DE19811735A1 - Verfahren zur Bestimmung des Einflusses einer Einwirkung auf ein respiratorisches System - Google Patents
Verfahren zur Bestimmung des Einflusses einer Einwirkung auf ein respiratorisches SystemInfo
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Abstract
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung des Einflusses einer Einwirkung auf ein respiratorisches System, bei dem ein Präparat, umfassend ein respiratorisches System, so in eine Vorrichtung eingebracht wird, daß ein erstes Fluid mit der apikalen Seite des Präparates und ein zweites Fluid mit der basalen Seite des Präparates in Kontakt gebracht wird, das Präparat der Einwirkung ausgesetzt wird und das erste und/oder zweite Fluid einer Analyse unterzogen wird.
Description
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung
des Einflusses einer Einwirkung auf ein respiratorisches System,
ein Verfahren zur Bestimmung von Faktoren, die die Folgen einer
Einwirkung auf ein respiratorische System an ein biologisches Sys
tem vermitteln, derartige Faktoren sowie eine Vorrichtung zur An
wendung in einem der Verfahren.
Eine für die Entwicklung von landlebenden Wirbeltieren wesentliche
Voraussetzung war das Vorhandensein eines Atmungsapparates, der
erlaubt, daß Sauerstoff aus der Außenwelt in den Körper zur Erhal
tung der aeroben zellulären Stoffwechselvorgänge aufgenommen und
Kohlendioxid als Produkt der inneren Zellatmung an die Luft ab
gegeben wird.
Hierzu ist das Atmungssystem strukturell und funktionell geglie
dert und umfaßt zum einen ein luftleitendes System für den Trans
port der ein- und ausgeatmeten Gasgemische und ein respiratoris
ches System für den passiven Austausch des Gasgemisches zwischen
dem Blut und der Luft.
Anatomische und histologische Untersuchungen haben ergeben, daß
das luftleitende System im wesentlichen von einem respiratorischen
Epithel ausgekleidet wird, das einem fibroelastischen Bindegewebe
mit meist seromukösen Drüsen aufliegt. Zusätzlich sind ausgeprägte
Gefäßnetze und stellenweise glatte Muskulatur entwickelt. An der
Außenseite des luftleitenden Systems finden sich vorrangig hyaline
Knorpelspangen oder -ringe.
Das respiratorische Epithel kleidet im wesentlichen die Atemwege
von der Nasenhöhle bis zu den Endbronchiolen aus. Es wird von
einem einschichtigen, mehrreihigen, hochprismatischen Epithel ge
bildet, das die folgenden Zelltypen einschließt: Epithelzellen
(Flimmerzellen), Becherzellen, Bürstenzellen, Basalzellen und
APUD-Zelen (Amine and Precusor Uptake and Decarboxylation).
Der größte Teil der Epithelzellen trägt an seiner freien Oberflä
che Kinozilien, die durch ihren synchronen Wimpernschlag mit der
Luft eingedrungene Fremdstoffe oder körpereigene Partikel in Rich
tung Pharynx transportieren (Flimmerzellen). Um diese "Selbstrei
nigung" der luftführenden Atemwege zu unterstützen, wird die Haf
tung der Teilchen an der Oberfläche der Zilien durch Schleim er
höht. Hierfür sind zusätzlich in hoher Zahl schleimproduzierende
Becherzellen intraepithelial lokalisiert. Diese treten bevorzugt
in den oberen Luftwegen auf, um nicht in der Lunge eine "Ver
schleimung" zu induzieren. Zusätzlich tragen sie zusammen mit den
subepithelialen gemischten Drüsen dazu bei, die ventilierte Atem
luft zu befeuchten. Neben diesen beiden Zellpopulationen treten
Epithelzellen mit Mikrovilli (Bürstenzellen) auf, die als Ersatz
zellen für kinozilientragende Zellen und für Becherzellen ange
sehen werden. Das Epithel schließt basal außerdem Reservezellen
(Basalzellen) ein, die durch Teilung zur Transformation in andere
Zellen befähigt sind.
In der Lamina epithelialis sind von besonderer Bedeutung die neu
roendokrinen K-Zellen (Kultschitzky-Zellen) und die APUD-Zellen,
die besonders bei jungen Tieren ausgeprägt sind und mit Nervenen
digungen im Kontakt stehen und biogene Amine produzieren. Der La
mina epithelialis schließt sich die Lamina propria an. In diesen
Gewebeschichten und in der Tela submucosa liegen tubuloazinöse
Einzeldrüsen (Trachealdrüsen). Die Epithelzellen der Ausführungs
gänge produzieren bevorzugt ein muköses, an sauren Glykoproteinen
reiches Sekret, während die azinösen Endstücke ein seröses, neu
trales Glykoprotein abgeben. Die Drüsen schieben sich oftmals zwi
schen die Knorpelspangen und können bis in die Tunica adventitia
vordringen. Die Ausführungsgänge weisen ein isoprismatisches Epi
thel auf und werden außen von glatten Muskelzellen umgeben.
Das luftleitende System beginnt im wesentlichen mit der Trachea,
die sich nach Aufteilung in die beiden Hauptbronchien immer mehr
auf zweigt und verästelt, um letzlich in die kleineren Bronchien
(Bronchioli veri) überzugehen, die sich ihrerseits mehrfach in
Endbronchiolen teilen und das Ende des luftleitenden Systems des
Atmungsapparates darstellen, an den sich der respiratorische Teil
anschließt.
Der respiratorische Teil beginnt mit dem ersten Auftreten von
kleinen, sackförmigen Ausstülpungen (Alveolen) in der Wand der
Bronchioli. Durch mehrfache Aufzweigungen entstehen enge, luftfüh
rende Gänge, deren Wände vollständig mit Alveolen besetzt sind,
die schließlich wiederum in die Sacculi alveolares übergehen, in
denen der Gasaustausch stattfindet.
Hinsichtlich ihrer Struktur entsprechen die Bronchien im wesent
lichen der Trachea. Auch hier findet sich ein mit Becherzellen
ausgestattetes respiratorisches Flimmerepithel. Die in den Bronch
ien auftretende Flüssigkeit setzt sich aus Schleim, proteinhal
tigen Serumbestandteilen, Immunglobulin A, Laktoferrin und Glyko
proteinen zusammen.
Gleiches gilt auch für die Bronchioli, in deren Epithel auch hoch
prismatische Zellen ohne Zilien ("Clara"-Zellen) auftreten. Diese
Zellen sezernieren proteolytische und muzinlösende Enzyme zur Ver
flüssigung des Bronchialschleims.
Neben diesen strukturellen Komponenten weist das Alveolargewebe
und die Bronchialschleimhaut auch eine weitere, funktionell defi
nierte Komponente auf, nämlich das Bronchus-assoziierte Immunsys
tem (BALT). Das BALT schützt als Teil des sekundären (peripheren)
lymphatischen Gewebes den Organismus vor Antigenen, die über die
Atemluft auf die Schleimhaut des Respirationstraktes gelangen.
