produce una señal dependiendo de la señal de salida de un sensor de
nivel 38 que trabaja en continuo, que está representado como sensor
emplazado en la superficie exterior del recipiente de cultivo 12
(pero dado el caso también puede estar emplazado en la superficie
interior del recipiente de cultivo 12) y en la práctica puede ser un
sensor óptico, y dependiendo de una, otra o ninguna de las salidas
de un indicador de valor nominal 40, que se representa como
resistencia ajustable, para provocar que la bomba 24 alimente al
interior del recipiente de cultivo 12 desde el depósito de
almacenamiento 28 líquido de cultivo adicional o devuelva líquido de
cultivo desde el interior del recipiente de cultivo 12 al depósito
de almacenamiento 28.
El indicador de valor nominal 40 se puede ajustar
a partir de una regulación programada 42, como se indica en la
figura 1 mediante una línea a trazos.
La regulación programada 42 conmuta en el ejemplo
de realización aquí contemplado el indicador de valor nominal 40
entre dos posiciones. Una posición del indicador de valor nominal 40
corresponde a una altura del nivel de líquido de cultivo 30 en el
interior del recipiente de cultivo 12, como se indica en el dibujo:
el líquido de cultivo 30 contacta ya con la parte inferior del
inserto para cultivo celular 15. En estas condiciones se alimenta al
cultivo celular 18 líquido de cultivo sólo desde el líquido de
cultivo inferior (alimentación basal).
La segunda posición del valor nominal de nivel
ajustada por la regulación programada 42 corresponde a una situación
del nivel como se indica en la figura 1 mediante la línea a trazos
44. En esta posición el nivel de líquido se encuentra por encima de
la cima del cultivo celular 18; por tanto este se nutre de forma
sumergida.
El ejemplo de realización mostrado en la figura 2
corresponde al de la figura 1 pero más amplio, se dan componentes
correspondientes de nuevo con los mismos números de referencia y en
lo sucesivo no se detallan más.
En lugar de la bomba 24 que opera
bidireccionalmente se dispone una bomba de suministro 24' que opera
unidireccionalmente, que está unida por una válvula de retención 46
con la conexión 22 del recipiente de cultivo 12. Este está unido
además por una válvula magnética 2/2 48 con una conducción de purga
50. La válvula magnética 48 se encuentra elásticamente en la
posición de cierre, y se puede llevar a la posición de paso mediante
activación de sus imanes. El imán de la válvula magnética 48 y la
bomba 24' están unidos nuevamente por los amplificadores de
potencia 32, 34 con el circuito de accionamiento 36, como se
describió anteriormente, lo que forma un circuito de
regulación.
Las figuras 3 a 7 muestran un dispositivo de
cultivo con el que se puede llevar a cabo un gran número de cultivos
celulares de forma simultánea.
El dispositivo de cultivo mostrado en las figuras
3 a 7 tiene una carcasa exterior 52 que se puede cerrar
herméticamente, que se compone de una pieza de carcasa 54 inferior,
en forma de caja compuesta por placas y una cubierta 56 retirable
colocada sobre esta hermética, de la que se prolongan
perpendicularmente desde abajo a lo largo de las líneas
55-1, 55-2 y 55-3
tres resaltes de vidrio 57 hasta el borde superior de los
recipientes de cultivo 12, para fijar los insertos para cultivo
celular 122 emplazadas en su interior.
En el interior de la carcasa exterior 52 están
dispuestos cuatro módulos de cultivo 58-1,
58-2, 58-3 y 58-4.
En tanto en lo sucesivo no es necesaria ninguna distinción de los
módulos de cultivo, se hace referencia a estos con la designación
58.
Cada uno de los módulos de cultivo 58 comprende
una carcasa templada designada con 60, que es hermética y se
compone de distintas placas. En el interior de un recipiente de
cultivo 60 están dispuestos respectivamente tres unidades de
cultivo 10, como se evidencia en el dibujo. Las conexiones 22 de los
distintos recipientes de cultivo 12 de estas unidades de cultivo
están unidas con una conducción de provisión 60 conjunta.
