CN113559273A - 一种静脉注射用成体干细胞的预处理方法、成体干细胞注射液及应用 - Google Patents

一种静脉注射用成体干细胞的预处理方法、成体干细胞注射液及应用 Download PDF

Info

Publication number
CN113559273A
CN113559273A CN202110836727.3A CN202110836727A CN113559273A CN 113559273 A CN113559273 A CN 113559273A CN 202110836727 A CN202110836727 A CN 202110836727A CN 113559273 A CN113559273 A CN 113559273A
Authority
CN
China
Prior art keywords
stem cells
adult stem
irisin
adsc
injection
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN202110836727.3A
Other languages
English (en)
Other versions
CN113559273B (zh
Inventor
闫文俊
陶凌
郭永珍
陈有虎
夏云龙
许晓明
齐婷婷
李聪叶
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Air Force Medical University of PLA
Original Assignee
Air Force Medical University of PLA
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Air Force Medical University of PLA filed Critical Air Force Medical University of PLA
Priority to CN202110836727.3A priority Critical patent/CN113559273B/zh
Publication of CN113559273A publication Critical patent/CN113559273A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN113559273B publication Critical patent/CN113559273B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/30—Macromolecular organic or inorganic compounds, e.g. inorganic polyphosphates
    • A61K47/42—Proteins; Polypeptides; Degradation products thereof; Derivatives thereof, e.g. albumin, gelatin or zein
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/28—Bone marrow; Haematopoietic stem cells; Mesenchymal stem cells of any origin, e.g. adipose-derived stem cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0019—Injectable compositions; Intramuscular, intravenous, arterial, subcutaneous administration; Compositions to be administered through the skin in an invasive manner
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/04—Inotropic agents, i.e. stimulants of cardiac contraction; Drugs for heart failure
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
    • C12N5/0662—Stem cells
    • C12N5/0663—Bone marrow mesenchymal stem cells (BM-MSC)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
    • C12N5/0662—Stem cells
    • C12N5/0665—Blood-borne mesenchymal stem cells, e.g. from umbilical cord blood
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
    • C12N5/0662—Stem cells
    • C12N5/0667—Adipose-derived stem cells [ADSC]; Adipose stromal stem cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/998—Proteins not provided for elsewhere

Abstract

本发明提供了一种静脉注射用成体干细胞的预处理方法、成体干细胞注射液及应用，涉及生物医药技术领域。本发明利用鸢尾素蛋白对成体干细胞进行预处理，大幅度增加静脉注射成体干细胞向心脏归巢，极大方便了成体干细胞治疗心脏病的实践操作和临床应用；提高了成体干细胞的抗凋亡和旁分泌功能，使归巢到心肌组织中的成体干细胞发挥更强的心肌保护效果；而且利用鸢尾素蛋白对成体干细胞进行预处理，不改变成体干细胞基因组，且可洗脱，具有良好的安全性，另外，鸢尾素蛋白体外处理成体干细胞的使用量小，成本低廉。

