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Die Erfindung betrifft eine Vorrichtung sowie ein Verfahren zur Untersuchung von Tabakrauch. Dabei wird insbesondere die Reizwirkung des Tabakrauchs untersucht.
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Tabakrauch enthält viele giftige Substanzen, beispielsweise CO, NO
x, HCHO, Cd, Cu, sowie auch krebserregende Substanzen, beispielsweise 3,4-Benzpyren, Teer und Nikotin. Viele Maßnahmen werden unternommen, um durch geeignete Filtertechnologie die genannten Schadstoffe aus dem Rauch zu filtern. Abseits der gesundheitsgefährdenden Wirkung mancher Substanzen enthält der Tabakrauch auch reizende Substanzen, die für eine Störung der sensorischen und geschmacklichen Wirkung sorgen. Durch Mischen (”blenden”) der Tabaksorten wird seitens der Hersteller versucht, die reizende Wirkung zu begrenzen und den Geschmack zu verbessern. Es stellt sich in der Zigarettenproduktion die Frage, wie viel (teuerer) milder Import Tabak vorhandenen sehr scharfem Tabak beigemischt werden muss, um etwas gut rauchbares zu erhalten. Die Notwendigkeit der Erzeugung von Rauchwaren mit angenehmen Geschmack und geringer Reizung zeigt sich auch durch die Erzeugung von Tabak-Aromen, wie in
DE 69805145 T2 .
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Untersuchungen des Zigarettenrauchs werden bereits jetzt unter anderem mit in vitro Zellkulturen gemacht. Dabei wird über automatische Zigaretten-Rauch-Geräte (”Rauchautomaten”) der Tabakrauch über lebende Zellen geleitet.
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In der
DE 19 526 533 A1 wird eine Expositionsvorrichtung beschrieben, um mit gas- und/oder partikelförmigen Beimengungen angereicherte Gasgemische auf lebende Zellkulturen zu bringen, wobei das definiert angereicherte Gasgemisch über ein Zuleitungssystem direkt an mindestens einen Träger für die lebenden Zellkulturen führbar ist. Die Auswirkung des Gasgemisches kann jedoch nur aufgrund von zellbiologischen Assays (z. B.: LDH, MTT, NRU, Ames, CCK8, Comet, CBMN etc. Putnam KP et al., Richter PA et al., Roemer E et al., Foy JWD et al., Jianlin et al.) untersucht werden.
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Die
DE 19811735 A1 beschreibt ein Verfahren zur Bestimmung des Einflusses einer Einwirkung auf ein respiratorisches System, bei dem ein Präparat, umfassend ein respiratorisches System, so in eine Vorrichtung eingebracht wird, das ein erstes Fluid mit der apikalen Seite des Präparates und ein zweites Fluid mit der basalen Seite des Präparates in Kontakt gebracht wird, das Präparat der Einwirkung ausgesetzt wird und das erste und/oder zweite Fluid einer Analyse unterzogen wird. Auch hierbei wird eine gleichzeitige Kontaktierung mit Nährmedium und Gasgemisch vorausgesetzt. Eine Untersuchung der Auswirkungen auf das respiratorische System kann nicht während der Gasbeaufschlagung sondern erst danach durch Untersuchung des Fluids erfolgen.
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In der Publikation Pouli AE et al. (2003) Free Radical Biology & Medicine 34(3)345–355 wird eine Vorgehensweise beschrieben, um die zytotoxischen Effekte von leicht flüchtigen organischen Verbindungen der Gas-Phase des Zigaretten-Rauchs auf Epithelzellen zu bestimmen. Dabei werden die Zellen der Zellkultur nach Beaufschlagung mit Zigaretten-Rauch lysiert und für weitere Untersuchungen (LDH- und Wst-1-Tests) vorbereitet.
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All diesen Verfahren gemeinsam ist, dass zwar Sonden eingesetzt werden, die ein passables Äquivalent zum Menschen darstellen, dass jedoch die Auslesung des Effektes nachher zeitraubend und aufwändig geschieht.
