BR112013026380B1 - Método para determinar a capacidade metabólica de pelo menos uma enzima - Google Patents

Abstract

método para determinar a capacidade metabólica de pelo menos uma enzima. a presente invenção refere-se a um método para determinar a capacidade metabólica de pelo menos uma enzima. ele compreende as etapas de determinação com resolução de tempo da concentração de um produto no ar exalado por um indivíduo, em que o produto foi criado por um metabolismo de um substrato, administrado previamente ao indivíduo, por pelo menos uma enzima do indivíduo e em que a concentração do produto é determinada pelo menos até que a concentração máxima do produto no ar exalado pelo indivíduo seja alcançada, o ajuste de uma função modelo aos valores medidos da concentração do produto, que foram obtidos pela determinação com resolução de tempo da concentração do produto entre um tempo inicial e um tempo final, e a determinação da capacidade metabólica da enzima com base nos parâmetros da função modelo, que especificam a função modelo. o método é caracterizado pelo fato que a determinação da capacidade metabólica da enzima ocorre com base em pelo menos dois parâmetros da função modelo, contanto que o valor máximo da função modelo e a constante do tempo da função modelo não sejam selecionados como parâmetros ao mesmo tempo, uma vez que a função modelo é uma função monoexponencial, e também contanto que o tempo inicial e/ou o tempo final não sejam selecionados como parâmetros.

Description

Relatório Descritivo

[0001] A invenção refere-se a um método para determinar acapacidade metabólica de pelo menos uma enzima de acordo com o preâmbulo da reivindicação 1 e o uso de vários substratos etiquetados com 13C em tal método de acordo com a reivindicação 16 ou 17, respectivamente.

[0002] As enzimas contribuem de maneira significativa para adegradação de substâncias prejudiciais no corpo de animais e de seres humanos. Há uma multiplicidade de várias enzimas, por exemplo, citocromos, que convertem substratos cataliticamente.

[0003] Devido ao fato que as enzimas ou sistemas de enzimas (aseguir, a referência será feita sempre somente às enzimas embora se refira a ambos) exercem funções importantes, é da mais alta importância a determinação de sua capacidade funcional em um organismo. Isto acontece hoje em dia, por exemplo, através de exames diretamente nas culturas de células fora do organismo, o que tem a desvantagem de que a enzima não é examinada em seu ambiente nativo. Os exames no organismo envolvem tipicamente a administração de substratos etiquetados com isótopos, que são metabolizados pela enzima. A administração ou a aplicação ocorrem tanto por intervenções cirúrgicas, tal como, por exemplo, a injeção direta no coração, quanto por outros métodos, tal como, por exemplo, a ingestão oral do substrato.

[0004] As aplicações não cirúrgicas aqui têm quase sempre adesvantagem de que a disponibilidade do substrato no sangue leva vários minutos. Ou seja, o período de tempo em cujo início a concentração do substrato S no sangue aumenta até que seja ingerido em uma concentração máxima (sem levar em consideração as possíveis diminuições na concentração pelo metabolismo) leva vários minutos.

[0005] Uma alternativa é a detecção altamente sensível deresquícios de gases sem a administração prévia de um substrato. Mas isso tem a desvantagem de que a anamnese exata do indivíduo examinado e todas as causas para o enriquecimento de um gás no ar que ele respira devem ser conhecidas. Como uma questão de princípio, no entanto, essa anamnese não pode ser determinada com uma exatidão suficiente.

[0006] O objeto subjacente à presente invenção consiste naprovisão de um método, por meio do qual a capacidade metabólica de uma enzima pode ser determinada com alta precisão e com resolução de tempo. Além disso, os substratos apropriados para tal método serão providos.

[0007] Esse objetivo é atingido com um método que tem ascaracterísticas da reivindicação 1. Tal método para determinar a capacidade metabólica de pelo menos uma enzima compreende as etapas explicadas a seguir.

[0008] Em primeiro lugar, ocorre uma determinação com resoluçãode tempo da concentração de um produto no ar exalado por um indivíduo. O produto é gerado aqui por um metabolismo de um substrato, administrado previamente ao indivíduo, por pelo menos uma enzima do indivíduo. Frequentemente sistemas inteiros de enzimas estão participando do metabolismo de um substrato correspondente. A concentração do produto é determinada pelo menos até que a concentração máxima do produto no ar exalado pelo indivíduo seja alcançada.

[0009] Subsequentemente, uma função modelo é ajustada aosvalores medidos da concentração do produto, que foram obtidos pela determinação com resolução de tempo da concentração do produto entre um tempo inicial e um tempo final. Ou seja, os valores medidos obtidos empiricamente são ajustados por uma função matemática, que pode ser especificada por uma equação.

[00010] Finalmente, a capacidade metabólica da enzima é determinada com base nos parâmetros da função modelo que especificam a função modelo. Para essa finalidade, vários parâmetros da função modelo podem ser basicamente usados.

[00011] O que é especial sobre o método reivindicado é que a determinação da capacidade metabólica da enzima ocorre com base em pelo menos dois parâmetros da função modelo. Esses parâmetros não podem, no entanto, ser o valor máximo da função modelo e a constante de tempo da função modelo ao mesmo tempo, em particular não quando a função modelo é uma função monoexponencial. Além disso, o tempo inicial t0 e/ou o tempo final tm da função modelo não podem ser selecionados como parâmetros.