Description

一种静脉注射用成体干细胞的预处理方法、成体干细胞注射 液及应用
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种静脉注射用成体干细胞的预处理方法、成体干细胞注射液及应用。
背景技术
大量的研究证实，间充质干细胞(Mesenchymal stromal cells,MSC)作为一种成体干细胞，可通过旁分泌心脏保护因子、释放细胞外囊泡等方式发挥心肌保护作用。MSC移植已进入多项III期临床试验，极有希望成为防治心力衰竭发生发展的一项临床新策略。MSC可以通过心肌内注射、冠状动脉内注射和静脉注射三种方法进行移植，MSC移植后在心肌中的滞留数量越多，其心肌修复能力越强。在三种MSC移植方法中，静脉注射效果明显优于心肌内注射和冠状动脉内注射。然而，静脉注射MSC存在一个明显问题，即单次静脉输注MSC后，MSC主要分布于肺脏中，少于3％的MSC分布于心肌组织中，使得单次注射MSC这种方法治疗心力衰竭的疗效不佳。国内外研究者报道了几种可提高静脉注射MSC向心脏归巢的方法，如MSC特定基因修饰、心肌组织特定基因干预、超声靶向微泡破坏技术等。但基因修饰会改变MSC的基因组，临床应用不安全；心肌组织特定基因干预这一方法则需要借助基因治疗，安全性差；超声靶向微泡破坏技术则需依托超声技术团队，技术难度高，难以推广应用，因此到目前还没有一种不改变MSC基因组且风险低的预处理方法。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种静脉注射用成体干细胞的预处理方法、成体干细胞注射液及应用，利用鸢尾素蛋白对成体干细胞进行预处理，不仅不改变成体干细胞基因组，且可洗脱，具有良好的安全性；还可以显著提高成体干细胞心肌保护能力。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了鸢尾素蛋白在制备提高静脉注射成体干细胞心肌保护能力的试剂中的应用。
优选的，所述鸢尾素蛋白包括重组鸢尾素蛋白。
本发明还提供了一种静脉注射用成体干细胞的预处理方法，包括以下步骤，将鸢尾素蛋白的工作液与成体干细胞混合孵育，所述孵育的温度为37℃。
优选的，所述成体干细胞包括脂肪间充质干细胞、骨髓间充质干细胞和脐带血间充质干细胞。
所述鸢尾素蛋白的工作液中鸢尾素蛋白的浓度为100～1000ng/mL。
优选的，所述鸢尾素蛋白的工作液的制备方法，包括：将鸢尾素蛋白溶解于PBS缓冲液中，配制成100～1000μg/mL的储存液，利用完全培养基对所述储存液进行稀释，得100～1000ng/mL的工作液。
优选的，所述成体干细胞包括汇合度至60～90％的成体干细胞。
优选的，所述孵育包括孵育两次，每次孵育的时间为12～24h。
优选的，在所述孵育后，还包括弃去培养基和鸢尾素蛋白，利用胰蛋白酶消化经预处理后的成体干细胞，离心去上清，用PBS缓冲液清洗。
本发明还提供了一种成体干细胞注射液，所述注射液包括经上述预处理方法预处理后得到的成体干细胞。
本发明还提供了上述成体干细胞注射液在制备治疗心脏病的药物中的应用。
有益效果：本发明提供了鸢尾素蛋白(Irisin)在制备提高静脉注射成体干细胞心肌保护能力的试剂中的应用，利用鸢尾素蛋白对成体干细胞进行预处理，大幅度增加静脉注射成体干细胞向心脏归巢，极大方便了成体干细胞治疗心脏病的实践操作和临床应用；提高了成体干细胞的抗凋亡和旁分泌功能，使归巢到心肌组织中的成体干细胞发挥更强的心肌保护效果；而且利用鸢尾素蛋白对成体干细胞进行预处理，不改变成体干细胞基因组，且可洗脱，具有良好的安全性，另外，鸢尾素蛋白是一种商品化重组蛋白，体外处理成体干细胞的使用量小，成本低廉。在本发明实施例中，采用脂肪间充质干细胞(ADSC)，在体外进行Irisin预处理，并在体内验证了经Irisin预处理后可以提高单次和多次静脉注射ADSC向心脏归巢、增加ADSC在心肌中的存活、增强ADSC的旁分泌促血管新生功能，从而提高静脉注射MSC治疗心力衰竭的疗效。
附图说明