Las conducciones de provisión 62 de los distintos
módulos de cultivo 58 están unidas respectivamente por un conducto
64 representado sólo esquemáticamente de silicona con una tubuladura
de purga 66 dispuesta de un distribuidor de medio de cultivo. El
distribuidor de medio de cultivo 68 se encuentra unido con una
tubuladura de alimentación 70 para el medio de cultivo, que de
forma similar al ejemplo de realización según la figura 1 ó 2 está
unido con la salida de una bomba de medio de cultivo 24 y/o 24' por
un conducto de silicona no representado.
Las conducciones de provisión 62 tienen
respectivamente una derivación 72 para conexión que se encuentra en
el exterior de la carcasa templada 60 dispuesta, que está unida por
un conducto de silicona 74 con un racor de toma 76 dispuesto de la
carcasa exterior 52. De esta forma se puede extraer por separado
para fines de ensayo líquido de cultivo 30 de los distintos módulos
58.
Los recipientes de cultivo 12 de un módulo de
cultivo 58 son recorridos de forma uniforme por el medio de
templado alimentado por una tubuladura de purga 78 del medio de
templado (por ejemplo, agua templada). La evacuación del medio
templado alimentado se realiza mediante un rebosadero 80, que está
provisto en la proximidad del ángulo de la carcasa templada 60 que
se encuentra diametralmente opuesto a la tubuladura de conexión
78.
El rebosadero 80 se encuentra unido por un tramo
de tubo 82 en forma de ángulo con una tubuladura de purga 84 de la
carcasa templada 60. La tubuladura de purga 84 de un módulo de
cultivo 58 está unida respectivamente con la tubuladura de conexión
78 del siguiente módulo de cultivo 58 que se encuentra paralelo, por
ejemplo, mediante un conducto 86. De esta forma las carcasas
templadas 60 son recorridas unas tras otras por el mismo medio de
templado.
La primera tubuladura de conexión 72 está unida
con una tubuladura de alimentación 88 del líquido de templado, que
está soportada por la carcasa exterior 52. La tubuladura de purga
84-1 de un módulo se encuentra unida por un
conducto 86 con la tubuladura de conexión del siguiente módulo. La
última tubuladura de purga 84-2 de la disposición
modular se encuentra unida por un conducto 90 y un tramo de tubo 92
con una tubuladura de purga 94 del medio de templado.
Como se evidencia en el dibujo, con el extremo de
la conducción de provisión 62 se encuentra unido un tubo ascendente
96. Este se encuentra perpendicular al plano del dibujo de la figura
3, como se hace especialmente bien apreciable en la figura 7.
De la figura 7 es además bien apreciable que el
distribuidor del medio de cultivo 68 presenta en vista frontal la
forma de una "V" muy abierta, en donde está dispuesta la
tubuladura de alimentación 70, que sirve a la vez también para la
toma de líquido de cultivo en exceso, en el lugar más bajo del
distribuidor del medio de cultivo 68.
Los dos brazos de una barrera de luces de gálibo
designada en su conjunto con 98 se extienden sobre la pared
exterior del tubo ascendente 96. La barrera de luces de gálibo 98
ajustable en dirección vertical se encuentra portada por un soporte
100, que se prolonga paralelo a una de las placas exteriores de la
carcasa exterior 52 en dirección vertical.
