DE19811735C2 - Verfahren zur Bestimmung des Einflusses einer Einwirkung auf ein respiratorisches System - Google Patents

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung des Einflusses einer Ein­ wirkung auf ein respiratorisches System, ein Verfahren zur Bestimmung von Faktoren, die die Folgen einer Einwirkung auf ein respiratorische System an ein biologisches System vermitt­ len, und die Verwendung einer Kammer in den Verfahren.

Eine für die Entwicklung von landlebenden Wirbeltieren wesentliche Voraussetzung war das Vorhandensein eines Atmungsapparates, der erlaubt, daß Sauerstoff aus der Außenwelt in den Körper zur Erhaltung der aeroben zellulären Stoffwechselvorgänge aufgenommen und Koh­ lendioxid als Produkt der inneren Zellatmung an die Luft abgegeben wird.

Hierzu ist das Atmungssystem strukturell und funktionell gegliedert und umfaßt zum einen ein luftleitendes System für den Transport der ein- und ausgeatmeten Gasgemische und ein respiratorisches System für den passiven Austausch des Gasgemisches zwischen dem Blut und der Luft.

Anatomische und histologische Untersuchungen haben ergeben, daß das luftleitende System im wesentlichen von einem respiratorischen Epithel ausgekleidet wird, das einem fibroelasti­ schen Bindegewebe mit meist seromukösen Drüsen aufliegt. Zusätzlich sind ausgeprägte Ge­ fäßnetze und stellenweise glatte Muskulatur entwickelt. An der Außenseite des luftleitenden Systems finden sich vorrangig hyaline Knorpelspangen oder -ringe.

Das respiratorische Epithel kleidet im wesentlichen die Atemwege von der Nasenhöhle bis zu den Endbronchiolen aus. Es wird von einem einschichtigen, mehrreihigen, hochprismatischen Epithel gebildet, das die folgenden Zelltypen einschließt: Epithelzellen (Flimmerzellen), Be­ cherzellen, Bürstenzellen, Basalzellen und APUD-Zellen (Amine and Precusor Uptake and Decarboxylation).

Der größte Teil der Epithelzellen trägt an seiner freien Oberfläche Kinozilien, die durch ihren synchronen Wimpernschlag mit der Luft eingedrungene Fremdstoffe oder körpereigene Parti­ kel in Richtung Pharynx transportieren (Flimmerzellen). Um diese "Selbstreinigung" der luft­ führenden Atemwege zu unterstützen, wird die Haftung der Teilchen an der Oberfläche der Zilien durch Schleim erhöht. Hierfür sind zusätzlich in hoher Zahl schleimproduzierende Be­ cherzellen intraepithelial lokalisiert. Diese treten bevorzugt in den oberen Luftwegen auf, um nicht in der Lunge eine "Verschleimung" zu induzieren. Zusätzlich tragen sie zusammen mit den subepithelialen gemischten Drüsen dazu bei, die ventilierte Atemluft zu befeuchten. Ne­ ben diesen beiden Zellpopulationen treten Epithelzellen mit Mikrovilli (Bürstenzellen) auf, die als Ersatzzellen für kinozilientragende Zellen und für Becherzellen angesehen werden. Das Epithel schließt basal außerdem Reservezellen (Basalzellen) ein, die durch Teilung zur Transformation in andere Zellen befähigt sind.

In der Lamina epithelialis sind von besonderer Bedeutung die neuroendokrinen K-Zellen (Kultschitzky-Zellen) und die APUD-Zellen, die besonders bei jungen Tieren ausgeprägt sind und mit Nervenendigungen im Kontakt stehen und biogene Amine produzieren. Der Lamina epithelialis schließt sich die Lamina propria an. In diesen Gewebeschichten und in der Tela submucosa liegen tubuloazinöse Einzeldrüsen (Trachealdrüsen). Die Epithelzellen der Aus­ führungsgänge produzieren bevorzugt ein muköses, an sauren Glykoproteinen reiches Sekret, während die azinösen Endstücke ein seröses, neutrales Glykoprotein abgeben. Die Drüsen schieben sich oftmals zwischen die Knorpelspangen und können bis in die Tunica adventitia vordringen. Die Ausführungsgänge weisen ein isoprismatisches Epithel auf und werden außen von glatten Muskelzellen umgeben.

Das luftleitende System beginnt im wesentlichen mit der Trachea, die sich nach Aufteilung in die beiden Hauptbronchien immer mehr aufzweigt und verästelt, um letztlich in die kleineren Bronchien (Bronchioli veri) überzugehen, die sich ihrerseits mehrfach in Endbronchiolen tei­ len und das Ende des luftleitenden Systems des Atmungsapprates darstellen, an den sich der respiratorische Teil anschließt.

Der respiratorische Teil beginnt mit dem ersten Auftreten von kleinen, sackförmigen Ausstül­ pungen (Alveolen) in der Wand der Bronchioli. Durch mehrfache Aufzweigungen entstehen enge, luftführende Gänge, deren Wände vollständig mit Alveolen besetzt sind, die schließlich wiederum in die Sacculi alveolares übergehen, in denen der Gasaustausch stattfindet.

Hinsichtlich ihrer Struktur entsprechen die Bronchien im wesentlichen der Trachea. Auch hier findet sich ein mit Becherzellen ausgestattetes respiratorisches Flimmerepithel. Die in den Bronchien auftretende Flüssigkeit setzt sich aus Schleim, proteinhaltigen Serumbestandteilen, Immunglobulin A, Laktoferrin und Glykoproteinen zusammen.

Gleiches gilt auch für die Bronchioli, in deren Epithel auch hochprismatische Zellen ohne Zilien ("Clara"-Zellen) auftreten. Diese Zellen sezernieren proteolytische und muzinlösende Enzyme zur Verflüssigung des Bronchialschleims.

Neben diesen strukturellen Komponenten weist das Alveolargewebe und die Bronchial­ schleimhaut auch eine weitere, funktionell definierte Komponente auf, nämlich das Bronchus­ assoziierte Immunsystem (BALT). Das BALT schützt als Teil des sekundären (peripheren) lymphatischen Gewebes den Organismus vor Antigenen, die über die Atemluft auf die Schleimhaut des Respirationstraktes gelangen. Morphologische Merkmale des BALT sind ein von Lymphozyten durchsetztes Epithel und in der Submucosa und Lamina propria gelegene Lymphozytenaggregate. Die Aktivität des BALT wird vom autonomen Nervensystem beein­ flußt.