图1为Irisin预处理提高单次静脉注射ADSC向心脏的归巢，其中A：MI/R小鼠心脏切片中ADSC-GFP-PBS和ADSC-GFP-Irisin的荧光图片，绿色代表ADSC-GFP，红框内是拟放大的视野，红色代表心肌组织，蓝色代表细胞核；B：MI/R小鼠心脏切片中ADSC-GFP的数量统计(n＝5只小鼠/组)；
图2为Irisin预处理提高多次静脉注射ADSC向心脏的归巢，其中A：MI/R小鼠心脏切片中ADSC-DiI-PBS和ADSC-DiI-Irisin的荧光图片，红框内是拟放大的视野，红色代表ADSC-DiI，绿色代表心肌组织，蓝色代表细胞核；B：MI/R小鼠心脏切片中ADSC-DiI的数量统计(n＝5只小鼠/组)；C：MI/R小鼠心脏无心肌细胞单细胞悬液中ADSC-DiI-PBS和ADSC-DiI-Irisin的流式分析图片，长方形框中的红点代表ADSC-DiI；D：MI/R小鼠心脏无心肌细胞单细胞悬液中ADSC-DiI的比例(n＝5只小鼠/组)；
图3为Irisin预处理提高多次静脉注射ADSC减轻小鼠缺血性心力衰竭的作用，其中A：小鼠MI/R后30天的心脏超声图片；B：长轴M模式下的左心室射血分数(LVEF-Longaxis)(n＝20-24只小鼠/组)；C：短轴M模式下的左心室射血分数(LVEF-Short axis)(n＝20-24只小鼠/组)；D：心脏切片马松-三色染色图片；E：心肌梗死面积统计(n＝8只小鼠/组)；F：心脏切片免疫荧光结果，上图中绿色指示CD31，即微血管，下图中绿色指示凋亡的心肌细胞；G：心肌组织血管密度统计(n＝6只小鼠/组)；H：心肌组织中心肌细胞凋亡统计(n＝6只小鼠/组)；
图4为Irisin预处理提高多次静脉注射ADSC减轻大鼠缺血性心力衰竭的作用，其中A：大鼠MI/R后30天的心脏超声图片；B：长轴M模式下的左心室射血分数(LVEF-Longaxis)(n＝10只大鼠/组)；C：短轴M模式下的左心室射血分数(LVEF-Short axis)(n＝10只大鼠/组)；D：心脏切片马松-三色染色图片；E：心肌梗死面积统计(n＝8只大鼠/组)；
图5为Irisin预处理具有降低ADSC凋亡的作用，其中A：大鼠ADSC经Irisin预处理48小时，然后经200μM双氧水(H2O2)处理6小时后的Caspase-3，Cleaved caspase-3的代表性Western blot条带；B：Cleaved caspase-3相对表达量的统计结果(n＝4/组)；C：大鼠ADSC经Irisin预处理48小时，然后经200μM双氧水(H2O2)处理6小时后的TUNEL染色典型图片，红色指示TUNEL阳性细胞核，蓝色指示所有细胞核；D：TUNEL阳性ADSC的统计结果(n＝4/组)；
图6为Irisin增强ADSC旁分泌促血管新生的作用，其中A：RCAEC成管实验的典型图片；B：RCAEC成管数目的统计结果(n＝4/组)。
具体实施方式
本发明提供了鸢尾素蛋白在制备提高静脉注射成体干细胞心肌保护能力的试剂中的应用。
本发明所述鸢尾素蛋白(Irisin)优选包括重组鸢尾素蛋白，本发明对所述Irisin的来源并没有特殊限定，优选购自Aviscera Bioscience公司。本发明经过研究，证实了利用Irisin对成体干细胞进行预处理，可增强静脉注射成体干细胞向心脏归巢，并提高静脉注射成体干细胞治疗心脏病的疗效。本发明对所述成体干细胞的种类并没有特殊限定，优选包括脂肪间充质干细胞、骨髓间充质干细胞和脐带血间充质干细胞。
本发明还提供了一种静脉注射用成体干细胞的预处理方法，包括以下步骤，将鸢尾素蛋白的工作液与成体干细胞混合孵育，所述孵育的温度为37℃；
所述鸢尾素蛋白的工作液中鸢尾素蛋白的浓度为100～1000ng/mL。
本发明所述鸢尾素蛋白的工作液的制备方法，优选包括：将鸢尾素蛋白溶解于PBS缓冲液中，配制成100～1000μg/mL的储存液，利用完全培养基对所述储存液进行稀释，得100～1000ng/mL的工作液。本发明所述完全培养基优选为含10％胎牛血清和1％青霉素-链霉素双抗的DMEM-F12培养基或αMEM培养基。
本发明进行预处理的成体干细胞优选为汇合至60～90％的成体干细胞，其制备方法优选包括从动物体内分离出第1代成体干细胞，用完全培养基重悬细胞，接种于细胞培养皿中，细胞接种6小时后，改换新鲜的完全培养基以去除未贴壁细胞，待细胞汇合度为80～90％时，用胰酶消化法进行传代，获得第2～6代传代成体干细胞。