En los brazos de la barrera de luces de gálibo 98
se usa de igual forma una fuente de luz IR 102 (véase la figura 8)
en forma de un diodo IR y/o un detector IR 104 en forma de un
fototransistor sensible a IR. Si se encuentra el nivel de líquido
en el tubo ascendente 96, que corresponde al nivel de líquido de los
distintos recipientes de cultivo 12 alineados exactamente en
horizontal, por debajo de la barrera de luz IR anteriormente
descrita, el fototransistor 104 recibe corriente y controla en
consecuencia. Si la columna de líquido en el tubo ascendente 96
asciende hasta la altura del eje de la barrera de luz formada por la
fuente de luz IR 102 y el detector IR 104, desaparece la señal de
salida del fototransistor. Esto es reconocido por un amplificador
diferencial 106, que recibe en su entrada lateral la señal de salida
de un indicador de valor nominal 108 representado de nuevo como
resistencia ajustable.
Mediante la señal de salida del amplificador
diferencial se activa mediante un transistor conmutador 110 la
bobina de relé 112 de un relé de láminas 114 designado en su
conjunto con 114. Mediante esto se cierra el contacto del relé116,
que es un contacto libre de potencial y por ejemplo controla el
trabajo de la bomba 24 en dirección de una alimentación de más
líquido de cultivo 30.
En una realización sencilla del dispositivo de
cultivo se realiza el cambio de alimentación sumergida a
alimentación basal, por ejemplo, de modo que la barrera de luces de
gálibo 98 se desplaza correspondientemente hacia abajo, entonces el
líquido de cultivo en exceso disminuye mediante vaciado manual hasta
un nivel que se encuentre claramente por debajo del nivel deseado
para alimentación basal y luego el nivel de líquido se deja subir,
bajo control mediante la señal de salida de la barrera de luces de
gálibo 98, que ahora está graduado, hasta el nivel para
alimentación basal.
Sin embargo para una conmutación automática entre
estas dos variantes de alimentación se provee preferiblemente una
segunda barrera de luces de gálibo, que se ajusta al nivel para
alimentación basal. Para esta segunda barrera de luces de gálibo
está provisto un segundo circuito regulador, que corresponde al de
la figura 8, con la diferencia de que entonces el contacto del relé
116 controla la evacuación de líquido de cultivo, por tanto la
actividad de una bomba bidireccional en el sentido de una evacuación
de líquido de cultivo.
Los distintos componentes mecánicos del
dispositivo de cultivo descrito anteriormente son, en tanto sean
componentes rígidos, preferiblemente de vidrio. Con ello estos
componentes se pueden esterilizar a temperaturas de 120ºC sin
problemas y se pueden incorporar antes de la realización de ensayos
en una situación de partida libre de gérmenes sin coste. Las
distintas conexiones de conductos anteriormente descritas se
componen preferiblemente de material para conductos de silicona,
que se puede esterilizar igualmente a 120ºC sin problemas.
Como se representó anteriormente, se usa para la
regulación del nivel del líquido de cultivo en los distintos
recipientes de cultivo 12 sólo un sensor de nivel único. Por este
motivo es necesario alinear los distintos recipientes de cultivo 12
exactamente, de modo que las botellas, sobre las que crecen los
cultivos celulares, se encuentren en un plano horizontal común.
Para un posicionamiento forzado de los distintos módulos de cultivo
y para una disposición de los módulos de cultivo en la carcasa
exterior están previstas dos formas de posicionamiento 118 y 120,
que cooperan con los bordes anteriores y/o posteriores de las placas
inferiores de la carcasa templada 60.
En las representaciones principales de las
figuras 1 y 2 los insertos para cultivo celular 15 se representaban
de forma esquemática como sustratos incorporados. En la práctica los
insertos para cultivo celular 15 no se tratan de componentes
incorporados de forma fija en los recipientes de cultivo 12, más
bien de partes que se pueden retirar de estos. Los insertos para
cultivo celular comerciales tienen, como se indica en la figura 4
con 122 para uno de los recipientes de cultivo 12, la forma de un
cubilete cilíndrico con una pared de fondo 124 plana y una pared
rodeante cilíndrica 126. Mediante el uso de los insertos para
cultivo celular 122 en el recipiente para cultivo 12 y fijación
mediante el resalte de vidrio 57 se asegura que las distintas
paredes de fondo 124 se encuentren en un plano horizontal común.