Morphologische Merkmale des BALT sind ein von Lymphozyten durch
setztes Epithel und in der Submucosa und Lamina propria gelegene
Lymphozytenaggregate. Die Aktivität des BALT wird vom autonomen
Nervensystem beeinflußt.
Die Innervation des Bronchialtraktes erfolgt auf vielfältige Wei
se. Zum einen tritt ein adrenerges System sowie ein cholinerges
System auf, zum anderen ein nicht-adrenerges, nicht-cholinerges
System (NANC), das sich Neuropeptide als Transmitter bedient. Bis
her sind die folgenden Substanzen als Transmitter des NANC bekan
nt: Vasoaktives intestinales Polypeptid (VIP), Substanz P (SP),
Neurokinin A (NKA), Neurokinin B (NKB), Neuropeptid K (NPK) und
Calcitonin gene related peptide (CGRP).
Das Atemsystem ist neben seiner Bedeutung für den Gasaustausch
auch unter dem Aspekt von Bedeutung, daß es neben der Haut das
jenige Organ ist, das mit der Umwelt am engsten unmittelbar in
Kontakt tritt. Infolgedessen ist das Atmungssystem auch dasjenige
Organ, das einer Vielzahl von durch die Umwelt an den Organismus
herangetragenen Einwirkungen ausgesetzt ist und diese (Umwelt)-Rei
ze an den Gesamtorganismus weitergibt. Die Art der Einwirkun
gen ist dabei von sehr verschiedener Qualität, nicht zuletzt ges
taltet oder zumindest beeinflußt vom Menschen selbst. Beispielhaft
sei hier auf das Rauchen verwiesen.
Die eingangs geschilderte Komplexität des Atmungssystems macht
eine Analyse der Vorgänge, die im Atmungssystem unter den ver
schiedenen Einwirkungen ablaufen, sehr schwierig. Gleichwohl ist
ein Verständnis dieser Abläufe erforderlich, um die Einwirkung
bspw. von in der Atemluft enthaltenen Chemikalien auf den Organis
mus, insbesondere den menschlichen Organismus, zu verstehen und
gegebenenfalls Gegenmaßnahmen zu entwickeln. Dieser Aspekt ist
bspw. im Bereich der Arbeitsmedizin von großer Bedeutung, wenn in
der Arbeitsumgebung vorhandene Chemikalien hinsichtlich ihres Ge
fährdungspotentials für den Menschen eingestuft werden sollen.
Aber auch in der Pharmazeutik sind derartige Fragestellungen von
Bedeutung, da somit die besonders effektive Verabreichung von
Träger- und Wirkstoffen über die Atemwege untersucht und optimiert
werden kann.
Im Stand der Technik sind im wesentlichen zwei Verfahrensweisen
bekannt, um den Einfluß einer Einwirkung, wie bspw. einer chemis
chen Verbindung, auf das respiratorische System zu untersuchen.
Dies ist zum einen die in vivo-Untersuchung an einem geeigneten
Tiermodell und zum anderen die in vitro-Untersuchung, typischer
weise an Zellkulturen.
Die Verwendung von Tiermodellen ist aus vielerlei Gründen nicht
erstrebenswert. Zum einen bestehen ethische Bedenken und zum an
deren sind Tiermodelle auch mit einer Vielzahl von technischen
Problemen und Einschränkungen verbunden. Darüberhinaus ist eine
wesentliche Voraussetzung das Vorhandensein eines geeigneten Tier
modells, das die Übertragung der erhaltenen Daten auf den Menschen
erlaubt. Tiermodelle stellen jedoch auch ein komplexes System dar
und die Untersuchungsmöglichkeiten liefern in Regel nur eine sys
temische Antwort auf die applizierte Einwirkung und keine Aussagen
über die grundlegenden molekularen und zellulären Vorgänge sowie
deren Wechselwirkungen, an denen letztendlich neue Strategien oder
Maßnahmen ansetzen müßten, um zu einer kausal orientierten Vor
gehensweise zu gelangen.
Die Verwendung von aus Zellen des Atmungsapparates hergestellten
Zellkulturen ermöglicht im Unterschied zum Tiermodell zwar das
Aufzeigen der molekularen Vorgänge an einzelnen, ein respiratori
sches System aufbauenden Zellen unter dem Einfluß einer Einwirk
ung, wie eines chemischen Reizes, erlaubt jedoch nicht das Aufzei
gen und die Analyse der bedingt durch die Vielzahl der im respira
torischen System vorhandenen Zelltypen vielfältigen Interaktionen
zwischen den Zelltypen und der daraus resultierenden prä-systemis
chen Reaktion.
Der vorliegenden Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde ein Verfah
ren zur Bestimmung des Einflusses einer Einwirkung auf ein respira
torische System bereitzustellen, das eine über die das molekulare
Geschehen hinausgehende Darstellung und Bestimmung der Abläufe
erlaubt. Dabei sollen die mit der Verwendung von Tiermodellen ver
bundenen Schwierigkeiten und Nachteile vermieden werden.
Es ist somit eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfah
ren zur Bestimmung des Einflusses einer Einwirkung auf ein respir
atorisches System zur Verfügung zu stellen, das die bekannten
Nachteile von Zellkulturen und Tiermodellen vermeidet.
Weiterhin ist es Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren
zur Bestimmung vorm Faktoren, die die Folgen einer Einwirkung auf
ein respiratorische System an ein biologisches System vermitteln,
zur Verfügung zu stellen, das die Verwendung von Tiermodellen
nicht erforderlich macht.
Eine Aufgabe der Erfindung ist auch, Faktoren bereit zustellen, die
die Folgen einer Einwirkung auf ein respiratorisches System an ein
biologisches System vermitteln.
Schließlich ist es Aufgabe der vorliegenden Erfindung, eine Vor
richtung zur Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren bereit
zustellen.
Erfindungsgemäß wird die Aufgabe gelöst durch ein Verfahren zur
Bestimmung des Einflusses einer Einwirkung auf ein respiratoris
ches System, bei dem
ein Präparat umfassend ein respiratoisches System so in eine Vor richtung eingebracht wird, daß ein erstes Fluid mit der apikalen Seite des Präparates und ein zweites Fluid mit der basalen Seite des Präparates in Kontakt gebracht wird,
das Präparat der Einwirkung ausgesetzt wird, und
das erste und/oder zweite Fluid einer Analyse unterzogen wird.
ein Präparat umfassend ein respiratoisches System so in eine Vor richtung eingebracht wird, daß ein erstes Fluid mit der apikalen Seite des Präparates und ein zweites Fluid mit der basalen Seite des Präparates in Kontakt gebracht wird,
das Präparat der Einwirkung ausgesetzt wird, und
das erste und/oder zweite Fluid einer Analyse unterzogen wird.
Weiterhin wird die Aufgabe gelöst durch ein Verfahren zur Bestim
mung von Faktoren, die die Folgen einer Einwirkung auf ein respir
atorisches System an ein biologisches System vermitteln, das das
erfindungsgemäße Verfahren zur Bestimmung des Einflusses einer
Einwirkung auf ein respiratorisches System verwendet.