Die Innervation des Bronchialtraktes erfolgt auf vielfältige Weise. Zum einen tritt ein adre­ nerges System sowie ein cholinerges System auf, zum anderen ein nicht-adrenerges, nicht- cholinerges System (NANC), das sich Neuropeptide als Transmitter bedient. Bisher sind die folgenden Substanzen als Transmitter des NANC bekannt: Vasoaktives intestinales Polypep­ tid (VIP), Substanz P (SP), Neurokinin A (NKA), Neurokinin B (NKB), Neuropeptid K (NPK) und Calcitonin gene related peptide (CGRP).

Das Atemsystem ist neben seiner Bedeutung für den Gasaustausch auch unter dem Aspekt von Bedeutung, daß es neben der Haut dasjenige Organ ist, das mit der Umwelt am engsten unmittelbar in Kontakt tritt. Infolgedessen ist das Atmungssystem auch dasjenige Organ, das einer Vielzahl von durch die Umwelt an den Organismus herangetragenen Einwirkungen aus­ gesetzt ist und diese (Umwelt-)Reize an den Gesamtorganismus weitergibt. Die Art der Ein­ wirkungen ist dabei von sehr verschiedener Qualität, nicht zuletzt gestaltet oder zumindest beeinflußt vom Menschen selbst. Beispielhaft sei hier auf das Rauchen verwiesen.

Die eingangs geschilderte Komplexität des Atmungssystems macht eine Analyse der Vorgän­ ge, die im Atmungssystem unter den verschiedenen Einwirkungen ablaufen, sehr schwierig. Gleichwohl ist ein Verständnis dieser Abläufe erforderlich, um die Einwirkung bspw. von in der Atemluft enthaltenen Chemikalien auf den Organismus, insbesondere den menschlichen Organismus, zu verstehen und gegebenenfalls Gegenmaßnahmen zu entwickeln. Dieser Aspekt ist bspw. im Bereich der Arbeitsmedizin von großer Bedeutung, wenn in der Arbeit­ sumgebung vorhandene Chemikalien hinsichtlich ihres Gefährdungspotentials für den Men­ schen eingestuft werden sollen. Aber auch in der Pharmazeutik sind derartige Fragestellungen von Bedeutung, da somit die besonders effektive Verabreichung von Träger- und Wirkstoffen über die Atemwege untersucht und optimiert werden kann.

Im Stand der Technik sind im wesentlichen zwei Verfahrensweisen bekannt, um den Einfluß einer Einwirkung, wie bspw. einer chemischen Verbindung, auf das respiratorische System zu untersuchen. Dies ist zum einen die in vivo-Untersuchung an einem geeigneten Tiermodell und zum anderen die in vitro-Untersuchung, typischerweise an Zellkulturen.

Die Verwendung von Tiermodellen ist aus vielerlei Gründen nicht erstrebenswert. Zum einen bestehen ethische Bedenken und zum anderen sind Tiermodelle auch mit einer Vielzahl von technischen Problemen und Einschränkungen verbunden. Darüberhinaus ist eine wesentliche Voraussetzung das Vorhandensein eines geeigneten Tiermodells, das die Übertragung der erhaltenen Daten auf den Menschen erlaubt. Tiermodelle stellen jedoch auch ein komplexes System dar und die Untersuchungsmöglichkeiten liefern in Regel nur eine systemische An­ wort auf die applizierte Einwirkung und keine Aussagen über die grundlegenden molekularen und zellulären Vorgänge sowie deren Wechselwirkungen, an denen letztendlich neue Strate­ gien oder Maßnahmen ansetzen müßten, um zu einer kausal orientierten Vorgehensweise zu gelangen.

Die Verwendung von aus Zellen des Atmungsapparates hergestellten Zellkulturen ermöglicht im Unterschied zum Tiermodell zwar das Aufzeigen der molekularen Vorgänge an einzelnen, ein respiratorisches System aufbauenden Zellen unter dem Einfluß einer Einwirkung, wie eines chemischen Reizes, erlaubt jedoch nicht das Aufzeigen und die Analyse der bedingt durch die Vielzahl der im respiratorischen System vorhandenen Zelltypen vielfältigen Inter­ aktionen zwischen den Zelltypen und der daraus resultierenden prä-systemischen Reaktion.

Samuelsen, G. S. et al. in Environ. Sci. Technol. (1978) Bd. 12, Nr. 4, S. 426-430 beschreiben ein Verfahren, bei dem Säugerzellen Verbindungen, wie sie typisch für Luftverschmutzung sind, bspw. NO₂, ausgesetzt werden. Hierzu werden die Zellen auf Membranfiltern angezogen und die Zellen über die Filterunterseite mit Medium versorgt.

Cheek, J. M. et al. in Toxicol. Appl. Pharmacol. (1994), Bd. 125, Nr. 1, S. 59-69 beschreiben die Charakterisierung eins in-vitro-Modells für die Bestimmung der Toxizität von oxidierend wirkendem Gas. Dabei werden primäre Zellkulturen von alveolaren Zellen vom Typ II, die in serumfreien Medium gehalten werden, verwendet.

Avenet et al. beschreiben in J. Phyiol. 1985, Bd. 363, S. 377-401 eine aus zwei symmetri­ schen Kammern bestehende Vorrichtung, in der die Ionenpermeabilität der Kiemenepidermis von Flußkrebsen untersucht wurde.

Ussing et al. beschreiben in Acta Physiologica Scandinavica, 1951, Bd. 23, S. 110-127 den aktiven Natriumtransport als Ursache für elektrischen Strom bei isolierter Froschhaut und verwenden hierzu eine Kammer bestehend aus zwei Kammerteilen, die durch das einge­ brachte Präparat getrennt werden.

Der vorliegenden Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde ein Verfahren zur Bestimmung des Einlusses einer Einwirkung auf ein respiratorische System bereitzustellen, das eine über die das molekulare Geschehen hinausgehende Darstellung und Bestimmung der Abläufe erlaubt. Dabei sollen die mit der Verwendung von Tiermodellen verbundenen Schwierigkeiten und Nachteile vermieden werden.

Es ist somit eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur Bestimmung des Einflusses einer Einwirkung auf ein respiratorisches System zur Verfügung zu stellen, das die bekannten Nachteile von Zellkulturen und Tiermodellen vermeidet.

Weiterhin ist es Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur Bestimmung von Faktoren, die die Folgen einer Einwirkung auf ein respiratorische System an ein biologisches System vermitteln, zur Verfügung zu stellen, das die Verwendung von Tiermodellen nicht erforderlich macht.

Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist eine neue Verwendung einer zweiteilba­ ren Kammer vorzusehen, wobei die Kammer durch ein in diese eingebrachtes Präparat in ei­ nen ersten Kammerteil und einen zweiten Kammerteil unterteilt wird und das in dem jeweili­ gen Kammerteil enthaltene Fluid getrennt ist von dem Fluid des anderen Kammerteils.