本发明进行所述孵育时，优选包括将生长良好的传代成体干细胞汇合度为60～90％时，弃去培养基，加入新鲜的Irisin工作液，放入37℃细胞孵箱中培养12～24小时，弃去培养基，再加入新鲜Irisin工作液，放入37℃细胞孵箱中培养12～24小时。
本发明在所述孵育后，优选还包括弃去培养基和鸢尾素蛋白，利用胰蛋白酶消化经预处理后的成体干细胞，且在所述胰蛋白酶消化后，还包括离心去上清，用PBS缓冲液清洗。本发明优选在弃去培养基后，用PBS缓冲液清洗成体干细胞2～3次，以去除残余培养基和Irisin蛋白，向清洗后的成体干细胞加入1～2ml的0.1～0.25％的胰蛋白酶，置于25～37℃孵育2～5min，当贴壁成体干细胞变圆脱落时，加入完全培养基终止消化，吹打消化后的成体干细胞。
本发明还提供了一种成体干细胞注射液，所述注射液包括经上述预处理方法预处理后得到的成体干细胞。
本发明所述成体干细胞注射液的制备方法，优选包括将上述吹打消化后的成体干细胞移至15ml离心管以150～600g离心4～5min，离心完成后弃去上清，加入PBS缓冲液洗涤成体干细胞2～3次，每次均以150～600g离心4～5min，得可治疗用的成体干细胞注射液。
本发明所述成体干细胞注射液中优选包括0.1×107～1×107个细胞/mL。本发明所述成体干细胞注射液，优选于0～6℃环境下保存，并在保存环境取出后，于0～2小时内进行注射，可反复多次注射，每次注射量为(0.5～5)×107细胞/千克体重，注射时间为每周1～3次。
本发明还提供了上述成体干细胞注射液在制备治疗心脏病的药物中的应用。
在本发明实施例中，将野生小鼠的脂肪间充质干细胞(ADSC)进行上述预处理，并制备成体干细胞注射液，利用所述注射液静脉注射心力衰竭动物模型，证实可以提高单次和多次静脉注射ADSC向心脏归巢、增加ADSC在心肌中的存活、增强ADSC的旁分泌促血管新生功能，从而提高静脉注射MSC治疗心力衰竭的疗效。
下面结合实施例对本发明提供的一种静脉注射用成体干细胞的预处理方法、成体干细胞注射液及应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
一、材料和方法
1、培养脂肪间充质干细胞(ADSC)
从野生小鼠体内分离出第1代ADSC，具体是用戊巴比妥钠麻醉动物，取白色脂肪组织，将脂肪组织放入预冷的磷酸盐缓冲液中洗涤数次，将脂肪组织剪碎为小块，置于胶原酶溶液中消化，期间吹打数次。待脂肪组织消化完全后，筛网上过滤去除未消化组织，离心获得细胞沉淀，使用红细胞裂解液重悬细胞沉淀去除红细胞，离心获得细胞沉淀，再用完全培养基(含10％胎牛血清和1％青霉素-链霉素双抗的DMEM-F12培养基)重悬细胞，接种于细胞培养皿中。细胞接种6小时后，改换新鲜的完全培养基以去除未贴壁细胞。待细胞汇合度为80～90％时，用胰酶消化法进行传代，获得第2～6代传代ADSC。
2、Irisin预处理成体干细胞
将商品化的重组Irisin粉末溶于磷酸盐缓冲液中，按100～1000μg/mL浓度配成Irisin储存液，再将Irisin储存液按比例与新鲜的完全培养基混合，配置100ng/mL的Irisin工作液。待生长良好的成体干细胞汇合度为60～90％时，弃去培养基，加入新鲜的Irisin工作液，放入37℃细胞孵箱中培养。12小时后，弃去培养基，再加入新鲜Irisin工作液，放入37℃细胞孵箱中培养12小时。
3、成体干细胞标记
采用两种方法标记成体干细胞，用以追踪成体干细胞移植后向心脏中的归巢。一是采用绿色荧光蛋白(GFP)转基因小鼠，从这种小鼠分离出的成体干细胞永久表达GFP，可实现长期示踪。二是选用CM-DiI对成体干细胞进行标记。CM-DiI是1,1'-双十八烷-3,3,3',3'-四甲基吲哚羰基花青高氯酸盐的衍生物，是一种具有亲脂性的荧光染料，可对细胞进行非特异性染色，以实现长期示踪。具体是在Irisin预处理后，在完全培养基中加入5μM的CM-DiI染料，对细胞培养皿中的成体干细胞进行20min染色。当CM-DiI嵌入细胞膜后，在549nm激发光下，可发射波长为565nm橙红色荧光，便于荧光显微镜下观察、辨识移植细胞。染色液配制及染色过程中注意避光。