Desweiteren wird die Erfindung gelöst durch Faktoren, die erhalten
werden können durch das erfindungsgemäße Verfahren.
Schließlich wird die Aufgabe auch gelöst durch eine Vorrichtung,
die zumindest eine zweiteilbare Kammer aufweist, wobei durch das
in die Kammer eingebrachte Präparat die Kammer in einen ersten
Kammerteil und einen zweiten Kammerteil unterteilt wird und das in
dem jeweiligen Kammerteil enthaltene Fluid getrennt ist von dem
Fluid des anderen Kammerteils.
Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren zur Bestimmung des Einflusses
einer Einwirkung auf ein respiratorisches System kann vorgesehen
sein, daß die Einwirkung auf das respiratorische System durch eine
chemische Verbindung erfolgt.
In einer Ausführungsform kann vorgesehen sein, daß die chemische
Verbindung in dem ersten und/oder zweiten Fluid vorhanden ist.
In einer alternativen Ausführungsform kann vorgesehen sein, daß
die Einwirkung auf das respiratorische System durch einen mecha
nischen Reiz erfolgt.
In weiteren alternativen Ausführungsformen kann vorgesehen sein,
daß die Einwirkung ausgewählt ist aus der Gruppe, die optische,
akustische, thermische, barometrische, elektrische und magnetische
Reize sowie Kombinationen davon umfaßt.
Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren kann vorgesehen sein, daß das
respiratorische System die Bronchialschleimhaut ist.
Die Erfindung sieht vor, daß das erste Fluid ausgewählt sein kann
aus der Gruppe, die Gase, Gasgemische und Flüssigkeiten umfaßt.
In einer Ausführungsform der Erfindung kann vorgesehen sein, daß
das zweite Fluid eine Flüssigkeit und insbesondere eine wässrige
Flüssigkeit ist.
Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren zur Bestimmung von Faktoren,
die die Folgen einer Einwirkung auf ein respiratori
sches System an ein biologisches System vermitteln, kann vorge
sehen sein, daß in einem weiteren Schritt die infolge der Ein
wirkung im ersten und/oder zweiten Fluid vorhandenen Faktoren hin
sichtlich ihrer Wirkung auf ein biologisches System untersucht
und/oder bestimmt werden.
In einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens kann
vorgesehen sein, daß das biologische System ausgewählt ist aus der
Gruppe, die Zellen, Gewebe, Organe und tierische Organismen um
faßt.
Dabei kann in einer besonders bevorzugten Ausführungsform vor
gesehen sein, daß die tierischen Organismen Säugetiere sind und
der tierische Organismus insbesondere der Mensch ist.
Bei der erfindungsgemäßen Vorrichtung kann vorgesehen sein, daß
der erste und/oder der zweite Kammerteil kontinuierlich mit einem
Fluid durchspülbar ist.
Den erfindungsgemäßen Verfahren liegt die überraschende Erkenntnis
zugrunde, daß der Einfluß einer Einwirkung auf ein respiratori
sches System über den Rahmen von mittels Zellkulturen möglichen
Einsichten bestimmbar ist, indem ein Präparat, das ein respira
torisches System umfaßt, so in eine Vorrichtung eingebracht wird,
daß ein erstes Fluid mit der apikalen Seite des Präparates und ein
zweites Fluid mit der basalen Seite des Präparates in Kontakt ge
bracht wird. Diese spezielle Anordnung erlaubt, daß die in vivo
vorliegenden Bedingungen auch für ein in vitro-Verfahren vor
liegen. Dies ist mit Blick auf den vektoriellen Aufbau des respi
ratorischen Systems, wie er in der Einleitung beschrieben wurde
und die hierin vollumfänglich aufgenommen wird, von großer Bedeu
tung. Lediglich unter diesen Bedingungen ist es zum einen möglich,
die komplexen Interaktionen der verschiedenen Zelltypen zu unter
suchen und gleichzeitig zu erkennen, ob die infolge der Einwirkung
zu beobachtenden Effekte, bspw. abgesonderte chemische Verbindun
gen, apikal oder basal orientiert sind, was Rückschlüsse auf die
systemische Verfügbarkeit und Auswirkungen dieser Effekte bzw.
Faktoren zuläßt. Dies zu leisten sind Zellkultursysteme nicht in
der Lage.
Zum anderen sind damit Verhältnisse realisiert, wie sie ansonsten
in ihrer Komplexität nur beim Tiermodell vorliegen, das jedoch
einen noch höheren Integrations- und damit Komplexitätsgrad auf
weist, was die Beobachtung der durch die Einwirkung bedingten Ef
fekte erschwert, was darin begründet liegen kann, daß die eigent
lich kausalen Vorgange im Gesamtsystem Tier maskiert werden. Ein
derartiges Maskieren kann zum einen daraus resultieren, daß die
Antworten des biologischen Systems auf die Einwirkung auf das res
piratorische System im biologischen System, d. h. typischerweise im
Tier, infolge der Konzentrationsverhältnisse nicht mehr zu erken
nen sind, durch andere Reaktionen des Tieres auf weitere, eben
falls vorhandene Einwirkungen oder Reize überlagert werden, oder
die Antwort sich in einem vom eigentlichen Erfolgsort entfernten
Kompartiment, bspw. im Blut, widerspiegelt und somit keinen Auf
schluß über den Wirkmechanismus erlaubt. Darüber hinaus ist bei
der Verwendung von Tiermodellen in der Regel unter physiologischen
Bedingungen nur eine systemische Reaktion zu bestimmen.
Aus den genannten Gründen ist es somit durch Verwendung der erfin
dungsgemäßen Verfahren auch möglich, die Faktoren zu ermitteln,
die den Einfluß und damit die Wirkung der Einwirkung auf das res
piratorische System an das Gesamtsystem vermitteln. Derartige Ver
bindungen können zum Beispiel sein niedermolekulare und hoch
molekulare Verbindungen, Kohlenhydrate und deren Polymere, Fett
säuren und Fette, Aminosäuren, Peptide und Proteine, sowie Deri
vate derselben, aber auch Gase. Die besagten Faktoren können,
funktionell betrachtet solche sein, die unmittelbar am Ort ihrer
Sekretion ihre Wirkung entfalten, können jedoch auch im Sinne von
Hormonen ihren Wirkort an einem von ihrer Entstehung verschiedenen
Ort haben. Desweiteren können die Faktoren auf die sie produzier
enden Zellen und Zelltypen ebenso wirken wie auf davon verschie
dene Zellen und Zelltypen. Die Faktoren schließen somit, u. a.,
Neurotransmitter und Neuropeptide ebenso ein wie das Lymphsystem
und die Immunantwort modulierende Verbindungen.