Erfindungsgemäß wird die Aufgabe gelöst durch ein Verfahren zur Bestimmung des Einflus­ ses einer Einwirkung auf ein respiratorisches System gemäß Anspruch 1.

Weiterhin wird die Aufgabe gelöst durch ein Verfahren zur Bestimmung von Faktoren, die die Folgen einer Einwirkung auf ein respiratorisches System an ein biologisches System ver­ mitteln gemäß Anspruch 9.

Schließlich wird die Aufgabe auch gelöst durch die Verwendung einer Vorrichtung in den erfindungsgemäßen Verfahren, die zumindest eine zweiteilbare Kammer aufweist, wobei durch das in die Kammer eingebrachte Präparat die Kammer in einem ersten Kammerteil und einen zweiten Kammerteil unterteilt wird und das in dem jeweiligen Kammerteil enthaltene Fluid getrennt ist von dem Fluid des anderen Kammerteils.

Weitere Ausführungsformen ergeben sich aus den verschiedenen Unteransprüchen.

Den erfindungsgemäßen Verfahren liegt die überraschende Erkenntnis zugrunde, daß der Einfluß einer Einwirkung auf ein respiratori­ sches System über den Rahmen von mittels Zellkulturen möglichen Einsichten bestimmbar ist, indem ein Präparat, das ein respira­ torisches System umfaßt, so in eine Vorrichtung eingebracht wird, daß ein erstes Fluid mit der apikalen Seite des Präparates und ein zweites Fluid mit der basalen Seite des Präparates in Kontakt ge­ bracht wird. Diese spezielle Anordnung erlaubt, daß die in vivo vorliegenden Bedingungen auch für ein in vitro- Verfahren vor­ liegen. Dies ist mit Blick auf den vektoriellen Aufbau des respi­ ratorischen Systems, wie er in der Einleitung beschrieben wurde und die hierin vollumfänglich aufgenommen wird, von großer Bedeu­ tung. Lediglich unter diesen Bedingungen ist es zum einen möglich, die komplexen Interaktionen der verschiedenen Zelltypen zu unter­ suchen und gleichzeitig zu erkennen, ob die infolge der Einwirkung zu beobachtenden Effekte, bspw. abgesonderte chemische Verbindun­ gen, apikal oder basal orientiert sind, was Rückschlüsse auf die systemische Verfügbarkeit und Auswirkungen dieser Effekte bzw. Faktoren zuläßt. Dies zu leisten sind Zellkultursysteme nicht in der Lage.

Zum anderen sind damit Verhältnisse realisiert, wie sie ansonsten in ihrer Komplexität nur beim Tiermodell vorliegen, das jedoch einen noch höheren Integrations- und damit Komplexitätsgrad auf­ weist, was die Beobachtung der durch die Einwirkung bedingten Ef­ fekte erschwert, was darin begründet liegen kann, daß die eigent­ lich kausalen Vorgänge im Gesamtsystem Tier maskiert werden. Ein derartiges Maskieren kann zum einen daraus resultieren, daß die Antworten des biologischen Systems auf die Einwirkung auf das res­ piratorische System im biologischen System, d. h. typischerweise im Tier, infolge der Konzentrationsverhältnisse nicht mehr zu erken­ nen sind, durch andere Reaktionen des Tieres auf weitere, eben­ falls vorhandene Einwirkungen oder Reize überlagert werden, oder die Antwort sich in einem vom eigentlichen Erfolgsort entfernten Kompartiment, bspw. im Blut, widerspiegelt und somit keinen Auf­ schluß über den Wirkmechanismus erlaubt. Darüber hinaus ist bei der Verwendung von Tiermodellen in der Regel unter physiologischen Bedingungen nur eine systemische Reaktion zu bestimmen.

Aus den genannten Gründen ist es somit durch Verwendung der erfin­ dungsgemäßen Verfahren auch möglich, die Faktoren zu ermitteln, die den Einfluß und damit die Wirkung der Einwirkung auf das res­ piratorische System an das Gesamtsystem vermitteln. Derartige Ver­ bindungen können zum Beispiel sein niedermolekulare und hoch­ molekulare Verbindungen, Kohlenhydrate und deren Polymere, Fett­ säuren und Fette, Aminosäuren, Peptide und Proteine, sowie Deri­ vate derselben, aber auch Gase. Die besagten Faktoren können, funktionell betrachtet solche sein, die unmittelbar am Ort ihrer Sekretion ihre Wirkung entfalten, können jedoch auch im Sinne von Hormonen ihren Wirkort an einem von ihrer Entstehung verschiedenen Ort haben. Desweiteren können die Faktoren auf die sie produzier­ enden Zellen und Zelltypen ebenso wirken wie auf davon verschie­ dene Zellen und Zelltypen. Die Faktoren schließen somit, u. a., Neurotransmitter und Neuropeptide ebenso ein wie das Lymphsystem und die Immunantwort modulierende Verbindungen.

Damit steht erstmals ein Verfahren zur Verfügung, mit dem funkti­ onell das Zusammenwirken der verschiedenen, das respiratorische System ausbildenden Zelltypen, einschließlich des sekundären Lymphsystems, unter physiologischen Bedingungen, einschließlich zugrundeliegender Reaktionskaskaden und Regelkreise, dargestellt und bestimmt werden kann, was bei den in der Technik verwendeten anatomischen und histologischen Ansätzen nicht möglich war.

Aus dem vorstehend Gesagten ergeben sich zahlreiche mögliche Ver­ wendungen der erfindungsgemäßen Verfahren.

Grundsätzlich werden die erfindungsgemäßen Verfahren auf dem Ge­ biet der Pulmonologie verwendet werden. Die entsprechenden Verwen­ dungen ergeben sich den Fachleuten auf diesem Gebiet aufgrund ih­ res Fachwissens.

Im besonderen sei hierin jedoch auf folgende zwei Verwendungen hingewiesen: Arbeitsmedizinische Bewertung/Klassifizierung von chemischen Verbindungen und Medikamententestung, insbesondere unter dem Aspekt der Pharmakologie und Toxikologie.