4、制备成体干细胞注射液
Irisin预处理后，弃去培养基、并用磷酸盐缓冲液清洗成体干细胞2～3次，以去除残余培养基和Irisin蛋白，向清洗后的成体干细胞加入1～2ml的0.25％的胰蛋白酶，置于37℃孵育，当贴壁成体干细胞变圆脱落时，加入完全培养基终止消化，吹打消化后的成体干细胞悬液，将成体干细胞悬液移至15ml离心管以500g离心5min，离心完成后弃去上清，加入磷酸盐缓冲液洗涤成体干细胞2次，每次均以500g离心5min，得治疗成体干细胞注射液(ADSC-GFP-Irisin和ADSC-GFP-PBS细胞注射液)。
5、心力衰竭动物模型制备
采用8～12周龄C57BL/6J小鼠或8～12周龄Sprague Dawley大鼠，建立心肌缺血/再灌注(MI/R)动物模型。大、小鼠通过异氟烷吸入麻醉后，仰卧位固定，沿胸骨左沿做一斜切口，分离胸大、小肌，暴露第四肋间，右手持弯钳钝性撑开第四肋间，左手轻柔顺势挤出心脏，快速用6-0缝合线暂时阻断冠状动脉左前降支进行心肌缺血，2小时后，解除对冠状动脉左前降支的阻断，进行血液再灌注。心肌缺血/再灌注术后1天，采用小动物心脏超声检测左心室射血分数，剔除左心室射血分数≥45％的动物，左心室射血分数＜45％的动物接受静脉注射成体干细胞治疗。
6、静脉注射
成体干细胞注射液制备后，置于0～6℃环境下保存，取出后用注射器抽取成体干细胞注射液，经静脉为心力衰竭动物模型进行注射，可反复多次注射，每次注射量为2×107细胞/千克体重，注射时间为每周1次，共注射5次。
7、成体干细胞心脏归巢检测
在检测成体干细胞静脉注射后向心脏归巢时，分别于心肌缺血/再灌注(MI/R)术后2天(单次静脉注射后1天)和30天(末次静脉注射后1天)牺牲动物，心脏结扎线以下取材，4％多聚甲醛固定24h，脱水后进行石蜡包埋后连续切片切成5μm厚的切片。进行免疫荧光染色，具体是将载玻片脱蜡，并在热柠檬酸缓冲液中进行抗原修复。冷却后，玻片在室温下用0.2％的Triton-100透膜15分钟，切片用含5％马血清的PBS封闭30分钟，用肌钙蛋白T的一抗在4℃下孵育过夜。用含红色或绿色荧光基团的二抗与一抗结合。用4’,6-二氨基-2-苯吲哚(DAPI)染色细胞核。通过荧光显微镜和照相机获取免疫染色的红色、绿色和蓝色显微照片。用CM-DiI阳性面积与心脏切片总面积之比量化CM-DiI示踪的成体干细胞，用GFP阳性的细胞数/心脏切片量化GFP示踪的ADSC。
8、心脏功能和心脏重构的检测
分别在心肌缺血/再灌注(MI/R)术后1天，15天和30天检测心脏功能。具体是采用高分辨率小动物心脏超声检测，首先将大、小鼠胸部脱毛，然后将大、小鼠通过异氟烷吸入麻醉，仰卧位固定于恒温小动物超声检测台，并持续给予异氟烷麻醉。用胶布将动物四肢固定于涂有导电胶的电极板上，同步记录心电图，心率维持在400～500次/分时开始进行超声检测。将高频超声探头，对动物进行M模式下超声检测，检测长轴和短轴左心室射血分数。
心脏重构包括心肌纤维化，心肌细胞凋亡和心肌微血管新生。于心肌缺血/再灌注术后30天牺牲动物，心脏结扎线以下取材，4％多聚甲醛固定24h，脱水后进行石蜡包埋后连续切片切成5μm厚的切片。分别进行马松-三色染色检测心脏纤维化，TUNEL染色检测心肌细胞凋亡，CD31免疫荧光染色检测心肌微血管新生。
二、结果与分析
1、Irisin预处理提高单次静脉注射ADSC向心脏的归巢情况
利用上述方法，采用人重组Irisin蛋白或PBS处理ADSC-GFP细胞，人重组Irisin蛋白浓度为100ng/mL，24小时一次，共处理两次，然后洗脱Irisin或磷酸缓冲盐溶液(PBS)，收集ADSC-GFP细胞，制成ADSC-GFP-Irisin和ADSC-GFP-PBS细胞注射液。
于MI/R后1天，为同批次的不同小鼠单次静脉注射ADSC-GFP-Irisin和ADSC-GFP-PBS细胞注射液，细胞输注量为5×105/小鼠。细胞注射1天后，牺牲小鼠，将心脏组织包埋于蜡块中，制作石蜡切片，采用免疫荧光染色的方法在心脏组织中寻找ADSC-GFP-Irisin和ADSC-GFP-PBS。
