TWI439276B

TWI439276B - 肝袓細胞及其使用

Info

Publication number: TWI439276B
Application number: TW100115836A
Authority: TW
Inventors: Horng Jyh Harn; Shinn Zong Lin
Original assignee: Gwo Xi Stem Cell Applied Technology Co Ltd
Priority date: 2010-05-06
Filing date: 2011-05-05
Publication date: 2014-06-01
Also published as: CN102234626B; CN102234626A; US8415149B2; US20110274664A1; TW201138790A

Description

肝祖細胞及其使用

本發明係關於一種肝祖細胞，尤指一種肝祖細胞的製備方法及其使用。

慢性肝病是一種世界性的的健康問題。B型肝炎、C型肝炎、酒精及某些化學藥物能夠導致肝臟纖維化及肝硬化，並最終導致肝衰竭，目前肝臟移植仍然是肝衰竭患者的唯一的選擇，然而肝臟移植常受阻於缺乏捐贈者，同時，肝臟移植並不適合某些疾病，例如某些感染及某些類型的癌症，所以需要一些替代性的方法來治療肝病及其相關的問題。

本發明是基於一個意料之外的發現，即多功能肝祖細胞能夠用以治療肝病及其相關問題。

本發明包含一種取得肝祖細胞的方法，其方法包括取得培養的多功能動物細胞，將此一多功能動物細胞與肝臟組織在一培養液中培養一段時間，並收集此一共培養的多功能動物細胞及其後裔以取得肝祖細胞。其中，此一多功能動物細胞是CD29、CD44、CD49b、CD49d、CD73、CD90、CD105和CD13所組成的群組中的標記呈陽性反應，並對由CD14、CD34、CD45和HLA-DR所組成的群組中的標記呈陰性反應。

此一多功能動物細胞可以是取自第一對象的臍帶的華頓氏膠(Wharton’s Jelly)，該第一對象可以是人類或是一種非人類的哺乳類動物，例如貓、狗、豬或馬等，此一共培養的肝臟組織可以是一種受損的肝臟組織，此一受損的肝臟組織是取自第二對象，第二對象可以是一種人類或非人類的哺乳類動物，將取自第二對象的肝臟組織置於一種具有肝毒性的反應物中，造成此一肝臟組織的損傷，第一對象及第二對象可以是相同或不同的動物，具肝臟毒性的反應物可以是一種機械的外力或一種生理的事件，比如局部缺血、發炎反應或是一種化學藥劑，比如硫乙醯胺、四氯甲烷或是酒精，肝臟組織亦可以取自暴露於肝毒性因素下的活體組織切片，肝祖細胞可以表現一種或多種選自由CK18、白蛋白(albumin)、色胺酸2,3雙加氧酶(tryptophan 2,3-dioxygenase)、α-胎兒蛋白(αfetoprotein,AFP)、CYP7A1、NANOG、oct4(octamer-binding transcription factor 4)、c-Kit、肝臟生長因子(hepatocyte growth factor,HGF)和金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMP)所組成的群組中的基因，在一實施例中，多功能動物細胞對肝臟生長因子或金屬蛋白酶呈陽性反應。

本發明的另一目的在於製備肝祖細胞，製備的方法如上所述。

本發明的另一目的包含製備被培養的多功能動物細胞及肝臟細胞的組合物，該多功能動物細胞對一種或多種選自由CD29、CD44、CD49b、CD49b、CD73、CD90、CD105和CD13所組成的群組中的標記呈陽性反應，並對一種或多種選自由CD14、CD34、CD45和HLA-DR所組成的群組中的標記呈陰性反應，肝臟組織可以是在體外培養的組織，在一實施例中肝臟組織是一種受肝毒性試劑損傷的肝臟組織，在一實施例中，多功能動物細胞是取自於第一對象，例如人類臍帶的華頓氏膠。

本發明包含一種治療肝臟疾病，例如纖維化或肝硬化的方法，此一治療方法包含鑑定出一具有肝臟疾病或有肝臟疾病風險的一對象，並對該對象施用一第一製備物或一第二製備物，該第一製備物含有上述的被培養的多功能動物細胞，該第二製備物含有上述的肝祖細胞，該多功能動物細胞或該肝祖細胞能夠分化成表現白蛋白的細胞，肝祖細胞的製備方法如上所述。

本發明並包含一種提升在一對象的肝臟中的白蛋白、金屬蛋白酶或肝臟生長因子濃度的方法，本方法包含在實驗對象中施用一有效劑量的一第一製備物或一第二製備物，該第一製備物含有上述被培養的多功能動物細胞，該第二製備物含有上述的肝祖細胞，肝祖細胞的製備方法已如上述。

在本發明中，肝祖細胞具有下列一第一特徵及一第二特徵，第一特徵是能夠表現一種或多種肝臟專一性的基因，該基因係選自由CK18、白蛋白、色胺酸2,3雙加氧酶、α-胎兒蛋白和CYP7A1所組成的群組，第二種特徵是具有發展成為幹細胞的潛力，相較於取自於臍帶的華頓氏膠的多功能動物細胞以及華頓氏膠幹細胞，肝祖細胞具有較低的NANOG、Oct-4和c-Kit的幹細胞基因表現量。

以下，本發明的實施例將配合圖式詳加描述，從本發明的描述、圖式及申請專利範圍，本發明的技術內容、特徵及優點將顯而易見。

本發明是關於一種多功能細胞及使用多功能細胞以治療肝臟疾病的方法。

由於具有修復的特質及分化的潛能，幹細胞被用來治療肝臟疾病已見諸於醫學文獻之中，然而由於倫理面與邏輯面的考量，阻礙了胚胎幹細胞的使用，自骨髓及臍帶取得的幹細胞具有成為各種細胞及肝祖細胞的潛能，同時，活體研究亦證實移植的幹細胞能分化成肝祖細胞，同時表現白蛋白、色胺酸2,3雙加氧酶和CK18特定的標記，而研究亦證實移植的老鼠幹細胞能夠加速受損肝臟的復原。