Im Bereich der Arbeitsmedizin ist es erforderlich, daß Chemikalien hinsichtlich ihres Gefährdungspotentiales bewertet bzw. klassifi­ ziert werden. Zu diesem Zweck kann das erfindungsgemäße Verfahren angewandt werden. Insoweit ist dieses bedeutsam auch unter dem Aspekt der Feststellung von - anerkannten oder potentiellen - Be­ rufskrankheiten bei Exposition von Organismen, insbesondere dem Menschen, gegenüber bestimmten Chemikalien. Mit den vorliegenden Verfahren ist es somit möglich, ein Modellsystem bereitzustellen, bei dem - anerkannte oder potentielle - Berufskrankheiten nachge­ stellt werden können und somit Einsichten in die Wirkungsweise der zu untersuchenden bzw. untersuchten chemischen Verbindung auf das respiratorische System sowie ggf. das biologische System, das die­ ses in der Regel enthält, zu gewinnen sowie ggf. die daran betei­ ligten Mechanismen und insbesondere chemischen Verbindungen zu bestimmen. Mit anderen Worten, es ist mit dem erfindungsgemäßen Verfahren möglich, eine bestimmte chemische Verbindung als Ein­ wirkung im Sinne der vorliegenden Erfindung zu verwenden und ein respiratorisches System, insbesondere ein Bronchialschleimhaut umfassendes Präparat, dem Einfluß dieser Einwirkung, d. h. bspw. der chemischen Verbindung, auszusetzen und festzustellen, welche Reaktionen daraufhin erfolgen und ggf. in weiteren nachfolgenden Schritten zu überprüfen, wie sich diese Reaktion(en) des respira­ torischen Systems auf das biologische System und insbesondere den Menschen auswirken, bzw. welche Faktoren an der Vermittlung der Folgen der Einwirkung, d. h. bspw. der chemischen Verbindung, auf das respiratorische System an das biologische System, d. h. bspw. den menschlichen Körper, beteiligt sind.

Welche Chemikalien insbesondere unter diesem Aspekt herangezogen werden können, ergibt sich insbesondere aus der einschlägigen Li­ teratur zum Gebiet Arbeitsmedizin.

Prinzipiell die gleiche Vorgehensweise kann gewählt werden, wenn es darum geht, Medikamententestung (im Englischen als "drug tes­ ting" bezeichnet) durchzuführen. Auch hier können unter dem Ein­ fluß der bspw. zu testenden Verbindung, d. h. der Einwirkung i. S. der vorliegenden Erfindung, auf das respiratorische System jene Faktoren ermittelt werden, die entweder lokal oder auch entfernt auf das biologische System, typischerweise also den menschlichen Organismus, einwirken. Dieses Verständnis ist, wie im Falle der arbeitsmedizinischen Verwendung, von zentraler Bedeutung für ein gesamtheitliches Verständnis der unter dem Einfluß der Einwirkung ablaufenden Ereignisse.

Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung ist insbesondere die Tatsache bedeutsam, daß mit den erfindungsgemäßen Verfahren vektorielle Aspekte der Vorgänge an einem respiratorischen System erfaßt werden können.

Unter dem Begriff "Einwirkung" soll hierin jeder Faktor verstanden werden, der auf ein respiratorisches System einwirken kann. Somit bezeichnet der Begriff, u. a., auch alle bekannten Reizqualitäten. Er schließt somit ein chemische, mechanische, optische, akus­ tische, thermische, barometrische, elektrische und magnetische Reize sowie Kombinationen dieser und weiterer Reize. Aufgrund der Art der erfindungsgemäßen Verfahren bestehen hinsichtlich der Aus­ wahl der Einwirkung keinerlei Beschränkungen. Die Applikation von elektrischen und magnetischen Reizen kann beispielsweise durch Anlegen entsprechender Felder erfolgen.

Unter dem Begriff "respiratorisches System" soll hierin insbeson­ dere das Atmungssystem von Wirbeltieren, insbesondere von Landwir­ beltieren, sowie Teile davon verstanden werden. Der Begriff respi­ ratorisches System soll hierin das luftleitende System, wie ein­ gangs definiert, und/oder den respiratorischen Teil davon, wie ebenfalls eingangs definiert, sowie Kombinationen oder die Gesamt­ heit davon bezeichnen und kann insoweit hierin synonym verwendet werden. Der Begriff soll hierin auch die Bronchialschleimhaut und die respirationsaktiven Oberflächen der Alveolarepithelien, ein­ schließlich der darin vorhandenen zusätzlichen Zelltypen, insbe­ sondere diejenigen des BALT, umfassen, ggf. ergänzt durch darun­ terliegende Zellschichten.

Der Begriff "apikale Seite" soll hierin jene Seite des Präparates bezeichnen, die unter physiologischen, d. h. in vivo- Bedingungen dem Gasraum, d. h. der Luft, zugewandt ist. Im Unterschied hierzu bezeichnet der Begriff "basale Seite" jene Seite des Präparates, die unter physiologischen Bedingungen dem Gasraum abgewandt ist. Die Begrifflichkeiten entsprechen somit den in der Anatomie ge­ wählten Bezeichnungen.

Der Begriff "Fluid" soll hierin, u. a., Gase, Flüssigkeiten, Gasge­ mische, Flüssigkeiten oder Flüssigkeitsgemische, in Flüssigkeiten gelöste Gase und Aerosole umfassen.

Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren zur Bestimmung des Einflusses einer Einwirkung auf ein respiratorisches System kann vorgesehen sein, daß das Präparat vor seiner Verwendung einer Behandlung un­ terzogen wird. Im Rahmen dieser Behandlung kann eine oder mehrere Zellpopulationen hinsichtlich ihres Antwortverhaltens auf die mit­ telbare oder unmittelbare Folge der Einwirkung modifiziert werden. Dies beinhaltet zum Beispiel, daß bestimmte Zellen oder Rezeptoren blockiert oder aus dem Präparat entfernt werden. Weiterhin ist es möglich, daß das Membranpotential des Präparates oder von Teilen davon verändert wird. Allgemein ist es möglich, daß das Präparat oder Teile davon bereits vor der eigentlichen Einwirkung mit einer anderen Einwirkung konfrontiert werden. Grundsätzlich ist dies auch in umgekehrter Reihenfolge möglich. Die verschiedenen mög­ lichen Abwandlungen des erfindungsgemäßen Verfahrens hängen letzt­ enendes von der zu beantwortenden Fragestellung ab und können vom Fachmann im Rahmen seines Fachwissens entsprechend gestaltet wer­ den.

Hinsichtlich der als Einwirkung im Sinne dieser Erfindung verwend­ baren chemischen Verbindungen bestehen grundsätzlich keinerlei Beschränkungen. Entsprechend können die chemischen Verbindungen Feststoffe, Flüssigkeiten oder Gase sein. Sie können auch in ge­ löster Form in Flüssigkeiten vorliegen. Die chemischen Verbindun­ gen können sowohl anorganischer als auch organischer Natur sein oder Mischformen. Grundsätzlich ist es sowohl möglich, daß die chemischen Verbindungen einzeln als auch in Kombination als Ein­ wirkung im Sinne der vorliegenden Erfindung verwendet werden kön­ nen.

Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren zur Bestimmung des Einflusses einer Einwirkung auf ein respiratorisches System kann vorgesehen sein, daß die Analyse des ersten und/oder zweiten Fluids erfolgt, noch bevor das Präparat der Einwirkung ausgesetzt wird. Dies em­ pfiehlt sich, um einen definierten Ausgangspunkt zu erhalten, ins­ besondere dann, wenn die unter dem Einfluß der Einwirkung beobach­ teten oder zu bestimmenden Faktoren bereits als solche, wenngleich in ggf. höheren oder niedrigeren Konzentrationen vom respiratori­ schen System hergestellt, sezerniert oder verbraucht werden.

Es ist im Rahmen der Fähigkeiten des Fachmannes auf diesem Gebiet, den Zeitpunkt, zu dem das erste und/oder zweite Fluid einer Ana­ lyse unterzogen wird, zu bestimmen. Beispielsweise ist es, insbe­ sondere bei kinetischen Untersuchungen, sinnvoll, innerhalb gewis­ ser Zeitabstände während und nach der Einwirkung die Analysen vor­ zunehmen. Dabei ist grundsätzlich möglich, daß die Analyse des Fluids bereits dann vorgenommen wird, wenn sich das Fluid noch mit dem Präparat in Kontakt befindet. Umgekehrt ist auch möglich, daß die Analyse erst dann erfolgt, nachdem das Fluid nicht mehr mit dem Präparat in Kontakt ist.

Hinsichtlich der Analysentechniken gibt es grundsätzlich keine Einschränkungen. Diese werden vielmehr durch die Art der Wirkun­ gen, die möglicherweise unter dem Einfluß der Einwirkungen auf das respiratorische System auftreten, definiert. Dabei kann es in einer Vielzahl von Fällen hilfreich sein, daß ein Teil der Fluide zu Analysenzwecken entnommen wird, d. h. eine Probe von den Fluiden gezogen wird.

Das erste Fluid kann so ausgewählt werden, daß es den natürlicher­ weise vorliegenden Verhältnissen möglichst nahe kommt, kann jedoch in Abhängigkeit von der Fragestellung auch hiervon abweichen. Typischerweise wird als erstes Fluid ein Gas oder Gasgemisch wie bspw. Luft dienen, dem/der die die Einwirkung darstellende che­ mische Verbindung zugesetzt ist. Darüberhinaus können die Gase jedoch weitere Komponenten wie bspw. Partikel oder dergleichen enthalten, um in dieser Form einen zusätzlichen mechanischen Reiz zu applizieren. Ein derartiger Ansatz ist bspw. für den Fall in­ teressant, daß die Einwirkung von Stäuben auf ein respiratorisches System untersucht werden soll. Eine weitere Form, in der das erste Fluid bevorzugt auftreten kann, sind Aerosole. Dies ist besonders bei der Entwicklung von Pharmazeutika und insbesondere von galeni­ schen Darreichungsformen von Interesse. Es ist jedoch auch grund­ sätzlich möglich und in manchen Anwendungsfällen ausdrücklich er­ wünscht und erforderlich, daß Flüssigkeiten, die ggf. eine chemi­ sche Verbindung enthalten, mit der apikalen Seite des Präparates in Kontakt gebracht werden. Als Flüssigkeiten bieten sich insbe­ sondere Pufferlösungen an.

Das zweite Fluid kann ebenfalls ein Gas, Gasgemisch oder Flüssig­ keit darstellen, wobei in diesem Fall besonders bevorzugt ist, daß in Nachahmung der unter natürlichen Bedingungen vorliegenden Situ­ ation das Fluid eine Flüssigkeit und insbesondere eine wässrige Flüssigkeit ist. Grundsätzlich ist jedoch auch denkbar, daß andere als wässrige Flüssigkeiten zum Einsatz gelangen. Das zweite Fluid ist jedoch hierauf nicht beschränkt, so ist bspw. auch denkbar, daß die Flüssigkeiten einen wesentlichen nicht wässrigen Anteil aufweisen.

Grundsätzlich bestehen sowohl bei der Auswahl des ersten oder zweiten Fluids hinsichtlich dessen Gestaltung keine grundsätzlich­ en Beschränkungen. Bei der Auswahl des ersten und zweiten Fluids wird zu berücksichtigen sein, daß es sich bei dem Präparat um bio­ logisches Material handelt, das auch unter den Bedingungen der erfindungsgemäßen Verfahren unter möglichst schonenden Bedingungen am Leben erhalten werde soll, was bedeutet, daß hierfür günstige Randbedingungen hergestellt werden müssen. Dies schließt die Zu­ fuhr von Nährstoffen ebenso ein wie die Entfernung von Stoffwech­ sel(end)produkten.

Der Kontakt zwischen der apikalen Seite des Präparats mit einem Fluid und der basalen Seite des Präparates mit einem zweiten Fluid kann dabei für jedes Fluid unabhängig kontinuierlich oder diskon­ tinuierlich (als Batch) erfolgen. Beliebige Kombinationen dieser beiden Möglichkeiten sind ebenfalls möglich. Die Vorteile für das jeweilige Kontaktieren der jeweiligen Seite in einer der beiden vorgenannten Weisen des Präparats sind für den Fachmann offen­ sichtlich. Beispielhaft sei auf für beide Seiten kontinuierliche Überströmung des Präparates hingewiesen, was den in vivo vor­ liegenden Verhältnissen am nächsten kommt.

Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren zur Bestimmung von Faktoren, die die Folgen einer Einwirkung auf ein respiratorisches System an ein biologisches System vermitteln, ist die Auswahl des biologi­ schen Systems, das betrachtet werden soll, grundsätzlich nicht be­ grenzt und kann insoweit Zellen, Gewebe, Organe und einen gesamten tierischen Organismus betreffen.

Bei dem Verfahren, welches in seinem Ablauf prinzipiell dem Ver­ fahren zur Bestimmung des Einflusses einer Einwirkung auf ein res­ piratorisches System entspricht, können die infolge der Einwirkung im ersten und/oder zweiten Fluid erstmalig vorhandenen, ggf. ver­ stärkt oder verringert auftretenden Faktoren durch Vergleich der Zusammensetzung des Fluids bzw. der Fluide vor der Einwirkung als solche ermittelt und identifiziert werden. In einem weiteren Schritt kann dann den solchermaßen ermittelten Faktoren ihre je­ weilige Wirkung auf das ausgewählte biologische System zugeschrie­ ben werden. Dabei ist es möglich, daß die infolge der Einwirkung im ersten und/oder zweiten Fluid auftretenden oder in ihrer Kon­ zentration geänderten Faktoren gereinigt werden und sodann in ver­ schiedenen - in der Regel funktionellen - Testsystemen auf ihre Wirkung untersucht werden. Es ist jedoch auch im Rahmen der vor­ liegenden Erfindung, daß das erste und/oder zweite Fluid direkt zu dem vorgenannten Zweck in einem derartigen Testsystem eingesetzt wird.