如图1所示，在对应小鼠的单个心脏切片中，可以找到平均12.4个ADSC-GFP-Irisin，但仅能找到平均2.4个ADSC-GFP-PBS。表明，Irisin预处理使单次静脉注射ADSC向心脏中归巢的数量提高了超过5倍。
2、Irisin预处理提高多次静脉注射ADSC向心脏的归巢情况
利用与上述相同的方法和浓度，利用红色示踪染料CM-DiI对ADSC进行染色，制成ADSC-DiI-Irisin和ADSC-DiI-PBS细胞注射液。
于MI/R后1天、8天、15天、22天和29天，为同批次的不同小鼠五次静脉注射ADSC-DiI-Irisin和ADSC-DiI-PBS细胞注射液，细胞输注量为5×105/小鼠/次。最后一次细胞注射1天后，牺牲小鼠，采用两种方法检测心肌组织中ADSC-DiI归巢情况。一是将心脏组织包埋于蜡块中，制作石蜡切片，采用免疫荧光染色的方法在心脏组织中寻找ADSC-DiI。结果如图2中A和B所示，每个心脏切片中可以找到的ADSC-DiI细胞数量，发现ADSC-DiI-Irisin比ADSC-DiI-PBS数量多5倍以上；二是将心脏组织酶解消化，采用细胞筛网去除组织块和心肌细胞，制成无心肌细胞的单细胞悬液，然后采用流式细胞术检测其中ADSC-DiI细胞的比例。结果如图2中C和D所示，对应MI/R小鼠心脏组织中ADSC-DiI-Irisin比ADSC-DiI-PBS数量同样多5倍以上。
3、Irisin预处理提高多次静脉注射ADSC减轻小鼠缺血性心力衰竭的作用
利用上述相同的方法制备相同浓度的ADSC-Irisin和ADSC-PBS细胞注射液。
于MI/R后1天、8天、15天、22天和29天，为小鼠五次静脉注射ADSC-Irisin或ADSC-PBS细胞注射液，细胞输注量为5×105/小鼠/次。采用小动物心脏超声仪，于心肌MI/R后1天、15天和30天连续三次检测MI/R小鼠的心脏功能，结果如图3中A、B和C所示，ADSC-Irisin比ADSC-PBS对长轴左心室射血分数(LVEF-Long axis)和短轴左心室射血分数(LVEF-Shortaxis)的提高更为显著。
于MI/R后30天，牺牲小鼠，将心脏组织包埋于蜡块中，制作石蜡切片，分别采用马松-三色染色检测心肌梗死面积，采用TUNEL染色检测心肌细胞凋亡率，采用CD31染色检测心肌组织血管新生情况。结果如图3中D和E所示，五次静脉注射ADSC-Irisin，显著降低了MI/R后的心肌梗死面积，增加了心肌组织中微血管的密度，图3中F和H所示，减少了心肌细胞凋亡率。
4、Irisin预处理提高多次静脉注射ADSC减轻大鼠缺血性心力衰竭的作用
利用上述相同的方法制备ADSC-Irisin和ADSC-PBS细胞注射液。
于MI/R后1天、8天、15天、22天和29天，为大鼠五次静脉注射ADSC-Irisin或ADSC-PBS细胞注射液，细胞输注量为5×106/大鼠/次。采用小动物心脏超声仪，于心肌MI/R后1天、15天和30天连续三次检测MI/R大鼠的心脏功能，结果如图4中A、B和C所示，ADSC-Irisin比ADSC-PBS对长轴左心室射血分数(LVEF-Long axis)和短轴左心室射血分数(LVEF-Shortaxis)的提高更为显著。
于MI/R后30天，牺牲大鼠，将心脏组织包埋于蜡块中，制作石蜡切片，分别采用马松-三色染色检测心肌梗死面积。结果如图4中D和E所示，五次静脉注射ADSC-Irisin，比注射ADSC-PBS更为显著降低了MI/R后的左心室心肌梗死面积(Infarcted area)。
5、Irisin预处理具有降低ADSC凋亡的作用
分离培养与上述相同的Sprague Dawley大鼠的脂肪间充质干细胞(ADSC)，培养至第2代，分别采用人重组Irisin蛋白或PBS处理ADSC细胞，人重组Irisin蛋白浓度为100ng/mL，24小时一次，共处理两次，然后洗脱Irisin或PBS，采用双氧水(H2O2，200μM，6小时)诱导ADSC凋亡，以模拟心肌缺血微环境中的氧化应激损伤，然后采用两种方法检测ADSC凋亡。
一是收集ADSC细胞蛋白，采用Western blot法检测Cleaved caspase-3的蛋白水平，结果如图5中A和B所示，Irisin预处理可以显著降低双氧水诱导的ADSC中Cleavedcaspase-3的表达。