Damit steht erstmals ein Verfahren zur Verfügung, mit dem funkti
onell das Zusammenwirken der verschiedenen, das respiratorische
System ausbildenden Zelltypen, einschließlich des sekundären
Lymphsystems, unter physioloigschen Bedingungen, einschließlich
zugrundeliegender Reaktionskaskaden und Regelkreise, dargestellt
und bestimmt werden kann, was bei den in der Technik verwendeten
anatomischen und histologischen Ansätzen nicht möglich war.
Aus dem vorstehend Gesagten ergeben sich zahlreiche mögliche Ver
wendungen der erfindungsgemäßen Verfahren.
Grundsätzlich werden die erfindungsgemäßen Verfahren auf dem Ge
biet der Pulmonologie verwendet werden. Die entsprechenden Verwen
dungen ergeben sich den Fachleuten auf diesem Gebiet aufgrund ih
res Fachwissens.
Im besonderen sei hierin jedoch auf folgende zwei Verwendungen
hingewiesen: Arbeitsmedizinische Bewertung/Klassifizierung von
chemischen Verbindungen und Medikamententestung, insbesondere
unter dem Aspekt der Pharmakologie und Toxikologie.
Im Bereich der Arbeitsmedizin ist es erforderlich, daß Chemikalien
hinsichtlich ihres Gefährdungspotentiales bewertet bzw. klassifi
ziert werden. Zu diesem Zweck kann das erfindungsgemäße Verfahren
angewandt werden. Insoweit ist dieses bedeutsam auch unter dem
Aspekt der Feststellung von - anerkannten oder potentiellen - Be
rufskrankheiten bei Exposition von Organismen, insbesondere dem
Menschen, gegenüber bestimmten Chemikalien. Mit den vorliegenden
Verfahren ist es somit möglich, ein Modellsystem bereit zustellen,
bei dem anerkannte oder potentielle - Berufskrankheiten nachge
stellt werden können und somit Einsichten in die Wirkungsweise der
zu untersuchenden bzw. untersuchten chemischen Verbindung auf das
respiratorische System sowie ggf. das biologische System, das die
ses in der Regel enthält, zu gewinnen sowie ggf. die daran betei
ligten Mechanismen und insbesondere chemischen Verbindungen zu
bestimmen. Mit anderen Worten, es ist mit dem erfindungsgemäßen
Verfahren möglich, eine bestimmte chemische Verbindung als Ein
wirkung im Sinne dem vorliegenden Erfindung zu verwenden und ein
respiratorisches System, insbesondere ein Bronchialschleimhaut
umfassendes Präparat, dem Einfluß dieser Einwirkung, d. h. bspw.
der chemischen Verbindung, auszusetzen und festzustellen, welche
Reaktionen daraufhin erfolgen und ggf. in weiteren nachfolgenden
Schritten zu überprüfen, wie sich diese Reaktion(en) des respira
torischen Systems auf das biologische System und insbesondere den
Menschen auswirken, bzw. welche Faktoren an der Vermittlung der
Folgen der Einwirkung, d,h, bspw. der chemischen Verbindung, auf
das respiratorische System an das biologische System, d. h. bspw.
den menschlichen Körper, beteiligt sind.
Welche Chemikalien insbesondere unter diesem Aspekt herangezogen
werden können, ergibt sich insbesondere aus der einschlägigen Li
teratur zum Gebiet Arbeitsmedizin.
Prinzipiell die gleiche Vorgehensweise kann gewählt werden, wenn
es darum geht, Medikamententestung (im Englischen als "drug tes
ting" bezeichnet) durchzuführen. Auch hier können unter dem Ein
fluß der bspw. zu testenden Verbindung, d. h. der Einwirkung i.S.
der vorliegenden Erfindung, auf das respiratorische System jene
Faktoren ermittelt werden, die entweder lokal oder auch entfernt
auf das biologische System, typischerweise also den menschlichen
Organismus, einwirken. Dieses Verständnis ist, wie im Falle der
arbeitsmedizinischen Verwendung, von zentraler Bedeutung für ein
gesamtheitliches Verständnis der unter dem Einfluß der Einwirkung
ablaufenden Ereignisse.
Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung ist insbesondere
die Tatsache bedeutsam, daß mit den erfindungsgemäßen Verfahren
vektorielle Aspekte der Vorgänge an einem respiratorischen System
erfaßt werden können.
Unter dem Begriff "Einwirkung" soll hierin jeder Faktor verstanden
werden, der auf ein respiratorisches System einwirken kann. Somit
bezeichnet der Begriff, u. a., auch alle bekannten Reizqualitäten.
Er schließt somit ein chemische, mechanische, optische, akus
tische, thermische, barometrische, elektrische und magnetische
Reize sowie Kombinationen dieser und weiterer Reize. Aufgrund der
Art der erfindungsgemäßen Verfahren bestehen hinsichtlich der Aus
wahl der Einwirkung keinerlei Beschränkungen. Die Applikation von
elektrischen und magnetischen Reizen kann beispielsweise durch
Anlegen entsprechender Felder erfolgen.
Unter dem Begriff "respiratorisches System" soll hierin insbeson
dere das Atmungssystem von Wirbeltieren, insbesondere von Landwir
beltieren, sowie Teile davon verstanden werden. Der Begriff respi
ratorisches System soll hierin das luftleitende System, wie ein
gangs definiert, und/oder den respiratorischen Teil davon, wie
ebenfalls eingangs definiert, sowie Kombinationen oder die Gesam
theit davon bezeichnen und kann insoweit hierin synonym verwendet
werden. Der Begriff soll hierin auch die Bronchialschleimhaut und
die respirationsaktiven Oberflächen der Alveolarepithelien, ein
schließlich der darin vorhandenen zusätzlichen Zelltypen, insbe
sondere diejenigen des BALT, umfassen, ggf. ergänzt durch darun
terliegende Zellschichten.
Der Begriff "apikale Seite" soll hierin jene Seite des Präparates
bezeichnen, die unter physiologischen, d. h. in vivo-Bedingungen
dem Gasraum, d. h. der Luft, zugewandt ist. Im Unterschied hierzu
bezeichnet der Begriff "basale Seite" jene Seite des Präparates,
die unter physiologischen Bedingungen dem Gasraum abgewandt ist.
Die Begrifflichkeiten entsprechen somit den in der Anatomie ge
wählten Bezeichnungen.
Der Begriff "Fluid" soll hierin, u. a., Gase, Flüssigkeiten, Gasge
mische, Flüssigkeiten oder Flüssigkeitsgemische, in Flüssigkeiten
gelöste Gase und Aerosole umfassen.
Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren zur Bestimmung des Einflusses
einer Einwirkung auf ein respiratorisches System kann vorgesehen
sein, daß das Präparat vor seiner Verwendung einer Behandlung un
terzogen wird. Im Rahmen dieser Behandlung kann eine oder mehrere
Zellpopulationen hinsichtlich ihres Antwortverhaltens auf die mit
telbare oder unmittelbare Folge der Einwirkung modifiziert werden.