Los insertos para cultivo celular 122 se fabrican todas ellas de un
material plástico poroso, como también los insertos para cultivo
celular 15 de las figuras 1 y 2.
Como se representó anteriormente, se puede
cambiar en el dispositivo de cultivo descrito muy fácilmente de
alimentación sumergida a basal de los cultivos celulares. Mediante
la variación de temperatura del líquido de templado alimentado se
puede emprender una variación adicional de las condiciones de
crecimiento. Finalmente se puede exponer los cultivos celulares a
condiciones dañinas o terapéuticas determinadas, de modo que se
alimente al interior de la carcasa exterior 52 por una conducción
128 sustancias en forma de gas. De igual forma se puede realizar
también una exposición con aerosoles.
De forma análoga al tratamiento directo con gases
y/o aerosoles se pueden poner en contacto directamente con los
cultivos celulares también principios activos particulados. Para
ello se espolvorean las partículas, cuyo efecto nocivo se debe
investigar, sobre los cultivos celulares. Si se sincronizan las
densidades de las partículas y del líquido de cultivo una tras otra
de modo que las partículas sean más ligeras que el líquido de
cultivo, las partículas ascienden con la subida del nivel del
líquido de cultivo del cultivo celular. Si el líquido de cultivo
por el contrario desciende (alimentación basal), las partículas
permanecen en contacto con el cultivo celular. Partículas adecuadas
de este tipo son polvos muy finos, por ejemplo, polvo de madera o
también partículas hidrófobas, que en suspensión sólo sedimentan de
forma insuficiente o a penas lo hacen.
Para la gasificación directa de las células con
sustancias como, por ejemplo, ozono o para la admisión de las
células con partículas y mezclas de sustancias complejas
directamente en el límite aire/líquido con retención de la técnica
de cultivo por pulso se pueden usar para el montaje adicional de la
unidad de cultivo piezas especiales para los módulos de
cultivo.
También se pueden adaptar en los módulos de
cultivo biosensores para la detección continua o discontinua de
constituyentes (por ejemplo, calcio) y productos celulares
especiales así como sondas de medida y dispositivos de medida para
la medida continua o discontinua de constituyentes en estado gaseoso
(por ejemplo, CO_{2}, NO_{x}) o particulados ("materia
particulada total", TPM) de sustancias que porta el aire en la
atmósfera de exposición de las células.
Estas distintas posibilidades del cultivo celular
se obtienen con diseño sencillo del dispositivo de cultivo.
Los dispositivos de cultivo descritos
anteriormente son adecuados para el uso universal de insertos para
cultivo celular comerciales. El modo de construcción modular del
dispositivo permite también una adaptación sin problemas al
recipiente de cultivo ("pocillos") en tamaños de insertos
específicos.
La realización de los ensayos es muy flexible, se
pueden realizar tres experimentos en paralelos por módulo. Con uso
de todos los módulos del dispositivo de cultivo según las figuras 3
a 7 se pueden realizar cuatro veces tres experimentos en paralelo
respectivamente. Esto permite, por ejemplo, determinar reacciones
celulares en función de la concentración y/o tiempo.
Por ejemplo, distintos planteamientos biológicos
celulares especiales, que se pueden resolver con un dispositivo
celular de acuerdo con la invención son los siguientes:
- 1.
- Tratamiento de células con, por ejemplo, gases, aerosoles o polvos directamente en la capa límite aire/líquido.
- 2.
- Interacciones celulares mediante co-cultivo de distintos tipos de células, por ejemplo, de células epiteliales y fibroplastos.
- 3.
- Comportamiento de adhesión de células en un sistema, que se provee con líquido de cultivo por pulsos.
- 4.
- Diferenciación de células de cultivos en provisión de líquido de cultivo basal (polarización).