[00012] Quando essas condições básicas são satisfeitas, a cinética do metabolismo diferentemente progredindo de uma variedade de substratos e desse modo uma diversidade de cinéticas da geração do produto pode ser analisada, para finalmente poder determinar a capacidade metabólica de uma enzima ou de um sistema de enzimas. Os parâmetros selecionados da função modelo permitem conclusões diretas sobre a capacidade metabólica da enzima. A capacidade metabólica de uma enzima pode servir como uma base para a determinação quantitativa do estado de saúde de um indivíduo no que diz respeito às funções corporais específicas. Isto pode ocorrer nas etapas subsequentes do processo que não fazem parte do método reivindicado. Uma vez que as enzimas ocorrem em uma diversidade de órgãos ou compartimentos do corpo, o presente método é adequado como uma base para numerosos exames subsequentes. De preferência, o método pode formar a base para analisar a condição do fígado que é caracterizada, por exemplo, pela capacidade da função do fígado ou pela microcirculação no fígado.

[00013] A fim de obter dados confiáveis e significativos da capacidade metabólica determinada da enzima, é bastante vantajoso quando uma disponibilidade rápida do substrato no sangue do indivíduo pode ser assegurada. Uma ingestão oral do substrato é de modo geral inadequada para esta finalidade.

[00014] A dependência temporal da concentração do substrato no sangue (sem metabolismo) é especificada pela função S(t). A fim de obter uma definição mais exata da disponibilidade ou da liberação do substrato no sangue, o período FZ de liberação vai ser aqui definido. Deixemos que Cmax seja a concentração máxima prevista do substrato no sangue (sem metabolismo), t0 o momento no tempo, em que a concentração do substrato no sangue aumentou até 4% a 6% de Cmax, e o tm o momento no tempo, em que a concentração do substrato no sangue aumentou até 40% a 60% de Cmax, em particular, em que a concentração do substrato no sangue se encontra acima de 40%, acima de 50% ou acima de 60% de Cmax, então o período FZ de liberação é fornecido pela diferença de tempo entre tm e t0 (FZ = tm - t0). Em outras palavras, o período de liberação é o período de tempo que é necessário para atingir um aumento da concentração do substrato no sangue (prosseguindo com a suposição que a concentração se encontra ligeiramente acima de 0% de Cmax, no entanto, ainda em uma faixa de porcentagem de um só dígito de Cmax) por um fator de 10, em particular por um fator de 12, em particular por um fator de 15 e especialmente por um fator de 20.

[00015] O período de liberação para uma administração oral padrão de um substrato é tipicamente de mais de 5 minutos e varia consideravelmente entre os indivíduos dia após dia. Por esta razão, as administrações com um período longo de liberação conduzem a resultados distorcidos, porque os resultados de medição são mesclados com a função S(t) e consequentemente "borrados" com uma função que é desconhecida.

[00016] Os períodos longos de liberação, conhecidos da técnica anterior, e as desvantagens associadas quando a capacidade metabólica de uma enzima é determinada subsequentemente podem ser evitados por uma indução visada do aparelho do metabolismo do indivíduo, que deve ser examinado, por meio de uma administração não cirúrgica de um substrato. Para a indução visada, a dosagem do substrato é predeterminada, de modo que nas etapas subsequentes de interpretação a reação do aparelho de metabolismo no que diz respeito à dosagem do substrato possa ser estimada. De preferência, apenas os gases são examinados como produtos, a concentração dos quais muda pela indução do aparelho de metabolismo em consequência da administração do substrato. A indução do aparelho de metabolismo pelo substrato e a resposta do metabolismo que segue rapidamente a mesma é um ponto chave para a aplicação subsequente do método reivindicado.

[00017] Em uma modalidade a indução visada explicada do aparelho metabólico é uma parte do método que está precedendo a etapa de determinação com resolução de tempo da concentração do produto.

[00018] A administração e a liberação do substrato, que é dependente do tipo e da maneira de administração, ocorrem melhor de uma maneira tal que o período de liberação (e desse modo a disponibilidade do substrato no sangue) é mais rápido do que 60 segundos, em particular mais rápido do que 50 segundos, em particular mais rápido do qu 40 segundos, em particular mais rápido do que 30 segundos, em particular mais rápido do que 20 segundos e especialmente mais rápido do que 10 segundos.

[00019] O substrato é desse modo mais bem administrado em uma forma de dosagem que permite um tempo de liberação do substrato no sangue do indivíduo dentro dos tempos acima mencionados. Tal período curto de liberação pode ser basicamente obtido por várias formas de administração ou aplicações. Sem limitar a interpretação, algumas delas serão aqui apresentadas: a) inalação de um aerossol que contém o substrato, b) administração através da pele, por exemplo, com nanocarreadores eficientes, c) ingestão oral de um substrato cambiável (particularmente ativável), que é liberado pela absorção de energia. Depois de ser administração oralmente, o substrato, que no estado ligado é não degradável, pode desse modo ser completamente liberado dentro de um segundo pela aplicação de energia, em particular pela luz. Tais substratos no estado ligado também são chamados de compostos aprisionados em termos técnicos. O uso de tais compostos aprisionados permite uma liberação ultrarrápida e seletiva do substrato metabolizável correspondente, induzível a qualquer momento.

