CN110946131A - 一种新型细胞冷冻添加液 - Google Patents

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李少卿
王娟
王思民
郭子宽
李乔丽
刘瑾
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    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
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    • A01N1/00—Preservation of bodies of humans or animals, or parts thereof
    • A01N1/02—Preservation of living parts
    • A01N1/0205—Chemical aspects
    • A01N1/021—Preservation or perfusion media, liquids, solids or gases used in the preservation of cells, tissue, organs or bodily fluids
    • A01N1/0221—Freeze-process protecting agents, i.e. substances protecting cells from effects of the physical process, e.g. cryoprotectants, osmolarity regulators like oncotic agents

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Abstract

一种新型细胞冷冻添加液，其特征在于，每100ml冷冻添加液按照以下的成分及含量，DMEM培养基65～75ml、胎牛血清15～725ml、二甲基亚砜8～712ml，柠檬酸钠1.004～1.012 g、青霉素10万单位。能够有效的提高细胞的冷冻的存活率；在常温下对细胞无毒害，降低细胞内蛋白质的变性；同时能够细胞冻存液的配置成本。

Description

一种新型细胞冷冻添加液
技术领域
本发明涉及生物低温保存技术领域，特别是一种新型细胞冷冻添加液。
背景技术
动物器官组织或者细胞经过特殊处理，保存在超低温中，抑制了其代谢活动，使其在相对静止的状态下保存下来。一旦升温又能复苏而不失去生命活动能力。复苏过程较为公认的理论是冷冻解冻过程中，在冷冻保护剂保护的作用下，阻止了细胞内水分的冰晶化，而直接形成玻璃化或是从玻璃化直接变为液态，越过了冰晶化。冰晶化是在降温过程中，水分子重新按几何图形排列形成结晶体(冰晶)。首先，细胞外水分形成冰晶，使胞外水分子迅速减少，细胞内水分子被迫通过半透膜扩散到细胞外，从而造成细胞脱水，原生质变干，使电解质浓度增高，酸碱度失去平衡，造成不可逆的化学损伤；其次冰晶还细胞内部产生，破坏细胞结构，引起细胞死亡。另一方面细胞外水分结成冰晶后，体积增大，冰晶块增大、移动，对细胞产生机械性的物理损伤，使细胞原生质表层破坏而失去保护作用。也就是说结晶形成的越大，对细胞的危害就会越大。玻璃化是在超低温下，水分子保持原来无序的排列，呈现微粒结晶且坚实均匀的纯粹玻璃样结构(即玻璃化冻结)。细胞在玻璃化冻结状态下，不会出现原生质脱水等现象，使细胞结构受到保护，解冻后的细胞仍能恢复活力。冰晶化和玻璃化形成的条件冰晶化是在0-60。C低温(冰晶化温度)区域内，缓慢降温的条件下形成的。玻璃化是在-60-250r超低温(玻璃化温度)区域内，快速越过冰晶化阶段后形成的，但玻璃化是可逆的、不稳定的，当缓慢升温再次经过冰晶化温度区域时，玻璃化又会转变为冰晶化。因此，在细胞冷冻过程中，如何使细胞快速越冰晶化进入玻璃化，是冷冻成败的关键。目前多采用的方法是在细胞稀释液中加入抗冻剂，快速冷冻、解冻，使细胞在冷冻解冻过程中迅速越过细胞致死危险温区(-15-60°C)，降低冰晶的形成，使细胞得以存活。目前所采用的抗冻物质有甘油、2—甲基亚砜、丙二醇等，它们对防止冰晶形成有着重要的作用。甘油等亲水性很强，可以在水结晶的过程中限制和干扰水分子晶.格排列，防止水形成结晶；又可使水处于过冷状态，降低水形成结晶的温度，縮短细胞穿越冰晶温度区的时间。但甘油等在常温下对细胞具有一定的毒害作用，造成细胞内蛋白质的变性，冷冻后细胞的存活率仍不高。
发明内容
针对上述情况，为克服现有技术之缺陷，本发明之目的就是提供一种新型细胞冷冻添加液，能够提高细胞冻存后的存活率，降低成本。
其解决方案是，一种新型细胞冷冻添加液，其特征在于，每100ml冷冻添加液按照以下的成分及含量，DMEM培养基65～75ml、胎牛血清15～725ml、二甲基亚砜8～712ml，柠檬酸钠1.004～1.012 g、青霉素10万单位。
本发明的有益效果是：能够有效的提高细胞的冷冻的存活率；在常温下对细胞无毒害，降低细胞内蛋白质的变性；同时能够细胞冻存液的配置成本。
附图说明
图1为本发明该冷冻添加液冻存细胞复苏24h时的照片。
图2为本发明常规冻存液冻存细胞复苏24h时的照片。
具体实施方式
以下结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。
实施例一、以充间质干细胞为例，
冷冻添加液配置：按照以下比例配置冷冻添加液，每100ml细胞冷冻抗冻剂由下列原料组成柠檬酸钠1.008g、DMEM培养基70ml、胎牛血清20ml、二甲基亚砜（dmso）10ml、青霉素10万单位。
细胞冻存：取对数生长期的细胞，去除旧培养液，用PBS清洗，去除PBS，加入适量胰蛋白酶，把单层生长的细胞消化下来；离心1000rpm，5min；去除胰蛋白酶，加入适量配制好的冻存配置好的冻存添加液，并用常规的冻存液做对照，用吸管轻轻吹打使细胞均匀，计数，调节冻存液中细胞的最终密度为5×106/ml～1×107/ml； 将细胞分装入冻存管中，每管1～1.5 ml；在冻存管上标明细胞的名称，冻存时间及操作者；冻存，标准的冻存程序为用程序降温仪降温速率-1～-2℃/ min；当温度达-25℃以下时，可增至-5℃～-10℃/min；到-100℃时，则可迅速浸入液氮中。也可将装有细胞的冻存管放入带有异丙醇的冻存盒内，然后放入-80℃冰箱中过夜，取出冻存管，移入液氮容器内。
细胞复苏：将冷冻管从液氮中取出，迅速投入37℃水浴融化，细胞融化后要尽快(约1min)移出37℃水浴。37℃水浴时间延长会提高细胞死亡率，复苏过程中一般细胞死亡率在20％～25％之间；迅速用酒精棉球擦拭冷冻管外部杀菌消毒；小心开启瓶盖，把细胞转入含有4mL培养基的培养瓶中，然后把培养瓶移至培养箱，26℃～28℃培养1h，让细胞贴壁；细胞贴壁后，小心移弃培养基，主要是去掉DMSO(悬浮生长细胞要通过离心沉淀除去DMSO)、死细胞及其碎片，加5mL新鲜培养基，26℃～28℃培养；细胞培养24h后，更换新鲜培养基，继续培养直到形成单层，便可以传代；详细记录复苏细胞的名称、数量、复苏时间、存放部位等。
以上所述的实施例并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计构思的前提下，本领域所属技术人员对本发明的技术方案作出的各种变形和改进，均应纳入本发明的权利要求书确定的保护范围内。