二是采用1％甲醛溶液将细胞固定，然后采用TUNEL染色检测TUNEL阳性细胞核比例，结果如图5中C和D所示，Irisin预处理可以显著降低TUNEL阳性细胞核比例。说明Irisin预处理具有降低氧化应激诱导的ADSC凋亡的作用。
6、Irisin增强ADSC旁分泌促血管新生的作用
分离培养与上述相同的SpragueDawley大鼠的脂肪间充质干细胞(ADSC)，培养至第2代，分别采用人重组Irisin蛋白或PBS处理ADSC细胞，人重组Irisin蛋白浓度为100ng/mL，24小时一次，共处理两次，然后洗脱Irisin或PBS，加入无血清培养基，开始收集ADSC细胞的条件培养基(CM)，12小时后得到ADSC-Irisin-CM和ADSC-PBS-CM。
将大鼠冠状动脉内皮细胞系(RCAEC)分为三组，均种于Matrigel上进行成管实验，一组给予F12培养基作为对照组，一组给予ADSC-PBS-CM，一组给予ADSC-Irisin-CM，24小时后，观察RCAEC成管情况。结果如图6所示，ADSC-PBS-CM组成管多于F12组，而ADSC-Irisin-CM组显著高于ADSC-PBS-CM组。该实验说明Irisin具有增强ADSC旁分泌促血管新生的作用。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.鸢尾素蛋白在制备提高静脉注射成体干细胞心肌保护能力的试剂中的应用。
2.根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述鸢尾素蛋白包括重组鸢尾素蛋白。
3.根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述成体干细胞包括脂肪间充质干细胞、骨髓间充质干细胞和脐带血间充质干细胞。
4.一种静脉注射用成体干细胞的预处理方法，包括以下步骤，将鸢尾素蛋白的工作液与成体干细胞混合孵育，所述孵育的温度为37℃；
所述鸢尾素蛋白的工作液中鸢尾素蛋白的浓度为100～1000ng/mL。
5.根据权利要求4所述预处理方法，其特征在于，所述鸢尾素蛋白的工作液的制备方法，包括：将鸢尾素蛋白溶解于PBS缓冲液中，配制成100～1000μg/mL的储存液，利用完全培养基对所述储存液进行稀释，得100～1000ng/mL的工作液。
6.根据权利要求4所述预处理方法，其特征在于，所述成体干细胞包括汇合度至60～90％的成体干细胞。
7.根据权利要求4所述预处理方法，其特征在于，所述孵育包括孵育两次，每次孵育的时间为12～24h。
8.根据权利要求4或7所述预处理方法，其特征在于，在所述孵育后，还包括弃去培养基和鸢尾素蛋白，利用胰蛋白酶消化经预处理后的成体干细胞，离心去上清，用PBS缓冲液清洗。
9.一种成体干细胞注射液，所述注射液包括经权利要求4～8任一项所述预处理方法预处理后得到的成体干细胞。
10.权利要求9所述成体干细胞注射液在制备治疗心脏病的药物中的应用。
CN202110836727.3A 2021-07-23 2021-07-23 一种静脉注射用成体干细胞的预处理方法、成体干细胞注射液及应用 Active CN113559273B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110836727.3A CN113559273B (zh) 2021-07-23 2021-07-23 一种静脉注射用成体干细胞的预处理方法、成体干细胞注射液及应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110836727.3A CN113559273B (zh) 2021-07-23 2021-07-23 一种静脉注射用成体干细胞的预处理方法、成体干细胞注射液及应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN113559273A true CN113559273A (zh) 2021-10-29
CN113559273B CN113559273B (zh) 2022-06-14