[00020] A disponibilidade rápida do substrato no sangue garante a disponibilidade rápida do substrato na enzima, cuja capacidade metabólica deve ser examinada.

[00021] Quando o substrato existe no sangue e se encontra na enzima, ele pode metabolizado pela enzima. Desse modo, o produto ou os produtos são gerados, os quais serão sempre referidos somente como um produto individual a seguir. As etapas do metabolismo têm que ser muito rápidas e ser melhor completadas dentro de 10 segundos, em particular dentro de 5 segundos, em particular dentro de 1 segundos, em particular dentro de 0,1 segundo, em particular dentro de 0,01 segundo, e em particular dentro de 0,001 segundo. Na faixa de tempo de disponibilidade do substrato isto garante um metabolismo virtualmente instantâneo. O produto ou produtos P, formados durante o metabolismo do substrato, são dissolvidos no sangue e exalados através do pulmão, de modo que eles possam então ser detectados no ar exalado pelo indivíduo. Mesmo que a referência seja feita atualmente a somente um produto, as modalidades do método também estão desse modo compreendidas em que não somente um produto individual mas múltiplos produtos são detectados.

[00022] Para especificar a capacidade metabólica da enzima, parâmetros diferentes de várias funções apropriadas podem ser usados. Os exemplos de parâmetros apropriados são parâmetros do grupo que compreende o valor máximo da função modelo, o i° momento da função modelo com i = 1, 2, 3, 4..., o j° momento central da função modelo com j = 1, 2, 3, 4., o desvio padrão da função modelo, uma constante de tempo da função modelo, o centro de gravidade das constantes de tempo, o desvio médio das constantes de tempo do centro de gravidade, a variação das constantes de tempo, a distribuição das constantes de tempo, a ponderação das constantes de tempo, a ponderação da distribuição das constantes de tempo, e a ponderação da variação das constantes de tempo.

[00023] Os momentos de uma função modelo são, por exemplo, explicados no manual de matemática de Bronstein e Semendjajew (páginas 665 a 668, 25a Ed., 1991). Nessa referência também podem ser encontradas numerosas outras funções de modelo e parâmetros de modelo, que podem ser usados individualmente ou em combinação entre si dentro do âmbito da presente invenção.

[00024] Um exemplo de dois parâmetros que são bem adequados para especificar a função modelo inclui a concentração ou quantidade máxima Pmax do produto P no ar que é respirado e o primeiro momento da função modelo de t0 a tm. O primeiro momento M1 é definido por: i k k k , com i = 1, em que a soma é calculada em relação a todos os pontos de medição k entre t0 e tm. Aqui, tk é o tempo do k° ponto de medição e pk é o valor medido da concentração do produto P no ar que é respirado nesse tempo tk.

[00025] Um exemplo adicional de dois parâmetros que são bem adequados para especificar a função modelo é a concentração ou quantidade máxima Pmax do produto P no ar que é respirado e o segundo momento central da função modelo de t0 a tm. O segundo momento central MZ2 é definido por: i k k 1 , com i = 2. Osegundo momento central é a variação do primeiro momento e fornece a largura da distribuição da função resultante do metabolismo examinado.

[00026] Outras combinações de parâmetros, por exemplo, de Pmax, M1 e MZ2, bem como de momentos mais elevados, momentos centrais mais elevados ou outros parâmetros, em particular os outros parâmetros mencionados acima, são possíveis e fornecem, dependendo da enzima examinada, a informação direta sobre a capacidade metabólica da enzima.

[00027] A função modelo pode ter basicamente uma ou múltiplas constantes de tempo. Por exemplo, no caso em que uma combinação de múltiplas funções é usada como função modelo, a função modelo tem múltiplas constantes de tempo. A existência de múltiplas constantes de tempo é um pré-requisito para o fato que, por exemplo, o centro de gravidade das constantes de tempo, o desvio médio das constantes de tempo do centro de gravidade, a variação das constantes de tempo, a distribuição das constantes de tempo, a ponderação das constantes de tempo, a ponderação das constantes de tempo ou a ponderação das constantes de tempo podem ser selecionados como parâmetros.

[00028] De preferência, a função modelo (ou a função de ajuste) é uma função da solução de uma equação diferencial da primeira ordem, uma função da solução de uma equação diferencial da segunda ordem, uma função da solução de uma equação diferencial da terceira ordem, uma função da solução de uma combinação de equações diferenciais de várias ordens ou uma função multiexponencial como uma função do tempo. Quando uma combinação de equações diferenciais de várias ordens é usada, a função da solução também pode incluir contribuições de uma equação diferencial da ordem zero.

[00029] Para permitir uma medição especialmente simples do ar exalado e obter ao mesmo tempo uma exatidão elevada dasmedições, por meio do que o valor informativo dos valores medidos obtidos melhora de maneira significativa, a determinação daconcentração do produto ocorre melhor em um fluxo passante.

[00030] Por uma medição da absorção de acordo com a lei de Beer-Lambert com um coeficiente de extinção conhecido e um comprimento de passagem conhecido da célula de medição a concentração da substância examinada pode ser obtida imediatamente. De preferência, além disso também é determinada a vazão do ar exalado, que flui através de um aparelho de mediçãousado para determinar a concentração. Então, a quantidade doproduto examinado pode ser calculada a partir do produto daconcentração e do volume, que fluíram através do aparelho demedição. O volume, que fluiu através do aparelho de medição, é obtido por uma multiplicação do fluxo volumétrico com o tempo dentro do qual o fluxo volumétrico é observado.