- 5.
- Estudio de células ciliadas en provisión basal y/o intermitente con líquido de cultivo.
- 6.
- Análisis continuo de productos de excreción celular durante el ensayo.
- 7.
- Adición intermitente de principios activos que estimulan el crecimiento y que inhiben el crecimiento sin interrupción del cultivo.
- 8.
- Adición intermitente de las sustancias mencionadas en el punto 6 durante la exposición de células a principios activos o sustancias dañinas.
En las figuras 3 a 7 se mostró un dispositivo de
cultivo, que tiene un mecanismo de templado propio. Sin embargo
este, al igual que los dispositivos de cultivo sin mecanismo de
templado, como se muestran en las figuras 1 y 2, se puede colocar
para el templado simplemente en una estufa de templado.
La preparación del dispositivo de cultivo para un
ensayo transcurre detalladamente como sigue:
El dispositivo de cultivo montado se somete a
autoclave, pero sin insertos para cultivo celular, mecanismo de
provisión y sensor de nivel, a 120ºC en autoclave durante 30
minutos, así como materiales necesarios tales como conductos de
bomba, pinzas para la introducción de los insertos para cultivo
celular, botellas para captación del medio de cultivo y similares.
Tras el proceso de autoclave se monta el sensor de nivel en un banco
de trabajo en sala limpia. Luego se realiza la conexión del
conducto para el medio a la bomba y el ajuste de la velocidad de la
bomba para las condiciones de ensayo previstas. Antes de la
introducción de los insertos para cultivo celular, que se
suministran envasadas individualmente y en condiciones de
esterilidad por parte del fabricante, se rellana el dispositivo de
cultivo una vez con el medio de cultivo específico del tipo de
célula y se vacía de nuevo (lavado), tras lo cual se desecha el
medio usado a este respecto. A continuación se rellena todo el
dispositivo de cultivo hasta por debajo del recipiente de cultivo
con el medio específico del tipo de célula, y se incorporan los
insertos para cultivo celular preparadas en el banco de trabajo en
sala limpia mediante una pinza. A continuación se inicia el programa
seleccionado para el control de bomba, y el dispositivo de cultivo
se transfiere dado el caso a una estufa de templado.
El programa controla un ciclo que se compone de
los pasos (1) pre-bombeo y tiempo de cultivo y (2)
re-bombeo y espera.
Tras la inicialización la bomba lleva a cabo su
función de pre-bombeo de forma autónoma. Para este
fin se selecciona previamente según cada tipo de célula y modo de
cultivo la velocidad de la bomba adecuada. El programa vigila la
señal de salida de las fotocélulas y regula la finalización de la
actividad de la bomba, tan pronto se alcance el estado de nivel
deseado. De forma típica tiene lugar la finalización de la actividad
de la bomba ya tras dos o varias veces por parte del programa de
vigilancia de detección de señal. Esto permite impedir la detección
de señales falsas que, por ejemplo, se pueden producir mediante
formación de burbujas y que conducen en detección de señal
individual a una finalización prematura e indeseada de la actividad
de la bomba. El consiguiente tiempo de cultivo es preferiblemente
seleccionable y ajustable.
Tras expirar el tiempo de cultivo se inicializa
el proceso de vaciado con bomba del medio, en donde de nuevo es
seleccionable y ajustable la velocidad de la bomba. De la velocidad
de vaciado con bomba seleccionada y del volumen del medio resulta el
tiempo de espera requerido para el proceso de vaciado con bomba.
Lo anteriormente mencionado sobre el ciclo
controlado por el programa, se puede llevar a cabo una, dos o varias
veces.
Los insertos para cultivo celular se pueden
retirar en cualquier momento en el banco de trabajo en sala limpia.
Para ello se detiene el programa informático. En caso de retirar
sólo algunos insertos, se puede iniciar de nuevo el programa.