本發明使用華頓氏膠幹細胞(Wharton’s jelly stem cells)取得肝祖細胞，並用肝祖細胞治療肝臟疾病。胚胎幹細胞或華頓氏膠幹細胞具有發展成各種細胞的潛能，包括肝祖細胞，因此其能夠再生肝細胞以治療肝臟疾病，如下例所示，華頓氏膠幹細胞(WJSCs)能夠用一般的技術手段在試管內隔離、培養及發展，將華頓氏膠幹細胞植入老鼠之後並沒有發現有絲分裂活化細胞、畸胎瘤、惡性增生的發生，因此這些細胞可以植入體內治療肝臟疾病，而沒有上述的顧慮，由於這些的優點，華頓氏膠幹細胞代表另一種取得多功能細胞的方法，在一個較佳的實施例中，本發明使用華頓氏膠幹細胞。在一個較佳的實施例中，本發明使用人類的華頓氏膠幹細胞。

華頓氏膠是一種取自於臍帶的凝膠狀結締組織，華頓氏膠是由肌纖維母細胞狀的基質細胞、膠質纖維及蛋白多醣(Kobayashi et al.,1998,Early Hum Dev 51,223-33)所組成，華頓氏膠幹細胞容易在體外被隔離及培養，華頓氏膠幹細胞具有發展的潛能，並且在適當的條件下，能夠分化成類神經元細胞、類軟骨細胞、脂肪細胞、心臟細胞或是骨細胞。

取自於豬臍帶的華頓氏膠的細胞，能夠培養至100倍的數量，而仍能活潑的成長(Weiss,et al.2003,Exp Neurol 182,288-99)，免疫組織化學及超微結構的研究發現取自於華頓氏膠的細胞具有基質細胞的特質，並且表現出各種細胞骨架及細胞外基質蛋白的不同的分佈樣態(Nanaev et al.1997,Placenta 18,53-64)。

下列實例一所描述的方法可用於製備華頓氏膠幹細胞(Wharton’s jelly Stem Cells)，為了確認所製備的細胞的確是華頓氏膠幹細胞，流式細胞儀分析或標準的免疫化學分析用於檢查培養至第4代至第8代的如前所述的細胞，上面所描述的抗體或描述於圖1-1至圖1-14的抗體可用來檢查抗原，這些抗體可以跟適當的標記結合，比如螢光異硫氰酸鹽(FITC)、藻紅素(PE)或量子點。使用流式細胞儀，將對CD14、CD34、CD45和HLA-DR呈陰性並且對CD29、CD44、CD49b、CD49d、CD73、CD90、CD105和CD13呈陽性的華頓氏膠幹細胞加以濃縮及純化。

這些被濃縮的華頓氏幹細胞可以用標準的技術來檢驗其分化潛力。習知技術中，第5代至第10代的細胞可以被用來誘發生成肝祖細胞、神經膠質細胞、骨細胞及脂肪細胞。下面實施例所描述的方法可以用來培養華頓氏膠質幹細胞以取得肝祖細胞，在另一實施例中，為確認華頓氏膠質幹細胞分化成骨細胞或脂肪細胞的潛力，華頓氏膠質幹細胞被培養之後再轉移至骨質培養液或脂肪質培養液，並培養一段適當的時間，例如三個禮拜。分化成骨質細胞的潛力，可用鈣質累積的程度來加以檢視，鈣質累積的程度可用von Kossa染色法以進行目視觀察。為檢測分化成脂肪細胞的潛力，細胞內的脂肪微粒可用Oil Red O加以染色，並且在顯微鏡之下觀察。華頓氏膠質幹細胞培養在神經培養液一段適當時間，例如七天，進行血清消耗處理及-巰基乙醇培養，在分化後，華頓氏膠質幹細胞呈現折射細胞體(refractile cell body)型態，具有延伸的軸凸狀構造並組成網路。族系專一性標記的免疫細胞化學染色，可以進步用來確認神經的分化潛力。這些標記包括III-tubulin(Tui-1)、神經中間絲蛋白(neurofilament)和GFAP。

上述的華頓氏膠質幹細胞或肝祖細胞可以在非分化性的培養液中培養數倍，而不產生自發的分化、老化、型態的改變、繁殖力的增加或分化成肝細胞的能力上的改變。

如下面內容所述，這些被確認後的華頓氏膠質幹細胞或肝祖細胞可以用標準的方法加以儲存或使用於需要的實驗對象。

本發明可以使用各種可以分化成肝祖細胞的多功能幹細胞或多功能幹細胞實施，換言之，除了華頓氏膠質幹細胞之外，本發明的幹細胞或肝祖細胞可以來自於各種來源，在本發明的一實施例中，幹細胞或肝祖細胞的來源是選自由造血細胞、臍帶血細胞、G-CSF活動週邊血細胞、骨髓細胞、肝臟細胞、胰臟細胞、神經細胞、寡樹突細胞、皮膚細胞、胚胎幹細胞、肌肉細胞、骨細胞、間質細胞、軟骨細胞、基質細胞所組成的群組，本發明自各種來源取得幹細胞的方法是此一領域的習知技術，通常是選擇能夠表現一種或多種肝細胞標記的細胞，例如CD34,CD133等，或取自於缺乏某些已分化細胞標記的細胞，幹細胞的篩選通常是用FACS或免疫磁性分離法，但是也可以使用核酸法，例如聚合酶連鎖反應(PCR)法，胚胎幹細胞取得的方法是此一領域中所習知技術(Smith,Annu Rev Cell Dev Biol(2001)17：435)，成人幹細胞，亦即取自於成人組織的幹細胞亦是此一領域所習知的技術，分離及濃縮成人幹細胞的方法已見諸於文獻中。(Miraglia et al.(1997)Blood 90：5013,Uchida et al.(2000)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97：14720,Simmons,P.J.et al.(1991)Blood 78：55,Prockop Cytotherapy(2001)3：393,；Bohmer Fetal Diagn Ther(2002)17：83；and Rowley et al.Bone Marrow Transplant(1998)21：1253),Stem Cell Biology Daniel R.Marshak(Editor)Richard L.Gardner(Editor),Publisher：Cold Spring Harbor Laboratory Press,(2001)and Hematopoietic Stem Cell Transplantation.Anthony D.Ho(Editor)Richard Champlin(Editor),Publisher：Marcel Dekker(2000))。

