CN114921523A - 一种干细胞内单体蛋白活性检测用的培养基的配制方法 - Google Patents

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    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
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Abstract

本发明公开了一种干细胞内单体蛋白活性检测用的培养基的配制方法，步骤包含以下几步：(1)配制基础培养基；(2)配制干扰素母液；(3)配制复合培养基。基础培养基为血清替代物与无血清培养液混合配制，扰素母液为γ干扰素母液。通过将上述两种母液混合复配制备的无异源物组分的复合培养基具有良好的高密度干细胞培养效果，能够有效防止高密度培养干细胞时的细胞减少现象，从而使得间充质干细胞内IDO1蛋白酶活性测试的结果更加准确，适宜在干细胞领域推广，具有广阔的发展前景。

Description

一种干细胞内单体蛋白活性检测用的培养基的配制方法
技术领域
本发明涉及C12Q1/00领域，尤其涉及一种干细胞内单体蛋白活性检测用的培养基的配制方法。
背景技术
间充质干细胞(MSCs)作为干细胞的一种，其广泛存在于机体的大部分组织中，可以从骨髓、脂肪、肌肉等组织中分离获得，具有跨胚层分化的特性，可以分化为脂肪细胞、成骨细胞、成软骨细胞、神经细胞等，参与组织的再生修复和机体内环境稳态的维持。
在间充质干细胞中，一些活性单体蛋白的表达能够明显的影响间充质干细胞进行神经细胞再生和免疫系统调节的表达效果。这其中吲哚胺2，3-双加氧蛋白酶1(IDO1)作为间充质干细胞中一种含亚铁血红素的单体蛋白，是肝脏之外唯一可催化细胞生长代谢的色氨酸分子中吡咯环氧化裂解的活性蛋白酶，其对干细胞在妊娠、肿瘤、自身免疫性疾病和移植免疫中发挥了重要的作用，所以，对于间充质干细胞中IDO1的活性的检测，在间充质干细胞医学效果的研究上就显得格外重要。
但是，本申请人发现，在一些现有技术中，例如现有专利CN201710357313.6，提供的一种羊膜间充质干细胞培养基以及相应的间充质干细胞培养方法，声称其制备的培养基以及采用的相关培养方法能够快速有效的对间充质干细胞进行培养，且能够进一步的提高干细胞的表达率和细胞纯度。但是，其在培养基使用的高体积比的胎牛血清，不仅容易在培养基组分中引入异源物组分产生干细胞在培育过程中的损失和死亡现象，其外胎牛血清提供的营养物质和活性因子不能够在培养基环境产生良好的自我更新能力，降低了培养基的培养质量。
因此，为了解决上述问题，研发一种能够有效培育数量较多间充质干细胞，且在培育过程中大大减少干细胞损失，使得IDO1活性检测结果准确度明显提高的无胎牛血清类检测用培养基是一项十分有意义的工作。
发明内容
为了解决上述问题，本发明第一方面提供了一种干细胞内单体蛋白活性检测用的培养基的配制方法，步骤包含以下几步：(1)配制基础培养基；(2)配制干扰素母液；(3)配制复合培养基。
在一些优选的实施方式中，所述基础培养基为血清替代物与无血清培养液混合配制。
在一些优选的实施方式中，所述血清替代物与无血清培养液的体积比为1～2：17～21。
在一些优选的实施方式中，所述血清替代物与无血清培养液的体积比为1：18～19。
在一些优选的实施方式中，所述干扰素母液为γ干扰素母液。
在一些优选的实施方式中，所述γ干扰素母液为γ干扰素与母液基础液混合配制。
在一些优选的实施方式中，所述干扰素母液中γ干扰素的浓度为80～140ng/μL。
在一些优选的实施方式中，所述母液基础液为血清替代物与无菌水于无菌环境中混合配制。
在一些优选的实施方式中，所述血清替代物与无菌水的体积比为1～2：15～25。
在一些优选的实施方式中，所述复合培养基为基础培养基和干扰素母液混合配制。
在一些优选的实施方式中，所述复合培养基中γ干扰素的浓度为5～15ng/mL。
在一些优选的实施方式中，所述复合培养基中γ干扰素的浓度为9～11ng/mL。
本发明中，通过血清替代物，无血清培养液和γ干扰素混合配制的混合培养基，能够有效培育数量较多间充质干细胞，且在培育过程中大大减少干细胞损失，使得IDO1活性检测结果准确度明显提高。本申请人推测为：本发明申请中的血清替代物EliteGroTM和无血清培养液NutriStem XF Medium与常用的胎牛血清和干细胞培养液相比都具有无动物性源且无异源物组分特点；两者复配，且积比为1～2：17～21时，基础培养液具有了在给众多干细胞提供所需营养物质和活性因子的同时，两者的协同作用能够表现出良好的自我更新和繁殖能力，能够长时间的为干细胞提供所需物质，保证细胞的支持物供给，并且在培养的过程中维持保护干细胞的正常的纤维囊肿形态；当混配γ干扰素母液时，母液中相同的血清替代物不仅和基础培养液体系具有良好的相容性，还补充了相应的营养物质未引入异源物组分，当γ干扰素的浓度为5～15ng/mL时，γ干扰素在正常诱导干细胞IDO1酶活性的同时，保证干细胞的培养环境不被破坏，从而最终提高IDO1酶活性检测结果的准确性。
本发明第二方面包括该培养基配制方法在检测人间充质干细胞IDO1活性的实验中的应用。
在一些优选的实施方式中，所述血清替代物为EliteCell生物医药集团公司出售的EliteGroTM型号的血清替代物产品。
在一些优选的实施方式中，所述无血清培养液为以色列BI公司出售的NutriStemXF Medium型号的无血清培养液产品。