Para la purificación se limpia el dispositivo de
cultivo completo varias veces con agua destilada. Las piezas de
vidrio se pueden limpiar sin problemas también con alcohol u otro
agente de limpieza.
Se acaba de describir la invención en función de
sensores de nivel especiales. Se entiende que también son adecuados
otros sensores de nivel, que pueden reconocer la situación del nivel
de líquido momentáneo en el recipiente de cultivo 12 y proporcionan
una señal de salida correspondiente. A estos pertenecen sensores
controlados por luz, sensores que operan según el principio
dieléctrico, sensores que presentan una pluralidad de electrodos
distanciados en dirección vertical y sensores por infrarrojo y
ultrasonidos.
Claims (25)
1. Dispositivo de cultivo con al menos un
recipiente de cultivo (12), que presenta al menos una conexión (22)
para la alimentación y evacuación de medio de cultivo (30),
respectivamente con un inserto para cultivo celular (15; 122) para
cada uno de los recipientes de cultivo (12), que está sujeta en el
interior del mismo, y con un mecanismo de provisión (24 a 28; 24',
48, 50) para la alimentación de medio de cultivo (30) a los
recipientes de cultivo (12) y/o para la evacuación del medio de
cultivo de estos, caracterizado porque a los recipientes de
cultivo (12) está/n asignado/s uno o dos sensores de nivel (38; 98)
dirigido(s) al nivel del medio de cultivo (30) y porque el
mecanismo de provisión (24 a 28; 24', 28, 48, 50) se controla en
función de la señal de salida de un sensor de nivel o de dos
sensores de nivel (38; 98), de modo que es posible tanto un cultivo
de células sumergido como también basal.
2. Dispositivo de cultivo según la reivindicación
1, caracterizado porque el inserto para cultivo celular (15;
122) proporciona respectivamente una superficie de cultivo
horizontal.
3. Dispositivo de cultivo según la reivindicación
1 ó 2, caracterizado por conducciones de recogida (74, 76)
asignadas a los recipientes de cultivo individuales (12) o grupos de
recipientes de cultivo (12).
4. Dispositivo de cultivo según una de las
reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque una pluralidad
de recipientes de cultivo (12) están conectados a una conducción de
provisión (62) común de modo tal que las superficies de cultivo de
los insertos para cultivo celular (15; 122) se encuentran en un
plano horizontal común.
5. Dispositivo de cultivo según la reivindicación
4, caracterizado porque las condiciones de provisión (62)
comunican con un tubo ascendente (96), en el que está provisto el
sensor de nivel (38; 98).
6. Dispositivo de cultivo según una de las
reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque uno o ambos
sensores de nivel (38, 98) comprenden uno y/o respectivamente una
barrera de luces de gálibo.
7. Dispositivo de cultivo según la reivindicación
5 ó 6, caracterizado porque el o uno de ambos sensores de
nivel (38; 98) es ajustable sobre el tubo ascendente (96).
8. Dispositivo de cultivo según una de las
reivindicaciones 1 a 7, caracterizado porque uno o ambos
sensores de nivel (38; 98) es/son un y/o respectivamente un sensor
que mide el nivel de forma continua.
9. Dispositivo de cultivo según una de las
reivindicaciones 1 a 7, caracterizado porque uno o ambos
sensores de nivel (38; 98) es un y/o respectivamente un conmutador
de nivel que responde a un nivel determinado.
10. Dispositivo de cultivo según una de las
reivindicaciones 5 a 9, caracterizado porque presenta varios
módulos (58), que por su parte comprenden respectivamente una
pluralidad de recipientes de cultivo (12), que están dispuestos
paralelamente orientados a una carcasa exterior (52), en donde está
provisto un distribuidor de provisión (68), que está conectado con
conducciones de provisión (62) de los módulos individuales (58).