「幹細胞」是指能夠分化成各種細胞的細胞，幹細胞可以是全功能幹細胞或多功能幹細胞，全功能幹細胞可以分化成任何一種細胞，全功能幹細胞可以是胚胎幹細胞或非胚胎幹細胞，多功能幹細胞通常可以分化成好幾種不同的細胞，單功能幹細胞只可以產生一種細胞的形式，但是單功能幹細胞不同於非幹細胞是因為其具有自我更新修復的功能，幹細胞可以取自於各種組織及器官，這些組織及器官包括但不限於血液、神經、肌肉、皮膚、腸道、乳頭、腎臟、肝臟、胰臟與胸腺等，在本發明中，這些幹細胞是可以是取自於成人或新生兒的組織或器官

在本發明中，這些細胞通常是指有相當純度的細胞，在此，相當的純度是指這些細胞占有一個相當的比例，或大部分的比例，例如超過20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或95，一般來說一個有相當純度的細胞占有70%，通常是80%，有的時候是至少90%，換言之，一種或多種組成的細胞族群都可以在本發明中使用。

「增殖」及「擴展」在本發明中被交互使用，並且同樣是指相同型態的細胞經由細胞分裂而增加數目，在此分化是指一個發展的過程，藉由此一過程細胞特化成具有一種特定功能的細胞，例如細胞取得一種或多種型態上的特徵或是具有不同於最初細胞的功能，此一名詞「分化」包含譜系提交及最終的分化過程，分化過程可以用偵測譜系標記是否存在而加以偵測，分化過程可以用此一領域中熟知的技術，例如免疫組織化學法，來偵測譜系標記是否存在以評估分化的程度，衍伸自前驅細胞的後代細胞可以是，但未必是屬於幹細胞來源組織的同一胚層或同一組織，例如神經前驅細胞及肌肉前驅細胞可以分化成造血細胞家族。在本發明中，「譜系提交」及「特化」可以被交互使用，是指幹細胞進行的過程，在此一過程中，幹細胞產生一種前驅細胞，用以形成一種特定範圍的已分化細胞型態，被譜系提交或指定的前驅細胞通常具有自我修復及細胞分裂的功能，在此，「最終分化」是指一種最後分化的過程，在此過程中，細胞變成一個成熟完全分化的細胞，例如造血前驅細胞及肌肉前驅細胞可以分化成神經或神經膠質細胞譜系，然後，其最終的分化過程導致形成成熟的神經元細胞或神經膠質細胞，通常最終分化過程伴隨著自細胞分裂週期的退出及細胞增殖的停止，在此，「前驅細胞」是指被指定或提交於一特定細胞譜系的細胞，這些細胞最終會經由一系列的細胞分裂而生成此一譜系細胞。

本發明並提供數種藥物組成，該藥物組成包含上述細胞、活性成分或化合物，該藥物組成的製備是經由混合治療上有效劑量的細胞、活性成分、化合物以一藥物學上可接受的載體，且該藥物成分可以選擇性的加入其他的活性物質，此一載體具有不同的形式，其形式依使用的途徑來決定。

上述的藥物組成可以使用習知的藥物賦形劑及藥物製備方法，該藥物賦形劑可以與各種藥劑、溶劑、造粒劑、濕潤劑及連結劑混合。在此所指的「有效劑量」或「治療上的有效量」，是指可以造成一特定病症的症狀或參數有可測量的改善的藥劑量，上述細胞的治療有效量，是可用此一領域中習知的方法來決定，此一領域的技術者可使用以經驗為依據的方法來決定治療一種疾病的有效量。使用於一患者的精確藥劑量，應當視疾病嚴重的程度及其患者的身體狀況來決定，一個可以造成症狀或參數可測量的改變的量，可由習此一領域知識者決定或由病人向醫生的報告而決定，在此應當了解的是，任何臨床上或統計學上的有意義的改變或改善均屬於本發明的範圍之內，所謂臨床上有意義的改變或改善，是指病人或醫生可以察覺到的改變或改善。

此一片語「藥物學上可接受的」是指，它的分子本身及它的成分是生理學上可以忍受而且不會對病人產生不想要的反應，更為理想的是，「藥物學上可接受」是指中央或地方政府的藥物管理當局所批准，或在於美國藥典或其他公認的藥典，而被認為是可以使用於哺乳類，尤其是人類的藥物，藥物學上可接受的鹽類、酯類、胺類及前驅藥物，是指該些有良好醫學評價並且與病人的組織接觸史，不會造成毒性發炎或過敏反應的鹽類、酯類、胺基化合物及前驅藥物，該些鹽類、酯類、胺基及前驅藥物等等，並須符合一個合理的利益/風險比例，並對使用的目的有效。

上面所述使用於藥物組成的載體，是指一種稀釋劑、賦形劑或載體，該些藥物載體可以是無菌的液體，如水或油。水或水溶液、食鹽溶液、葡萄糖水溶液及甘油溶液是較理想的載體，尤其是對注射用的溶液而言，適合使用的藥物載體記載於下述文獻(“Remington's Pharmaceutical Sciences”by E.W.Martin,18th Edition)。

