JP2000512122A - 二重ファイバーバイオリアクター - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 ２つの端部を有するシェルと、前記端部間の細長いチャンバーとを含む細胞培養ユニットが開示される。各端部には、液体と気体との灌流口が配置される。液体灌流口には液体灌流ファイバーが接続し、気体灌流口には気体灌流ファイバーが接続する。それによって、これらのファイバーは毛管外と毛管内の空間を画定する。さらに、本細胞培養ユニットは気体灌流ファイバーの毛管内空間と連通する手段と、液体灌流ファイバーの毛管内空間と連通する手段と、前記毛管外空間と連通する手段とを含む。

Description

【発明の詳細な説明】 二重ファイバーバイオリアクター 本発明は一般に細胞培養系に関し、特に２種類の異なるタイプの培地（気体と 液体）を循環させる中空ファイバー培養系および／またはｅｘ ｖｉｖｏ生体外 処理手段に関する。 最も広く用いられる細胞培養系にはバッチ式培養と中空ファイバー培養とがあ る。バッチ式培養はプラスチック又はガラスローラーの内面上で細胞を増殖させ ること、又は例えばペトリ皿のような固定容器上の平らな表面に細胞を付着させ ることを含む。 これとは対照的に、中空ファイバー培養系は半透性管状膜又は毛管上での細胞 のｉｎ ｖｉｔｒｏ増殖を可能にする。細胞は毛管壁の外側表面に付着する。栄 養培地は毛管を通って循環して、灌流培地から毛管壁を通って細胞へと拡散する 。次に、細胞産生物が細胞から毛管壁を通って灌流液（perfusate）中に拡散し 、そこから必要な場合にはそれを回収することができる。中空ファイバー細胞培 養系に関して先行技術が完成しているが、ｉｎ ｖｉｖｏ系と同じであるｉｎ ｖｉｔｒｏ培養系はまだ不充分である。一般的にいえば、中空ファイバー培養系 は３つの主要なカテゴリーの問題に遭遇している。第一に、細胞に栄養培地を供 給しなければならない。第二に、細胞の代謝中に最適でかつ定常な環境が維持さ れなければならない。第三に、細胞が付着するための適当な支持体が利用可能で なければならない。 中空ファイバーを介して人工器官を形成するための組織類似誘導体の製造にお いて克服されるべき、栄養カテゴリー中の最も重要な問題の１つは酸素供給であ る。適切な酸素供給なしには、細胞は代謝することができず、即ち、細胞自体を 調節して成長することができない。先行技術の培養系は予備的な灌流によって酸 素を供給している。ファイバーの外部からの流体の酸素供給(oxygenating)は、 細胞が酸素の連続的で定常な速度を好むという点で不適切である。さらに、酸素 を細胞に直接に、距離を置かずに、供給することが最も好ましい。このことはま た、分子類を運搬するヘモグロビンを含有する血液が細胞を浸すｉｎ ｖｉｖｏ 状態の模倣であるに過ぎない。要約すると、先行技術の中空ファイバー系は、初 期の不連続な酸素灌流を供給することによって、又は細胞から離れた距離で酸素 灌流をおこなうことによって細胞の“浸漬(bathing)”が不充分になる。 先行技術は培地を酸素によって直接灌流させることも試みている。しかし、空 気と平衡化した水性栄養培地はリットル当たり４．５ｍｌの酸素を運搬すること ができるに過ぎない（３７℃、７６０ｍｍＨｇ）。水溶液が酸素を運搬できない ことは、培養プロセスの律速工程である酸素灌流を生じることになる。酸素不足 を解消するためには、速度を高めなければならない。高い循環速度は内部圧力を 高め、乱流を生じる。細胞は極めて脆いので、激しい通気(aeration)は細胞増殖 を妨害し、タンパク質の変性を招来する可能性がある。 結論として、予備酸素供給及び／又は毛管外部の酸素供給及び空気による培地 の平衡化のいずれも最適ではない。人工器官が目的である場合には、全ての細胞 が異化状態であり、一層多量の酸素を必要とするので、問題はさらに複雑になる 。不連続な及び／又は不充分な及び／又は乱流の酸素供給は、不規則な細胞代謝 と成長から早期死亡に至るまでの範囲の細胞問題を生じる。