WO2012143212A1 - Verfahren und vorrichtung zur untersuchung von tabakrauch - Google Patents

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WO2012143212A1
WO2012143212A1 PCT/EP2012/055419 EP2012055419W WO2012143212A1 WO 2012143212 A1 WO2012143212 A1 WO 2012143212A1 EP 2012055419 W EP2012055419 W EP 2012055419W WO 2012143212 A1 WO2012143212 A1 WO 2012143212A1
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WO
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cell culture
cells
tobacco smoke
sensor
culture medium
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PCT/EP2012/055419
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Ulrich Bohrn
Maximilian Fleischer
Evamaria STÜTZ
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Siemens Aktiengesellschaft
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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G—PHYSICS
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    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/94—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving narcotics or drugs or pharmaceuticals, neurotransmitters or associated receptors

Definitions

  • the invention relates to a device and a method for the examination of tobacco smoke.
  • the irritant effect of tobacco smoke is examined.
  • Tobacco smoke contains many toxic substances, such as CO, ⁇ , HCHO, Cd, Cu, as well as carcinogenic substances, such as 3, 4-benzopyrene, tar and nicotine. Many measures ⁇ men be made to filter through suitable filter technology which said pollutants from the smoke. Aside from the harmful effects of some substances, tobacco smoke also contains irritating substances that are harmful to one's health
  • the object underlying the invention is to provide an improved method and an improved device by means of which the irritating properties of cigarette smoke on the human body through a system based on physiological modifier Derun ⁇ gene of living cells measured signal can be read.
  • This object is achieved by a measuring method having the features of claim 1.
  • Another solution consists in the measuring device with the features of claim 4.
  • the dependent claims relate to advantageous embodiments of the invention.
  • the cell culture is in a ahme Road On introduced ⁇ and the cells of the cell culture covered for producing an output state through a liquid cell culture medium. This step may take place near or far before an actual measurement or repeated.
  • the cell culture medium is we ⁇ ilias partially removed via a drain from the receiving device.
  • the cells are then applied in a measurement step with the tobacco smoke, wherein the tobacco smoke while substantially occurs un- dissolved in direct contact with at least part of cell h ⁇ len.
  • the cell culture medium is appropriately Wenig ⁇ least as far removed from the receiving means that a part of the cells is exposed to the gaseous environment and is no longer covered by the cell culture medium.
  • the measuring step physiological changes of the cells through the supply Beaufschla ⁇ be determined with the tobacco smoke with at least one sensor.
  • the Beaufschla ⁇ supply of the cell culture is carried out with the tobacco smoke at the same time to measure the physiological changes by the sensor.
  • the inventive device for examination of the stimulus ⁇ effect of tobacco smoke the following components: - at least one receiving unit for receiving a Zellkul structure with living cells, at least one sensor for measuring physiological changes of the cells by exposure to the tobacco smoke,
  • a tobacco smoke feeder for supplying the tobacco smoke to the cells of the cell culture
  • Control means which are designed for a measuring ⁇ step at least partially be removed from the receptacle, the cell culture medium via the outlet to introduce the Ta ⁇ bakrauch via the supply means into the receiving means and to bring thus for a definable period of time in direct contact with the cell culture and in the time period to make a measurement of the physiological modifier ⁇ requirements of the cells by the sensor, so that available during the direct contact between the tobacco smoke and cell h ⁇ len measured values for the response of the cells.
  • Tobacco smoke A continuous measurement of the change in the cell parameters (time resolution ⁇ 10 seconds) during and after the tobacco smoke exposure is feasible. So this allows a determination of the kinetic profile of the ef- Anlagenes the gas or gas mixture and thus provides beneficial ⁇ way an increased information content. It therefore requires no elaborate endpoint determinations or test methods that damage the cells in the detection of cell physiological change lasting.
  • Preferred measuring methods are impedance measurements for the characterization of the morphology as well as optical measuring methods such as fluorescence or chemiluminescence.
  • an actual real-time measurement is made possible for the first time, since further tests do not have to be carried out after the cells have been exposed to the gas to be investigated.
  • a measurement is made or continued even after the application of the gas.
  • a measurement is also carried out when the cells have returned to the cell culture medium. This may be advantageous, for example, if the oxygen consumption of the cells is permanently or temporarily changed by the loading with the gas or gas mixture. This in turn is preferably also measured when the cells are in the cell culture medium.
  • the sensors in turn preferably measure chemical or electrical parameters. It can also be used sensors for optical measurements. Preferred are the sensors in direct physical contact with the cells. For example, the cells can lie directly on the sensors.
  • the introduction of the tobacco smoke can take place before, at the same time or after the removal of the cell culture medium. As a result, the tobacco smoke acts more or less strongly on the cells. At the same time the physiological effects are recorded by means of the sensor or the sensors. Subsequently, the receiving means is suitably transition state ge ⁇ filled to restore the off ⁇ a flow with cell culture medium.
  • the senor forms at least part of the bottom of the receiving unit and a surface of the sensor serving for the measurement faces the cell culture.
  • the cells of the cell culture come to rest directly on the functional surface of the sensor. As a result, the coupling between sensor and cells is optimal.
  • the receiving device and the Sen ⁇ sensors or the sensor can be sterilized, ie, in a sufficient manner to heat, pressure and / or solvents are stable.