上述的細胞可藉由注射或注入的方式施加於患者，例如：靜脈注射、腦脊椎膜注射、肌肉注射、管腔注入、氣管注入、腹膜注入或皮下注射，口服或貼皮吸收，或其它此一領域中所習用的方式，藥物的施用可以是兩個禮拜一次、一個禮拜一次或更高的頻率使用，但是在疾病的穩定期通常使用的頻率會減少。

異體移植細胞與自體移植細胞都可以被使用。在前一種情形，應該要進行人類白血球抗原配對(HLA-matching)，以避免或減低被移植者的免疫反應，在後面的一種情形中，自體細胞被濃縮和純化並且儲存以待後續使用，這些細胞可以在體外以被移植者的T細胞共培養然後再被導入被移植者的體內，這樣做可以讓被移植者的身體認為這些細胞是他自己的，而進而降低T細胞的反應。

藥物使用的劑量及使用的頻率將視臨床徵兆而定，例如病人在緩解期或急性期，在緩解期中，至少一種急性期的臨床徵兆將會消失或減少，並且藥物的劑量與使用的頻率也將視這種用藥物或用藥物來治療的疾病的病人徵兆及臨床或非臨床的徵候是否有減少，藥物劑量及使用的頻率也將視病人或是被治療的哺乳類實驗對象的年紀、性別、健康狀況而定，並且也參考藥物的作用及副作用以及醫生的判斷，在所有上述的方法中，細胞可以每次以一萬到十萬個數量使用於試驗對象。

本發明並包含一種治療肝臟疾病或緩解肝臟疾病症狀的方法，此一方法包含診斷「需要」治療的試驗對象，以及使用或移植上述的細胞，需要診斷的對象例如患有肝臟疾病或具有肝臟疾病風險。

施用或移植可藉由直接注入目標器官、注入血液或注入腹膜內的方式施行，適當的施用或移植的方法將由以下的方式決定，例如監測被植入的細胞到目標器官的遷徙路徑，所想要的器官專一性基因或標記的表現，以及試驗對象的器官的功能，例如白蛋白或肝臟生長因子。在此，應當被認知的是在活體外被培養的幹細胞或前驅細胞被植入肝臟，以提供細胞一個有利生長的環境，然後分化成能夠表現出對肝臟細胞專一性的特徵，然後這些分化完成的細胞可以再被移出、分離、再度的植入肝臟的其他部份或其他的試驗對象。

該些試驗對象可以是人類或是非人類的哺乳類動物，諸如貓、狗、豬、馬，肝臟疾病包括肝硬化及肝纖維化，在第21段中提及的「需要」是指試驗對象處於一種狀態，這種狀態為肝功能需要被加強，此一狀態包括但不限於該些施用對象患有下列原發性肝臟疾病，例如原發性膽汁鬱積性肝硬化、肝癌、原發性硬化性膽管炎、自體免疫慢性肝炎、酒精性肝炎以及感染性疾病，例如C型肝炎，此一狀態亦包含一些次要的狀態，比如寄生蟲引起的感染，例如：蛔蟲，或是藥物及化學藥品中毒。在本發明的此一部分，幹細胞或前驅細胞的捐贈者及接受者可以是同一個體或是不同個體，比如同種異體或異種異體，當進行同種異體的移植，降低移植排斥的照護需要被進行，此類的照護常常施行於人類的治療，相關的治療如以下文獻所述(Slavin et al.,e.g.,J Clin Immunol(2002)22：64,and J.Hematother Stem Cell Res(2002)11：265),Gur et al.(Blood(2002)99：4174),and Martelli et al,(Semin Hematol (2002)39：48))。

標準的技術可用來診斷一個需要被治療的試驗對象是否具有相關的狀況或症狀，例如過度的膠原沉積是由慢性病毒、肝炎、酒精濫用以及藥物中毒所引起的肝臟纖維化的主要特徵。

此一治療方法須對需要治療的試驗對象使用一有效劑量的上述細胞，而且治療效果可用標準的方法加以評估，例如以下實施例所描述的方法。

本發明並包含一種增加在受測試對象肝臟中白蛋白、肝臟生長因子或金屬蛋白酶的方法，此一方法包括在需要治療的試驗對象中，使用一含有培養多功能動物細胞的一第一製備品，或含有肝祖細胞的一第二製備品，該多功能動物細胞是對多種標記呈陽性反應，該群組係由CD29、CD44、CD49b、CD49d、CD73、CD90、CD105和CD13所組成，該多功能動物細胞並對取自一群組的一種或多種標記產生陰性反應，該群組係由CD14、CD34、CD45和HLA-DR所組成，該金屬蛋白酶在消化肝硬化膠原中扮演重要的角色，某些研究顯示增加金屬蛋白酶的表現有助於降低肝硬化中的膠原。

我們可以藉由測量白蛋白、肝臟生長因子或金屬蛋白酶在樣本中的表現量，以確認治療的功效，該些樣本是在本發明的藥品使用前及使用後取自於試驗對象，這些表現量是由mRNA含量或蛋白質含量所決定，在測量組織樣本或體液樣本中的mRNA含量的方法，是此一領域中的習知技術，為測量mRNA的含量，細胞被溶解，而在溶解產物中mRNA的含量可由如下方法所決定，例如：雜交試驗法或定量或半定量的RT-PCR，無論該溶解產物是否有純化，其中，該雜交試驗法是使用具有基因專一性的DNA或RNA探針，而RT-PCR是使用適當的基因專一性引子，另外，定量或半定量的原位雜交試驗，可用來檢查組織切片或未溶解的細胞懸浮液，該定量或半定量的原位雜交試驗是使用以螢光劑或酶所標記的DNA或RNA探針，此外，mRNA定量法包含有RNA保護試驗法(RPA)、基因表現序列分析法(SAGE)及陣列技術。