Claims (1)

1.一种新型细胞冷冻添加液，其特征在于，每100ml冷冻添加液按照以下的成分及含量，DMEM培养基65～75ml、胎牛血清15～725ml、二甲基亚砜8～712ml，柠檬酸钠1.004～1.012 g、青霉素10万单位。
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Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1795587A1 (en) * 2005-12-07 2007-06-13 Schuler, Gerold, Prof. Dr. Method for the direct culture of dendritic cells without a preceding centrifugation step
CN102106342A (zh) * 2009-12-29 2011-06-29 山东省齐鲁干细胞工程有限公司 一种间充质干细胞的保存方法和培养方法
CN102648708A (zh) * 2011-02-25 2012-08-29 深圳华大方舟生物技术有限公司 一种用于胚胎或细胞的冷冻液及其用途
CN103891709A (zh) * 2012-12-24 2014-07-02 深圳先进技术研究院 细胞冻存液及细胞冻存方法

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1795587A1 (en) * 2005-12-07 2007-06-13 Schuler, Gerold, Prof. Dr. Method for the direct culture of dendritic cells without a preceding centrifugation step
CN102106342A (zh) * 2009-12-29 2011-06-29 山东省齐鲁干细胞工程有限公司 一种间充质干细胞的保存方法和培养方法
CN102648708A (zh) * 2011-02-25 2012-08-29 深圳华大方舟生物技术有限公司 一种用于胚胎或细胞的冷冻液及其用途
CN103891709A (zh) * 2012-12-24 2014-07-02 深圳先进技术研究院 细胞冻存液及细胞冻存方法

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