[00031] A resistência à respiração do instrumento de medição é aqui de preferência de menos de 100 mbar, em particular de menos de 80 mbar, em particular de menos de 70 mbar e especialmente de menos de 60 mbar. Isto é obtido, por exemplo, por uma estrutura aberta sem válvulas e sem aletas de ar.

[00032] O aumento do produto no sangue é espelhado proporcionalmente no ar que é respirado. A quantidade ou a concentração do produto é medida no ar que é respirado como uma função do tempo. Em uma modalidade o ar exalado é canalizado até toda a extensão (completamente) através de um instrumento de medição, por meio do que o produto é detectado. Ou seja, nesta modalidade todo o ar exalado de pelo menos uma respiração do indivíduo é usado como ar exalado. Desse modo, a concentração do produto no ar que é respirado pode ser determinada de uma maneira especialmente vantajosa enquanto minimiza o erro da medição ao não usar interpolações.

[00033] Em uma outra modalidade, o ar exalado de uma respiração ou de múltiplas respirações (cerca de 2 a 20 respirações, em particular 3 a 15 respirações, em particular 4 a 10 respirações, em particular 5 a 8 respirações) é completamente misturado, e uma parte dessa mistura é canalizada então através de um instrumento de medição, por meio do que o produto é detectado.

[00034] A fim de obter dados que possam ser especialmente bem reproduzidos, o indivíduo examinado deve ser mais bem posicionado em uma fase estável enquanto é determinada a concentração do produto na respiração. Com seres humanos e animais isto pode, por exemplo, ser assegurado ao não sujeitar o organismo a movimentos fortes durante a determinação da concentração do produto no ar exalado. Por exemplo, no estado deitado do indivíduo, o ato de levantar as pernas em 45 graus da posição horizontal pode mudar os valores medidos da concentração do produto no ar que é respirado. Por conta da função de armazenagem de sangue e sua distribuição no organismo, os movimentos de caminhar, correr ou ficar em pé conduzem a valores alterados da concentração do produto no ar exalado. Desse modo, a determinação da concentração do produto ocorre melhor quando o indivíduo se encontra essencialmente em uma posição de repouso. Essa posição de repouso pode ser uma posição deitada ou sentada. É vantajoso quando a posição das pernas e/ou da parte superior do corpo do indivíduo é mudada em menos de 45 graus, em particular em menos de 30 graus e especialmente em menos de 15 graus em comparação com a posição predeterminada. Na posição deitada do indivíduo essa posição predeterminada é, por exemplo, uma posição essencialmente horizontal do indivíduo.

[00035] De preferência, somente o aumento na concentração do produto (ou seja, a dinâmica do metabolismo) é analisado até o máximo. Esse máximo corresponde à concentração máxima de um produto no ar exalado pelo indivíduo. Esse aumento leva de preferência menos de 40 minutos, em particular menos de 20 minutos e especialmente menos de 10 minutos. Quanto mais tempo leva para aumentar, é mais provável que os próprios processos do corpo podem influenciar o resultado, por meio do que a exatidão total dos dados de medição obtidos diminui.

[00036] A execução do método atualmente reivindicado com a ajuda de espectroscopia NMR e/ou CT ocorre ligeiramente divergente a uma execução por meio de espectroscopia infravermelha e/ou espectrometria de massa. A espectroscopia NMR e a CT são métodos de medição de imagem e podem ser empregados, por exemplo, nas seguintes maneiras:a) Por meio de espectroscopia NMR e CT a área espacial de interesse é examinada. Além disso, o produto no ar que é respirado é analisado. Uma comparação de ambas as medições fornece novas informações.b) Por meio de espectroscopia NMR e CT a área espacial de interesse é examinada, enquanto o produto no ar exalado também é analisado. Uma comparação das sequências cronológicas de ambas as medições fornece novas informações. A espectroscopia NMR e CT podem aqui acompanhar o aumento e a diminuição da concentração do produto de uma maneira espacialmente resolvida. O uso de substratos etiquetados com isótopos ou de substratos com alta densidade de elétrons aqui permite o uso de espectroscopia NMR e CT de uma maneira especialmente vantajosa.

[00037] A fim de permitir uma comparação com outros indivíduos, é feita de preferência uma normalização com respeito ao peso do corpo do indivíduo examinado. Em particular, tal normalização pode ser realizada ao dividir o valor obtido que é indicativo para a capacidade metabólica pelo peso de corpo do indivíduo. No caso em que o peso do corpo já é considerado na função modelo que está sendo utilizada para obter um valor concomitante que é indicativo para a capacidade metabólica, o peso de corpo é considerado duas vezes durante todo o método. Como um exemplo, é concebível que o valor que é indicativo para a capacidade metabólica contenha uma unidade em que kg2 está presente no denominador. Este deve ser o resultado de duas divisões consecutivas pelo peso do corpo do indivíduo (ou de uma divisão pelo quadrado do peso do corpo do indivíduo).