在組織樣本或體液中，測量蛋白質含量的方法在此一領域中是習知的方法，某些測量蛋白質含量的方法，使用可專一性的結合於目標蛋白質的抗體，例如單株抗體或多株抗體，在該些方法中，抗體本身或結合於該抗體的次級抗體可以被偵測。或者抗體結合生物素。而抗生物素又用來標記生物素(抗生物素是一種可與生物素結合的多胜肽)，抗生物素可被偵測，偵測抗生物素的含量就可以決定生物素的含量，上述多種手段的結合，包括「多層三明治檢測法(multi-layer sandwich assay)」可以用來加強偵測蛋白質的敏感度，某些蛋白質測量法，例如酵素連結免疫吸附法(ELISA)或免疫印跡法(Western blot)可以使用於體液或細胞的溶解物的蛋白質檢測，而一些其他的蛋白質檢測法，比如免疫組織學法或螢光流式細胞儀，則可使用於組織切片或未溶解細胞懸浮液的蛋白質檢測，可以使用的標記包括放射性核種，例如：¹²⁵I、¹³¹I、³⁵S、³H或³²P，酶，例如：鹼性磷酸酶(alkaline phosphatase)、辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase)、螢光酵素(luciferase)或半乳糖苷酶(β-glactosidase)，螢光/發光劑，例如：熒光(fluorescein)、羅丹明(Rhodamine)、藻紅蛋白(phycoerythrin)、GFP、BFP和Qdot^TM(由Quantum Dot Corporation供應)，其它可使用的方法包括定量免疫沉澱反應法(quantitative immunoprecipitation)及互補結合反應法(complement fixation assays)。

上述試驗方法的結果可用以決定藥物使用的劑量範圍及藥物施用的途徑，藥物的劑量決定於藥物施用的途徑、藥物的配方、患者的疾病，以及患者本身的體重、表面積、年紀或性別，以及是否有其他的藥物也在同時施用以及醫生的判斷，由於不同的藥物適用途徑有不同的藥物效率，因此藥物劑量的變化是必須的，習知根據經驗的標準方法可用於調整藥物劑量以達到最佳的效果。一般而言，細胞的施用量是在1x10⁴到1x10⁷個之間，比如1x10⁵到5x10⁶個，而較理想的是5x10⁵到2x10⁵個，依據治療的特質，藥物可以同時施用於多個不同部位，如上所述，自體移植或異體移植的華頓氏膠幹細胞或肝祖細胞都可以被使用，在異體移植的情形，人類白血球抗原配對要被進行以避免或減低被移植者的反應，在自體移植的情形，自體細胞將被濃縮及純化並且被儲存備用。

“治療”是指對試驗對象施用一藥物組成，例如一細胞組成，而該試驗對象是患有肝臟疾病或有肝臟疾病的風險，治療的目的是在改善肝臟的疾病並且減輕肝臟疾病的症狀或是減少發生肝臟疾病的風險，肝臟疾病包括原發性的肝臟疾病，例如原發明膽汁肝硬化，肝癌、原發性硬化性膽管炎、自體免疫性肝炎、酒精性肝炎以及感染性肝炎，例如A形、B形或C型肝炎、肝臟疾病包括一些次級的狀況，例如寄生蟲或蛔蟲感染，藥物及化學藥品中毒等，由於肝臟在新陳代謝及體內平衡中扮演關鍵性的角色，例如白蛋白的合成及血管的形成，因此受損的肝功能會造成神經系統、骨骼系統、消化系統、內分泌系統及循環系統的嚴重結果。

在此，所謂的有效劑量是指藥物組成的量足以在受治療的對象產生醫學上所想要的效果，治療可以單獨使用或與其他的藥物或治療併用。

在本發明的一實施例中，上述的細胞及方法可用於有效率的促進幹細胞或前驅細胞的體外培養，這些幹細胞或前驅細胞是取自於攜帶型骨髓、週邊血液及內皮層器官並且適合於移植進入肝臟，同時這些體外培養的細胞能夠用於治療肝臟疾病即恢復肝臟功能，本發明的這些方法並能用於移植器官的細胞基因治療。

本發明的上述方法並可包括在該些植入細胞之前、同時或之後，對受試驗者進行抑制免疫反應的照護，該些免疫照護的方法包括使用免疫抑制的藥物，提高對植入細胞的容忍度以及使用的免疫抑制的放射線照射，該些免疫治療照護的方法是此一領域中習知的技術並見諸於下列文獻。(例如Kirkpatrick et al.,1992.JAMA.268,2952；Higgins et al.,1996.Lancet 348,1208；Suthanthiran et al.,1996.New Engl.J.Med.331,365；Midthun et al.,1997.Mayo Clin Proc.72,175；Morrison et al.,1994.Am J.Med.97,14；Hanto 1995.Annu Rev Med.46,381；Senderowicz et al.,1997.Ann Intern Med.126,882；Vincenti et al.,1998.New Engl.J.Med.338,161；Dantal et al.1998.Lancet 351,623)

適用的免疫抑制藥物包括CTLA4-Ig,anti-CD40 antibodies,anti-CD40 ligand antibodies,anti-B7 antibodies,anti-CD3 antibodies(for example,anti-human CD3 antibody OKT3),methotrexate(MTX),prednisone,methyl prednisolone,azathioprene,cyclosporin A(CsA),tacrolimus,cyclophosphamide and fludarabin,mycophenolate mofetil,daclizumab(a humanized(IgG1 Fc)anti-IL2R alpha chain(CD25)antibody),anti-T-lymphocyte antibodies conjugated to toxins(for example,cholera A chain,or Pseudomonas toxin),and an agent capable of inhibiting the activity of the protein mammalian-target-of-rapamycin(mTOR).