Dies beinhaltet zum Beispiel, daß bestimmte Zellen oder Rezeptoren
blockiert oder aus dem Präparat entfernt werden. Weiterhin ist es
möglich, daß das Membranpotential des Präparates oder von Teilen
davon verändert wird. Allgemein ist es möglich, daß das Präparat
oder Teile davon bereits vor der eigentlichen Einwirkung mit einer
anderen Einwirkung konfrontiert werden. Grundsätzlich ist dies
auch in umgekehrter Reihenfolge möglich. Die verschiedenen mög
lichen Abwandlungen des erfindungsgemäßen Verfahrens hängen letzten
endes von der zu beantwortenden Fragestellung ab und können vom
Fachmann im Rahmen seines Fachwissens entsprechend gestaltet wer
den.
Hinsichtlich der als Einwirkung im Sinne dieser Erfindung verwend
baren chemischen Verbindungen bestehen grundsätzlich keinerlei
Beschränkungen. Entsprechend können die chemischen Verbindungen
Feststoffe, Flüssigkeiten oder Gase sein. Sie können auch in ge
löster Form in Flüssigkeiten vorliegen. Die chemischen Verbindun
gen können sowohl anorganischer als auch organischer Natur sein
oder Mischformen. Grundsätzlich ist es sowohl möglich, daß die
chemischen Verbindungen einzeln als auch in Kombination als Ein
wirkung im Sinne der vorliegenden Erfindung verwendet werden kön
nen.
Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren zur Bestimmung des Einflusses
einer Einwirkung auf ein respiratorisches System kann vorgesehen
sein, daß die Analyse des ersten und/oder zweiten Fluids erfolgt,
noch bevor das Präparat der Einwirkung ausgesetzt wird. Dies em
pfiehlt sich, um einen definierten Ausgangspunkt zu erhalten, ins
besondere dann, wenn die unter dem Einfluß der Einwirkung beobach
teten oder zu bestimmenden Faktoren bereits als solche, wenngleich
in ggf. höheren oder niedrigeren Konzentrationen vom respiratori
schen System hergestellt, sezerniert oder verbraucht werden.
Es ist im Rahmen der Fähigkeiten des Fachmannes auf diesem Gebiet,
den Zeitpunkt, zu dem das erste und/oder zweite Fluid einer Ana
lyse unterzogen wird, zu bestimmen. Beispielsweise ist es, insbe
sondere bei kinetischen Untersuchungen, sinnvoll, innerhalb gewis
ser Zeitabstände während und nach der Einwirkung die Analysen vor
zunehmen. Dabei ist grundsätzlich möglich, daß die Analyse des
Fluids bereits dann vorgenommen wird, wenn sich das Fluid noch mit
dem Präparat in Kontakt befindet. Umgekehrt ist auch möglich, daß
die Analyse erst dann erfolgt, nachdem das Fluid nicht mehr mit
dem Präparat in Kontakt ist.
Hinsichtlich der Analysentechniken gibt es grundsätzlich keine
Einschränkungen. Diese werden vielmehr durch die Art der Wirkun
gen, die möglicherweise unter dem Einfluß der Einwirkungen auf das
respiratorische System auftreten, definiert. Dabei kann es in
einer Vielzahl von Fällen hilfreich sein, daß ein Teil der Fluide
zu Analysenzwecken entnommen wird, d. h. eine Probe von den Fluiden
gezogen wird.
Das erste Fluid kann so ausgewählt werden, daß es den natürlicher
weise vorliegenden Verhältnissen möglichst nahe kommt, kann jedoch
in Abhängigkeit von der Fragestellung auch hiervon abweichen.
Typischerweise wird als erstes Fluid ein Gas oder Gasgemisch wie
bspw. Luft dienen, dem/der die die Einwirkung darstellende che
mische Verbindung zugesetzt ist. Darüberhinaus können die Gase
jedoch weitere Komponenten wie bspw. Partikel oder dergleichen
enthalten, um in dieser Form einen zusätzlichen mechanischen Reiz
zu applizieren. Ein derartiger Ansatz ist bspw. für den Fall in
teressant, daß die Einwirkung von Stäuben auf ein respiratorisches
System untersucht werden soll. Eine weitere Form, in der das erste
Fluid bevorzugt auftreten kann, sind Aerosole. Dies ist besonders
bei der Entwicklung von Pharmazeutika und insbesondere von galeni
schen Darreichungsformen von Interesse. Es ist jedoch auch grund
sätzlich möglich und in manchen Anwendungsfällen ausdrücklich er
wünscht und erforderlich, daß Flüssigkeiten, die ggf. eine chemi
sche Verbindung enthalten, mit der apikalen Seite des Präparates
in Kontakt gebracht werden. Als Flüssigkeiten bieten sich insbe
sondere Pufferlösungen an.
Das zweite Fluid kann ebenfalls ein Gas, Gasgemisch oder Flüssig
keit darstellen, wobei in diesem Fall besonders bevorzugt ist, daß
in Nachahmung der unter natürlichen Bedingungen vorliegenden Situ
ation das Fluid eine Flüssigkeit und insbesondere eine wässrige
Flüssigkeit ist. Grundsätzlich ist jedoch auch denkbar, daß andere
als wässrige Flüssigkeiten zum Einsatz gelangen. Das zweite Fluid
ist jedoch hierauf nicht beschränkt, so ist bspw. auch denkbar,
daß die Flüssigkeiten einen wesentlichen nicht wässrigen Anteil
aufweisen.
Grundsätzlich bestehen sowohl bei der Auswahl des ersten oder
zweiten Fluids hinsichtlich dessen Gestaltung keine grundsätzli
chen Beschränkungen. Bei der Auswahl des ersten und zweiten Fluids
wird zu berücksichtigen sein, daß es sich bei dem Präparat um bio
logisches Material handelt, das auch unter den Bedingungen der
erfindungsgemäßen Verfahren unter möglichst schonenden Bedingungen
am Leben erhalten werde soll, was bedeutet, daß hierfür günstige
Randbedingungen hergestellt werden müssen. Dies schließt die Zu
fuhr von Nährstoffen ebenso ein wie die Entfernung von Stoffwech
sel(end)produkten.
Der Kontakt zwischen der apikalen Seite des Präparats mit einem
Fluid und der basalen Seite des Präparates mit einem zweiten Fluid
kann dabei für jedes Fluid unabhängig kontinuierlich oder diskon
tinuierlich (als Batch) erfolgen. Beliebige Kombinationen dieser
beiden Möglichkeiten sind ebenfalls möglich. Die Vorteile für das
jeweilige Kontaktieren der jeweiligen Seite in einer der beiden
vorgenannten Weisen des Präparats sind für den Fachmann offen
sichtlich. Beispielhaft sei auf für beide Seiten kontinuierliche
Überströmung des Präparates hingewiesen, was den in vivo vor
liegenden Verhältnissen am nächsten kommt.
Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren zur Bestimmung von Faktoren,
die die Folgen einer Einwirkung auf ein respiratorisches System an
ein biologisches System vermitteln, ist die Auswahl des biologi
schen Systems, das betrachtet werden soll, grundsätzlich nicht be
grenzt und kann insoweit Zellen, Gewebe, Organe und einen gesamten
tierischen Organismus betreffen.