  • means are provided for adjusting a dilution of the tobacco smoke before or during the introduction into the receiving device. If the tobacco smoke diluted prior to exposure of the cells, so that an excessive reaction of the cells can be avoided and thus a better, because longer lasting ⁇ continuous signal can be achieved or even the survival of the cells are made possible.
  • a device for humidifying the tobacco smoke is preferably present. Particularly preferred is a device for controlling the temperature of at least a part of the device vorgese ⁇ hen.
  • the area around the receiving means at a substantially constant temperature can be maintained at ⁇ play.
  • the before ⁇ ferred temperature range is 5 ° C to 65 ° C, preferably 15 ° C to 45 ° C. The influence of the surrounding Tem ⁇ temperature is reduced to the measurement results. In addition, condensation can be avoided.
  • Figure 1 shows a cross section of an open device for
  • FIG. 2 shows a cross section of the same closed device
  • FIG 3 shows a cross section of a closed device for
  • Figure 5 tion the change in cell activity parameters Anklad-, respiration and impedance at 10 minutes Beaufschla ⁇ supply with inhaled cigarette smoke.
  • the exemplary embodiment illustrated in FIG. 1 comprises, as a receiving unit for cells, a culture vessel 1 with a number of components and an application device 15, which likewise comprises a number of further components.
  • the loading device 15 is arranged displaceable relative to the culture vessel 1 in the vertical direction.
  • the culture vessel 1 comprises a substrate 12 of a sensor chip.
  • On the substrate 12 of the sensor chip multiple planar (electro) are designed chemical and physical sensors 2, so that accommodated in this embodiment, on a chip area of 0.7088 cm 2 five proton activity sensors, five oxygen ⁇ sensors and an impedance sensor and connected to Be ⁇ drive circuits are ,
  • the sensor chip is mounted with ei ⁇ nem not shown lever on the contacts of the operation ⁇ circuit.
  • a cell culture 3 is formed in the culture vessel 1 on the physical sensors 2. Since at ⁇ form the sensors 2 the bottom of the culture vessel 1 so that the cells of the cell culture directly on the 3 sensors on ⁇ adhere.
  • the loading device 15 has a distribution piece 5, in the present embodiment, an inflow 8 and two outlets 9 are drilled. About the inflow 8 and the outflows 9, the cell culture 3 is covered in the culture vessel 1 with a cell culture medium 10, which serves as a nutrient solution, for example. Can form guide in other from several tributaries 8 and / or at least two drains 9 have occurred see ⁇ .
  • the cell culture medium 10 from ⁇ sucked via the two outlets 9 in order to free the surface of the cell culture by a 3 flues ⁇ stechniksGermanstand, for example with a pe- ristaltician pump.
  • the closed cell mono ⁇ location of the cell culture 3 is maintained.
  • tobacco smoke 11 enters the volume above the cell culture 3 and subsequently in direct contact with the same.
  • the tobacco smoke 11 can be introduced via the smoke inlet 6 on the one hand by tobacco consumption of a subject or by the smoke development of a smoke machine.
  • the tobacco smoke 8 can be filtered or introduced unfiltered into the device. The process of Raucheinlei ⁇ tion takes place in this embodiment for 10 minutes.
  • About the smoke outlet 7 of tobacco smoke 11 comes after it ⁇ Inventter charging of the cell culture 3 into the outside air.
  • the resulting state is shown in FIG.
  • the loading device 15 is pushed closer to theGoodge ⁇ vessel 1, so that on the one hand, a suction of the cell culture medium 10 through the outlets 9 is made possible and on the other hand, a gas-tight closure of the culture vessel 1 scratches ⁇ least made to the extent that the tobacco smoke 11 can be ⁇ flows.
  • the distance between the cell culture 3 and the distributor 5 of the original length of 1 to 5 cm, preferably 2 to 3 cm, is preferably significantly reduced.
  • the tobacco smoke 11 enters through the smoke inlet 6 a Kul ⁇ turgefäß 1 a. Opposite the smoke inlet 6 is a smoke outlet 7. Through this, the tobacco smoke 11 exits again. On the path between the smoke inlet 6 and the smoke ⁇ outlet 7 branches in the distribution piece 5, a connector 4 from.
  • the connecting piece 4 is connected to the housing of the culture vessel
  • the tobacco smoke 11 covers the cell culture 3.
  • the cell culture 3 reacts with physiological
  • the connecting piece 4 for example formed as a tube piece made ⁇ , preferably has a flexible, smooth, iner ⁇ tes, sterilizable and gas impermeable material and in particular special silicone, rubber, fluororubber, polyethylene or polyethylene terephthalate.
  • the distribution piece 5, in turn preferably has a solid, smooth, inert, sterilizable, ga ⁇ sun be easily uses and corrosion-resistant material, in particular stainless steel, glass or ceramic.
  • the distributor 5 is attached to the connector 4.
  • the cell culture medium 10 is at least one of From ⁇ 9 flows partially or completely from the culture vessel 1 ent ⁇ removed, and
  • the tobacco smoke 11 is introduced into the culture vessel 1 via at least one smoke inlet 6 and thus comes into direct contact with the cell culture 3,
  • the sensor 2 or the sensors 2 measure the changes in physiological parameters of the cell culture 3,
  • an evaluation unit detects the signals which the sensors 2 generate and evaluate on the basis of the changes
  • the culture vessel 1 is filled via the inflow 8 again with cell ⁇ culture medium 10.