底下的實施例在此需要特別說明的是以下的實施例僅用於說明本發明而並非用於限制本發明的範圍，根據本發明所敘述的內容任何熟悉此項技術者當然能據以充分實施本發明，而任何依據本發明所做的任何變化與修飾亦將包含於本發明的範圍之內。

下述則為本發明之實施步驟。

華頓氏膠幹細胞的培養

根據先前的報告(Wang et al.,2004,Stem Cells 22(7)：1330-1337)，本試驗使用的華頓氏膠質幹細胞是在捐贈者同意之下取自於捐贈者的臍帶，這些華頓氏膠幹細胞的取得是在佛教慈濟醫院審核委員會的同意之下進行，這些取得的細胞是在含有5%二氧化碳的培養箱中，在攝氏37℃進行培養，這些取得的細胞是在IMDM(Iscove's Modified Dulbecco's Medium)中進行培養及增值，此一培養液含10%的胎瘤血清(HYCLONE,Logan,UT,USA)及10毫微克/毫升的鹼性纖維組織母細胞增長因子(basic fibroblast growth factor)(R&D,Minneapolis,MN,USA)2毫莫耳的麩胺醯胺和100單位/升的盤尼西林鏈黴素(penicillin-streptomycin)(INVITROGEN,Carlsbad,CA,USA)。在本發明的實驗中是使用繁殖10到20倍的細胞。

華頓氏膠幹細胞的特徵

在使用各種抗體對華頓氏膠幹細胞的表面標誌進行標記之後，華頓氏膠幹細胞的表面標誌用流式細胞儀加以分析(FC500；BECKMAN COULTER,Brea,CA,USA)，這些抗體是針對各種人類的抗原CD105(SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY,Santa Cruz,CA,USA)；CD13,CD14,CD29,CD34,CD44,CD45,HLA-DR and IgG2a(DAKO,Carpinteria,CA,USA)and CD49b,CD49d,CD73 and CD90(BECTON DICKINSON,Franklin Lakes,NJ,USA)，次級抗體則與異硫氰酸酯螢光素(CHEMICON,Temecula,CA,USA)結合以便進行偵測。

試管內肝細胞分化

在本發明中，試管內肝細胞分化實驗是依據一個修正過的細胞培養方案進行，該方案是記載於下列文獻(2004,Nat.Cell Biol.6(6)：532-539,by Jang et al.)，Wyss(3×10⁴)與50毫克的肝臟組織共同培養於一個6孔培養皿(BECTON DCKINSON)，該培養皿具有一孔徑大小為0.4微米的薄膜分開細胞及組織，這些肝臟組織是取自於一種雄性的老鼠，而這些雄性的老鼠在培養之前其父母以350毫克/公斤的劑量暴露於一種肝毒性的試劑，例如：硫乙醯胺中24小時，在培養期間的第2天及第4天，從華頓氏膠幹細胞萃取出所有的RNAs，同時cDNAs則被製備成樣本以進行肝臟專一基因的聚合酶連鎖反應分析(PCR)。

該聚合酶連鎖反應是在下列條件下進行35個週期，每一週期包含在95℃進行變性反應30秒，再進行退火30秒，依據所使用的引子對(primer set)在56-60℃進行，在72℃延伸60秒，最後在72℃進行10分鐘的培養，使用該些引子對放大的DNAs則使用膠質電泳進行分析。

白蛋白

(F)5-TGCTTGAATGTGCTGATGACAGGG-3(SEQ ID NO：1)與 (R)5-AAGGCAAGTCAGCAGGCATCTCATC-3(SEQ ID NO：2).

色胺酸2,3雙加氧酶

(F)5-TGGTACTCTCCTCAATCTGCTG-3(SEQ ID NO：3)與(R)5-CTCTGGATTGACTGTGGAAGT-3'(SEQ ID NO：4)；

α-胎兒蛋白

(F)5-ATACAGAGACTTCAGGAGC-3(SEQ ID NO：5)與(R)5-GTGAAGAGGGAAGACATAACTG-3(SEQ ID NO：6).

肝臟生長因子

(F)5-CAGATCATCCATTGCATTCG-3(SEQ ID NO：7)與(R)5-ACTCCAGAGGCATTTCCATG-3(SEQ ID NO：8).

金屬蛋白酶

(F)5’-TgAATgCCCTTgATgTCATCCT-3’(SEQ ID NO：9)與(R)5’-ACACCTACACCAAgAACTTC-3’(SEQ ID NO：10).

CYP7A1：

(F)5’-GAGAAGGCAAACGGGTGAAC-3’(SEQ ID NO：11)與(R)5’-ATCGGGTCAATGCTTCTGTG-3’(SEQ ID NO：12).

NANOG：

(F)5’-TGCCTCACACGGAGACTGTC-3’(SEQ ID NO：13)與(R)5’-TGCTATTCTTCGGCCAGTTG-3’(SEQ ID NO：14).

Oct-4：

(F)5’-CTTGCTGCAGAAGTGGGTGGAGGAA-3’(SEQ ID NO：15)(R)5’-CTGCAGTGTGGGTTTCGGGCA-3’(SEQ ID NO：16).

c-Kit：

(F)5’-ATGAGAGGCGCTCGCGGCGC-3’(SEQ ID NO：17)與(R)5’-AGCTTGGCAGGATCTCTAAC-3’(SEQ ID NO：18).

甘油醛-3-磷酸脫氫酶

(F)5-GGGCTGCTTTTAACTCTGGT-3(SEQ ID NO：19)與(R)5-GCAGGTTTTTCTAGACGG-3(SEQ ID NO：20).