従って、最適な酸素 供給を提供することが本発明の第１の目的である。 上述のことを考えれば、酸素供給を培地サポートから分離することが最も好ま しい。このようにしている先行技術デバイスは中空ファイバー拡散機構と浴(bat h)との両方を用いている。酸素を中空ファイバーを通して拡散させ、細胞を培地 中に浸漬するか、又は細胞を酸素によって灌流させ、培地を中空ファイバーに通 して拡散させるかのいずれかである。この系は非常に有利であるが、中空ファイ バーを酸素供給のみに用いる場合には、産生物を取り出すことが困難である。こ れに反して、中空ファイバーが培地を灌流するのみで、酸素を灌流しない場合に は、酸素の連続的かつ定常的な供給を提供することが問題になる。したがって、 気体と液体の両方を灌流するデバイスを提供することが、本発明の他の目的であ る。 米国特許第４，１８４，９２２号は２つの灌流回路を用いている。しかし、両 方の回路は液体培地によって灌流されている。この特許は気体を灌流していない 。 それ故、この特許は酸素供給を扱っていず、酸素供給を先行技術に比べて改良し ている訳でもない。さらに、二重液体灌流を考えれば、この特許は限外濾過ファ イバーを用いているに過ぎない。米国特許第４，１８４，９２２号に述べられた 長さ５ｃｍおよび直径０．２６ｃｍのユニットに対して本発明のユニットのサイ ズが長さ７〜４０ｃｍおよび直径１．４〜５．０ｃｍであるという点においても 本発明はさらになお差異を認められることができる。最後に、上記特許に述べら れた系は５０本のファイバーに限定されているが、本発明は７５００本までのフ ァイバーを用いることができ、そのため、極めて有利なマージンで目的産生物を 増加させることができる。本発明のさらなる利点は以下の明細書から明らかにな るであろう。 要約すると、上記先行技術の欠点を克服する中空ファイバー細胞培養系及び／ 又はｅｘ ｖｉｖｏ生体外血液、血漿及び／又は血清処理ユニットを製造するこ とが非常に望ましい。 発明の概要 本発明の課題は、一部のファイバーが気体を運搬し、他のファイバーが液体を 運搬する中空ファイバー系を提供することによって、エレガントで新規な方法で 解決することができ、さらに詳しくは、２つの端部を有するシェルと前記端部の 各々に配置された液体と気体との灌流口とを含み、前記両端部がそれらの間の細 長いチャンバーを画定している細胞培養ユニットを提供することによって、解決 することができる。前記細胞培養ユニットはさらに前記液体灌流口に接続した液 体灌流ファイバーと前記気体灌流口に接続した気体灌流ファイバーとを含み；前 記ファイバーは毛管外と毛管内の空間を画定する。さらにまた、前記ユニットは 前記気体灌流ファイバーの毛管内空間と連通する手段と、前記液体灌流ファイバ ーの毛管内空間と連通する手段と、前記毛管外空間と連通する手段とを含む。 図面の簡単な説明 添付図面に関連した、好ましい実施態様の下記説明から、本発明の利点と特徴 とがさらに十分に理解されるであろう。 図１は、本発明の細胞培養ユニットの第１実施態様の透視図であり； 図２は、本発明の細胞培養ユニットの第２実施態様の透視図であり； 図３は、第３実施態様の透視図であり； 図４は、図３のライン２−２に沿った横断面図であり； 図５は、第４実施態様の透視図であり； 図６は、図５のライン３−３に沿った横断面図であり； 図７は、ｅｘ ｖｉｖｏ生体外血液回路の概略図である。 好ましい実施態様の説明 図１と図２に示す本発明の第１実施態様では、第１端部１２と第２端部１３と を含むシェル部材１１を有する細胞培養ユニット１０が提供される。各端部は２ 個の口、液体灌流用の口１４と気体灌流用の口１５とに分かれる。図１は特にＹ 形状の端部１２と１３とを説明する。 毛管気体ファイバー１６と液体灌流ファイバー１７とはシェル１１の長さに及 ぶ。孔１９を介して毛管外空間への接近を可能にするために、通常の構造の１対 の接種口１８が備えられる。 