11. Dispositivo de cultivo según la
reivindicación 10, caracterizado porque una conexión (70)
para unión única con el mecanismo de provisión (24 a 28; 24', 28,
48, 50) del distribuidor de provisión (68) se encuentra en el lugar
más bajo del mismo.
12. Dispositivo de cultivo según la
reivindicación 10, caracterizado porque la carcasa exterior
(52) presenta conexiones separadas (76) para conducciones de
recogida (74), que conducen respectivamente a uno de los módulos de
cultivo (58).
13. Dispositivo de cultivo según la
reivindicación 12, caracterizado porque los recipientes de
cultivo (12) están dispuestos en módulos (58) que comprenden
respectivamente al menos un recipiente de cultivo (12), que presenta
respectivamente una carcasa templada (60) que rodea la disposición
de recipientes de cultivo, que presenta una entrada para el medio de
templado (78) y una salida para el medio de templado (84).
14. Dispositivo de cultivo según la
reivindicación 13, caracterizado porque la salida del medio
de templado (84) permanece en unión con un rebosadero (80) que se
encuentra en la zona superior de la carcasa templada (60), que
preferiblemente se encuentra diametralmente opuesto a la entrada de
medios de templado (78).
15. Dispositivo de cultivo según la
reivindicación 14, caracterizado porque la carcasa templada
(60) de los distintos módulos (58) son conmuntados en serie conforme
a la corriente del medio de templado.
16. Dispositivo de cultivo según una de las
reivindicaciones 1 a 15, caracterizado porque los recipientes
de cultivo (12) están rodeados de una carcasa exterior (52) con
cierre hermético.
17. Dispositivo de cultivo según la
reivindicación 16, caracterizado porque la carcasa exterior
(52) está provista con una conexión (128) para un medio en forma de
gas.
18. Dispositivo de cultivo según una de las
reivindicaciones 1 a 17, caracterizado porque este se
compone, a excepción del sensor de nivel y piezas del dispositivo de
provisión, esencialmente de un material que se puede esterilizar, en
especial vidrio y material de silicona.
19. Dispositivo de cultivo según una de las
reivindicaciones 1 a 18, caracterizado porque el dispositivo
de provisión (24 a 28) presenta una disposición de bomba para
trabajar bidireccionalmente (24), en especial una bomba
peristáltica.
20. Dispositivo de cultivo según una de las
reivindicaciones 1 a 19, caracterizado por una regulación
programada 42, que controla en función del tiempo un indicador de
nivel nominal 40.
21. Dispositivo de cultivo según la
reivindicación 20, caracterizado porque la regulación
programada 42 conmuta periódicamente el valor de nivel nominal entre
dos valores, de los cuales uno corresponde a un nivel de líquido que
se encuentra a una distancia dada sobre la parte superior de la
superficie de cultivo y el otro a un nivel que se encuentra a una
distancia dada por debajo de la parte superior de la superficie de
cultivo.
22. Procedimiento para el cultivo de células o
componentes de tejido usando un dispositivo de cultivo según una de
las reivindicaciones 1 a 21, caracterizado porque el nivel de
líquido de una solución de sustancia nutritiva para las células o
partes de tejido se encuentra alternativamente a una distancia dada
sobre la parte superior de un cultivo de células o de partes de
tejido (cultivo sumergido) y a una distancia dada por debajo de la
parte superior del cultivo (cultivo basal).
23. Procedimiento según la reivindicación 22,
caracterizado porque en un periodo de tiempo, en el que el
nivel de líquido se encuentra por debajo de la parte superior del
cultivo, se suspende en el cultivo sustancias sólidas, en forma de
gas o en forma de aerosol.
24. Procedimiento según la reivindicación 22 ó
23, caracterizado porque la situación del nivel de líquido se
acomete con ayuda de un sensor de nivel y un dispositivo de bombeo
controlado con este.
25. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 22 a 24, caracterizado porque se acomete un
ajuste temporal de la situación del nivel de líquido con ayuda de
una regulación programada.
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