[00038] Em uma modalidade, a função modelo pode ser expressa pela seguinte fórmula:MetPow = cal * [F(product, t) - f(product, t)nat]* g(P)* h(n)* L(n/M) * (n/M2) * V(n/M), em queMetPow denota a capacidade metabólica,cal é uma constante que leva em conta as correções, F(product, t) é uma função que expressa a dinâmica do produto exalado,f(product, t)nat é uma função que expressa aabundância natural do produto no ar exalado pelo indivíduo antes da administração do substrato, g(P) é uma função que expressa a dependência da taxa de produção do produto P do indivíduo no status de atividade do indivíduo,h(n) é uma função que expressa o número de moléculas do produto geradas por molécula do substrato,L(n/M) é uma função que expressa um comportamento não linear da capacidade metabólica dependente do número de moléculas de substrato administradas, em que M denota o peso do corpo do indivíduo, eV(n/M) é uma função que expressa as dependênciasdevido aprocedimentos diferentes de administração do substrato.

[00039] Todas essas funções individuais e constantes da função modelo exemplificadora serão explicadas em mais detalhes a seguir com respeito a uma modalidade específica em relação a 13CO2 como produto do metabolismo de um substrato etiquetado com 13C. Essas explanações não devem ser interpretadas como limitadoras para a fórmula geral de MetPow indicada acima, mas irão ajudar a compreender melhor os parâmetros individuais dessa função modelo.

[00040] Um exemplo preferido do método reivindicado é a determinação da função metabólica de um órgão, por exemplo, o fígado, medida através da dinâmica metabólica de um substrato etiquetado com 13C por meio da determinação da capacidade metabólica de uma enzima. Um substrato possível é a 13C-metacetina que é metabolizada em 13CO2 e paracetamol nas células do fígado pela enzima CYP450 1A2. Outros substratos, tal como a 13C-cafeína, também são apropriados para uma determinação concomitante.

[00041] A dinâmica de 13CO2 gerado pelo metabolismo fornece a informação sobre a função metabólica do fígado ou um outro órgão. Infelizmente, o 13CO2 tem uma abundância natural de cerca de 1,1% de CO2 total no corpo humano. Desse modo, é preciso discriminar entre a abundância natural no corpo e o 13CO2 adicional gerado pelo metabolismo do substrato no fígado. Outros substratos com produtos diferentes de metabolismo podem não sofrer essas limitações. Uma maneira comum para determinar a abundância natural de 13CO2 no corpo consiste em medir a relação de 13CO2 e 12CO2 antes da administração do substrato. Dependendo do procedimento de medição a abundância natural será calculada por uma função f(13CO2, 12CO2)nat. Dois exemplos possíveis para esta função são:f(13CO2, 12CO2)nat = k1 * 13CO2/12CO2 * 0,011,com um número constante k1;ouf(13CO2, 12CO2)nat = k2 * (k3 * 13CO2 — 12CO2)/(13CO2 — 12CO2), com os números constantes k2 e k3.

[00042] Outras funções também são possíveis. Em particular, se a abundância natural de 13CO2 no corpo for determinada por um determinado período de tempo ou expressa como um valor médio de medição diferente em pontos distintos do tempo, uma dependência do tempo deve ser considerada. Então, essa função deve ser escrita como f(13CO2, 12CO2, t)nat. Se não existir nenhuma dependência do tempo, f(13CO2, 12CO2, t)nat é igual a f(13CO2, 12CO2)nat.

[00043] A fim de determinar a função metabólica da dinâmica do 13CO2 exalado ou da dinâmica da relação exalada de 13CO2/12CO2, é utilizada a função F(13CO2, 12CO2, t). A forma a mais fácil dafunção F consiste em tomar o valor máximo da dinâmica no tempo tmax. Uma outra opção consiste em usar o primeiro ou segundo momento da dinâmica ou usar uma combinação da área sob a curva até o valor máximo, da área sob a curva até a metade do valor máximo e a duração desses pontos do tempo. Outras combinações também são possíveis ao usar as funções descritas acima.

[00044] Em uma modalidade, a função total que descreve o poder metabólico do fígado MetPow (que é idêntico à capacidade metabólica de uma enzima selecionada) é fornecida pela seguinte fórmula: MetPow = cal * [F(13CO2, 12CO2,t)-f(13CO2, 12CO2, t)nat] * g(PCO2) * h(n) * L(n/M) * (n/M2) * V(n/M)

[00045] Nessa fórmula, o número constante cal leva em conta as correções, em particular devido à calibração das experiências e devido às aplicações médicas.

[00046] PCO2 denota a taxa de produção total de CO2 que depende do status da atividade do indivíduo que respira (em repouso ou praticando um esporte) que determina os valores de 12CO2 e 13CO2 naturais no ar exalado Desse modo, a taxa total de produção de CO2 é aqui descrita pela função g(PCO2). No caso mais simples de um indivíduo em repouso, a função é fornecida por g(PCO2) = k4 * PCO2, com k4 = 1.

[00047] A função h(n) descreve a parte das moléculas que serão metabolizadas pelo fígado em 13CO2. O número de moléculas do substrato n é fornecido em mol. Dependendo do substrato, ele pode variar entre x e 0, em que x é um número maior do que 0. Os substratos altamente funcionais têm valores de x próximos de ou acima de 1. Um substrato com x = 3 significa que, por molécula de substrato, 3 moléculas de 13CO2 serão geradas pelo metabolismo.

[00048] A função V(n/M) descreve as dependências devidas a vários procedimentos de administração dos substratos. Por exemplo, as administrações oral e intravenosa resultam em processos metabolicamente diferentes e constantes de tempo diferentes. Essas diferenças são corrigidas pela função V(n/M).