在一些优选的实施方式中，所述无菌水为Peprotech公司生产出售的无菌水产品。
在一些优选的实施方式中，所述γ干扰素为Peprotech公司生产出售的IFN-γ干扰素产品。
有益效果：本发明申请中通过基础培养基和干扰素母液的无血清混合配制，并控制基础培养基中血清替代物与无血清培养液的体积比和培养基中的干扰素的浓度制备的混合培养基，为间充质干细胞的高密度接种提供了优良的环境，极大的减少了培养过程中干细胞的损失；并且适当的干扰素浓度在激发干细胞产生酶活性表达的同时，能够同时保证干细胞的培养环境不被破坏，从而最终提高IDO1酶活性检测结果的准确性。
具体实施方式
根据以下优选实施方法的详述描述可更容易地理解本发明的内容。除非另有限定，本文使用的所有技术以及科学术语具有与本发明所属领域普通技术人员通常理解的相同的含义,当存在矛盾时，以本说明书中的定义为准。
实施例
以下通过实施例对本发明技术方案进行详细的说明，但是本发明的保护范围不局限于所述的所有实施例。如无特殊说明，本发明的原料均为市售。
实施例1
实施例1第一方面提供了一种干细胞内单体蛋白活性检测用的培养基的配制方法，步骤包含以下几步：(1)采用血清替代物和无血清培养液以体积比1：19配制成基础培养基；(2)首先，采用血清替代物与无菌水以体积比1：20配制母液基础液，在母液基础液中加入γ干扰素，配制成浓度为100ng/μL的γ干扰素母液；(3)将γ干扰素母液与基础培养基混合配制成最终浓度为10ng/mL的复合培养基。
本实施例中，血清替代物为EliteCell生物医药集团公司出售的EliteGroTM型号的血清替代物产品。
本实施例中，无血清培养液为以色列BI公司出售的NutriStem XF Medium型号的无血清培养液产品。
本实施例中，无菌水为Peprotech公司生产出售的无菌水产品。
本实施例中，γ干扰素为Peprotech公司生产出售的IFN-γ干扰素产品。
实施例2
本实施例的具体实施方式同实施例1，不同之处在于：血清替代物和无血清培养液的体积比为2：17。
实施例3
本实施例的具体实施方式同实施例1，不同之处在于：血清替代物与无菌水的体积比为1：25。
实施例4
本实施例的具体实施方式同实施例1，不同之处在于：γ干扰素母液的浓度为120ng/μL。
性能评价
1.形貌观察：采用所有实施例和对比例配制的复合培养基对24孔板上的间充质干细胞进行24小时的培养，间充质干细胞的接种密度为5×104个/孔。培养完成后显微镜观察间充质干细胞的细胞形状是否规则，是否有破裂或其他现象。
2.间充质干细胞保存量：采用所有实施例和对比例配制的复合培养基对24孔板上的间充质干细胞进行24小时的培养，间充质干细胞的接种密度为5×104个/孔；培养完成后检测剩余细胞密度，以实施例1的细胞密度为基准密度，计算其他实施例剩余细胞密度相对于基准密度的百分比，百分比越大代表复合培养基的培养效果越好，干细胞损失量越少；每个实施例对比例测试5个试样，测得的数值的平均值记入表1。
表1
Figure BDA0003154925760000061
Figure BDA0003154925760000071
通过实施例1～4和表1可以得知，本发明提供的干细胞内单体蛋白活性检测用的培养基的配制方法，制备的复合培养基具有良好的高密度干细胞培养效果，能够有效防止高密度培养干细胞时的细胞减少现象，从而使得IDO1蛋白酶活性测试的结果更加准确，适宜在干细胞领域推广，具有广阔的发展前景。其中实施例1在具有最佳的配制方法和配制原料体积比等因素下获得了最佳性能指数。
最后指出，以上所述实施例仅为本发明较佳的实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所做任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种干细胞内单体蛋白活性检测用的培养基的配制方法，其特征在于：步骤包含以下几步：(1)配制基础培养基；(2)配制干扰素母液；(3)配制复合培养基。
2.根据权利要求1所述的干细胞内单体蛋白活性检测用的培养基的配制方法，其特征在于：所述基础培养基为血清替代物与无血清培养液混合配制。
3.根据权利要求2所述的干细胞内单体蛋白活性检测用的培养基的配制方法，其特征在于：所述血清替代物与无血清培养液的体积比为1～2：17～21。
4.根据权利要求1所述的干细胞内单体蛋白活性检测用的培养基的配制方法，其特征在于：所述干扰素母液为γ干扰素母液。
5.根据权利要求4所述的干细胞内单体蛋白活性检测用的培养基的配制方法，其特征在于：所述γ干扰素母液为γ干扰素与母液基础液混合配制。
6.根据权利要求4所述的干细胞内单体蛋白活性检测用的培养基的配制方法，其特征在于：所述干扰素母液中γ干扰素的浓度为80～140ng/μL。
7.根据权利要求5所述的干细胞内单体蛋白活性检测用的培养基的配制方法，其特征在于：所述母液基础液为血清替代物与无菌水于无菌环境中混合配制。
8.根据权利要求1所述的干细胞内单体蛋白活性检测用的培养基的配制方法，其特征在于：所述复合培养基为基础培养基和干扰素母液混合配制。
9.根据权利要求8所述的干细胞内单体蛋白活性检测用的培养基的配制方法，其特征在于：所述复合培养基中γ干扰素的浓度为5～15ng/mL。
10.一种根据权利要求1～9任意一项所述的干细胞内单体蛋白活性检测用的培养基的配制方法的应用，其特征在于：包括该培养基配制方法在检测人间充质干细胞IDO1活性的实验中的应用。
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