Family

ID=78166738

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202110836727.3A Active CN113559273B (zh) 2021-07-23 2021-07-23 一种静脉注射用成体干细胞的预处理方法、成体干细胞注射液及应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN113559273B (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115044544A (zh) * 2022-02-22 2022-09-13 张建秋 一种牙髓间充质干细胞的复苏方法
CN115400149A (zh) * 2022-09-09 2022-11-29 南京艾尔普再生医学科技有限公司 一种含有msc细胞的制剂

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103585620A (zh) * 2013-11-16 2014-02-19 中国人民解放军第三军医大学第三附属医院 鸢尾素在制备预防心肌缺血再灌注损伤的药物中的应用

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103585620A (zh) * 2013-11-16 2014-02-19 中国人民解放军第三军医大学第三附属医院 鸢尾素在制备预防心肌缺血再灌注损伤的药物中的应用

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
JINGYU DENG等: "FNDC5/irisin improves the therapeutic efficacy of bone marrow-derived mesenchymal stem cells for myocardial infarction", 《STEM CELL RESEARCH & THERAPY》 *
ZHAO, YU TINA等: "Irisin promotes cardiac progenitor cell-induced myocardial repair and functional improvement in infarcted heart", 《JOURNAL OF CELLULAR PHYSIOLOGY》 *
余元勋等: "《中国分子医学系列丛书 中国分子心脏病学》", 31 August 2015, 安徽科学技术出版社 *
佛山综合细胞库: "2019年国家自然基金面上项目完整名单——间充质", 《HTTPS://WWW.SOHU.COM/A/335787110_99917888，2019年国家自然基金面上项目完整名单——间充质》 *
杨涛等: "《基因诊断与细胞治疗》", 31 August 2018, 科学技术文献出版社 *
高润霖等: "《百科全书 心血管病学》", 31 July 2017, 中国协和医科大学出版社 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115044544A (zh) * 2022-02-22 2022-09-13 张建秋 一种牙髓间充质干细胞的复苏方法
CN115400149A (zh) * 2022-09-09 2022-11-29 南京艾尔普再生医学科技有限公司 一种含有msc细胞的制剂

Also Published As

Publication number Publication date
CN113559273B (zh) 2022-06-14

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN105985985A (zh) Crispr技术编辑并用igf优化的异体间充质干细胞的制备方法及在治疗心梗中应用
CN113559273B (zh) 一种静脉注射用成体干细胞的预处理方法、成体干细胞注射液及应用
US20030103951A1 (en) Cardiac muscle regeneration using mesenchymal stem cells
CN103861088B (zh) 一种治疗原发性肝癌的干细胞制剂及其制备方法
CN105769910B (zh) 一种人羊膜间充质干细胞的应用
CN105820998A (zh) 临床回输级细胞治疗用人脂肪干细胞ADSCs分离提取培养方法
CN107090431A (zh) 一种用于输注糖尿病的活性间充质干细胞注射液
CN110577931A (zh) 间断缺氧处理干细胞来源外泌体及在心肌组织中的应用
CN108472319A (zh) 用于治疗心脏病的移植材料
CN106074604A (zh) 用于修复机体机能老化和延缓脏器功能衰退的治疗剂
CN106434542A (zh) 一种增强脂肪干细胞增殖与移植后存活能力的方法
WO2020030097A1 (zh) 促进细胞生长和组织修复的方法及组合物
CN109402175B (zh) 表达趋化因子受体ccr2b的脂肪干细胞及制备方法与应用
CN106754650B (zh) 一种骨髓来源的内皮祖细胞培养方法
CN106606512B (zh) 一种用于治疗心肌梗死的混合细胞制剂及制备方法与应用
US20240034997A1 (en) Myogenin-expressing fibroblast-like cell (meflc) line and construction method and use thereof
Li et al. An improved two-step method for extraction and purification of primary cardiomyocytes from neonatal mice
CN101182493A (zh) 一种治疗放射性肠炎的转基因间充质干细胞及其制备方法
CN108495924A (zh) 用于产生间充质干细胞的方法
CN105755098A (zh) 一种毛囊干细胞诱导分化为血管内皮细胞的联合鉴定方法
CN108841786A (zh) 人羊膜来源的间充质干细胞预处理方法及其应用
CN102703380A (zh) 亚全能干细胞、其制备方法及其用途
WO2020030091A1 (zh) 用于治疗组织坏死或改善心脏功能的药物
CN106474157A (zh) 一种肝干细胞注射液及其制备方法
CN101432420A (zh) 用于血管生成治疗的自体或异源祖细胞的条件培养基

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant