DE102011007310A1

DE102011007310A1 - Verfahren zur Bestimmung der metabolischen Leistung mindestens eines Enzyms

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Publication number: DE102011007310A1
Application number: DE102011007310A
Authority: DE
Inventors: Prof. Dr. Heyne Karsten
Original assignee: Humedics GmbH
Current assignee: Humedics GmbH
Priority date: 2011-04-13
Filing date: 2011-04-13
Publication date: 2012-10-18
Also published as: EA028154B1; ES2593797T3; CN103547215A; CN103547215B; ZA201308470B; AU2012241802A1; US9560989B2; AU2012241802B2; JP2014518518A; DK2696757T3; BR112013026380B1; WO2012140213A3; PT2696757T; CA2832940A1; BR112013026380A2; CA2832940C; US20140107516A1; JP6092845B2; EA201301153A1; EP2696757B1

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung der metabolischen Leistung mindestens eines Enzyms. Es umfasst die Schritte der zeitaufgelösten Bestimmung der Konzentration eines Produktes in der Ausatemluft eines Individuums, wobei das Produkt durch eine Metabolisierung eines dem Individuum zuvor verabreichten Substrates durch mindestens ein Enzym des Individuums erzeugt wurde und wobei die Produktkonzentration zumindest bis zum Erreichen der maximalen Produktkonzentration in der Ausatemluft des Individuums bestimmt wird, der Anpassung einer Modellfunktion an Messwerte der Produktkonzentration, die durch die zeitaufgelöste Bestimmung der Produktkonzentration zwischen einem Anfangszeitpunkt und einem Endzeitpunkt erhalten wurden, und der Bestimmung der metabolischen Leistung des Enzyms anhand von Parametern der Modellfunktion, welche die Modellfunktion spezifizieren. Das Verfahren zeichnet sich dadurch aus, dass die Bestimmung der metabolischen Leistung des Enzyms anhand mindestens zweier Parameter der Modellfunktion erfolgt, mit der Maßgabe, dass als Parameter nicht gleichzeitig der Maximalwert der Modellfunktion und die Zeitkonstante der Modellfunktion gewählt werden, sofern die Modellfunktion eine monoexponentielle Funktion ist, und der weiteren Maßgabe, dass der Anfangszeitpunkt und/oder der Endzeitpunkt nicht als Parameter gewählt werden.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung der metabolischen Leistung mindestens eines Enzyms gemäß dem Oberbegriff des Anspruchs 1 und die Verwendung verschiedener ¹³C-markierter Substrate in einem solchen Verfahren gemäß den Ansprüchen 12 bzw. 13.
Enzyme tragen maßgeblich zum Abbau schädlicher Stoffen im Körper von Tieren und Menschen bei. Es gibt eine Vielzahl verschiedener Enzyme, z. B. Cytochrome, die Substrate katalytisch umsetzen.
Da die Enzyme bzw. Enzymsysteme (im Weiteren wird immer nur von Enzymen gesprochen, aber beides gemeint sein) wichtige Funktionen ausüben, ist es von hoher Wichtigkeit, deren funktionelle Leistungsfähigkeit in einem Organismus zu bestimmen. Dies geschieht heutzutage z. B. über Untersuchungen direkt an den Zellkulturen außerhalb des Organismus, was den Nachteil aufweist, dass das Enzym nicht in seiner nativen Umgebung untersucht wird. Untersuchungen im Organismus gehen typischerweise einher mit der Verabreichung von isotopenmarkierten Substraten, die von dem Enzym verstoffwechselt werden. Die Verabreichung oder Applikation erfolgt entweder durch chirurgische Eingriffe, wie z. B. die direkte Injektion ins Herz, oder aber durch andere Verfahren, wie z. B. die orale Einnahme des Substrats.
Dabei weisen die nicht-chirurgischen Applikationen fast immer den Nachteil auf, dass die Verfügbarkeit des Substrates im Blut sich zeitlich über mehrere Minuten hinzieht. Das heißt, dass der Zeitraum, von dem ab sich die Konzentration des Substrates S im Blut erhöht, bis es eine maximale Konzentration angenommen hat (ohne Berücksichtigung eventueller Konzentrationsabnahmen durch Verstoffwechselung), mehrere Minuten dauert.
Eine Alternative ist der hochempfindliche Nachweis von Spurengasen ohne vorherige Verabreichung eines Substrates. Das hat aber den Nachteil, dass die exakte Vorgeschichte des untersuchten Individuums und alle Ursachen für die Anreicherung eines Gases in der Atemluft bekannt sein müssen. Diese Vorgeschichte kann aber aus prinzipiellen Gründen nicht genau genug bestimmt werden.