[00049] Uma vez que o número de moléculas de substrato metabolizadas aumenta com o aumento das moléculas de substrato, os valores de sinais medidos da dinâmica aumentam com o número crescente de moléculas de substrato. Para o metabolismo do fígado é útil a administração de uma quantidade específica de moléculas por peso do corpo ao quadrado M2. Isto leva em conta que o fígado aumenta ao seu poder com o aumento do peso do corpo ao quadrado. Desse modo, o poder metabólico do fígado é proporcional a n/M2.

[00050] Finalmente, devido aos processos de distribuição dentro do corpo, os processos de difusão e de transporte nas membranas celulares das células do fígado, o poder do metabólico determinado "MetPow" do fígado depende não linearmente do número de moléculas de substrato administradas n. A função L(n/M) descreve essa funcionalidade. A função L(n/M) tem algumas regiões, onde mostra uma dependência linear, mas com a administração crescente de dosagens desvia cada vez mais de uma dependência linear.

[00051] Em uma modalidade, g(P) é P - ou se o produto for CO2, g(PCO2) é PCO2, respectivamente - e/ou V(n/M) é 1 e/ou h(n) é 1.

[00052] No caso mais simples, representando uma modalidade mais preferida, quando g(PCO2) = PCO2, V(n/M) = 1 e h(n) = 1 o poder metabólico do fígado é calculados por:MetPow = cal * [F(13CO2, 12CO2, t) - f(13CO2, 12CO2, t)nat] * PCO2 * (n/M2) * L(n/M)

[00053] Em uma modalidade, é possível calcular F(13CO2, 12CO2, t) da mesma maneira como f(13CO2, 12CO2)nat, por exemplo, por uma das duas equações concomitantes indicadas acima

[00054] O poder metabólico do fígado MetPow pode ser usado para determinar a máxima capacidade possível do fígado pela variação da dosagem (n/M) e da interpolação da função L(n/M). Em todo o caso, o pode metabólico pode ser visto como equivalente à capacidade metabólica de uma enzima selecionada. Embora o poder metabólico do fígado seja aqui escolhido como exemplo ilustrativo, todas as explanações acima também podem ser transferidas ao poder metabólico de um órgão em geral e também se aplicar à determinação da capacidade metabólica de uma enzima sem deduções adicionais para a função ou o poder metabólico de um órgão.

[00055] A fim de determinar a concentração do produto, vários métodos de medição altamente sensíveis e com resolução de tempo tais como, por exemplo, a espectroscopia de absorção infravermelha, a espectrometria de massa, a espectroscopia de ressonância magnética nuclear (espectroscopia NMR) ou a tomografia computadorizada (CT), por exemplo, na forma de CT de volumetria, podem ser usados individualmente ou em qualquer combinação de uns com os outros. Por tal combinação, as vantagens respectivas dos métodos individuais de medição podem ser combinadas entre si para poder desta maneira fazer indicações suplementares ou mais exatas na capacidade metabólica da enzima.

[00056] Os substratos apropriados, que por um lado podem ser metabolizados por enzimas do indivíduo examinado e cujos metabólitos podem ser facilmente detectados, incluem metacetina etiquetada com 13C, fenacetina etiquetada com 13C, aminopirina etiquetada com 13C, cafeína etiquetada com 13C, eritromicina etiquetada com 13C e/ou etóxi cumarina etiquetada com 13C. O uso desses substratos, individualmente ou em combinação, em um método de acordo com as explanações acima, também é objeto da presente invenção.

[00057] As dosagens aqui preferíveis são de cerca de 0,1 mg a 10 mg por kg do peso do corpo do indivíduo, em particular de 0,5 mg a 9 mg, em particular de 1 mg a 8 mg, em particular de 2 mg a 7 mg, em particular de 3 mg a 6 mg e especialmente de 4 mg a 5 mg por kg do peso do corpo do indivíduo.

[00058] Dentro do âmbito do presente método, de preferência é determinado o teor absoluto de um produto de metabolismo etiquetado com 13C, em particular o teor de 13CO2, no ar exalado. Aqui, a medição do teor de produto etiquetado com 13C, em particular do teor de 13CO2, no ar exalado pode ocorrer ambos em tempo real e continuamente. Uma determinação contínua da concentração do produto do metabolismo etiquetado com 13C, em particular da concentração de 13CO2, no ar exalado no instrumento de medição resulta na detecção de mais pontos de dados, por meio do que seguem uma definição e uma precisão mais elevadas da curva de medição, calculadas a partir dos pontos de dados detectados.

[00059] Muitos substratos, que devem ser apropriados para a detecção direta de uma dinâmica do metabolismo pela determinação da concentração do produto no ar exalado por um indivíduo, são infelizmente difíceis de dissolver. Essa não é uma desvantagem quando esses substratos são ingeridos oralmente e ativados mais tarde no sangue pela indução de luz (compostos aprisionados). As forma alternativas de administração em parte são baseadas no fato que esses substratos podem ser dissolvidos, por exemplo, em uma solução aquosa ou em uma solução ligeiramente volátil. Para esta finalidade, nanocarreadores podem ser empregados, os quais podem ser especificamente modelados e consequentemente contêm áreas que podem absorver o substrato de uma forma suficiente. O desenvolvimento de nanocarreadores oferece possibilidades ilimitadas e pode ser empregado para a análise da respiração em espectroscopia infravermelha, em espectrometria de massa, em CT e/ou em espectroscopia NMR.