Bei dem Verfahren, welches in seinem Ablauf prinzipiell dem Ver
fahren zur Bestimmung des Einflusses einer Einwirkung auf ein res
piratorisches System entspricht, können die infolge der Einwirkung
im ersten und/oder zweiten Fluid erstmalig vorhandenen, ggf. ver
stärkt oder verringert auftretenden Faktoren durch Vergleich der
Zusammensetzung des Fluids bzw. der Fluide vor der Einwirkung als
solche ermittelt und identifiziert werden. In einem weiteren
Schritt kann dann den solchermaßen ermittelten Faktoren ihre je
weilige Wirkung auf das ausgewählte biologische System zugeschrie
ben werden. Dabei ist es möglich, daß die infolge der Einwirkung
im ersten und/oder zweiten Fluid auftretenden oder in ihrer Kon
zentration geänderten Faktoren gereinigt werden und sodann in ver
schiedenen - in der Regel funktionellen - Testsystemen auf ihre
Wirkung untersucht werden. Es ist jedoch auch im Rahmen der vor
liegenden Erfindung, daß das erste und/oder zweite Fluid direkt zu
dem vorgenannten Zweck in einem derartigen Testsystem eingesetzt
wird.
Diese Funktionszuweisung kann unter Verwendung der den Fachmann
bekannten Techniken erfolgen und schließt, bspw., Struktur- und
Sequenzvergleiche, Zellkultur-, Gewebe-, Organtests und Versuche
am Tier ein.
Die erfindungsgemäßen Verfahren sind insbesondere mit Blick auf
arbeitsmedizinische, pharmakologische und toxikologische Unter
suchungen von verschiedenen Einwirkungen auf ein respiratorisches
System von zentraler Bedeutung, mithin ganz besonders dann, wenn
das biologische System ein Säugetier und insbesondere der Mensch
ist.
Hinsichtlich der Auswahl des respiratorischen System einerseits
und des biologischen Systems andererseits bestehen grundsätzlich
keine Einschränkungen, insbesondere was die Auswahl des das das
respiratorische System umfassende Präparat liefernde Organismus
anbelangt. Der Donor-Organismus wird in Abhängigkeit von der je
weiligen Fragestellung ausgewählt. Es bietet sich an, daß für den
Fall, daß Einwirkungen auf das respiratorische System des Menschen
untersucht werden sollen, das in den erfindungsgemäßen Verfahren
verwendete respiratorische System ebenfalls vom Menschen stammt,
das ggf. durch Autopsie oder Biopsie erhalten werden kann. Eine
Alternative hierzu ist die Verwendung eines respiratischen System
aus einem Spender- oder Donor-Organismus bzw. einer Spendertier
art, die hinsichtlich des strukturellen sowie funktionellen Auf
baus weitgehend mit demjenigen des respiratorischen Systems des
Menschen übereinstimmt, mithin ein geeigneter Modellorganismus.
Geeignete Donororganismen bzw. Modellorganismen sind, unter ande
rem, das Rind und das Schwein.
Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren zur Bestimmung von Faktoren,
die die Folgen einer Einwirkung auf respiratorisches System an ein
biologisches System vermitteln, ist es aus Gründen der direkten
Übertragbarkeit sinnvoll, daß das respiratorische System aus dem
gleichen Spenderorganismus stammt, wie das biologische System,
zumindest jedoch der Donororganismus für respiratorische System
und für das biologische System bzw. das biologische System als
solche, wenn unter biologischem System im speziellen Fall ein Tier
verstanden wird, diese der gleichen Art angehören, oder, als wei
tere vorteilhafte Alternative, der Donororganismus für das respi
ratorische System ein geeignetes Modell für das biologische System
darstellt bzw. umgekehrt.
Mit den erfindungsgemäßen Verfahren stehen damit auch Verfahren
zur Verfügung, mittels derer chemische Verbindungen daraufhin ge
testet werden, ob, wie und in welchem Umfang sie geeignet sind,
die Folgen einer Einwirkung auf das respiratorische System zu ver
ringern oder zu verstärken. Die erfindungsgemäßen Verfahren eignen
sich insoweit auch zum Screenen von pharmazeutischen Wirkstoffen.
Dabei wird so vorgegangen, daß ein Präparat umfassend ein respira
torisches System so in eine Vorrichtung eingebracht wird, daß ein
erstes Fluid mit der apikalen Seite des Präparates und ein zweites
Fluid mit der basalen Seite des Präparates in Kontakt gebracht
wird, das Präparat der Einwirkung ausgesetzt wird, wobei die zu
screenende oder testende Substanz dem Reaktionsansatz, typischer
weise mit dem ersten und/oder zweiten Fluid zeitgleich oder zeit
lich versetzt relativ zum Applizieren der Einwirkung, bspw. in
Form eines bakteriellen oder viralen Antigens, zugesetzt wird.
Durch Vergleich der Reaktion des Präparates auf die Einwirkung mit
und ohne die zu testende Substanz kann deren Wirksamkeit festge
stellt werden.
Bei der erfindungsgemäßen Kammer, die durch das Präparat in zwei
funktionale Kammerteile unterteilt wird, ist vorgesehen, daß in
folge der Sperrwirkung des Präparates typischerweise das erste
und/oder zweite Fluid nicht miteinander vermischt werden. Um eine
stabile Trennung des ersten Kammerteils vom zweiten Kammerteil
durch das eingebrachte Präparat zu gewährleisten, wird das Prä
parat typischerweise auf ein Siebgitter plaziert.
Die Vorrichtung umfaßt weiterhin Fördereinrichtungen, wie bspw.
Pumpen, die ein kontinuierliches oder ansatzweises Zu- und Abfüh
ren des ersten Fluides und/oder des zweiten Fluides ermöglichen,
wobei die Zu- und Abfuhr des ersten Fluides mit derjenigen des
zweiten Fluids gekoppelt oder auch unabhängig davon sein kann.
Die Vorrichtung wird desweiteren Temperiereinrichtungen aufweisen,
die geeignet sind, eine gewünschte Temperatur in den Kammerteilen
zu realisieren. Typischerweise wird eine Temperatur von 37°C re
alisiert werden. Es ist jedoch auch insbesondere bei Fragestellun
gen, die sich mit dem Einfluß von Temperaturen auf ein respirato
risches System befassen, möglich, daß die Kammer eine andere Tem
peratur aufweisen kann, wobei es im Rahmen der Erfindung ist, daß
in den beiden Kammerteilen verschiedene Temperaturen realisiert
werden können. Die Temperierung der Kammerteile kann durch ein
außen angelegtes Temperiermittel, wie beispielsweise ein Wasserbad
realisiert werden; es ist jedoch auch, ggf. zusätzlich möglich,
daß die Temperierung durch eine geeignete Temperierung des ersten
und/oder zweiten Fluides realisiert wird.
Desweiteren kann die Vorrichtung Begasungseinrichtungen vorsehen,
die das Einstellen einer geeigneten Gasatmosphäre erlauben, wie
sie typischerweise bei der Kultivierung von tierischen Zellen er
forderlich ist.