Der vorliegenden Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren bereitzustellen, durch das die metabolische Leistung eines Enzyms hochpräzise und zeitaufgelöst bestimmt werden kann. Ferner sollen geeignete Substrate für ein derartiges Verfahren bereitgestellt werden.
Diese Aufgabe wird mit einem Verfahren mit den Merkmalen des Anspruchs 1 gelöst. Ein solches Verfahren zur Bestimmung der metabolischen Leistung mindestens eines Enzyms, umfasst die nachfolgend erläuterten Schritte.
Zunächst erfolgt eine zeitaufgelöste Bestimmung der Konzentration eines Produktes in der Ausatemluft eines Individuums. Das Produkt entsteht dabei durch eine Metabolisierung (Verstoffwechselung) eines dem Individuum zuvor verabreichten Substrates durch mindestens ein Enzym des Individuums. Häufig sind ganze Enzymsysteme an der Metabolisierung eines entsprechenden Substrats beteiligt. Die Produktkonzentration wird zumindest bis zum Erreichen der maximalen Produktkonzentration in der Ausatemluft des Individuums bestimmt wird.
Anschließend wird eine Modellfunktion an Messwerte der Produktkonzentration, die durch die zeitaufgelöste Bestimmung der Produktkonzentration zwischen einem Anfangszeitpunkt und einem Endzeitpunkt erhalten wurden, angepasst. Das heißt, die empirisch erhaltenen Messwerte werden durch eine mathematische Funktion angepasst, die sich durch eine Gleichung beschreiben lässt.
Schließlich wird die metabolische Leistung des Enzyms anhand von Parametern der Modellfunktion, welche die Modellfunktion spezifizieren, bestimmt. Dazu können grundsätzlich verschiedene Parameter der Modellfunktion herangezogen werden.
Das Besondere an dem beanspruchten Verfahren ist, dass die Bestimmung der metabolischen Leistung des Enzyms anhand mindestens zweier Parameter der Modellfunktion erfolgt. Diese Parameter dürfen jedoch nicht gleichzeitig der Maximalwert der Modellfunktion und die Zeitkonstante der Modellfunktion sein, insbesondere dann nicht, wenn die Modellfunktion eine monoexponentielle Funktion ist. Ferner dürfen nicht der Anfangszeitpunkt t₀ und/oder der Endzeitpunkt t_m der Modellfunktion als Parameter gewählt werden.
Werden diese Rahmenbedingungen eingehalten, lassen sich unterschiedlich verlaufende Metabolisierungskinetiken verschiedenster Substrate und damit unterschiedlichste Produktenstehungskinetiken analysieren, um letztlich die metabolische Leistung eines Enzyms oder eines Enzymsystems bestimmen zu können. Die ausgewählten Parameter der Modellfunktion ermöglichen nämlich direkte Rückschlüsse auf die metabolische Leistung des Enzyms. Die metabolische Leistung eines Enzyms kann als Grundlage zur quantitativen Bestimmung des Gesundheitszustandes eines Individuums in Bezug auf bestimmte Körperfunktionen dienen. Dies kann in nachfolgenden Verfahrensschritten, die nicht Teil des beanspruchten Verfahrens sind, erfolgen. Da Enzyme in den unterschiedlichsten Organen oder Kompartimenten des Körpers auftreten, ist das vorliegende Verfahren als Grundlage für zahlreiche nachfolgende Untersuchungen geeignet. Vorzugsweise kann das Verfahren die Grundlage dazu bilden, den Zustand der Leber, der etwa durch die Leberfunktionskapazität oder die Mikrozirkulation in der Leber gekennzeichnet wird, zu analysieren.
Um verlässliche und aussagekräftige Daten der bestimmten metabolischen Leistung des Enzyms zu erhalten, ist es von großem Vorteil, wenn eine schnelle Verfügbarkeit des Substrates im Blut des Individuums gewährleistet werden kann. Eine orale Aufnahme des Substrates ist hierzu in aller Regel ungeeignet.
Die zeitliche Abhängigkeit der Substratkonzentration im Blut (ohne Verstoffwechselung) wird durch die Funktion S(t) beschrieben. Um eine genauere Definition der Verfügbarkeit bzw. Freisetzung des Substrates im Blut zu geben, sei hier der Freisetzungszeitraum FZ definiert. Sei C_max die maximal zu erwartende Substratkonzentration im Blut (ohne Verstoffwechselung), t₀ der Zeitpunkt, zu dem sich die Substratkonzentration im Blut auf 4% bis 6% von C_max erhöht hat, und t_m der Zeitpunkt, zu dem sich die Substratkonzentration im Blut auf 40% bis 60% von C_max erhöht hat, insbesondere, zu dem die Substratkonzentration im Blut bei über 40%, über 50% oder über 60% von C_max liegt, dann ist der Freisetzungszeitraum FZ gegeben durch die Zeitdifferenz zwischen t_m und t₀ (FZ = t_m – t₀). Mit anderen Worten ausgedrückt, ist der Freisetzungszeitraum der Zeitraum, der benötigt wird, um eine Erhöhung der Substratkonzentration im Blut (ausgehend von einer etwas über 0% von C_max, jedoch noch in einstelligen Prozentbereich von C_max liegenden Konzentration) um den Faktor 10, insbesondere um den Faktor 12, insbesondere um den Faktor 15 und ganz besonders um den Faktor 20 zu erreichen.
Der Freisetzungszeitraum für gewöhnliche orale Verabreichung eines Substrates liegt typischerweise bei über 5 Minuten und schwankt interindividuell und von Tag zu Tag sehr stark. Aus diesem Grund liefern Verabreichungen mit einem langen Freisetzungszeitraum zu verfälschten Ergebnissen, da die Messergebnisse mit der Funktion S(t) gefaltet und somit mit einer Funktion „verschmiert” sind, die unbekannt ist.
Durch eine gezielte Induktion des metabolischen Apparates des zu untersuchenden Individuums mittels nicht-chirurgischer Verabreichung eines Substrats können die aus dem Stand der Technik bekannten langen Freisetzungszeiträume und die damit einhergehenden Nachteile bei der anschließenden Bestimmung der metabolischen Leistung eines Enzyms umgangen werden. Zur gezielten Induktion wird die Dosierung des Substrates festgelegt, so dass in den nachfolgenden Auswertungsschritten die Reaktion des metabolischen Apparates in Bezug auf die Dosierung des Substrates eingeschätzt werden kann. Vorzugsweise werden ausschließlich Gase als Produkte untersucht, deren Konzentration sich durch Induktion des metabolischen Apparates infolge der Substratverabreichung verändern. Die Induktion des metabolischen Apparates durch das Substrat und die schnell darauf folgende Antwort des Metabolismus ist ein zentraler Punkt für die nachfolgende Anwendung des beanspruchten Verfahrens.
In einer Ausgestaltung ist die erläuterte gezielte Induktion des metabolischen Apparates ein Teil des Verfahrens, der dem Schritt der zeitaufgelösten Bestimmung der Konzentration des Produktes vorgelagert ist.
Die Verabreichung und die von der Art und Weise der Verabreichung abhängige Freisetzung des Substrates erfolgt vorzugsweise dergestalt, dass der Freisetzungszeitraum (und damit die Verfügbarkeit des Substrates im Blut) schneller als 60 Sekunden, insbesondere schneller als 50 Sekunden, insbesondere schneller als 40 Sekunden, insbesondere schneller als 30 Sekunden, insbesondere schneller als 20 Sekunden und ganz besonders schneller als 10 Sekunden ist.
Vorzugsweise wird das Substrat daher in einer Darreichungsform verabreicht, die eine Freisetzungszeit des Substrats im Blut des Individuums innerhalb der vorgenannten Zeiten ermöglicht. Ein solch kurzer Freisetzungszeitraum kann grundsätzlich durch verschiedene Verabreichungsformen oder Applikationen erreicht werden. Ohne beschränkende Auslegung seien hier einige aufgeführt: a) Einatmen eines Aerosols, das das Substrat enthält, b) Verabreichung über die Haut, z. B. mit effizienten Nanocarriern, c) orale Einnahme eines schaltbaren Substrates, das durch Energieabsorption freigesetzt wird. Dadurch kann nach oraler Verabreichung das im gebundenen Zustand nicht abbaubare Substrat durch Energieeinwirkung, insbesondere durch Licht innerhalb einer Sekunde vollständig freigesetzt werden. Derartige Substrate im gebundenen Zustand bezeichnet man fachsprachlich auch als „caged compounds” oder „Caged-Verbindungen”. Der Einsatz derartiger Caged-Verbindungen ermöglicht eine ultraschnelle, selektive und jederzeit induzierbare Freisetzung des entsprechenden, metabolisierbaren Substrates.
Die schnelle Verfügbarkeit des Substrates im Blut garantiert die schnelle Verfügbarkeit des Substrates am Enzym, dessen metabolische Leistung untersucht werden soll.
Liegt das Substrat im Blut vor und am Enzym an, so kann es vom Enzym metabolisiert werden. Dabei entsteht das Produkt bzw. entstehen die Produkte, die im Folgenden stets nur als einzelnes Produkt bezeichnet werden. Die Metabolisierungsschritte müssen sehr schnell sein und vorzugsweise innerhalb von 10 Sekunden, insbesondere innerhalb von 5 Sekunden, insbesondere innerhalb von 1 Sekunde, insbesondere innerhalb von 0,1 Sekunden, insbesondere innerhalb von 0,01 Sekunden, insbesondere innerhalb von 0,001 Sekunden abgeschlossen sein. Das garantiert auf der Zeitskala der Verfügbarkeit des Substrates eine quasi instantane Verstoffwechselung. Das bei der Metabolisierung des Substrates gebildete Produkt oder die gebildeten Produkte P wird/werden im Blut gelöst und über die Lunge abgeatmet, so dass es/sie dann in der Ausatemluft des Individuums nachgewiesen werden kann/können. Auch wenn vorliegend stets nur von einem Produkt die Rede ist, sind davon auch Ausführungsformen des Verfahrens umfasst, bei denen nicht nur ein einzelnes Produkt, sondern mehrere Produkte nachgewiesen werden.