[00060] Se alguém não quiser confiar em compostos aprisionados ou em nanocarreadores, o uso de um solubilizante tal como, por exemplo, o propileno glicol, é recomendável para obter uma solubilidade melhor do substrato. O uso de uma solução aquosa de 13C-metacetina e um solubilizante, em particular o propileno glicol, em um método de acordo com as explanações acima também é desse modo objeto da presente invenção.

[00061] A concentração do solubilizante, em particular de propileno glicol, é aqui de preferência de 10 a 100 mg/ml, em particular de 20 a 80 mg/ml, em particular de 30 a 70 mg/ml e especialmente de 40 a 60 mg/ml, e a concentração de 13C-metacetina é de preferência de 0,2 a 0,6% em peso por peso, em particular de 0,3 a 0,5% em peso por peso ou de cerca de 0,4% em peso por peso.

[00062] Em uma modalidade alternativa, a 13C-metacetina éempregada até mesmo a uma concentração mais elevada, ou seja, a uma concentração de mais de 3% em peso por peso, em particular de mais de 4% em peso por peso, em particular de mais de 5% em peso por peso. A concentração do solubilizante aqui pode ficar compreendida nas faixas mencionadas previamente.

[00063] Outras vantagens e detalhes da invenção reivindicada atualmente serão explicados ainda com a ajuda das figuras de modalidades exempificadoras.

[00064] A Fig. 1 mostra uma representação gráfica da cinética da concentração de um produto metabolizado durante o período de medição, ea Fig. 2 mostra uma representação gráfica da não linearidade do poder metabólico do fígado determinado de acordo com uma modalidade.

[00065] A Figura 1 mostra uma representação gráfica da concentração medida do produto no ar exalado por um indivíduo como uma função do tempo. Como substrato, a metacetina etiquetada com 13C a uma dose de 2 mg por kg do peso do corpo do indivíduo foi administrada ao indivíduo, em que o período de liberação era mais curto do que 60 segundos. No corpo do indivíduo a metacetina etiquetada com 13C foi metabolizada no fígado em paracetamol e CO2 etiquetado com 13C. Este último foi detectado como produto no ar exalado pelo indivíduo.

[00066] O diagrama da Figura 1 mostra um aumento na concentração de 13CO2 na forma do valor delta sobre a linha basal (valor DOB) no ar exalado. 1 DOB aqui refere-se a uma mudança da relação entre 13CO2 e 12CO2 por um milésimo acima da relação natural. Os valores medidos obtidos, ilustrados na Figura 1, são ajustados subsequentemente com uma função modelo apropriada. Isto não é ilustrado ainda na Figura 1. A partir dessa função modelo - com uma equação da função familiar como tal - parâmetros diferentes podem agora ser derivados, os quais especificam a função. A partir desses parâmetros as conclusões podem ser tiradas sobre a capacidade metabólica do sistema de enzimas examinado.

[00067] O ponto do tempo do metabolismo máximo de metacetina (tmax, a cerca de 6,5 minutos) e o ponto do tempo da metade do metabolismo máximo de metacetina (t1/2, a cerca de 1,5 minuto) são indicados na Figura 1.

[00068] Uma vez que a metacetina é quase que unicamente metabolizada no fígado, com a dinâmica do metabolismo especificada é possível acompanhar direta e imediatamente o metabolismo do substrato administrado pelas enzimas existentes no fígado. Desta maneira, a metacetina administrada é desmetilada pela enzima CYP450 1A2 no fígado. Ao interpretar a cinética aumentada da metacetina administrada e os parâmetros derivados da mesma, é agora possível determinar diretamente a função do fígado. Aqui, por exemplo, o valor da concentração máxima do produto no ar exalado Pmax permite que seja feita uma indicação sobre o número de células saudáveis do fígado e o volume do fígado que fica desse modo disponível para o metabolismo; ao passo que o aumento na forma da(s) constante(s) do tempo da função modelo, ajustado aos valores medidos, permite que sejam feitas indicações sobre a velocidade de entrada do substrato nas células do fígado. A(s) constante(s) do tempo da função modelo permite(m) desse modo que as indicações sejam feitas sobre o fato se o fígado tem mesmo a capacidade de absorver substratos. A partir da dispersão de constantes do tempo, podem ser tiradas conclusões sobre as diferenças intercelulares no que diz respeito a uma susceptibilidade ao substrato das células do fígado.

[00069] A Figura 2 mostra a não linearidade do poder metabólico do fígado determinado pelo metabolismo da metacetina. O poder metabólico foi determinado de acordo com as fórmulas indicadas acima para os metabolismos diferentes da metacetina observados após a administração da metacetina a dosagens diferentes. Especificamente, foram administrados 1 mg de metacetina etiquetada com 13C por kg do peso do corpo, 2 mg/kg, 4 mg/kg e 8 mg/kg.

[00070] 1 mg de metacetina etiquetada com 13C por kg do peso docorpo M, bem como 2 mg/kg, revelam uma dependência linear nos sinais medidos. O aumento da administração para 4 mg/kg mostra que 10% de desvio do comportamento linear e da administração de 8 mg/kg mostra mais de 20% de desvio do comportamento linear.