Die Erfindung, mögliche Ausführungsformen und weitere Vorteile
sollen an den nachfolgenden Beispielen und Figuren näher erläutert
werden, wobei
Fig. 1 einen schematischen Aufbau des verwendeten Perfusions
systems,
Fig. 2 die basale Bombesinfreisetzung nach Rauchstimulation,
Fig. 3 die apikale VP-Freisetzung bei Stimulation mit 10-8
mol/l Nornikotin
Fig. 4 die basale SP-Freisetzung bei Stimulation mit 10-12
mol/l Nikotin und
Fig. 5 die basale Bombesinfreisetzung bei Stimulation mit Nor
nikotin 10-12 mol/l zeigt.
Bei den Fig. 2-5 entspricht die x-Achse der Zeit nach Beginn
der Stimulationsphase und die y-Achse der auf den Ausgangswert
normierten Änderungen.
Das ein respiratorisches System umfassende Präparat wurde dadurch
hergestellt, daß die Trachea eines Rindes knapp oberhalb der Bi
furkation und dann die Hauptbronchien etwa 10 cm unterhalb der
Bifurkation durchtrennt wurden. Die Bronchien wurden der Länge
nach aufgeschnitten, auf eine Korkplatte aufgespannt und drei
runde Ausstanzungen mit 15 mm Durchmesser vorgenommen. Die Mukosa
wurde von dem knorpeligen Anteil entfernt. Das Präparat befand
sich sowohl während der Lagerung, d. h. in der Zeit zwischen Her
stellen des Präparates und Versuchsbeginn in Hanks' Salt Solution.
Es wurde eine aus einer oberen und unteren Hälfte bestehende Per
fusionskammer aus Plexiglas verwendet, wie dargestellt in Fig. 1.
Die Plexiglaskammer 1 besteht aus einem oberen, apikalen Kammer
teil 2 und einem unteren, basalen Kammerteil 3. Sie weist eine dem
oberen Kammerteil 2 zugeordnete Zuleitung 4 und eine dem unteren
Kammerteil 3 zugeordnete Zuleitung 5 auf. Beide Kammerteile weisen
einen Ablauf 6 und 7 auf, an dem im speziellen vorliegenden Fall
Pumpen 8 und 9 angeordnet sind. Im Falle des dem oberen Kammerteil
2 zugeordneten Ablaufes 6 handelt es sich bei Pumpe 8 im Falle der
Rauchstimulation um eine Wasserstrahlpumpe und im Falle der Flüs
sigkeitsstimulation um eine Schlauchpumpe. Pumpe 9, dem Ablauf 7
des unteren Kammerteils 3 zugeordnet, ist im vorliegenden Fall
ebenfalls eine Schlauchpumpe.
Das Mukosascheibchen 10 wurde zwischen die obere und untere Hälfte
aufgespannt und fungierte auf diese Weise als Trennschicht zwis
chen beiden Kammerteilen. Hierzu lag die Mukosa auf einem Siebgit
terring aus Metall mit eingesetztem Siebgewebe aus Nylon, Maschen
öffnung 200 µm.
Die Kammer wurde auf 37°C unter Verwendung eines Warmwasserbades
11 temperiert.
Es wurden jeweils parallel drei Doppelkammersysteme benutzt, wobei
jeweils ein Bronchialschleimhautstück (Mukosa) von dem gleichen
Rind verwendet wurde. Die Zeitspanne von der Schlachtung bis zum
Versuchsbeginn betrug zwischen einer und drei Stunden.
Nach einer Äquilibrierungsphase von 20 Minuten in der das Gewebe
stück in Hanks' Solution bzw. Luft an der apikalen Seite und mit
Nährmedium an der basalen Seite perfundiert wurde, erfolgte an
schließend über 20 Minuten eine Basalwertsammelphase, bei der das
Efluat aus der oberen, d. h. apikalen, und der unteren, d. h. ba
salen Kammer (bei den Gasversuchen entsprechend nur aus dem basa
len Kammerteil) gesammelt wurde.
In der Stimulationsphase wurden im Falle der Verwendung von Flüs
sigkeiten zu Stimulationszwecken die Mukosastückchen 10 Minuten
mit Testsubstanz perfundiert und die apikal und basal abgezogenen
Efluate jeweils über Intervalle von 2,5 Minuten getrennt gesam
melt. Bei gasförmiger Stimulation wurden die zuführenden Schläuche
mit dem Gasgenerator verbunden und das Gas 20 Minuten über die
Mukosa geleitet. Das Efluat der unteren Kammer (basale Mukosasei
te) wurden jeweils über Intervalle von 2,5 Minuten aufgefangen.
Die Flußrate betrug 5 ml/min für den unteren Kammerteil. Im Falle
von Flüssigkeitsstimulation auf der apikalen Seite des Präparates
betrug die Flußrate ebenfalls 5 ml/min.
Der Stimulationsphase schloß sich eine Nachlaufphase an, bei der
die Mukosa auf gleiche Weise wie in der Äquilibrierphase 20 Minu
ten lang perfundiert wurde und das Efluat wie in der Basalwertsam
melphase gesammelt wurden.
Vor Versuchsbeginn und nach Durchführung der Stimulationsversuche
wurden von den Mukosastückchen histologische Schnitte angefertigt
und auf morphologische Veränderungen hin überprüft. Dabei ergab
sich in allen Fällen die Unversehrtheit der gesamten Mukosa, ins
besondere der Lamina propria und des Flimmerepithels einschließ
lich Kinozilienbesatzes.
Um den Einfluß von mechanischer Reizung infolge des Einspannens
der Mukosastückchen in das Perfusionssystem auszuschließen, wurden
die Versuche mehrfach ohne Testsubstanz durchgeführt und die sol
chermaßen erhaltenen Werte für die betrachteten Faktoren jeweils
von den Veränderungen bei Stimulation abgezogen.
Im vorliegenden Fall wurden die Peptide VIP, SP und Bombesin mit
tels Radioimmunoassay (RIA) bestimmt. Die vorgenannten Peptide
sind als Faktoren, die die Folgen der Einwirkung auf ein respira
torisches System, hier der Mukosa, an ein biologisches System ver
mitteln, im Sinne der vorliegenden Erfindung zu verstehen.
Im vorliegenden Beispiel wurde die Bronchialschleimhaut mit Ziga
rettenrauch stimuliert, wobei der Zigarettenrauch über die apikale
Seite geleitet wurde. Bei dieser gasförmigen Stimulation waren
insgesamt drei Kammern mit einer brennenden Zigarette verbunden.
Der Rauch wurde unter Verwendung einer Wasserstrahlpumpe über die
apikale Seite des Präparats geleitet, wobei die Saugkraft der Was
serstrahlpumpe so eingestellt war, daß durch die drei Kammern ge
meinsam der Rauch einer Zigarette innerhalb von 5 Minuten durchge
saugt wurde, woraufhin sie jeweils umgehend durch eine neue er
setzt wurde. Als Kontrollversuch wurde Zimmerluft über die Mukosa
mit gleicher Saugkraft gesaugt.