Zur Beschreibung der metabolischen Leistung des Enzyms können unterschiedliche Parameter verschiedener Anpassungsfunktionen herangezogen werden. Beispiele geeigneter Parameter sind Parameter aus der Gruppe umfassend den Maximalwert der Modellfunktion, das i-te Moment der Modellfunktion mit i = 1, 2, 3, 4, ..., das j-te zentrale Moment der Modellfunktion mit j = 1, 2, 3, 4, ..., die Standardabweichung der Modellfunktion, eine Zeitkonstante der Modellfunktion, der Schwerpunkt der Zeitkonstanten, die mittlere Abweichung der Zeitkonstanten vom Schwerpunkt, die Variation der Zeitkonstanten, die Verteilung der Zeitkonstanten, die Gewichtung der Zeitkonstanten, die Gewichtung der Verteilung der Zeitkonstanten, die Gewichtung der Variation der Zeitkonstanten.
Die Momente einer Modellfunktion sind beispielsweise im Taschenbuch der Mathematik von Bronstein und Semendjajew (S. 665 bis 668, 25. Aufl., 1991) erläutert. In dieser Literaturquelle finden sich auch zahlreiche andere Modellfunktionen und Modellparameter, die einzeln oder in Kombination miteinander im Rahmen der vorliegenden Erfindung verwendet werden können.
Ein Beispiel für zwei gut zur Spezifizierung der Modellfunktion geeignete Parameter sind die maximale Konzentration bzw. Menge P_max des Produktes P in der Atemluft und das erste Moment der Modellfunktion von t₀ bis t_m. Das erste Moment M₁ ist definiert durch:
mit i = 1, wobei die Summe über alle Messpunkte k zwischen t₀ und t_m gebildet wird. Dabei ist t_k der Zeitpunkt des k-ten Messpunktes und p_k der Messwert der Konzentration des Produktes P in der Atemluft zum Zeitpunkt t_k.
Ein weiteres Beispiel für zwei gut zur Spezifizierung der Modellfunktion geeignete Parameter sind die maximale Konzentration bzw. Menge P_max des Produktes P in der Atemluft und das zweite zentrale Moment der Modellfunktion von t₀ bis t_m. Das zweite zentrale Moment MZ₂ ist definiert durch:
mit i = 2. Das zweite zentrale Moment ist die Varianz vom ersten Moment und gibt die Breite der Verteilung der Anstiegsfunktion der untersuchten Verstoffwechselung an.
Weitere Parameterkombinationen, z. B. aus P_max, M₁ und MZ₂, sowie aus höheren Momenten, höheren zentralen Momenten oder anderen Parametern, insbesondere den anderen oben genannten Parametern, sind möglich und geben je nach untersuchtem Enzym direkte Informationen über die metabolische Leistung des Enzyms an.
Die Modellfunktion kann grundsätzlich eine oder mehrere Zeitkonstanten aufweisen. Beispielsweise in dem Fall, in dem eine Kombination mehrerer Funktionen als Modellfunktion verwendet wird, weist die Modellfunktion mehrere Zeitkonstanten auf. Das Vorhandensein mehrerer Zeitkonstanten ist eine Voraussetzung dafür, dass beispielsweise der Schwerpunkt der Zeitkonstanten, die mittlere Abweichung der Zeitkonstanten vom Schwerpunkt, die Variation der Zeitkonstanten, die Verteilung der Zeitkonstanten, die Gewichtung der Zeitkonstanten, die Gewichtung der Verteilung der Zeitkonstanten oder die Gewichtung der Variation der Zeitkonstanten als Parameter gewählt werden können.
Vorzugsweise handelt es bei der Modellfunktion (bzw. Anpassungsfunktion) um eine Lösungsfunktion einer Differentialgleichung erster Ordnung, eine Lösungsfunktion einer Differentialgleichung zweiter Ordnung, eine Lösungsfunktion einer Differentialgleichung dritter Ordnung, eine Lösungsfunktion einer Kombination aus Differentialgleichungen verschiedener Ordnungen oder eine multiexponentielle Funktion in Abhängigkeit von der Zeit ist. Wird eine Kombination aus Differentialgleichungen verschiedener Ordnungen verwendet, können in der Lösungsfunktion auch Beiträge einer Differentialgleichung nullter Ordnung enthalten sein.