[00071] Essa não linearidade é expressa pela função L(n/M), em que n denota o número de moléculas de substrato, isto é, as moléculas de metacetina, e M denota o peso do corpo em quilogramas. Essa função L(n/M) faz parte da curva apropriada representada na Figura 2 pela curva de interpolação entre os pontos de medição individuais. A curva reta indica uma curva de interpolação hipotética se uma dependência linear do poder metabólico na dosagem do substrato for suposta e nenhum efeito não linear for considerado.

Claims (10)

1. Método para determinar a capacidade metabólica de pelo menos uma enzima compreendendo as seguintes etapas:determinar a resolução de tempo da concentração de um produto no ar exalado por um indivíduo, em que o produto foi criado por um metabolismo de um substrato, administrado previamente ao indivíduo, por pelo menos uma enzima do indivíduo,ajustar uma função modelo aos valores medidos da concentração do produto, que foram obtidos pela determinação com resolução de tempo da concentração do produto, edeterminar a capacidade metabólica da enzima com base nos parâmetros da função modelo, que especificam a função modelo, caracterizado pelo fato de quea concentração do produto é determinada apenas até que a concentração máxima do produto no ar exalado pelo indivíduo seja alcançada e em que a determinação da capacidade metabólica da enzima ocorre baseada em pelo menos dois parâmetros da função modelo, contanto que o valor máximo da função modelo e a constante de tempo da função modelo não sejam selecionados como parâmetros ao mesmo tempo, uma vez que a função modelo é uma função monoexponencial, e também contanto que um tempo inicial e/ou um tempo final da função modelo sejam outros que os selecionados como parâmetros.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que os parâmetros são selecionados do grupo que compreende o valor máximo da função modelo, o i-th momento da função modelo com i = 1, 2, 3, 4..., o j-th momento central da função modelo com j = 1, 2, 3, 4., o desvio padrão da função modelo, uma constante de tempo da função modelo, o centro de gravidade das constantes de tempo, o desvio médio das constantes de tempo do centro de gravidade, a variação das constantes de tempo, a distribuição das constantes de tempo, a ponderação das constantes de tempo, a ponderação da distribuição das constantes de tempo, e a ponderação das constantes de tempo.

3. Método, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que a determinação da concentração do produto ocorre em fluxo passante para que o ar exalado está fluindo através de um aparelho de medição que é utilizado para determinar a concentração, em que é determinado um fluxo de ar exalado.

4. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que todo o ar exalado de pelo menos uma respiração do indivíduo é utilizado como ar exalado.

5. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que a determinação da concentração do produto ocorre quando o indivíduo se encontra essencialmente em uma posição de repouso.

6. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que a determinação da concentração do produto ocorre quando o indivíduo se encontra em uma posição, deitado ou sentado, na qual a posição das pernas e/ou da parte superior do corpo do indivíduo é alterada em menos de 45 graus, em particular em menos de 30 graus e especialmente em menos de 15 graus em comparação com a posição predeterminada.

7. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que a função modelo pode ser expressa pela seguinte fórmula:MetPow = cal * [F(product, t) - f(product, t)nat]* g(P)* h(n) * L(n/M) * (n/M2)* V(n/M), na qualMetPow denota a capacidade metabólica, cal é uma constante que leva em conta as correções, F(product, t) é uma função que expressa a dinâmica do produto exalado,f(product, t)nat é uma função que expressa aabundância natural do produto no ar exalado pelo indivíduo antes da administração do substrato,g(P) é uma função que expressa a dependência da taxa de produção do produto P do indivíduo no status de atividade do indivíduo,h(n) é uma função que expressa um número de moléculas do produto geradas por molécula do substrato,L(n/M) é uma função que expressa um comportamento não linear da capacidade metabólica dependente do número de moléculas de substrato administradas, em que M denota o peso do corpo do indivíduo, eV(n/M) é uma função que expressa as dependênciasdevido a procedimentos diferentes de administração do substrato.

8. Método, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que g(P) = P e/ou h(n) = 1 e/ou V(n/M) = 1.

9. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que a função modelo pode ser expressa pela seguinte fórmula:MetPow = cal * [F(product, t) - f(product, t)nat] * g(P) * h(n) * L(n/M) * (n/M2) * V(n/M), na qualMetPow denota a capacidade metabólica,cal é uma constante que leva em conta as correções,F(13CO2, 12CO2, t) é uma função que expressa a dinâmica de 13CO2 exalado como produto ou expressa a dinâmica da relação exalada de 13CO2/12CO2, f(13CO2, 12CO2)nat é uma função que expressa a abundância natural de 13CO2 e 12CO2 no ar exalado pelo indivíduo antes da administração do substrato,g(PCO2) é uma função que expressa a dependência dataxa de produção de CO2 PCO2 do indivíduo no status de atividade do indivíduo,h(n) é uma função que expressa o número de moléculas de CO2 geradas por molécula do substrato,L(n/M) é uma função que expressa um comportamento não linear da capacidade metabólica dependente do número de moléculas de substrato administradas, em que M denota o peso do corpo do indivíduo, eV(n/M) é uma função que expressa as dependênciasdevido a procedimentos diferentes de administração do substrato.

10. Método, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que g(PCO2) = PCO2 e/ou h(n) = 1 e/ou V(n/M) = 1.

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