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Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein verbessertes Verfahren und eine verbesserte Vorrichtung anzugeben, mittels derer die reizenden Eigenschaften von Zigarettenrauch auf den menschlichen Körper durch ein auf physiologischen Veränderungen von lebendigen Zellen beruhendes Messsignal abgelesen werden kann.
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Diese Aufgabe wird durch ein Messverfahren mit den Merkmalen von Anspruch 1 gelöst. Eine weitere Lösung besteht in der Messvorrichtung mit den Merkmalen von Anspruch 4. Die abhängigen Ansprüche betreffen vorteilhafte Ausgestaltungen der Erfindung.
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Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren zur Messung eines Gases oder eines Gasgemischs mittels einer Zellkultur mit lebenden Zellen wird die Zellkultur in eine Aufnahmeeinrichtung eingebracht und die Zellen der Zellkultur zur Herstellung eines Ausgangszustands durch ein flüssiges Zellkulturmedium bedeckt. Dieser Schritt kann zeitlich nahe oder fern vor einer eigentlichen Messung stattfinden oder auch wiederholt.
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Nachfolgend wird das Zellkulturmedium über einen Abfluss wenigstens teilweise aus der Aufnahmeeinrichtung entfernt. Die Zellen werden in einem Messschritt sodann mit dem Tabakrauch beaufschlagt, wobei der Tabakrauch dabei im Wesentlichen ungelöst in direkten Kontakt mit wenigstens einem Teil der Zellen tritt. Dazu wird zweckmäßig das Zellkulturmedium wenigstens soweit aus der Aufnahmeeinrichtung entfernt, dass ein Teil der Zellen der gasförmigen Umgebung ausgesetzt ist und nicht mehr vom Zellkulturmedium bedeckt ist.
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Während des Messschritts werden mit wenigstens einem Sensor physiologische Veränderungen der Zellen durch die Beaufschlagung mit dem Tabakrauch ermittelt. Dabei wird die Beaufschlagung der Zellkultur mit dem Tabakrauch zeitgleich zur Messung der physiologischen Veränderungen durch den Sensor vorgenommen.
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Die erfindungsgemäße Vorrichtung zur Untersuchung der Reizwirkung von Tabakrauch weist die folgenden Komponenten auf:
- – mindestens eine Aufnahmeeinheit zur Aufnahme einer Zellkultur mit lebenden Zellen,
- – mindestens einen Sensor zur Messung von physiologischen Veränderungen der Zellen durch die Beaufschlagung mit dem Tabakrauch,
- – eine Zuführungseinrichtung für Tabakrauch zur Zuführung des Tabakrauchs zu den Zellen der Zellkultur,
- – einen Zufluss zur Zuführung eines flüssigen Zellkulturmediums zur Aufnahmeeinheit,
- – einen Abfluss zur Abführung des flüssigen Zellkulturmediums von der Aufnahmeeinheit,
- – Steuerungsmittel, die ausgestaltet sind, für einen Messschritt das Zellkulturmedium über den Abfluss wenigstens teilweise aus der Aufnahmeeinrichtung zu entfernen, den Tabakrauch über die Zuführungseinrichtung in die Aufnahmeeinrichtung einzubringen und damit für einen festlegbaren Zeitraum in direkten Kontakt mit der Zellkultur zu bringen und in dem Zeitraum eine Messung der physiologischen Veränderungen der Zellen durch den Sensor vorzunehmen, sodass während des direkten Kontakts zwischen Tabakrauch und Zellen Messwerte für die Reaktion der Zellen zur Verfügung stehen.
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Dadurch wird es verbessert ermöglicht, das Mischen der Tabaksorten gezielter auf eine Verminderung der reizenden Wirkung hin abzustimmen. Der Einsatz von lebenden Zellen erlaubt die Untersuchung der Auswirkungen des Tabakrauches hinsichtlich ganzheitlicher Parameter wie etwa „Giftigkeit” oder „Reizbarkeit” ohne Bezugnahme auf bzw. notwendige Kenntnis der exakten chemischen Zusammensetzung. Die Auswirkung des Tabakrauches auf die lebenden Zellen kann ohne zusätzliche Markermoleküle (= „label-free”) und ohne invasive Einwirkung (= „non-destructive”) auf die Zellen ermittelt werden. Der Tabakrauch kann direkt, ohne eine, die Ergebnisse erheblich beeinflussende, Flüssigkeitsschicht, auf die zu untersuchende Zellkultur gelangen.