Das Ergebnis ist in Fig. 2 dargestellt.
Wie aus Fig. 2 ersichtlich, kommt es innerhalb der ersten zweiein
halb Minuten nach Rauchexposition zu einer deutlichen Erhöhung des
basal freigesetzten Bombesins unter den vorgenannten Bedingungen.
Im vorliegenden Beispiel wurde das Bronchialschleimhautpräparat
einer Flüssigstimulation durch Nornikotin unter ansonsten zu Bei
spiel 1 identischen Bedingungen unterzogen. Nornikotin wurde in
Konzentrationen von 10-6 mol/l, 10-8 mol/l, 10-10 mol/l und 10-12
mol/l in Hanks' Salt Solution verdünnt und die solchermaßen erhal
tene Flüssigkeit überströmte das Bronchialschleimhautpräparat mit
einer Flußrate von 5 ml/Min.
Aufgrund der Nikotin- und Nornikotinkonzentrationen der in allen
hierin beschriebenen Versuchen verwendeten Zigaretten (0,1 mg
Nikotin) ist davon auszugehen, daß die bei der Flüssigstimula
tion gewählten Konzentrationen den Bereich der bei Berauchung
der Mukosa auf diese applizierten Nornikotinkonzentrationen ab
deckt. Das Präparat wurde 10 Minuten mit einer Durchflußrate von
5 ml/min/Mukosa perfundiert.
Für eine Nornikotinkonzentration von 10-6 mol/l ergab sich hin
sichtlich der apikalen Freisetzung keine signifikante Änderung
verglichen mit den Kontrollwerten. Unter Anwendung der mehrfak
toriellen Varianzanlyse konnten jedoch bei einer Stimulation mit
10-8 mol/l Nornikotin, 10-10 mol/l Nornikotin und 10-12 mol/l
Nornikotin Signifikanzen gefunden werden. Das Ergebnis ist in
Fig. 3 für eine Nornikotinkonzentration von 10-8 mol/l darges
tellt.
Bei diesem Beispiel wurde die basale SP-Freisetzung bei Flüssig
stimulation mit Nikotin untersucht, wobei im Rahmen eines ent
sprechenden Versuches Konzentrationen von 10-6 mol/l Nikotin,
10-8 mol/l Nikotin, 10-10 mol/l und 10-12 mol/l Nikotin getestet
wurden. Die Versuchsbedingungen entsprechen ansonsten denjenigen
von Beispiel 2.
Lediglich bei einer Stimulationskonzentration von 10-12 mol/l
Nikotin trat eine signifikante Änderung gegenüber den Kontroll
werten auf (Fig. 4).
Die verwendeten Nornikotinkonzentrationen betrugen 10-6 mol/l,
10-8 mol/l, 10-10 mol/l und 10-12 mol/l. Die Versuchsbedingungen
entsprachen ansonsten denjenigen von Beispiel 2.
Lediglich bei einer Nornikotinkonzentration von 10-12 mol/l
konnte eine signifikante Abweichung gegenüber den Kontrollwerten
beobachtet werden. Das Ergebnis für 10-12 mol/l Nornikotin ist
graphisch in Fig. 5 dargestellt.
Die in der vorstehenden Beschreibung, in den Zeichnungen, sowie
in den Ansprüchen offenbarten Merkmalen der Erfindung können
sowohl einzeln als auch in beliebiger Kombination für die Ver
wirklichung der Erfindung wesentlich sein.
Claims (15)
1. Verfahren zur Bestimmung des Einflusses einer Einwirkung auf
ein respiratorisches System, dadurch gekennzeichnet, daß
ein Präparat umfassend ein respiratorisches System so in eine Vorrichtung eingebracht wird, daß ein erstes Fluid mit der apikalen Seite des Präparates und ein zweites Fluid mit der basalen Seite des Präparates in Kontakt gebracht wird,
das Präparat der Einwirkung ausgesetzt wird, und
das erste und/oder zweite Fluid einer Analyse unterzogen wird.
ein Präparat umfassend ein respiratorisches System so in eine Vorrichtung eingebracht wird, daß ein erstes Fluid mit der apikalen Seite des Präparates und ein zweites Fluid mit der basalen Seite des Präparates in Kontakt gebracht wird,
das Präparat der Einwirkung ausgesetzt wird, und
das erste und/oder zweite Fluid einer Analyse unterzogen wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die
Einwirkung auf das respiratorische System durch eine chemische
Verbindung erfolgt.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die
chemische Verbindung in dem ersten und/oder zweiten Fluid
vorhanden ist.
4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die
Einwirkung auf das respiratorische System durch einen mechanischen
Reiz erfolgt.
5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die
Einwirkung ausgewählt ist aus der Gruppe, die optische, akus
tische, thermische, barometrische, elektrische und magnetische
Reize sowie Kombinationen davon umfaßt.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekenn
zeichnet, daß das respiratorische System Bronchialschleimhaut ist.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekenn
zeichnet, daß das erste Fluid ausgewählt ist aus der Gruppe, die
Gase, Gasgemische und Flüssigkeiten umfaßt.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekenn
zeichnet, daß das zweite Fluid eine Flüssigkeit und insbesondere
eine wässrige Flüssigkeit ist.
9. Verfahren zur Bestimmung von Faktoren, die die Folgen einer
Einwirkung auf ein respiratorisches System an ein biologisches
System vermitteln, dadurch gekennzeichnet, daß ein Verfahren nach
einem der vorangehenden Ansprüche verwendet wird.
10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß in
einem weiteren Schritt die infolge der Einwirkung im ersten
und/oder zweiten Fluid vorhandenen Faktoren hinsichtlich ihrer
Wirkung auf ein biologisches System untersucht und/oder bestimmt
werden.
11. Verfahren nach Anspruch 9 oder 10, dadurch gekennzeichnet,
daß das biologische System ausgewählt ist aus der Gruppe, die
Zellen, Gewebe, Organe und tierische Organismen umfaßt.
12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß die
tierischen Organismen Säugetiere und der tierische Organismus
insbesondere der Mensch ist.
13. Faktoren, die die Folgen einer Einwirkung auf ein respira
torisches System an ein biologisches System vermitteln, die durch
ein Verfahren nach einem der Ansprüche 9-12 erhalten werden
können.
14. Vorrichtung für ein Verfahren nach einem der vorangehenden
Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Vorrichtung zumindest
eine zweiteilbare Kammer aufweist, wobei durch das in die Kammer
eingebrachte Präparat die Kammer in einen ersten Kammerteil und
einen zweiten Kammerteil unterteilt wird und das in dem jeweiligen
Kammerteil enthaltene Fluid getrennt ist von dem Fluid des anderen
Kammerteils.
15. Vorrichtung nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß der
erste und/oder der zweite Kammerteil kontinuierlich mit einem
Fluid durchspülbar ist.
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