図２に示す本発明の第２実施態様は、第１端部１２と第２端部１３とを有する シェル部材１１を包含する第１細胞培養ユニット１０を含む。前記端部は流入口 １４と排出口１５とを含む。さらに、前記シェル部材１１は、それぞれ、第１端 部２２と第２端部２３とを有するシェル部材２１を含む第２細胞培養ユニット２ ０によって二叉に分かれる。前記端部は各々流入口２４と排出口２５とを含む。 注目に値することには、液体又は気体は、両方が灌流されるものであるかぎり、 ユニット１０又はユニット２０のいずれを通っても、灌流することができる。同 様に、灌流の方向も無関係である。したがって、排出口と流入口とは任意に（se rendipidously）選択することができる。したがって、毛管気体ファイバー１６ はシェル１１の長さに及ぶことができ、液体灌流ファイバー１７はシェル２１の 長さに及ぶことができ、又はこの逆も可能である。それぞれ、孔１９と２９を介 して毛管外空間への接近を可能にするために、シェル１１と２１の各々には１対 の接種口１８と２８が存在する。 シェル部材１１と２１は、ガラス、ポリマー材料、例えばポリエチレン、ポリ スルホン、ポリスチレン、スチレンアクリロニトリル、プレキシガラス、ポリカ ーボネート等のような、通常に入手可能な任意の物質から製造することができる 。しかし、目視可能性を与えるためには、例えばポリカーボネート、ポリスチレ ン、スチレン、アクリロニトリル、プレキシガラス等のような、透明で耐久性の 物質が好ましく；ポリカーボネートが最も好ましい。 シェル１１と２１の寸法は長さにおいて約７ｃｍ〜約４０ｃｍ、好ましくは約 ２０ｃｍ〜約３０ｃｍの範囲であり、最も好ましくは２５ｃｍであり；直径にお いて約１．４ｃｍ〜約５ｃｍ、好ましくは約２ｃｍ〜約４．５ｃｍの範囲であり 、最も好ましくは４ｃｍである。 端部１２と１３は完全な細胞ユニット１０と２０の一部であることができ（図 １と２）、このようなものとして、同じ物質から製造することができる。或いは 、これらはＹコネクター端部ピースを分離することができる。前記Ｙ端部ピース １２と１３とは直接結合するか、又は連結スリーブ２４（図示せず）によって接 続されることができる。分離する場合に、これらは例えば長さにおいて約４ｃｍ 〜約１２ｃｍ、好ましくは約５ｃｍ〜約８ｃｍの範囲であり、最も好ましくは６ ｃｍであり；直径において約１．５ｃｍ〜約６ｃｍ、好ましくは約２ｃｍ〜約５ ｃｍの範囲であり、最も好ましくは３ｃｍである寸法を有する標準Ｐｙｒｅｘガ ラスＹコネクターのような物質でありうる。 図３は、液体ファイバー１７が気体ファイバー１６を完全に囲んでいる、本発 明の第３実施態様を示す。液体灌流口１４は気体口１５に垂直に配置される。気 体は気体ファイバー１６に通じる口１５を通して供給される。液体は端部１２と １３から側方に伸びる口１４を通して、液体ファイバー１７に供給される。 図４は、図３のライン２−２に沿った横断面図であり、口１４と１５及び内部 ファイバー配置をさらに説明する。 図５は、各端部に相互に平行な形態で２個の口を有する培養ユニット１０を示 す。次に、各口は、それぞれ、別々のチャンバー３１と３２を画定する。端部１ ２と１３はシェル１１内のリング３０中に嵌合し、リング３０は端部１２と１３ を２個の別々のシャンバー３１と３２に分割する。注目すべきことには、口は分 離されるが、気体灌流ファイバーと液体灌流ファイバーとはユニット１０内では 分離されない。 図６は、ライン３−３に沿った横断面図であり、別々の酸素口と灌流口とをさ らに説明する。 図７は、新規な培養ユニット１０を組み入れた生体外回路の概略図である。図 示するように、血液はポンプを介して患者からユニット１０へ流れ、再び患者に 戻って循環する。 中空気体ファイバー１６は任意の通常用いられる材料から製造することができ る。例示のためで限定するものではないが、これらは以下の物質：ポリエチレン 、ポリプロピレン等から製造されることができる。