Diese Funktionszuweisung kann unter Verwendung der den Fachmann bekannten Techniken erfolgen und schließt, bspw., Struktur- und Sequenzvergleiche, Zellkultur-, Gewebe-, Organtests und Versuche am Tier ein.

Die erfindungsgemäßen Verfahren sind insbesondere mit Blick auf arbeitsmedizinische, pharmakologische und toxikologische Unter­ suchungen von verschiedenen Einwirkungen auf ein respiratorisches System von zentraler Bedeutung, mithin ganz besonders dann, wenn das biologische System ein Säugetier und insbesondere der Mensch ist.

Hinsichtlich der Auswahl des respiratorischen System einerseits und des biologischen Systems andererseits bestehen grundsätzlich keine Einschränkungen, insbesondere was die Auswahl des das das respiratorische System umfassende Präparat liefernde Organismus anbelangt. Der Donor-Organismus wird in Abhängigkeit von der je­ weiligen Fragestellung ausgewählt. Es bietet sich an, daß für den Fall, daß Einwirkungen auf das respiratorische System des Menschen untersucht werden sollen, das in den erfindungsgemäßen Verfahren verwendete respiratorische System ebenfalls vom Menschen stammt, das ggf. durch Autopsie oder Biopsie erhalten werden kann. Eine Alternative hierzu ist die Verwendung eines respiratischen Systems aus einem Spender- oder Donor-Organismus bzw. einer Spendertier­ art, die hinsichtlich des strukturellen sowie funktionellen Auf­ baus weitgehend mit demjenigen des respiratorischen Systems des Menschen übereinstimmt, mithin ein geeigneter Modellorganismus. Geeignete Donororganismen bzw. Modellorganismen sind, unter ande­ rem, das Rind und das Schwein.

Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren zur Bestimmung von Faktoren, die die Folgen einer Einwirkung auf ein respiratorisches System an ein biologisches System vermitteln, ist es aus Gründen der direkten Übertragbarkeit sinnvoll, daß das respiratorische System aus dem gleichen Spenderorganismus stammt, wie das biologische System, zumindest jedoch der Donororganismus für das respiratorische System und für das biologische System bzw. das biologische System als solche, wenn unter biologischem System im speziellen Fall ein Tier verstanden wird, diese der gleichen Art angehören, oder, als wei­ tere vorteilhafte Alternative, der Donororganismus für das respi­ ratorische System ein geeignetes Modell für das biologische System darstellt bzw. umgekehrt.

Mit den erfindungsgemäßen Verfahren stehen damit auch Verfahren zur Verfügung, mittels derer chemische Verbindungen daraufhin ge­ testet werden, ob, wie und in welchem Umfang sie geeignet sind, die Folgen einer Einwirkung auf das respiratorische System zu ver­ ringern oder zu verstärken. Die erfindungsgemäßen Verfahren eignen sich insoweit auch zum Screenen von pharmazeutischen Wirkstoffen.

Dabei wird so vorgegangen, daß ein Präparat umfassend ein respira­ torisches System so in eine Vorrichtung eingebracht wird, daß ein erstes Fluid mit der apikalen Seite des Präparates und ein zweites Fluid mit der basalen Seite des Präparates in Kontakt gebracht wird, das Präparat der Einwirkung ausgesetzt wird, wobei die zu screenende oder testende Substanz dem Reaktionsansatz, typischer­ weise mit dem ersten und/oder zweiten Fluid zeitgleich oder zeit­ lich versetzt relativ zum Applizieren der Einwirkung, bspw. in Form eines bakteriellen oder viralen Antigens, zugesetzt wird. Durch Vergleich der Reaktion des Präparates auf die Einwirkung mit und ohne die zu testende Substanz kann deren Wirksamkeit festge­ stellt werden.

Bei der erfindungsgemäßen Kammer, die durch das Präparat in zwei funktionale Kammerteile unterteilt wird, ist vorgesehen, daß in­ folge der Sperrwirkung des Präparates typischerweise das erste und/oder zweite Fluid nicht miteinander vermischt werden. Um eine stabile Trennung des ersten Kammerteils vom zweiten Kammerteil durch das eingebrachte Präparat zu gewährleisten, wird das Prä­ parat typischerweise auf ein Siebgitter plaziert.

Die Vorrichtung umfaßt weiterhin Fördereinrichtungen, wie bspw. Pumpen, die ein kontinuierliches oder ansatzweises Zu- und Abfüh­ ren des ersten Fluides und/oder des zweiten Fluides ermöglichen, wobei die Zu- und Abfuhr des ersten Fluides mit derjenigen des zweiten Fluids gekoppelt oder auch unabhängig davon sein kann.

Die Vorrichtung wird desweiteren Temperiereinrichtungen aufweisen, die geeignet sind, eine gewünschte Temperatur in den Kammerteilen zu realisieren. Typischerweise wird eine Temperatur von 37°C re­ alisiert werden. Es ist jedoch auch insbesondere bei Fragestellun­ gen, die sich mit dem Einfluß von Temperaturen auf ein respirato­ risches System befassen, möglich, daß die Kammer eine andere Tem­ peratur aufweisen kann, wobei es im Rahmen der Erfindung ist, daß in den beiden Kammerteilen verschiedene Temperaturen realisiert werden können. Die Temperierung der Kammerteile kann durch ein außen angelegtes Temperiermittel, wie beispielsweise ein Wasserbad realisiert werden; es ist jedoch auch, ggf. zusätzlich möglich, daß die Temperierung durch eine geeignete Temperierung des ersten und/oder zweiten Fluides realisiert wird.

Desweiteren kann die Vorrichtung Begasungseinrichtungen vorsehen, die das Einstellen einer geeigneten Gasatmosphäre erlauben, wie sie typischerweise bei der Kultivierung von tierischen Zellen er­ forderlich ist.