建立老鼠肝臟纖維化的模型及決定其肝臟纖維化的程度

Wistar Kyoto(WKY)老鼠自LASCO公司(台北、台灣)取得，所有的試驗程序皆遵循道德規範，並由東華大學動物照護使用委員會所批准。

20隻成年的雄性WKY老鼠重量320±20克被使用來建立慢性肝臟纖維化的模型，其中的20隻在父母內被注射200毫升/公斤的硫乙醯胺(SIGMA-ALDRICH)，每3天一次總共60天，亦即總共注射20次以做為纖維化模型組，其中的8隻則被注射食鹽水做為對照組，在第64天，亦即在最後一次注射之後的四天，這些老鼠被犧牲並且取其心臟血液樣本及肝臟樣本。

這些血液樣本使用生化分析儀(INTEGRA 800；ROCHE,Holliston,MA,USA)分析，以測量肝功能指數，該些肝功能指數包含GOT(glutamate oxaloacetate transaminase)與GPT(glutamate pyruvate transaminase)。

這些肝臟組織的樣本使用膠質纖維染色法(Masson’s trichrome staining)檢查組織，以檢查是否有過度膠原蛋白的累積造成的纖維化切片，該些肝臟組織樣本以3.7%的甲醛固定，然後鑲嵌於石蠟中，然後一系列的三微米厚的切片是被鑲嵌的組織中取出，並以蘇木色素(hematoxylin)、曙紅染料(eosin)或麻省三色(Masson’s trichrome)染色。

就膠質纖維染色法而言，被切片的樣本放置於56℃的布安氏液(Bouin’s solution；SIGMA-ALDRICH)中一個小時，然後依照順序在下列溶液中培養，蘇木紫溶液(Mayer’s hematoxylin solution)中培養5分鐘、猩紅酸溶液(Biebrich scarlet-acid fuchsin solution)中培養15分鐘、磷鉬酸-磷鎢酸溶液(phosphomolybdic acid-phosphotungstic acid)中培養15分鐘、苯胺藍溶液(aniline blue)中培養5分鐘。

每一個實驗組的肝臟纖維化程度由以是文獻記載的方法加以定量(Bruck et al.,2007,J.Gastroenterol.Hepatol.22(12)：2189-2194)，這些由膠質纖維染色的肝臟組織切片被拍照，然後由三位獨立的病理學家從0-3分作半定量的評分，每一塊載玻片選取十個不同位置加以評分，然後平均這些分數以決定肝臟纖維化的程度，分數越高表示肝臟纖維化的程度越高。

細胞移植步驟

如前所述，華頓氏膠幹細胞(2×10⁷個)已與硫乙醯氨中毒的肝臟組織在75平方公分的培養皿中培養，然後華頓氏膠幹細胞以胰蛋白酶消化的方法分離並用離心的方法加以收集，這些收集的細胞再以2×10⁶個細胞/毫升的濃度懸浮於一般的食鹽水中。

細胞移植是依照一個修正的實驗方案進行，該實驗方案記載於以下文獻(Abdel Aziz et al.,2007,Clin.Biochem.40(12)：893-899 and Zhao et al.,2005,World J.Gastroenterol.11(22)：3431-3440)，如上述建立肝臟纖維化模型中所提及，用硫乙醯胺引起纖維化肝臟的30隻老鼠在第64天，即在最後一次注射硫乙醯胺後的4天，被使用於細胞移植實驗，這些老鼠被隨意分成兩組，一組是華頓氏膠幹細胞組，一組是偽治療組，15隻在華頓氏膠幹細胞組的老鼠用乙醚加以麻醉後，再經由門靜脈注入含有100萬個華頓氏膠幹細胞的食鹽水，而偽治療組的老鼠則被注射0.5毫升的一般生理食鹽水。

自細胞移植之後，每週從兩組各取出5隻老鼠加以犧牲，連續三週，然後進行生化肝功能組織檢查及肝臟病理組織學檢查。

被移植的華頓氏膠幹細胞的特徵

對人類白蛋白、人類粒線體、人類金屬蛋白酶以及人類肝臟生長因子有專一性的單株抗體被用來決定被移植的華頓氏膠幹細胞是否有表現出如前面所述的肝臟標記。使用抗人類白蛋白，抗金屬蛋白酶以及抗人類肝臟生長因子的試劑，對鑲嵌於石蠟並經過切片的肝臟樣本進行免疫組織化學分析，而一個免疫組織化學分析的套組(INNOGENEX,San Ramon,CA,USA)則用來將抗原予以視覺化。為了用螢光顯微鏡來偵測抗原，該些被切片的肝臟樣本先與抗人類粒線體(anti-human mitochondria)(1：50；CHEMICON,Billerica,MA,USA)培育一個晚上，再與一二級抗體(rhodamine-conjugated anti-mouse secondary antibody)(CHEMICON,Billerica,MA,USA)一起培育。

統計分析

所有取得的數據皆以具有標準差的平均值呈現，使用Student’s t test來比較治療組與對照組的數據差異，考慮到治療組及對照組的統計差異，p值應該要小於0.05。

實驗結果

華頓氏膠幹細胞的形態及其表面標記分別用顯微鏡及流式細胞儀加以決定，華頓氏膠幹細胞的表面標記類似於前面所述(Tang et al.,2006,World J.Gastroenterol.12(25)：4014-4019)，在此一研究中所取得的華頓氏膠幹細胞並不具有造血細胞的標記，例如CD14,CD34 or CD45但是具有間葉幹細胞的標記(例如：CD29,CD44,CD49b,CD49d,CD73,CD90和CD105)及骨髓細胞的標記CD13以及主要組織相容性複合體標記HLA-DR，如圖第1-1到圖1-13所示，同時華頓氏膠幹細胞具有類似人類纖維母細胞的型態，如圖1-14所示。

為了測試華頓氏膠幹細胞與受硫乙醯胺損傷的老鼠肝臟組織共同培養時能夠進行肝臟細胞分化，用前面所述方法去測試肝臟細胞標誌，RT-PCR顯示，在分化條件下所培養的華頓氏膠幹細胞能夠取得肝臟專一性基因的表現，包括色胺酸2,3雙加氧酶、白蛋白、α-胎兒蛋白和CYP7A1，同時肝臟生長因子和金屬蛋白酶的基因表現亦有所增加，而幹細胞的基因表現，包括NANOG、Oct-4和c-Kit則減少，這些結果顯示華頓氏膠幹細胞具有在試管中分化成類肝臟細胞的潛力。