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Die Untersuchung der Auswirkungen des Tabakrauches auf die lebenden Zellen erfolgt dabei in besonders vorteilhafter Weise sehr zeitnah bzw. zeitgleich zur Beaufschlagung mit dem Tabakrauches. Eine kontinuierliche Messung der Veränderung der Zellparameter (Zeitauflösung < 10 Sekunden) während und nach der Tabakrauchbeaufschlagung ist realisierbar. Dies erlaubt also eine Ermittlung des kinetischen Verlaufs des Effektes des Gases oder Gasgemischs und liefert daher vorteilhaft einen erhöhten Informationsgehalt. Es bedarf also keiner aufwendigen Endpunktbestimmungen oder Testmethoden, die die Zellen beim der Detektion der zellphysiologischen Veränderung nachhaltig schädigen. Bevorzugte Messmethoden sind dafür Impedanz-Messungen zur Charakterisierung der Morphologie sowie optische Messmethoden wie etwa Fluoreszenz oder Chemilumineszenz. Somit wird erstmals eine tatsächliche real-time-Messung ermöglicht, da nicht nach der Beaufschlagung der Zellen mit dem zu untersuchenden Gas weitere Tests durchgeführt werden müssen. Die Auswirkungen des Tabakrauchs auf die gleiche Zellpopulation können dabei mehrmals hintereinander getestet werden. Zur Untersuchung der Auswirkung des Tabakrauchs kann nach der Rauchbeaufschlagung weiterhin eines der bisher bekannten Analyseverfahren eingesetzt werden ohne Verlust der durch die erfindungsgemäß gewonnenen Untersuchungsergebnisse.
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Dabei ist es auch möglich, dass zusätzlich zur Messung der physiologischen Veränderungen der Zellen während der Beaufschlagung mit dem Gas oder Gasgemisch eine Messung auch nach der Beaufschlagung mit dem Gas gemacht oder fortgesetzt wird. Mit anderen Worten wird also auch eine Messung durchgeführt, wenn die Zellen in das Zellkulturmedium zurückgekehrt sind. Dies kann beispielsweise vorteilhaft sein, wenn durch die Beaufschlagung mit dem Gas oder Gasgemisch der Sauerstoffverbrauch der Zellen bleibend oder zeitweilig geändert ist. Das wiederum wird bevorzugt auch dann gemessen, wenn die Zellen im Zellkulturmedium sind.
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Bevorzugt werden dabei als Zellen tierische, pflanzliche, Insekten- oder menschliche Zellen, insbesondere V79, N2A, A594, HFBE oder HUVE, verwendet. Die Sensoren wiederum messen bevorzugt chemische oder elektrische Messgrößen. Es sind auch Sensoren für optische Messgrößen einsetzbar. Bevorzugt sind die Sensoren in direktem physischem Kontakt mit den Zellen. Beispielsweise können die Zellen direkt auf den Sensoren liegen.
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Das Einbringen des Tabakrauchs kann vor, zeitgleich oder nach dem Entfernen des Zellkulturmediums erfolgen. In der Folge wirkt der Tabakrauch mehr oder weniger stark auf die Zellen. Gleichzeitig werden die physiologischen Effekte, mittels des Sensors oder der Sensoren aufgenommen. Nachfolgend wird die Aufnahmeeinrichtung zweckmäßig zur Wiederherstellung des Ausgangszustands über einen Zufluss mit Zellkulturmedium gefüllt. Es ist auch möglich, die Zellen nach dem Messschritt auszutauschen.
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In einer bevorzugten Ausgestaltung der Erfindung bildet der Sensor wenigstens einen Teil des Bodens der Aufnahmeeinheit und eine der Messung dienende Oberfläche des Sensors ist der Zellkultur zugewandt. Mit anderen Worten kommen die Zellen der Zellkultur in der Ausgestaltung der Erfindung direkt auf der funktionalen Oberfläche des Sensors zu liegen. Dadurch ist die Kopplung zwischen Sensor und Zellen optimal.
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Zweckmäßig ist es, wenn die Aufnahmeeinrichtung und die Sensoren oder der Sensor sterilisierbar sind, d. h. in ausreichender Weise gegenüber Hitze, Druck und/oder Lösungsmitteln stabil sind.
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In einer weiteren bevorzugten Ausgestaltung der Erfindung sind Mittel zur Einstellung einer Verdünnung des Tabakrauchs vor oder während der Einbringung in die Aufnahmeeinrichtung vorgesehen. Wird der Tabakrauch vor der Beaufschlagung der Zellen verdünnt, so kann damit eine zu starke Reaktion der Zellen vermieden werden und so ein besseres, weil länger andauerndes Signal erreicht werden oder überhaupt das Überleben der Zellen ermöglicht werden. Weiterhin ist bevorzugt eine Einrichtung zur Befeuchtung des Tabakrauchs vorhanden.
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Besonders bevorzugt ist eine Einrichtung zur Regelung der Temperatur von wenigstens einem Teil der Vorrichtung vorgesehen. Damit kann vorteilhaft der Teil der Vorrichtung, beispielsweise der Bereich um die Aufnahmeeinrichtung auf einer weitgehend konstanten Temperatur gehalten werden. Der bevorzugte Temperaturbereich ist dabei 5°C bis 65°C, vorzugsweise 15°C bis 45°C. Dadurch wird der Einfluss der umgebenden Temperatur auf die Messergebnisse reduziert. Zusätzlich kann Kondensation vermieden werden.
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Bevorzugte, jedoch keinesfalls einschränkende Ausführungsbeispiele für die Erfindung werden nunmehr anhand der Zeichnung näher erläutert. Dabei sind die Merkmale schematisiert dargestellt und sich entsprechende Merkmale sind mit gleichen Bezugszeichen markiert. Dabei zeigen im Einzelnen
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1 einen Querschnitt einer geöffneten Vorrichtung zur Untersuchung der Reizwirkung von Tabakrauch,
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2 einen Querschnitt derselben geschlossenen Vorrichtung,
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3 einen Querschnitt einer geschlossenen Vorrichtung zur Untersuchung der Reizwirkung von Tabakrauch mit einer Ummantelung,
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4 die Veränderung der Zellaktivitätsparameter Ansäuerung, Atmung und Impedanz bei 10 Minuten Beaufschlagung mit gepafften Zigarettenrauch, und
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5 die Veränderung der Zellaktivitätsparameter Ansäuerung, Atmung und Impedanz bei 10 Minuten Beaufschlagung mit inhaliertem Zigarettenrauch.
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Das in 1 dargestellte Ausführungsbeispiel umfasst als Aufnahmeeinheit für Zellen ein Kulturgefäß 1 mit einer Reihe von Komponenten sowie eine Beaufschlagungsvorrichtung 15, die ebenfalls eine Reihe weiterer Komponenten umfasst. Dabei ist die Beaufschlagungsvorrichtung 15 gegenüber dem Kulturgefäß 1 in vertikaler Richtung verschiebbar angeordnet.
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Das Kulturgefäß 1 umfasst ein Substrat 12 eines Sensorchips. Auf dem Substrat 12 des Sensorchips sind mehrere planare (elektro)chemische und physikalische Sensoren 2 ausgebildet, sodass in diesem Ausführungsbeispiel auf einer Chipfläche von 0,7088 cm2 fünf Protonenaktivitätssensoren, fünf Sauerstoffsensoren und ein Impedanzsensor untergebracht und mit Betriebsschaltungen verbunden sind. Der Sensorchip wird mit einem nicht dargestellten Hebel auf den Kontakten der Betriebsschaltung befestigt. Weiterhin ist im Kulturgefäß 1 auf den physikalischen Sensoren 2 eine Zellkultur 3 ausgebildet. Dabei bilden die Sensoren 2 den Boden des Kulturgefäßes 1, so dass die Zellen der Zellkultur 3 direkt auf den Sensoren anhaften.
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Die Beaufschlagungsvorrichtung 15 weist ein Verteilstück 5 auf, in das im vorliegenden Ausführungsbeispiel ein Zufluss 8 und zwei Abflüsse 9 gebohrt sind. Über den Zufluss 8 und die Abflüsse 9 wird die Zellkultur 3 im Kulturgefäß 1 mit einem Zellkulturmedium 10 überschichtet, das beispielsweise als Nährlösung dient. In anderen Ausführungsformen können auch mehrere Zuflüsse 8 und/oder wenigstens zwei Abflüsse 9 vorgesehen sein. Der Ausgangszustand, bei dem das Zellkulturmedium 10 die Zellen der Zellkultur 3 bedeckt, ist in 1 dargestellt.
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Vor einer Beaufschlagung der Zellkultur 3 mit dem Tabakrauch 11 wird über die zwei Abflüsse 9 das Zellkulturmedium 10 abgesaugt, um die Oberfläche der Zellkultur 3 von einem Flüssigkeitsüberstand zu befreien, beispielsweise mit einer peristaltischen Pumpe. Dabei bleibt die geschlossene Zellmonolage der Zellkultur 3 erhalten. Über den Raucheinlass 6, das Verteilstück 5 und das mit dem Kulturgefäß 1 verbundenem Verbindungsstück 4 gelangt Tabakrauch 11 in das Volumen oberhalb der Zellkultur 3 und in weiterer Folge in direkten Kontakt mit eben jener. Der Tabakrauch 11 kann über den Raucheinlass 6 einerseits durch Tabakkonsum eines Probanden oder aber durch die Rauchentwicklung eines Rauchautomaten eingebracht werden.
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Der Tabakrauch 8 kann dabei gefiltert oder ungefiltert in die Vorrichtung eingeleitet werden. Der Vorgang der Raucheinleitung erfolgt in diesem Ausführungsbeispiel für 10 Minuten. Über den Rauchauslass 7 gelangt der Tabakrauch 11 nach erfolgter Beaufschlagung der Zellkultur 3 in die Außenluft. Hiernach ist das Verbindungsstück 4 vom Kulturgefäß 1 zu lösen und erneut Nährmedium auf die Zellkultur 3 zu applizieren. Dieser Vorgang ist unter Beibehaltung der Vitalität der Zellkultur 3 beliebig oft zu wiederholen.
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Der sich ergebende Zustand ist in 2 dargestellt. Dabei ist die Beaufschlagungsvorrichtung 15 enger auf das Kulturgefäß 1 aufgeschoben, so dass zum einen ein Absaugen des Zellkulturmediums 10 über die Abflüsse 9 ermöglicht ist und zum anderen ein gasdichter Abschluss des Kulturgefäßes 1 wenigstens insoweit hergestellt ist, dass der Tabakrauch 11 eingeströmt werden kann. Dazu wird bevorzugt der Abstand zwischen der Zellkultur 3 und dem Verteilstück 5 von der ursprünglichen Länge von 1 bis 5 cm, vorzugsweise 2 bis 3 cm, deutlich reduziert.
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Der Tabakrauch 11 tritt durch den Raucheinlass 6 ein das Kulturgefäß 1 ein. Dem Raucheinlass 6 gegenüber liegt ein Rauchauslass 7. Durch diesen tritt der Tabakrauch 11 wieder aus. Auf dem Wegstück zwischen dem Raucheinlass 6 und dem Rauchauslass 7 zweigt im Verteilstück 5 ein Verbindungsstück 4 ab. Das Verbindungsstück 4 ist mit dem Gehäuse des Kulturgefäßes 1 gasdicht verschlossen. Der Tabakrauch 11 überschichtet die Zellkultur 3. Die Zellkultur 3 reagiert mit physiologischen Veränderungen auf den direkten Kontakt mit dem Tabakrauch 11. Diese physiologischen Veränderungen werden durch die Sensoren 2 detektiert und über eine Betriebsschaltung an eine Auswerteeinheit 21 weitergeleitet.
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Das Verbindungsstück 4, beispielsweise als Schlauchstück ausgebildet, weist dabei bevorzugt ein flexibles, glattes, inertes, sterilisierbares und gasundurchlässiges Material, insbesondere Silikon, Kautschuk, Fluorkautschuk, Polyethylen oder Polyethylenterephtalat auf. Das Verteilstück 5 wiederum weist bevorzugt ein festes, glattes, inertes, sterilisierbares, gasundurchlässiges und korrosionsbeständiges Material, insbesondere Edelstahl, Glas oder Keramik auf. Das Verteilstück 5 ist auf das Verbindungsstück 4 aufgesteckt.
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Eine Messung läuft also in diesem Beispiel nach dem folgenden Schema ab:
- – das Zellkulturmedium 10 wird über zumindest einen der Abflüsse 9 teilweise oder komplett aus dem Kulturgefäß 1 entfernt, und
- – der Tabakrauch 11 wird über zumindest einen Raucheinlass 6 in das Kulturgefäß 1 eingebracht und gelangt somit in direkten Kontakt mit der Zellkultur 3,
- – der Sensor 2 oder die Sensoren 2 messen die Veränderungen physiologischer Parameter der Zellkultur 3,
- – eine Auswerteelektronik erfasst die Signale, die die Sensoren 2 aufgrund der Änderungen erzeugen und wertet diese aus, und
- – das Kulturgefäß 1 wird über den Zufluss 8 wieder mit Zellkulturmedium 10 gefüllt.
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In der Folge kann die Messung wiederholt werden, beispielsweise als regelmäßiger Messzyklus. Dabei findet dann ein regelmäßiger Austausch von Zellkulturmedium 10 und dem Tabakrauch 11 statt. Die Dauer eines Messzyklus kann dabei in weiten Bereichen variiert werden.
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Werden mehrere Sensoren 2 verwendet, so sind dies bevorzugt solche Sensoren, die sich gegenseitig praktisch nicht chemisch und physikalisch beeinflussen, um möglichst aussagekräftige und unabhängige Signale zu bekommen.
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3 zeigt ein weiteres Ausführungsbeispiel. Bei diesem Ausführungsbeispiel sind das Verteilstück 5 und das Verbindungsstück 4 ineinander integriert. Das Verbindungsstück 5 wird dann ohne beispielsweise ein Schlauchelement direkt auf das Kulturgefäß 1 aufgeschoben. In diesem Fall ist der Raucheinlass 6 und der Rauchauslass 7 in einem Ummantelungselement 13 integriert, das Teil des Verteilstücks 5 ist. Die Ummantelung 13 weist bevorzugt ein inertes, sterilisierbares, gasundurchlässiges und korrosionsbeständiges Material, insbesondere, Silikon, Kautschuk, Fluorkautschuk, Polyethylen, Polyethylenterephtalat, Edelstahl, Glas oder Keramik auf.
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In 4 sind die Werte von Sensorsignalen einer der beschriebenen Vorrichtungen gegen die Zeit in einem Diagramm dargestellt. Wie in 4 ersichtlich, kommt es bei einer 10 Minuten andauernden Beaufschlagung einer V79-Hamsterlungenzelllinie mit gepafftem Zigarettenrauch zu einer Abnahme der Ansäuerung 41 um etwa 40% und zu einer Abnahme der Atmung 42 um etwa 60% bezogen auf Kontrollwerte 43 einer Beaufschlagung mit synthetischer befeuchteter Luft eine Stunde nach Beendigung der Rauchbeaufschlagung.
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Wie in 5 ersichtlich, kommt es bei einer 10 Minuten andauernden Beaufschlagung der V79-Hamsterlungenzelllinie mit inhaliertem Zigarettenrauch zu einer Abnahme der Ansäuerung 51 um etwa 30% und zu einer Abnahme der Atmung 52 um etwa 40% bezogen auf Kontrollwerte 53 einer Beaufschlagung mit synthetischer befeuchteter Luft eine Stunde nach Beendigung der Rauchbeaufschlagung.