ファイバー１６は長さにおい て約７ｃｍ〜約４０ｃｍ、好ましくは約２０ｃｍ〜約３０ｃｍの範囲であり、最 も好ましくは２５ｃｍである。ファイバー１６の直径は約１５０μｍ〜約１．５ ｍｍ、好ましくは約２００μｍ〜約６５０μｍの範囲であり、最も好ましくは２ ５０μｍである。 同様に、中空液体ファイバー１７は任意の通常用いられる材料から製造するこ とができる。例示のためで限定するものではないが、次の物質：ポリプロピレン 、ポリスルホン、セルロース等を挙げることができる。ファイバー１７は長さに おいて約７ｃｍ〜約４０ｃｍ、好ましくは約２０ｃｍ〜約３０ｃｍの範囲であり 、最も好ましくは２５ｃｍである。ファイバー１７の直径は約１５０μｍ〜約１ ．５ｍｍ、好ましくは約２００μｍ〜約６５０μｍの範囲であり、最も好ましく は２５０μｍである。 培養細胞系は次のように組み立てられる。液体ファイバーと気体ファイバーと をシェル中に設置し、それらのそれぞれの流入口と排出口とに結合させる。ファ イバーの分離が必要である場合には、図４に示すようなリングを用いるか、又は 図２に示すようなＹ形状を用いることができる。ファイバーが固定されたならば 、ファイバーをポッティングすることができる（potted）。任意のポッティング （potting）方法を用いることができる。例示のためで限定するものではないが 、遠心ポッティング方法、静的なポッティングなどを挙げることができる。同様 に、ファイバーをポッティングするために、任意の数の物質を用いることができ る。 例示のためで限定するものではないが、ポリウレタン、エポキシ、シリコーン等 を挙げることができる。過剰なポッティング物質を除去して、末端キャップを固 定する。末端キャップの固定は任意の接着剤によって又は溶接によって達成する ことができる。 新規な培養ユニットは通常の方法で用いることができ、細胞懸濁培地と培養す べき細胞とは接種部２８、１８を介してシェル１１に接種される。酸素を必要と する細胞種の全てが考えられる一方、例示のためで限定するものではないが、種 々の器官細胞を挙げることができ、これには、肝細胞と膵臓細胞並びに全てのラ イン細胞と幹細胞が包含されるが、これらに限定されるわけではない。しかし、 新規な特徴は、気体はファイバー１６に結合する端部ピースに供給される一方、 液体はファイバー１７に結合する端部ピースを通して灌流されるということであ る。液体灌流は、任意の生物学的流体を含むことができ、これには培養培地、血 液（血漿又は血清のいずれか）、尿、痰等が含まれるが、これらに限定されるわ けではない。液体及び気体の灌流回路の特定の種類は、デバイスの特定の用途に 依存するが、そのいずれも当該技術分野で容易に知られるものである。本発明に よって考えられる回路の１つは酸素供給手段と培地灌流手段とを含むであろう。 本発明は如何なる培養培地にも限定されないが、Ｃｈｅｅ’ｓ Ｍｅｄｉａ（Ｇ ＩＢＣＯ社の商標，第９３−０１６５号によって知られる）、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ のＭｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ Ｍｅｄｉａ（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（１９９３〜１９９４）製品カタログに記載）、Ｍ ｉｎｉｍｕｍ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉａ（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ Ｌｉｆ ｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（１９９３〜１９９４）製品カタログに記載）等 を挙げることができる。培地には、任意の既知添加剤を補給することができ、こ れらにはインシュリン、デキサメタゾン、ゲンタマイシン、セリニウム、トラン スフェリン等が包含されるが、これらに限定されるわけではない。 