Um eine besonders einfache Messung der Ausatemluft zu ermöglichen und gleichzeitig eine hohe Genauigkeit der Messungen zu erreichen, wodurch die Aussagekraft der erhaltenen Messwerte signifikant besser wird, erfolgt die Bestimmung der Konzentration des Produktes vorzugsweise im Durchfluss.
Durch eine Absorptionsmessung kann nach dem Lambert-Beer'schen Gesetz bei bekanntem Extinktionskoeffizienten und bekannter Schichtdicke der Messzelle unmittelbar die Konzentration des untersuchten Stoffes erhalten werden. Vorzugsweise wird darüber hinaus auch die Flussrate der Ausatemluft, welche durch eine zur Bestimmung der Konzentration verwendete Messapparatur strömt, bestimmt. Dann kann aus dem Produkt der Konzentration und der durch die Messapparatur geströmten Volumen die Menge des untersuchten Produkts berechnet werden. Das durch die Messapparatur geströmte Volumen erhält man durch eine Multiplikation des Volumenstroms mit der Zeit, innerhalb derer der Volumenstrom beobachtet wird.
Dabei ist der Atemwiderstand des Messgeräts vorzugsweise geringer als 100 mbar, insbesondere geringer als 80 mbar, insbesondere geringer als 70 mbar und ganz besonders geringer als 60 mbar. Dies wird beispielsweise durch einen offenen Aufbau ohne Ventile und ohne Luftklappen erreicht.
Die Zunahme des Produktes im Blut spiegelt sich in der Atemluft proportional wider. Die Menge oder Konzentration des Produktes wird in der Atemluft in Abhängigkeit von der Zeit gemessen. Die ausgeatmete Luft wird in einer Ausführung im vollen Umfang (vollständig) durch ein Messgerät geleitet, mittels dessen das Produkt nachgewiesen wird. Das heißt, als Ausatemluft wird in dieser Ausgestaltung die gesamte Ausatemluft mindestens eines Atemzuges des Individuums verwendet. Dadurch lässt sich auf besonders vorteilhafte Art und Weise unter Minimierung des Messfehlers durch Verzicht auf Interpolationen die Konzentration des Produktes in der Atemluft bestimmen.
In einer anderen Ausführung wird die Ausatemluft eines Atemzugs oder mehrerer Atemzüge (rund 2 bis 20 Atemzüge, insbesondere 3 bis 15 Atemzüge, insbesondere 4 bis 10 Atemzüge, insbesondere 5 bis 8 Atemzüge) vollständig durchmischt, und ein Teil dieses Gemisches wird dann durch ein Messgerät geleitet, mittels dessen das Produkt nachgewiesen wird.
Um besonders gut reproduzierbare Daten zu erhalten, sollte sich das untersuchte Individuum während der Bestimmung der Produktkonzentration im Atem vorzugsweise sich in einer stabilen Phase befindet. Bei Menschen und Tieren kann dies beispielsweise dadurch gewährleistet sein, dass der Organismus während der Bestimmung der Produktkonzentration in der Ausatemluft keinen starken Bewegungen ausgesetzt ist. So kann z. B. im liegenden Zustand des Individuums das Heben der Beine um 45 Grad aus der waagerechten Position die gemessenen Werte der Konzentration des Produkts in der Atemluft verändern. Laufende, rennende oder aufstehende Bewegungen führen aufgrund der Speicherfunktion des Blutes und dessen Verteilung im Organismus zu veränderten Werten der Konzentration des Produkts in der Ausatemluft. Daher erfolgt die Bestimmung der Konzentration des Produktsvorzugsweise, während sich das Individuum im Wesentlichen in einer Ruhelage befindet. Diese Ruhelage kann eine liegende oder sitzende Position sein. Es ist vorteilhaft, wenn die Lage der Beine und/oder des Oberkörpers des Individuums um weniger als 45 Grad, insbesondere um weniger als 30 Grad und ganz besonders um weniger als 15 Grad gegenüber der vorgegebenen Position geändert wird. In der liegenden Position des Individuums ist diese vorgegebene Position beispielsweise eine im Wesentlichen waagerechte Position des Individuums.
Vorzugsweise wird nur der Anstieg der Konzentration des Produktes (also die Verstoffwechselungsdynamik) bis zum Maximum analysiert. Dieses Maximum entspricht der maximalen Konzentration des Produktes in der Ausatemluft des Individuums. Dieser Anstieg dauert vorzugsweise weniger als 40 Minuten, insbesondere weniger als 20 Minuten und ganz besonders weniger als 10 Minuten. Je länger der Anstieg dauert, desto wahrscheinlicher können körpereigene Prozesse das Ergebnis beeinflussen, wodurch die Gesamtgenauigkeit der erhaltenen Messdaten geringer wird.
Zur Bestimmung der Produktkonzentration können verschiedene hochempfindliche und zeitaufgelöste Messmethoden wie etwa Infrarotabsorptionsspektroskopie, Massenspektrometrie, die kernmagnetische Resonanzspektroskopie (NMR-Spektroskopie) oder die Computertomographie (CT), beispielsweise in Form der CT-Volumetrie, einzeln oder in beliebiger Kombination miteinander verwendet werden. Durch eine derartige Kombination können die jeweiligen Vorteile der einzelnen Messverfahren miteinander kombiniert werden, um so ergänzende oder genauere Aussagen zu der metabolischen Leistung des Enzyms treffen zu können.
Die Ausführung des vorliegend beanspruchten Verfahrens mit Hilfe der NMR-Spektroskopie und/oder der CT erfolgt etwas abweichend zu einer Ausführung mittels Infrarotspektroskopie und/oder Massenspektrometrie. Die NMR-Spektroskopie und die CT sind bildgebende Messmethoden und können beispielsweise auf folgende Weisen eingesetzt werden:

a) Mittels NMR-Spektroskopie und CT wird der räumliche Bereich von Interesse untersucht. Zusätzlich wird das Produkt in der Atemluft analysiert. Ein Vergleich beider Messungen liefert neue Informationen.
b) Mittels NMR-Spektroskopie und CT wird der räumliche Bereich von Interesse untersucht, während zusätzlich das Produkt in der Atemluft analysiert wird. Ein Vergleich der zeitlichen Abläufe beider Messungen liefert neue Informationen. Die NMR-Spektroskopie und die CT können hierbei die Zunahme und Abnahme der Produktkonzentration räumlich aufgelöst verfolgen. Der Einsatz von isotopenmarkierten Substraten oder Substraten mit hoher Elektronendichte ermöglicht dabei den Einsatz der NMR-Spektroskopie und der CT auf besonders vorteilhafte Weise.

Geeignete Substrate, die einerseits von Enzymen des untersuchten Individuums verstoffwechselt werden können und deren Stoffwechselprodukte gut nachweisbar sind, sind ¹³C-markiertes Methacetin, ¹³C-markiertes Phenacetin, ¹³C-markiertes Aminopyrin, ¹³C-markiertes Koffein, ¹³C-markiertes Erythromycin und/oder ¹³C-markiertes Ethoxycoumarin. Die Verwendung dieser Substrate einzeln oder in Kombination in einem Verfahren gemäß den vorstehenden Erläuterungen ist auch Gegenstand dieser Erfindung.
Bevorzugte Dosierungen betragen dabei rund 0,1 mg bis 10 mg pro Kilogramm Körpergewicht des Individuums, insbesondere 0,5 mg bis 9 mg, insbesondere 1 mg bis 8 mg, insbesondere 2 mg bis 7 mg, insbesondere 3 mg bis 6 mg und ganz besonders 4 mg bis 5 mg pro Kilogramm Körpergewicht des Individuums.
Im Rahmen des vorliegenden Verfahrens wird bevorzugt der absolute Gehalt eines ¹³C-markierten Metabolisierungsproduktes, insbesondere der ¹³CO₂-Gehalt, in der Ausatemluft bestimmt. Dabei kann die Messung des Gehaltes des ¹³C-markierten Produktes, insbesondere des ¹³CO₂-Gehaltes, in der Ausatemluft sowohl in Echtzeit als auch kontinuierlich erfolgen. Eine kontinuierliche Bestimmung der Konzentration des ¹³C-markierten Metabolisierungsproduktes, insbesondere der ¹³CO₂-Konzentration, in der Ausatemluft im Messgerät resultiert in der Ermittlung von mehr Datenpunkten, wodurch eine höhere Auflösung und Präzision der aus den ermittelten Datenpunkten gebildeten Messkurve folgt.
Viele Substrate, die für den direkten Nachweis einer Verstoffwechselungsdynamik durch Bestimmung der Produktkonzentration in der Ausatemluft eines Individuums in Frage kommen würden, sind leider schwer löslich. Das ist kein Nachteil, wenn diese Substrate oral eingenommen werden und später im Blut durch Lichtinduktion aktiviert werden (caged compounds). Alternative Verabreichungsformen sind zum Teil darauf angewiesen, dass diese Substrate z. B. in einer wässrigen Lösung oder einer leicht flüchtigen Lösung gelöst werden können. Dazu können Nanocarrier eingesetzt werden, die gezielt modellierbar sind und somit Bereiche enthalten, die das Substrat in einer ausreichenden Form aufnehmen können. Die Entwicklung von Nanocarriern bietet weitreichende Möglichkeiten und kann für die Atemanalyse in der Infrarotspektroskopie, der Massenspektrometrie, der CT und/oder der NMR-Spektroskopie eingesetzt werden.