Die Erfindung, mögliche Ausführungsformen und weitere Vorteile sollen an den nachfolgenden Beispielen und Figuren näher erläutert werden, wobei

Fig. 1 einen schematischen Aufbau des verwendeten Perfusions­ systems,

Fig. 2 die basale Bombesinfreisetzung nach Rauchstimulation,

Fig. 3 die apikale VP-Freisetzung bei Stimulation mit 10^-8 mol/l Nornikotin

Fig. 4 die basale SP-Freisetzung bei Stimulation mit 10^-12 mol/l Nikotin und

Fig. 5 die basale Bombesinfreisetzung bei Stimulation mit Nor­ nikotin 10^-12 mol/l zeigt.

Bei den Fig. 2-5 entspricht die x-Achse der Zeit nach Beginn der Stimulationsphase und die y-Achse der auf den Ausgangswert normierten Änderungen.

Beispiel 1 Basale Bombesinfreisetzung bei Rauchstimulation 1. Material und Methoden

Das ein respiratorisches System umfassende Präparat wurde dadurch hergestellt, daß die Trachea eines Rindes knapp oberhalb der Bi­ furkation und dann die Hauptbronchien etwa 10 cm unterhalb der Bifurkation durchtrennt wurden. Die Bronchien wurden der Länge nach aufgeschnitten, auf eine Korkplatte aufgespannt und drei runde Ausstanzungen mit 15 mm Durchmesser vorgenommen. Die Mukosa wurde von dem knorpeligen Anteil entfernt. Das Präparat befand sich sowohl während der Lagerung, d. h. in der Zeit zwischen Her­ stellen des Präparates und Versuchsbeginn in Hanks' Salt Solution.

2. Perfusionssystem

Es wurde eine aus einer oberen und unteren Hälfte bestehende Per­ fusionskammer aus Plexiglas verwendet, wie dargestellt in Fig. 1.

Die Plexiglaskammer 1 besteht aus einem oberen, apikalen Kammer­ teil 2 und einem unteren, basalen Kammerteil 3. Sie weist eine dem oberen Kammerteil 2 zugeordnete Zuleitung 4 und eine dem unteren Kammerteil 3 zugeordnete Zuleitung 5 auf. Beide Kammerteile weisen einen Ablauf 6 und 7 auf, an dem im speziellen vorliegenden Fall Pumpen 8 und 9 angeordnet sind. Im Falle des dem oberen Kammerteil 2 zugeordneten Ablaufes 6 handelt es sich bei Pumpe 8 im Falle der Rauchstimulation um eine Wasserstrahlpumpe und im Falle der Flüs­ sigkeitsstimulation um eine Schlauchpumpe. Pumpe 9, dem Ablauf 7 des unteren Kammerteils 3 zugeordnet, ist im vorliegenden Fall ebenfalls eine Schlauchpumpe.

Das Mukosascheibchen 10 wurde zwischen die obere und untere Hälfte aufgespannt und fungierte auf diese Weise als Trennschicht zwis­ chen beiden Kammerteilen. Hierzu lag die Mukosa auf einem Siebgit­ terring aus Metall mit eingesetztem Siebgewebe aus Nylon, Maschen­ öffnung 200 µm.

Die Kammer wurde auf 37°C unter Verwendung eines Warmwasserbades 11 temperiert.

3. Versuchsablauf

Es wurden jeweils parallel drei Doppelkammersysteme benutzt, wobei jeweils ein Bronchialschleimhautstück (Mukosa) von dem gleichen Rind verwendet wurde. Die Zeitspanne von der Schlachtung bis zum Versuchsbeginn betrug zwischen einer und drei Stunden.

Nach einer Äquilibrierungsphase von 20 Minuten in der das Gewebe­ stück in Hanks' Solution bzw. Luft an der apikalen Seite und mit Nährmedium an der basalen Seite perfundiert wurde, erfolgte an­ schließend über 20 Minuten eine Basalwertsammelphase, bei der das Efluat aus der oberen, d. h. apikalen, und der unteren, d. h. ba­ salen Kammer (bei den Gasversuchen entsprechend nur aus dem basa­ len Kammerteil) gesammelt wurde.

In der Stimulationsphase wurden im Falle der Verwendung von Flüs­ sigkeiten zu Stimulationszwecken die Mukosastückchen 10 Minuten mit Testsubstanz perfundiert und die apikal und basal abgezogenen Efluate jeweils über Intervalle von 2,5 Minuten getrennt gesam­ melt. Bei gasförmiger Stimulation wurden die zuführenden Schläuche mit dem Gasgenerator verbunden und das Gas 20 Minuten über die Mukosa geleitet. Das Efluat der unteren Kammer (basale Mukosasei­ te) wurden jeweils über Intervalle von 2,5 Minuten aufgefangen.

Die Flußrate betrug 5 ml/min für den unteren Kammerteil. Im Falle von Flüssigkeitsstimulation auf der apikalen Seite des Präparates betrug die Flußrate ebenfalls 5 ml/min.

Der Stimulationsphase schloß sich eine Nachlaufphase an, bei der die Mukosa auf gleiche Weise wie in der Äquilibrierphase 20 Minu­ ten lang perfundiert wurde und das Efluat wie in der Basalwertsam­ melphase gesammelt wurden.

Vor Versuchsbeginn und nach Durchführung der Stimulationsversuche wurden von den Mukosastückchen histologische Schnitte angefertigt und auf morphologische Veränderungen hin überprüft. Dabei ergab sich in allen Fällen die Unversehrtheit der gesamten Mukosa, ins­ besondere der Lamina propria und des Flimmerepithels einschließ­ lich Kinozilienbesatzes.

Um den Einfluß von mechanischer Reizung infolge des Einspannens der Mukosastückchen in das Perfusionssystem auszuschließen, wurden die Versuche mehrfach ohne Testsubstanz durchgeführt und die sol­ chermaßen erhaltenen Werte für die betrachteten Faktoren jeweils von den Veränderungen bei Stimulation abgezogen.

4. Analytik

Im vorliegenden Fall wurden die Peptide VIP, SP und Bombesin mit­ tels Radioimmunoassay (RIA) bestimmt. Die vorgenannten Peptide sind als Faktoren, die die Folgen der Einwirkung auf ein respira­ torisches System, hier der Mukosa, an ein biologisches System ver­ mitteln, im Sinne der vorliegenden Erfindung zu verstehen.

5. Art der Einwirkung

Im vorliegenden Beispiel wurde die Bronchialschleimhaut mit Ziga­ rettenrauch stimuliert, wobei der Zigarettenrauch über die apikale Seite geleitet wurde. Bei dieser gasförmigen Stimulation waren insgesamt drei Kammern mit einer brennenden Zigarette verbunden. Der Rauch wurde unter Verwendung einer Wasserstrahlpumpe über die apikale Seite des Präparats geleitet, wobei die Saugkraft der Was­ serstrahlpumpe so eingestellt war, daß durch die drei Kammern ge­ meinsam der Rauch einer Zigarette innerhalb von 5 Minuten durchge­ saugt wurde, woraufhin sie jeweils umgehend durch eine neue er­ setzt wurde. Als Kontrollversuch wurde Zimmerluft über die Mukosa mit gleicher Saugkraft gesaugt.

6. Ergebnis Das Ergebnis ist in Fig. 2 dargestellt

Wie aus Fig. 2 ersichtlich, kommt es innerhalb der ersten zweiein­ halb Minuten nach Rauchexposition zu einer deutlichen Erhöhung des basal freigesetzten Bombesins unter den vorgenannten Bedingungen.

Beispiel 2 Apikale VIP-Freisetzung bei Stimulation mit 10^-8 mol/l Nornikotin

Im vorliegenden Beispiel wurde das Bronchialschleimhautpräparat einer Flüssigstimulation durch Nornikotin unter ansonsten zu Bei­ spiel 1 identischen Bedingungen unterzogen. Nornikotin wurde in Konzentrationen von 10^-6 mol/l, 10^-8 mol/l, 10^-10 mol/l und 10^-12 mol/l in Hanks' Salt Solution verdünnt und die solchermaßen erhal­ tene Flüssigkeit überströmte das Bronchialschleimhautpräparat mit einer Flußrate von 5 ml/Min.

Aufgrund der Nikotin- und Nornikotinkonzentrationen der in allen hierin beschriebenen Versuchen verwendeten Zigaretten (0,1 mg Nikotin) ist davon auszugehen, daß die bei der Flüssigstimula­ tion gewählten Konzentrationen den Bereich der bei Berauchung der Mukosa auf diese applizierten Nornikotinkonzentrationen ab­ deckt. Das Präparat wurde 10 Minuten mit einer Durchflußrate von 5 ml/min/Mukosa perfundiert.

Für eine Nornikotinkonzentration von 10^-6 mol/l ergab sich hin­ sichtlich der apikalen Freisetzung keine signifikante Änderung verglichen mit den Kontrollwerten. Unter Anwendung der mehrfak­ toriellen Varianzanlyse konnten jedoch bei einer Stimulation mit 10^-8 mol/l Nornikotin, 10^-10 mol/l Nornikotin und 10^-12 mol/l Nornikotin Signifikanzen gefunden werden. Das Ergebnis ist in Fig. 3 für eine Nornikotinkonzentration von 10^-8 mol/l darges­ tellt.

Beispiel 3 Basale SP-Freisetzung bei Stimulation mit 10^-12 mol/l Nikotin

Bei diesem Beispiel wurde die basale SP-Freisetzung bei Flüssig­ stimulation mit Nikotin untersucht, wobei im Rahmen eines ent­ sprechenden Versuches Konzentrationen von 10^-6 mol/l Nikotin, 10^-8 mol/l Nikotin, 10^-10 mol/l und 10^-12 mol/l Nikotin getestet wurden. Die Versuchsbedingungen entsprechen ansonsten denjenigen von Beispiel 2.

Lediglich bei einer Stimulationskonzentration von 10^-12 mol/l Nikotin trat eine signifikante Änderung gegenüber den Kontroll­ werten auf (Fig. 4).

Beispiel 4 Basale Bombesinfreisetzung bei Stimulation mit 10^-12 mol/l Nornikotin

Die verwendeten Nornikotinkonzentrationen betrugen 10^-6 mol/l, 10^-8 mol/l, 10^-10 mol/l und 10^-12 mol/l. Die Versuchsbedingungen entsprachen ansonsten denjenigen von Beispiel 2.

Lediglich bei einer Nornikotinkonzentration von 10^-12 mol/l konnte eine signifikante Abweichung gegenüber den Kontrollwerten beobachtet werden. Das Ergebnis für 10^-12 mol/l Nornikotin ist graphisch in Fig. 5 dargestellt.

Claims (14)

1. Verfahren zur Bestimmung des Einflusses einer Einwirkung auf ein respiratorisches Sy­ stem, dadurch gekennzeichnet, daß
ein Präparat umfassend ein respiratorisches System so in eine Vorrichtung eingebracht wird, daß ein erstes Fluid mit der apikalen Seite des Präparates und ein zweites Fluid mit der basa­ len Seite des Präparates in Kontakt gebracht wird,
das Präparat der Einwirkung ausgesetzt wird, und
das erste und/oder zweite Fluid einer Analyse unterzogen wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichent, daß die Einwirkung auf das re­ spiratorische System durch eine chemische Verbindung erfolgt.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die chemische Verbindung in dem ersten und/oder zweiten Fluid vorhanden ist.

4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichent, daß die Einwirkung auf das respiratorische System durch einen mechanischen Reiz erfolgt.

5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Einwirkung ausgewählt ist aus der Gruppe, die optische, akkustische, thermische, barometrische, elektrische und ma­ gnetische Reize sowie Kombinationen davon umfaßt.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß das respi­ ratorische System Bronchialschleimhaut ist.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß das erste Fluid ausgewählt ist aus der Gruppe, die Gase, Gasgemische und Flüssigkeiten umfaßt.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß das zweite Fluid eine Flüssigkeit und insbesondere eine wässrige Flüssigkeit ist.

9. Verfahren zur Bestimmung von Faktoren, die die Folgen einer Einwirkung auf ein respiratorisches System an ein biologisches System vermitteln, dadurch gekennzeichnet, daß ein Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche verwendet wird.

10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß in einem weiteren Schritt die infolge der Einwirkung im ersten und/oder zweiten Fluid vorhandenen Faktoren hinsicht­ lich ihrer Wirkung auf ein biologisches System untersucht und/oder bestimmt werden.

11. Verfahren nach Anspruch 9 oder 10, dadurch gekennzeichnet, daß das biologische System ausgewählt ist aus der Gruppe, die Zellen, Gewebe, Organe und tierische Organismen umfaßt.

12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß die tierischen Organismen Säugetiere und der tierische Organismus insbesondere der Mensch ist.

13. Verwendung einer Vorrichtung für ein Verfahren nach einem der vorangehenden An­ sprüche, wobei die Vorrichtung zumindest eine zweiteilbare Kammer aufweist, und wobei durch das in die Kammer eingebrachte Präparat die Kammer in einen ersten Kammerteil und einen zweiten Kammerteil unterteilt wird und das in dem jeweiligen Kammerteil enthaltene Fluid getrennt ist von dem Fluid des anderen Kammerteils.

14. Verwendung nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß der erste und/oder der zweite Kammerteil kontinuierlich mit einem Fluid durchspülbar ist.