二重中空ファイバー灌流の多くの利点は下記グラフから明らかである。先行技 術のユニットと本発明の培養ユニットとに２８０×１０⁶個のウサギ肝細胞を接 種し、これらのユニットをジアゼパムを用いて代謝活性に関してモニターした。 両培養ユニットを、毎日の培養培地の交換によって、３日間培養に維持した。ジ アゼパム代謝産物の濃度を毎日測定した。以下のグラフはその結果を示す。 異なる酸素供給によるバイオリアクターにおけるウサギ肝細胞のジアゼパ ム代謝活性 培養日数 代謝活性＝代謝産物（μｇ）／培養培地（ｍｌ） 本発明の二重灌流ユニット、即ち、二重バイオリアクターは先行技術の培養ユ ニットよりも１日目には５倍、そして２日目と３日目には４倍優れた性能を示し た。 ｅｘ ｖｉｖｏ生体外血漿又は血清又は全血の処理における本発明の使用は、 周知の任意の透析手法を含むことができる。図７は、本発明の新規なユニットを 用いる、典型的な生体外処理セットアップを示す。このユニットは次のようにし て有利に用いられる。動脈血又は静脈血又は血漿を約５０ｍＬ〜約１０００ｍＬ の範囲の所定速度で患者からデバイスに通るようにポンプで押し出す。流体はバ イオリアクターを灌流し、患者に戻り、それによって、デバイス内の細胞に酸素 を有利に供給する。 要約すると、本発明は細胞が気体と液体とによって同時に灌流される、新規な 二重灌流培養ユニットを含む。さらに詳しくは、本発明は、２つの端部を有する シェルと前記端部の各々に配置された液体と気体との灌流口とを含み、前記両端 部がそれらの間の細長いチャンバーを画定している細胞培養ユニットを含む。前 記細胞培養ユニットはさらに前記液体灌流口に接続した液体灌流ファイバーと前 記気体灌流口に接続した気体灌流ファイバーとを含み；前記ファイバーは毛管外 と毛管内の空間を画定する。さらにまた、前記ユニットは前記気体灌流ファイバ ーの毛管内空間と連通する手段と、前記液体灌流ファイバーの毛管内空間と連通 する手段と、前記毛管外空間と連通する手段とを含む。この新規なユニットの利 点は細胞の代謝活性の増強から容易に明らかである。 本明細書に述べた本発明の範囲から逸脱せずにある一定の変更がなされうるの で、図面を含めて上記明細書に述べた全ての事柄が例示として解釈されるべきで あり、限定の意味ではないことが意図される。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，Ｓ Ｚ，ＵＧ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，Ｉ Ｓ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ， ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，Ｓ Ｄ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 トソン，クリスティン・マリー アメリカ合衆国マサチューセッツ州02081, ワルポール，ジャージー・ウェイ ７ (72)発明者 ガノン，ケリー・アン アメリカ合衆国マサチューセッツ州01923, ダンバーズ，グレンデール・ドライブ 33 (72)発明者 ジョーレギュイ，ヒューゴ・オズバルド アメリカ合衆国ロード・アイランド州 02906，プロビデンス，ビベリン・ロード 25