Will man weder auf Caged-Verbindungen noch auf Nanocarrier setzen, bietet sich auch der Einsatz eines Lösungsvermittlers wie etwa Propylenglykol an, um eine bessere Löslichkeit des Substrats zu erreichen. Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher auch die Verwendung einer wässrigen Lösung aus ¹³C-Methacetin und eines Lösungsvermittlers, insbesondere Propylenglykol, in einem Verfahren gemäß den vorstehenden Erläuterungen.
Die Konzentration des Lösungsvermittlers, insbesondere des Propylenglykols, beträgt dabei vorzugsweise 10 bis 100 mg/ml, insbesondere 20 bis 80 mg/ml, insbesondere 30 bis 70 mg/ml und ganz besonders 40 bis 60 mg/ml, und die Konzentration des ¹³C-Methacetins vorzugsweise 0,2 bis 0,6 Massenprozent, insbesondere 0,3 bis 0,5 Massenprozent oder rund 0,4 Massenprozent.
In einer alternativen Ausgestaltung wird das ¹³C-Methacetin in noch höherer Konzentration eingesetzt, nämlich in einer Konzentration von mehr als 3 Massenprozent, insbesondere mehr als 4 Massenprozent, insbesondere mehr als 5 Massenprozent. Die Konzentration des Lösungsvermittlers kann dabei in den vorgenannten Bereichen liegen.
Weitere Vorteile und Einzelheiten der vorliegend beanspruchten Erfindung werden anhand einer Figur eines Ausführungsbeispiels näher erläutert. Es zeigt:
1 eine graphische Darstellung der Kinetik der Konzentration eines metabolisierten Produktes über der Messzeit.
Die 1 zeigt eine graphische Darstellung der gemessenen Produktkonzentration in der Ausatemluft eines Individuums in Abhängigkeit der Zeit. Als Substrat wurde dem Individuum ¹³C-markiertes Methacetin in einer Dosis von 2 mg pro Kilogramm Körpergewicht des Individuums verabreicht, wobei der Freisetzungszeitraum kleiner als 60 Sekunden war. Das ¹³C-markierte Methacetin wurde im Körper des Individuums in der Leber zu Paracetamol und ¹³C-markiertem CO₂ verstoffwechselt. Letzteres wurde als Produkt in der Ausatemluft des Individuums nachgewiesen.
Das Diagramm der 1 zeigt einen Anstieg der ¹³CO₂-Konzentration in Form des Deltaover-Baseline-Wertes (DOB-Wertes) in der Ausatemluft. 1 DOB bezeichnet dabei eine Änderung des ¹³CO₂-zum-¹²CO₂-Verhältnisses um ein Tausendstel über dem natürlichen Verhältnis. Die erhaltenen und in der 1 dargestellten Messwerte werden anschließend mit einer geeigneten Modellfunktion angepasst. Dies ist in der 1 noch nicht dargestellt. Aus dieser Modellfunktion sind nun – bei an sich bekannter Funktionsgleichung – unterschiedliche Parameter ableitbar, die die Funktion spezifizieren. Aus diesen Parametern lassen sich Rückschlüsse auf die metabolische Leitung des untersuchten Enzymsystems ziehen.
Da Methacetin nahezu ausschließlich in der Leber verstoffwechselt wird, ist es mit der beschriebenen Metabolisierungsdynamik möglich, direkt und unmittelbar die Metabolisierung des verabreichten Substrates durch die in der Leber vorhandenen Enzyme zu verfolgen. So wird das verabreichte Methacetin über das Enzym CYP450 1A2 in der Leber demethyliert. Durch die Auswertung der Anstiegskinetik des verabreichten Methacetins und die daraus abgeleiteten Parameter ist es nunmehr möglich, die Leberleistung direkt zu bestimmen. Dabei ermöglicht beispielsweise der Wert der maximalen Produktkonzentration in der Ausatemluft P_max eine Aussage über die Anzahl der gesunden Leberzellen und das damit zur Verstoffwechselung zur Verfügung stehende Lebervolumen. Der Anstieg in Form der Zeitkonstante(n) der an die Messwerte angepassten Modellfunktion ermöglicht hingegen Aussagen über die Eintrittsgeschwindigkeit des Substrates in die Leberzellen. Die Zeitkonstante(n) der Modellfunktion ermöglichen also Aussagen darüber, ob die Leber überhaupt in der Lage ist, Substrate aufzunehmen. Aus der Streuung der Zeitkonstanten können Rückschlüsse auf interzelluläre Unterschiede hinsichtlich einer Substratsuszeptibilität der Leberzellen gezogen werden.
ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Nicht-Patentliteratur

Bronstein und Semendjajew (S. 665 bis 668, 25. Aufl., 1991) [0023]

Claims

Verfahren zur Bestimmung der metabolischen Leistung mindestens eines Enzyms, umfassend die folgenden Schritte: • zeitaufgelöste Bestimmung der Konzentration eines Produktes in der Ausatemluft eines Individuums, wobei das Produkt durch eine Metabolisierung eines dem Individuum zuvor verabreichten Substrates durch mindestens ein Enzym des Individuums erzeugt wurde und wobei die Produktkonzentration zumindest bis zum Erreichen der maximalen Produktkonzentration in der Ausatemluft des Individuums bestimmt wird, • Anpassung einer Modellfunktion an Messwerte der Produktkonzentration, die durch die zeitaufgelöste Bestimmung der Produktkonzentration zwischen einem Anfangszeitpunkt und einem Endzeitpunkt erhalten wurden, und • Bestimmung der metabolischen Leistung des Enzyms anhand von Parametern der Modellfunktion, welche die Modellfunktion spezifizieren, dadurch gekennzeichnet, dass die Bestimmung der metabolischen Leistung des Enzyms anhand mindestens zweier Parameter der Modellfunktion erfolgt, mit der Maßgabe, dass als Parameter nicht gleichzeitig der Maximalwert der Modellfunktion und die Zeitkonstante der Modellfunktion gewählt wenden, sofern die Modellfunktion eine monoexponentielle Funktion ist, und der weiteren Maßgabe, dass der Anfangszeitpunkt und/oder der Endzeitpunkt nicht als Parameter gewählt werden.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Parameter ausgewählt sind aus der Gruppe umfassend den Maximalwert der Modellfunktion, das i-te Moment der Modellfunktion mit i = 1, 2, 3, 4, ..., das j-te zentrale Moment der Modellfunktion mit j = 1, 2, 3, 4, ..., die Standardabweichung der Modellfunktion, eine Zeitkonstante der Modellfunktion, der Schwerpunkt der Zeitkonstanten, die mittlere Abweichung der Zeitkonstanten vom Schwerpunkt, die Variation der Zeitkonstanten, die Verteilung der Zeitkonstanten, die Gewichtung der Zeitkonstanten, die Gewichtung der Verteilung der Zeitkonstanten, die Gewichtung der Variation der Zeitkonstanten.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Modellfunktion eine Lösungsfunktion einer Differentialgleichung erster Ordnung, eine Lösungsfunktion einer Differentialgleichung zweiter Ordnung, eine Lösungsfunktion einer Differentialgleichung dritter Ordnung, eine Lösungsfunktion einer Kombination aus Differentialgleichungen verschiedener Ordnungen oder eine multiexponentielle Funktion in Abhängigkeit von der Zeit ist.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Bestimmung der Konzentration des Produktes im Durchfluss erfolgt.
Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Flussrate der Ausatemluft, welche durch eine zur Bestimmung der Konzentration verwendete Messapparatur strömt, bestimmt wird.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass zur Bestimmung der Konzentration des Produktes eine Messapparatur verwendet wird, deren Atemwiderstand bei unter 100 mbar liegt
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass als Ausatemluft die gesamte Ausatemluft mindestens eines Atemzuges des Individuums verwendet wird.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Bestimmung der Konzentration des Produkts erfolgt, während sich das Individuum im Wesentlichen in einer Ruhelage befindet.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Bestimmung der Konzentration des Produkts erfolgt, während das Individuum sich in einer liegenden oder sitzenden Position befindet, in der die Lage der Beine und/oder des Oberkörpers des Individuums um weniger als 45 Grad, insbesondere um weniger als 30 Grad und ganz besonders um weniger als 15 Grad gegenüber der vorgegebenen Position geändert wird.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Bestimmung der Konzentration des Produkts im Wesentlichen bis zur maximalen Konzentration des Produkts in der Ausatemluft erfolgt.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Bestimmung der Konzentration des Produkts durch Infrarot-Absorptionsspektroskopie, durch Massenspektrometrie, durch Computertomographie und/oder durch kernmagnetische Resonanzspektroskopie erfolgt.
Jeweils ¹³C-markiertes Methacetin, Phenacetin, Aminopyrin, Koffein, Erythromycin und/oder Ethoxycoumarin als Substrat in einem Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche.
Wässrige Lösung von ¹³C-Methacetin und einem Lösungsvermittler als Substrat in einem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10.
Wässrige Lösung von ¹³C-Methacetin und einem Lösungsvermittler nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass die Konzentration des Lösungsvermittlers 10 bis 100 mg/ml und die Konzentration des ¹³C-Methacetins 0,2 bis 0,6 Massenprozent beträgt.
Wässrige Lösung von ¹³C-Methacetin und einem Lösungsvermittler nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass die Konzentration des ¹³C-Methacetins über 3 Massenprozent beträgt.