  • FIG. 3 shows a further exemplary embodiment.
  • the distribution piece 5 and the Verbin ⁇ extension piece 4 are integrated with each other.
  • the connector 5 is then directly without, for example, a hose element the culture vessel 1 postponed.
  • the smoke inlet 6 and the smoke outlet 7 are integrated in a casing element 13, which is part of the distribution piece 5.
  • the sheathing lung 13 preferably comprises an inert, sterilizable, gasun- permeable and corrosion resistant material, insbesonde ⁇ re, silicone rubber, fluorine rubber, polyethylene, poly ethylene terephthalate, stainless steel, glass or ceramics.
  • FIG. 4 shows the values of sensor signals of one of the described devices versus time in a diagram. As shown in Figure 4 can be seen, it comes at a lasting 10 minutes exposure of a V79 Hamsterlun ⁇ genzellline covered with gepafftem cigarette smoke to a reduction of acidification 41 mung by about 40% and a decrease of the AT 42 by about 60% to control levels 43 a loading ⁇ aufschlagung synthetic humidified air one hour after completion of the Rauchbeetzschlagung.

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Abstract

Es wird ein Verfahren zur Untersuchung der Reizwirkung von Tabakrauch mittels einer Zellkultur mit lebenden Zellen angegeben, bei dem die Zellkultur in eine Aufnahmeeinrichtung eingebracht wird, die Zellen der Zellkultur zur Herstellung eines Ausgangszustands durch ein flüssiges Zellkulturmedium bedeckt werden, nachfolgend das Zellkulturmedium über einen Abfluss wenigstens teilweise aus der Aufnahmeeinrichtung entfernt wird, die Zellen in einem Messschritt mit dem Tabakrauch beaufschlagt werden, wobei der Tabakrauch dabei im Wesentlichen ungelöst in direkten Kontakt mit wenigstens einem Teil der Zellen tritt, während des Messschritts mit wenigstens einem Sensor physiologische Veränderungen der Zellen durch die Beaufschlagung mit dem Tabakrauch ermittelt werden, wobei die Beaufschlagung der Zellkultur mit dem Tabakrauch zeitgleich zur Messung der physiologischen Veränderungen durch den Sensor durchgeführt wird.

Description

Beschreibung
Verfahren und Vorrichtung zur Untersuchung von Tabakrauch Die Erfindung betrifft eine Vorrichtung sowie ein Verfahren zur Untersuchung von Tabakrauch. Dabei wird insbesondere die Reizwirkung des Tabakrauchs untersucht.
Tabakrauch enthält viele giftige Substanzen, beispielsweise CO, ΝΟχ , HCHO, Cd, Cu, sowie auch krebserregende Substanzen, beispielsweise 3 , 4-Benzpyren, Teer und Nikotin. Viele Maßnah¬ men werden unternommen, um durch geeignete Filtertechnologie die genannten Schadstoffe aus dem Rauch zu filtern. Abseits der gesundheitsgefährdenden Wirkung mancher Substanzen ent- hält der Tabakrauch auch reizende Substanzen, die für eine
Störung der sensorischen und geschmacklichen Wirkung sorgen. Durch Mischen ("blenden") der Tabaksorten wird seitens der Hersteller versucht, die reizende Wirkung zu begrenzen und den Geschmack zu verbessern. Es stellt sich in der Zigaret- tenproduktion die Frage, wie viel (teuerer) milder Import Ta¬ bak vorhandenen sehr scharfem Tabak beigemischt werden muss, um etwas gut rauchbares zu erhalten. Die Notwendigkeit der Erzeugung von Rauchwaren mit angenehmen Geschmack und geringer Reizung zeigt sich auch durch die Erzeugung von Tabak- Aromen, wie in DE 69805145 T2.
Untersuchungen des Zigarettenrauchs werden bereits jetzt un¬ ter anderem mit in vitro Zellkulturen gemacht. Dabei wird über automatische Zigaretten-Rauch-Geräte ("Rauchautomaten") der Tabakrauch über lebende Zellen geleitet.
In der DE 19 526 533 AI wird eine Expositionsvorrichtung be¬ schrieben, um mit gas- und/oder partikelförmigen Beimengungen angereicherte Gasgemische auf lebende Zellkulturen zu brin- gen, wobei das definiert angereicherte Gasgemisch über ein Zuleitungssystem direkt an mindestens einen Träger für die lebenden Zellkulturen führbar ist. Die Auswirkung des Gasge¬ misches kann jedoch nur aufgrund von zellbiologischen Assays (z.B.: LDH, MTT, NRU, Arnes, CCK8, Comet, CBMN etc. Putnam KP et al., Richter PA et al . , Roemer E et al . , Foy JWD et al . , Jianlin et al . ) untersucht werden. Die DE 19811735 AI beschreibt ein Verfahren zur Bestimmung des Einflusses einer Einwirkung auf ein respiratorisches Sys¬ tem, bei dem ein Präparat, umfassend ein respiratorisches System, so in eine Vorrichtung eingebracht wird, das ein ers¬ tes Fluid mit der apikalen Seite des Präparates und ein zwei- tes Fluid mit der basalen Seite des Präparates in Kontakt ge¬ bracht wird, das Präparat der Einwirkung ausgesetzt wird und das erste und/oder zweite Fluid einer Analyse unterzogen wird. Auch hierbei wird eine gleichzeitige Kontaktierung mit Nährmedium und Gasgemisch vorausgesetzt. Eine Untersuchung der Auswirkungen auf das respiratorische System kann nicht während der Gasbeaufschlagung sondern erst danach durch Un¬ tersuchung des Fluids erfolgen.
In der Publikation Pouli AE et al . (2003) Free Radical Biolo- gy & Medicine 34(3)345-355 wird eine Vorgehensweise beschrie¬ ben, um die zytotoxischen Effekte von leicht flüchtigen orga¬ nischen Verbindungen der Gas-Phase des Zigaretten-Rauchs auf Epithelzellen zu bestimmen. Dabei werden die Zellen der Zell¬ kultur nach Beaufschlagung mit Zigaretten-Rauch lysiert und für weitere Untersuchungen (LDH- und Wst-l-Tests) vorberei¬ tet .
All diesen Verfahren gemeinsam ist, dass zwar Sonden einge¬ setzt werden, die ein passables Äquivalent zum Menschen dar- stellen, dass jedoch die Auslesung des Effektes nachher zeit¬ raubend und aufwändig geschieht.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein verbessertes Verfahren und eine verbesserte Vorrichtung anzugeben, mittels derer die reizenden Eigenschaften von Zigarettenrauch auf den menschlichen Körper durch ein auf physiologischen Veränderun¬ gen von lebendigen Zellen beruhendes Messsignal abgelesen werden kann. Diese Aufgabe wird durch ein Messverfahren mit den Merkmalen von Anspruch 1 gelöst. Eine weitere Lösung besteht in der Messvorrichtung mit den Merkmalen von Anspruch 4. Die abhän- gigen Ansprüche betreffen vorteilhafte Ausgestaltungen der Erfindung .
Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren zur Messung eines Gases oder eines Gasgemischs mittels einer Zellkultur mit lebenden Zellen wird die Zellkultur in eine Auf ahmeeinrichtung einge¬ bracht und die Zellen der Zellkultur zur Herstellung eines Ausgangszustands durch ein flüssiges Zellkulturmedium bedeckt. Dieser Schritt kann zeitlich nahe oder fern vor einer eigentlichen Messung stattfinden oder auch wiederholt.
Nachfolgend wird das Zellkulturmedium über einen Abfluss we¬ nigstens teilweise aus der Aufnahmeeinrichtung entfernt. Die Zellen werden in einem Messschritt sodann mit dem Tabakrauch beaufschlagt, wobei der Tabakrauch dabei im Wesentlichen un- gelöst in direkten Kontakt mit wenigstens einem Teil der Zel¬ len tritt. Dazu wird zweckmäßig das Zellkulturmedium wenigs¬ tens soweit aus der Aufnahmeeinrichtung entfernt, dass ein Teil der Zellen der gasförmigen Umgebung ausgesetzt ist und nicht mehr vom Zellkulturmedium bedeckt ist.
Während des Messschritts werden mit wenigstens einem Sensor physiologische Veränderungen der Zellen durch die Beaufschla¬ gung mit dem Tabakrauch ermittelt. Dabei wird die Beaufschla¬ gung der Zellkultur mit dem Tabakrauch zeitgleich zur Messung der physiologischen Veränderungen durch den Sensor vorgenommen .
Die erfindungsgemäße Vorrichtung zur Untersuchung der Reiz¬ wirkung von Tabakrauch weist die folgenden Komponenten auf: - mindestens eine Aufnahmeeinheit zur Aufnahme einer Zellkul tur mit lebenden Zellen, mindestens einen Sensor zur Messung von physiologischen Veränderungen der Zellen durch die Beaufschlagung mit dem Tabakrauch,
eine Zuführungseinrichtung für Tabakrauch zur Zuführung des Tabakrauchs zu den Zellen der Zellkultur,
einen Zufluss zur Zuführung eines flüssigen Zellkulturmedi¬ ums zur Aufnahmeeinheit,
einen Abfluss zur Abführung des flüssigen Zellkulturmediums von der Aufnahmeeinheit ,
Steuerungsmittel, die ausgestaltet sind, für einen Mess¬ schritt das Zellkulturmedium über den Abfluss wenigstens teilweise aus der Aufnahmeeinrichtung zu entfernen, den Ta¬ bakrauch über die Zuführungseinrichtung in die Aufnahmeeinrichtung einzubringen und damit für einen festlegbaren Zeitraum in direkten Kontakt mit der Zellkultur zu bringen und in dem Zeitraum eine Messung der physiologischen Verän¬ derungen der Zellen durch den Sensor vorzunehmen, sodass während des direkten Kontakts zwischen Tabakrauch und Zel¬ len Messwerte für die Reaktion der Zellen zur Verfügung stehen .
Dadurch wird es verbessert ermöglicht, das Mischen der Ta¬ baksorten gezielter auf eine Verminderung der reizenden Wir¬ kung hin abzustimmen. Der Einsatz von lebenden Zellen erlaubt die Untersuchung der Auswirkungen des Tabakrauches hinsicht¬ lich ganzheitlicher Parameter wie etwa „Giftigkeit" oder „Reizbarkeit" ohne Bezugnahme auf bzw. notwendige Kenntnis der exakten chemischen Zusammensetzung. Die Auswirkung des Tabakrauches auf die lebenden Zellen kann ohne zusätzliche Markermoleküle (= „label-free" ) und ohne invasive Einwirkung (= „non-destructive" ) auf die Zellen ermittelt werden. Der Tabakrauch kann direkt, ohne eine, die Ergebnisse erheblich beeinflussende, Flüssigkeitsschicht, auf die zu untersuchende Zellkultur gelangen.
Die Untersuchung der Auswirkungen des Tabakrauches auf die lebenden Zellen erfolgt dabei in besonders vorteilhafter Wei¬ se sehr zeitnah bzw. zeitgleich zur Beaufschlagung mit dem c
Tabakrauches. Eine kontinuierliche Messung der Veränderung der Zellparameter (Zeitauflösung <10 Sekunden) während und nach der Tabakrauchbeaufschlagung ist realisierbar. Dies erlaubt also eine Ermittlung des kinetischen Verlaufs des Ef- fektes des Gases oder Gasgemischs und liefert daher vorteil¬ haft einen erhöhten Informationsgehalt. Es bedarf also keiner aufwendigen Endpunktbestimmungen oder Testmethoden, die die Zellen beim der Detektion der zellphysiologischen Veränderung nachhaltig schädigen. Bevorzugte Messmethoden sind dafür Im- pedanz-Messungen zur Charakterisierung der Morphologie sowie optische Messmethoden wie etwa Fluoreszenz oder Chemilumines- zenz . Somit wird erstmals eine tatsächliche real-time-Messung ermöglicht, da nicht nach der Beaufschlagung der Zellen mit dem zu untersuchenden Gas weitere Tests durchgeführt werden müssen. Die Auswirkungen des Tabakrauchs auf die gleiche
Zellpopulation können dabei mehrmals hintereinander getestet werden. Zur Untersuchung der Auswirkung des Tabakrauchs kann nach der Rauchbeaufschlagung weiterhin eines der bisher bekannten Analyseverfahren eingesetzt werden ohne Verlust der durch die erfindungsgemäß gewonnenen Untersuchungsergebnisse.
Dabei ist es auch möglich, dass zusätzlich zur Messung der physiologischen Veränderungen der Zellen während der Beaufschlagung mit dem Gas oder Gasgemisch eine Messung auch nach der Beaufschlagung mit dem Gas gemacht oder fortgesetzt wird. Mit anderen Worten wird also auch eine Messung durchgeführt, wenn die Zellen in das Zellkulturmedium zurückgekehrt sind. Dies kann beispielsweise vorteilhaft sein, wenn durch die Be¬ aufschlagung mit dem Gas oder Gasgemisch der Sauerstoffver- brauch der Zellen bleibend oder zeitweilig geändert ist. Das wiederum wird bevorzugt auch dann gemessen, wenn die Zellen im Zellkulturmedium sind.
Bevorzugt werden dabei als Zellen tierische, pflanzliche, In¬ sekten- oder menschliche Zellen, insbesondere V79, N2A, A594, HFBE oder HUVE, verwendet. Die Sensoren wiederum messen bevorzugt chemische oder elektrische Messgrößen. Es sind auch Sensoren für optische Messgrößen einsetzbar. Bevorzugt sind die Sensoren in direktem physischem Kontakt mit den Zellen. Beispielsweise können die Zellen direkt auf den Sensoren lie- gen . Das Einbringen des Tabakrauchs kann vor, zeitgleich oder nach dem Entfernen des Zellkulturmediums erfolgen. In der Folge wirkt der Tabakrauch mehr oder weniger stark auf die Zellen. Gleichzeitig werden die physiologischen Effekte, mittels des Sensors oder der Sensoren aufgenommen. Nachfolgend wird die Aufnahmeeinrichtung zweckmäßig zur Wiederherstellung des Aus¬ gangszustands über einen Zufluss mit Zellkulturmedium ge¬ füllt. Es ist auch möglich, die Zellen nach dem Messschritt auszutauschen . In einer bevorzugten Ausgestaltung der Erfindung bildet der Sensor wenigstens einen Teil des Bodens der Aufnahmeeinheit und eine der Messung dienende Oberfläche des Sensors ist der Zellkultur zugewandt. Mit anderen Worten kommen die Zellen der Zellkultur in der Ausgestaltung der Erfindung direkt auf der funktionalen Oberfläche des Sensors zu liegen. Dadurch ist die Kopplung zwischen Sensor und Zellen optimal.
Zweckmäßig ist es, wenn die Aufnahmeeinrichtung und die Sen¬ soren oder der Sensor sterilisierbar sind, d.h. in ausrei- chender Weise gegenüber Hitze, Druck und/oder Lösungsmitteln stabil sind.
In einer weiteren bevorzugten Ausgestaltung der Erfindung sind Mittel zur Einstellung einer Verdünnung des Tabakrauchs vor oder während der Einbringung in die Aufnahmeeinrichtung vorgesehen. Wird der Tabakrauch vor der Beaufschlagung der Zellen verdünnt, so kann damit eine zu starke Reaktion der Zellen vermieden werden und so ein besseres, weil länger an¬ dauerndes Signal erreicht werden oder überhaupt das Überleben der Zellen ermöglicht werden. Weiterhin ist bevorzugt eine Einrichtung zur Befeuchtung des Tabakrauchs vorhanden. Besonders bevorzugt ist eine Einrichtung zur Regelung der Temperatur von wenigstens einem Teil der Vorrichtung vorgese¬ hen. Damit kann vorteilhaft der Teil der Vorrichtung, bei¬ spielsweise der Bereich um die Aufnahmeeinrichtung auf einer weitgehend konstanten Temperatur gehalten werden. Der bevor¬ zugte Temperaturbereich ist dabei 5°C bis 65°C, vorzugsweise 15°C bis 45°C. Dadurch wird der Einfluss der umgebenden Tem¬ peratur auf die Messergebnisse reduziert. Zusätzlich kann Kondensation vermieden werden.
Bevorzugte, jedoch keinesfalls einschränkende Ausführungsbei¬ spiele für die Erfindung werden nunmehr anhand der Zeichnung näher erläutert. Dabei sind die Merkmale schematisiert darge¬ stellt und sich entsprechende Merkmale sind mit gleichen Be- zugszeichen markiert. Dabei zeigen im Einzelnen
Figur 1 einen Querschnitt einer geöffneten Vorrichtung zur
Untersuchung der Reizwirkung von Tabakrauch,
Figur 2 einen Querschnitt derselben geschlossenen Vorrich- tung,
Figur 3 einen Querschnitt einer geschlossenen Vorrichtung zur
Untersuchung der Reizwirkung von Tabakrauch mit einer Ummantelung,
Figur 4 die Veränderung der Zellaktivitätsparameter Ansäue- rung, Atmung und Impedanz bei 10 Minuten Beaufschla¬ gung mit gepafften Zigarettenrauch, und
Figur 5 die Veränderung der Zellaktivitätsparameter Ansäue- rung, Atmung und Impedanz bei 10 Minuten Beaufschla¬ gung mit inhaliertem Zigarettenrauch.
Das in Fig. 1 dargestellte Ausführungsbeispiel umfasst als Aufnahmeeinheit für Zellen ein Kulturgefäß 1 mit einer Reihe von Komponenten sowie eine Beaufschlagungsvorrichtung 15, die ebenfalls eine Reihe weiterer Komponenten umfasst. Dabei ist die Beaufschlagungsvorrichtung 15 gegenüber dem Kulturgefäß 1 in vertikaler Richtung verschiebbar angeordnet. Das Kulturgefäß 1 umfasst ein Substrat 12 eines Sensorchips. Auf dem Substrat 12 des Sensorchips sind mehrere planare (elektro) chemische und physikalische Sensoren 2 ausgebildet, sodass in diesem Ausführungsbeispiel auf einer Chipfläche von 0,7088 cm2 fünf Protonenaktivitätssensoren, fünf Sauerstoff¬ sensoren und ein Impedanzsensor untergebracht und mit Be¬ triebsschaltungen verbunden sind. Der Sensorchip wird mit ei¬ nem nicht dargestellten Hebel auf den Kontakten der Betriebs¬ schaltung befestigt. Weiterhin ist im Kulturgefäß 1 auf den physikalischen Sensoren 2 eine Zellkultur 3 ausgebildet. Da¬ bei bilden die Sensoren 2 den Boden des Kulturgefäßes 1, so dass die Zellen der Zellkultur 3 direkt auf den Sensoren an¬ haften . Die Beaufschlagungsvorrichtung 15 weist ein Verteilstück 5 auf, in das im vorliegenden Ausführungsbeispiel ein Zufluss 8 und zwei Abflüsse 9 gebohrt sind. Über den Zufluss 8 und die Abflüsse 9 wird die Zellkultur 3 im Kulturgefäß 1 mit einem Zellkulturmedium 10 überschichtet, das beispielsweise als Nährlösung dient. In anderen Aus führungs formen können auch mehrere Zuflüsse 8 und/oder wenigstens zwei Abflüsse 9 vorge¬ sehen sein. Der Ausgangszustand, bei dem das Zellkulturmedium
10 die Zellen der Zellkultur 3 bedeckt, ist in Fig. 1 darge¬ stellt.
Vor einer Beaufschlagung der Zellkultur 3 mit dem Tabakrauch
11 wird über die zwei Abflüsse 9 das Zellkulturmedium 10 ab¬ gesaugt, um die Oberfläche der Zellkultur 3 von einem Flüs¬ sigkeitsüberstand zu befreien, beispielsweise mit einer pe- ristaltischen Pumpe. Dabei bleibt die geschlossene Zellmono¬ lage der Zellkultur 3 erhalten. Über den Raucheinlass 6, das Verteilstück 5 und das mit dem Kulturgefäß 1 verbundenem Ver¬ bindungsstück 4 gelangt Tabakrauch 11 in das Volumen oberhalb der Zellkultur 3 und in weiterer Folge in direkten Kontakt mit eben jener. Der Tabakrauch 11 kann über den Raucheinlass 6 einerseits durch Tabakkonsum eines Probanden oder aber durch die Rauchentwicklung eines Rauchautomaten eingebracht werden . Der Tabakrauch 8 kann dabei gefiltert oder ungefiltert in die Vorrichtung eingeleitet werden. Der Vorgang der Raucheinlei¬ tung erfolgt in diesem Ausführungsbeispiel für 10 Minuten. Über den Rauchauslass 7 gelangt der Tabakrauch 11 nach er¬ folgter Beaufschlagung der Zellkultur 3 in die Außenluft.
Hiernach ist das Verbindungsstück 4 vom Kulturgefäß 1 zu lö¬ sen und erneut Nährmedium auf die Zellkultur 3 zu applizie¬ ren. Dieser Vorgang ist unter Beibehaltung der Vitalität der Zellkultur 3 beliebig oft zu wiederholen.
Der sich ergebende Zustand ist in Figur 2 dargestellt. Dabei ist die Beaufschlagungsvorrichtung 15 enger auf das Kulturge¬ fäß 1 aufgeschoben, so dass zum einen ein Absaugen des Zell- kulturmediums 10 über die Abflüsse 9 ermöglicht ist und zum anderen ein gasdichter Abschluss des Kulturgefäßes 1 wenigs¬ tens insoweit hergestellt ist, dass der Tabakrauch 11 einge¬ strömt werden kann. Dazu wird bevorzugt der Abstand zwischen der Zellkultur 3 und dem Verteilstück 5 von der ursprüngli- chen Länge von 1 bis 5 cm, vorzugsweise 2 bis 3 cm, deutlich reduziert .
Der Tabakrauch 11 tritt durch den Raucheinlass 6 ein das Kul¬ turgefäß 1 ein. Dem Raucheinlass 6 gegenüber liegt ein Rauch- auslass 7. Durch diesen tritt der Tabakrauch 11 wieder aus. Auf dem Wegstück zwischen dem Raucheinlass 6 und dem Rauch¬ auslass 7 zweigt im Verteilstück 5 ein Verbindungsstück 4 ab. Das Verbindungsstück 4 ist mit dem Gehäuse des Kulturgef ßes
1 gasdicht verschlossen. Der Tabakrauch 11 überschichtet die Zellkultur 3. Die Zellkultur 3 reagiert mit physiologischen
Veränderungen auf den direkten Kontakt mit dem Tabakrauch 11. Diese physiologischen Veränderungen werden durch die Sensoren
2 detektiert und über eine Betriebsschaltung an eine Auswer¬ teeinheit 21 weitergeleitet.
Das Verbindungsstück 4, beispielsweise als Schlauchstück aus¬ gebildet, weist dabei bevorzugt ein flexibles, glattes, iner¬ tes, sterilisierbares und gasundurchlässiges Material, insbe- sondere Silikon, Kautschuk, Fluorkautschuk, Polyethylen oder Polyethylenterephtalat auf. Das Verteilstück 5 wiederum weist bevorzugt ein festes, glattes, inertes, sterilisierbares, ga¬ sundurchlässiges und korrosionsbeständiges Material, insbe- sondere Edelstahl, Glas oder Keramik auf. Das Verteilstück 5 ist auf das Verbindungsstück 4 aufgesteckt.
Eine Messung läuft also in diesem Beispiel nach dem folgenden Schema ab:
- das Zellkulturmedium 10 wird über zumindest einen der Ab¬ flüsse 9 teilweise oder komplett aus dem Kulturgefäß 1 ent¬ fernt, und
- der Tabakrauch 11 wird über zumindest einen Raucheinlass 6 in das Kulturgefäß 1 eingebracht und gelangt somit in di- rekten Kontakt mit der Zellkultur 3,
- der Sensor 2 oder die Sensoren 2 messen die Veränderungen physiologischer Parameter der Zellkultur 3,
- eine Auswerteelektronik erfasst die Signale, die die Senso¬ ren 2 aufgrund der Änderungen erzeugen und wertet diese aus, und
- das Kulturgefäß 1 wird über den Zufluss 8 wieder mit Zell¬ kulturmedium 10 gefüllt.
In der Folge kann die Messung wiederholt werden, beispiels- weise als regelmäßiger Messzyklus. Dabei findet dann ein re¬ gelmäßiger Austausch von Zellkulturmedium 10 und dem Tabakrauch 11 statt. Die Dauer eines Messzyklus kann dabei in wei¬ ten Bereichen variiert werden. Werden mehrere Sensoren 2 verwendet, so sind dies bevorzugt solche Sensoren, die sich gegenseitig praktisch nicht che¬ misch und physikalisch beeinflussen, um möglichst aussage¬ kräftige und unabhängige Signale zu bekommen. Figur 3 zeigt ein weiteres Ausführungsbeispiel. Bei diesem Ausführungsbeispiel sind das Verteilstück 5 und das Verbin¬ dungsstück 4 ineinander integriert. Das Verbindungsstück 5 wird dann ohne beispielsweise ein Schlauchelement direkt auf das Kulturgefäß 1 aufgeschoben. In diesem Fall ist der Rauch- einlass 6 und der Rauchauslass 7 in einem Ummantelungselement 13 integriert, das Teil des Verteilstücks 5 ist. Die Ummante- lung 13 weist bevorzugt ein inertes, sterilisierbares, gasun- durchlässiges und korrosionsbeständiges Material, insbesonde¬ re, Silikon, Kautschuk, Fluorkautschuk, Polyethylen, Poly- ethylenterephtalat , Edelstahl, Glas oder Keramik auf.
In Figur 4 sind die Werte von Sensorsignalen einer der be- schriebenen Vorrichtungen gegen die Zeit in einem Diagramm dargestellt. Wie in Figur 4 ersichtlich, kommt es bei einer 10 Minuten andauernden Beaufschlagung einer V79-Hamsterlun¬ genzelllinie mit gepafftem Zigarettenrauch zu einer Abnahme der Ansäuerung 41 um etwa 40 % und zu einer Abnahme der At- mung 42 um etwa 60 % bezogen auf Kontrollwerte 43 einer Be¬ aufschlagung mit synthetischer befeuchteter Luft eine Stunde nach Beendigung der Rauchbeaufschlagung.
Wie in Figur 5 ersichtlich, kommt es bei einer 10 Minuten an- dauernden Beaufschlagung der V79-Hamsterlungenzelllinie mit inhaliertem Zigarettenrauch zu einer Abnahme der Ansäuerung 51 um etwa 30 % und zu einer Abnahme der Atmung 52 um etwa 40 % bezogen auf Kontrollwerte 53 einer Beaufschlagung mit synthetischer befeuchteter Luft eine Stunde nach Beendigung der Rauchbeaufschlagung.

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zur Untersuchung der Reizwirkung von Tabakrauch mittels einer Zellkultur (3) mit lebenden Zellen, bei dem - die Zellkultur (3) in eine Aufnahmeeinrichtung (1) eingebracht wird,
- die Zellen der Zellkultur (3) zur Herstellung eines Aus¬ gangszustands durch ein flüssiges Zellkulturmedium (10) bedeckt werden,
- nachfolgend das Zellkulturmedium (10) über einen Abfluss (9) wenigstens teilweise aus der Aufnahmeeinrichtung (1) entfernt wird,
- die Zellen in einem Messschritt mit dem Tabakrauch beauf¬ schlagt werden, wobei der Tabakrauch dabei im Wesentlichen ungelöst in direkten Kontakt mit wenigstens einem Teil der Zellen tritt,
- während des Messschritts mit wenigstens einem Sensor (2) physiologische Veränderungen der Zellen durch die Beauf¬ schlagung mit dem Tabakrauch ermittelt werden,
dadurch gekennzeichnet, dass die Beaufschlagung der Zellkultur (3) mit dem Tabakrauch zeitgleich zur Messung der physiologischen Veränderungen durch den Sensor (2) durchgeführt wird .
2. Verfahren gemäß Anspruch 1, bei dem als Zellen tierische, pflanzliche, Insekten- oder menschliche Zellen, insbesondere V79, N2A, A594, HFBE oder HUVE, verwendet werden.
3. Verfahren gemäß Anspruch 2, bei dem eine Messung der phy- siologischen Veränderungen durch den Sensor (2) auch durchgeführt wird, wenn die Zellen der Zellkultur (3) durch das Zellkulturmedium (10) bedeckt sind.
4. Vorrichtung zur Untersuchung der Reizwirkung von Tabak- rauch, aufweisend:
- mindestens eine Aufnahmeeinheit (1) zur Aufnahme einer
Zellkultur (3) mit lebenden Zellen, - mindestens einen Sensor (2) zur Messung von physiologischen Veränderungen der Zellen durch die Beaufschlagung mit dem Tabakrauch,
- einen Zuführungseinrichtung (6) für Tabakrauch zur Zufüh- rung des Tabakrauchs zu den Zellen der Zellkultur (3),
- einen Zufluss zur Zuführung eines flüssigen Zellkulturmedi¬ ums (10) zur Aufnahmeeinheit (1),
- einen Abfluss zur Abführung des flüssigen Zellkulturmediums (10) von der Aufnahmeeinheit (1),
- Steuerungsmitteln, die ausgestaltet sind, für einen Mess¬ schritt das Zellkulturmedium (10) über den Abfluss (9) we¬ nigstens teilweise aus der Aufnahmeeinrichtung (1) zu ent¬ fernen, den Tabakrauch über die Zuführungseinrichtung in die Aufnahmeeinrichtung (1) einzubringen und damit für ei- nen festlegbaren Zeitraum in direkten Kontakt mit der Zell¬ kultur (3) zu bringen und in dem Zeitraum eine Messung der physiologischen Veränderungen der Zellen durch den Sensor (2) vorzunehmen, sodass während des direkten Kontakts zwi¬ schen Tabakrauch und Zellen Messwerte für die Reaktion der Zellen zur Verfügung stehen.
5. Vorrichtung gemäß Anspruch 4, bei der der Sensor (2) we¬ nigstens einen Teil des Bodens der Aufnahmeeinheit (1) bildet und eine der Messung dienende Oberfläche des Sensors (2) der Zellkultur (3) zugewandt ist.
6. Vorrichtung gemäß Anspruch 4 oder 5 mit Mitteln zur Ein¬ stellung einer Verdünnung des Tabakrauchs vor oder während der Einbringung in die Aufnahmeeinrichtung (1) .
7. Vorrichtung gemäß einem der Ansprüche 5 bis 6 mit einer Einrichtung zur Befeuchtung des Tabakrauchs vor oder während der Einbringung in die Aufnahmeeinrichtung (1) .
8. Vorrichtung gemäß einem der Ansprüche 5 bis 7 mit einer
Einrichtung zur Regelung der Temperatur von wenigstens einem Teil der Vorrichtung.
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