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．下記要素： ａ．２つの端部を有し、それらの間に細長いチャンバーを画定するシェル； ｂ．前記端部の各々に配置された液体灌流口と気体灌流口； ｃ．前記液体灌流口に接続した液体灌流ファイバーと前記気体灌流口に接続し た気体灌流ファイバーとであって、毛管外空間と毛管内空間とを画定する上記フ ァイバー； ｄ．前記気体灌流ファイバーの毛管内空間と連通する手段； ｅ．前記液体灌流ファイバーの毛管内空間と連通する手段；及び ｆ．前記毛管外空間と連通する手段 を含む細胞培養ユニット。 ２．各端部が気体及び液体の灌流口を含む、請求の範囲第１項記載の細胞培 養ユニット。 ３．端部がＹ形状に二叉に分かれ、それによって液体灌流ファイバーと気体 灌流ファイバーとを分離させる、請求の範囲第２項記載の細胞培養ユニット。 ４．液体ファイバーが気体ファイバーを囲むように、液体口と気体口とが相 互に垂直である、請求の範囲第２項記載の細胞培養ユニット。 ５．各端部口が２つのチャンバーを含み、１つが液体灌流用であり、他方が 気体灌流用である、請求の範囲第２項記載の細胞培養ユニット。 ６．チャンバーがリングによって分離される、請求の範囲第５項記載の細胞 培養ユニット。 ７．前記毛管外空間と連通する手段が前記シェル上に配置された１つ以上の 接種口を含む、請求の範囲第１項記載の細胞培養ユニット。 ８．気体が酸素である、請求の範囲第１項記載の細胞培養ユニット。 ９．液体が血液である、請求の範囲第８項記載の細胞培養ユニット。 １０．シェルがガラス又はポリマー材料から製造される、請求の範囲第１項 記載の細胞培養ユニット。 １１．シェルがポリカーボネートから製造される、請求の範囲第１０項記載 の細胞培養ユニット。 １２．気体灌流ファイバーがポリエチレン、ポリプロピレン、シリコーンか ら製造される、請求の範囲第１項記載の細胞培養ユニット。 １３．液体灌流ファイバーがポリスルホン、セルロース、ポリプロピレンか ら製造される、請求の範囲第１項記載の細胞培養ユニット。 １４．次の要素： ａ．各シェルが２つの端部を有し、それらの間に細長いチャンバーを画定する ２つの分岐シェル； ｂ．１つのシェルの各端部に配置された液体灌流口と前記第２シェルの各端部 に配置された気体灌流口； ｃ．前記液体灌流口に接続した液体灌流ファイバーと前記気体灌流口に接続し た気体灌流ファイバーとであって、毛管外空間と毛管内空間とを画定する上記フ ァイバー； ｄ．前記気体灌流ファイバーの毛管内空間と連通する手段； ｅ．前記液体灌流ファイバーの毛管内空間と連通する手段；及び前記毛管外空 間と連通する手段 を含む細胞培養ユニット。 １５．次の工程： ａ．請求の範囲第１項に定義した細胞培養ユニットに細胞を接種する工程； ｂ．患者から血液を取り出す工程； ｃ．前記気体灌流口から酸素を供給しながら、前記取り出された血液をポンプ によって前記培養ユニットの液体灌流口に通して供給する工程； ｄ．前記濾過済み血液を患者に戻す工程；及び ｅ．細胞又は細胞成分を取り出す工程 を含む生体外回路を含む細胞培養方法。 １６．次の工程： ａ．請求の範囲第１項に定義した細胞培養ユニットに細胞を接種する工程； ｂ．患者から血液を取り出す工程； ｃ．血液からの血漿とその細胞成分とを分離する工程； ｄ．前記気体灌流口から酸素を供給しながら、前記分離された血漿をポンプに よって前記培養ユニットの液体灌流口に通して供給する工程； ｅ．血漿と血液の細胞成分とを再結合させる工程； ｆ．前記濾過済み血液を患者に戻す工程；及び ｇ．細胞又は細胞成分を取り出す工程 を含む生体外回路を含む細胞培養方法。 １７．接種される細胞が肝細胞である、請求の範囲第１４項記載の方法。 １８．次の工程： ａ．２つの端部を有し、それらの間に、１つ以上の接種口を有する細長いチャ ンバーを画定するシェル中に液体灌流ファイバーと気体灌流パートとを挿入する 工程； ｂ．前記ファイバーの１端部を流入口に接続させ、他方の端部をシェル端部に 配置された排出口に接続させる工程； ｃ．前記ファイバーをポッティングする工程； ｄ．前記チャンバーに細胞を接種する工程； ｅ．前記液体灌流ファイバーを通して液体を灌流させ、前記気体灌流ファイバ ーを通して気体を灌流させる工程； ｆ．細胞又は細胞成分を取り出す工程 を含む細胞又は細胞成分を培養する方法。 １９．ファイバーを遠心ポッティング方法によってポッティングする、請求 の範囲第１８項記載の方法。 ２０．接種される細胞が肝細胞である、請求の範囲第１８項記載の方法。