肝臟纖維化模型的特徵及華頓氏膠幹細胞細胞治療的效果評估

如表一所示，相較於正常的老鼠群組，肝臟纖維化老鼠群組的GOT及GPT有顯著的增加(GOT從110±16U/L至1034±361U/L，以及GPT從77±10U/L至185±50U/L)，這樣的結果顯示肝臟有受到傷害。

在那些血液當中也發現白蛋白的濃度有明顯的降低(從4.11±0.43g/dL至3.43±0.08g/dL)，同時，凝血酶原時間也有明顯的增加(從9.4±0.11sec至11.5±1.0sec)，在以硫乙醯胺誘發肝臟纖維化的實驗，其生化檢查的實驗結果顯示與之前的報告相一致(Abdel Aziz et al.,2007,Clin.Biochem.40(12)：893-899)，這顯示肝功能在那些動物中有明顯的降低。

表2顯示華頓氏膠幹細胞組及偽治療組的肝功能生化指數，在移植的七天後，華頓氏膠幹細胞群組及偽治療組的GOT及GPT濃度降至正常值，實驗結果顯示，GOT及GPT在兩個群組之中並沒有顯著的差別，所觀察到的GOT及GPT濃度或可歸因於GOT及GPT的短促的半衰期，亦即分別為17小時及47小時(Knapen et al.,1998,Am.J.Obstet.Gynecol.178(1 Pt 1)：161-165)。

雖然GOT及GPT的濃度在兩個群組中並沒有明顯的差別，但是在移植後的第21天，其凝血酶原時間在兩個群組中卻有顯著的差異，同時，華頓氏膠幹細胞群組在第21天，其白蛋白濃度已經趨近於正常的水準，在移植後的第21天，華頓氏膠幹細胞群組的凝血酶原時間顯著不同於偽治療組(9.5±0.1 vs.9.9±0.2,P<0.01)，在移植後的第21天，華頓氏膠幹細胞群組的血清白蛋白恢復的程度大於偽治療組(3.84±0.22 vs.3.52±0.14)，這些變化顯示，在華頓氏膠幹細胞治療後的第21天，肝功能已經恢復(表2)。

**P<0.01，第21天的WJSC群組與第21天的Sham群組比較

如第3-1圖所示，以蘇木色素及曙紅染料染色的正常老鼠肝臟組織切片顯示，他們並沒有受到傷害，而第3-2圖所示，以硫乙醯胺誘發肝臟纖維化的老鼠的肝臟組織切片，則可以觀察到組織空洞化、細胞壞死及細胞核退化的現象，組織病理學的資料顯示，華頓氏膠幹細胞移植修復肝臟的損傷在移植後的第21天，在華頓氏膠幹細胞群組可以發現組織退化與空洞化有明顯的復原，然而偽治療組仍具有嚴重的發炎及細胞壞死的現象，如第3-3及3-4圖所示。

如第4圖所示，以麻省三色(Masson’s Trichrome)染色的肝纖維群組的老鼠肝臟顯示有嚴重的膠原堆積，如表3所示，肝臟纖維化老鼠群組的肝臟纖維化程度明顯的高於正常的老鼠群組。(表3)

上述的結果顯示硫乙醯胺的注射確實會導致老鼠肝臟纖維化。如第4-2圖所示，“架橋”，這種現象起因於堆積的膠原連接兩條血管。在肝臟纖維化群組老鼠肝臟大部分區域皆可發現架橋現象，這種現象非常類似於先前報告的描述(Anand et al.,1999,West.J.Med.171(2)：110-115；Bataller et al.,2005,.J.Clin.Invest.115(2)：209-218；Kershenobich et al.,2003,Ann.Hepatol.2(4)：159-163 and Lee,2006,Korean J.Gastroenterol.48(5)：297-305)，但此一現象並沒有在對照組中發現，如第4-1圖所示。

膠質纖維染色法(Masson’s trichrome staining)被用來呈現膠原的表現，參考圖4-3圖4-4及表3，從這些資料中可以發現，在移植後的第7天，從兩個群組中取出來的老鼠，在膠原的含量上並沒有差異，如圖4-5、4-6及表3所示，在移植後的第14天，華頓氏膠幹細胞群組可以觀察到膠原的退化，如圖4-7及表3所示，到了移植後的第21天，華頓氏膠幹細胞群組已經很難觀察到膠原的累積，如圖4-8及表3所示，在移植後的第21天，偽治療群組仍然有明顯的膠原堆積現象。

移植的華頓氏膠幹細胞肝臟標記的偵測

為了追蹤移植的人類細胞，對人類白蛋白、人類粒線體、人類金屬蛋白酶以及人類肝臟成長因子具有專一性的抗體被用來對肝臟細胞切片染色，如圖5-1及圖5-2所示，對人類白蛋白呈陽性反應的細胞在華頓氏膠幹細胞群組中一直到第21天都可以被偵測到，然而，在偽治療群組中，並沒有發現對人類白蛋白呈陽性反應的細胞，如圖5-3及圖5-4所示，這個結果顯示在華頓氏膠幹細胞群組受損的肝臟中，被移植的華頓氏膠幹細胞可以分化成分泌白蛋白的類肝臟細胞。參考圖6-1，金屬蛋白酶的免疫組織化學染色顯示，許多對金屬蛋白酶呈陽性反應的細胞出現在華頓氏膠幹細胞群組的周圍小靜脈及膽道區域，如圖6-2及6-4所示，對金屬蛋白酶呈陽性反應及對人類粒線體呈陽性反應的細胞，並未在偽治療群組中發現，如圖6-3所示，在華頓氏膠幹細胞群組對金屬蛋白酶呈陽性反應的細胞與人類粒線體細胞一起被染色，但是對金屬蛋白酶呈陽性反應的細胞並未在偽治療群組中觀察到，這顯示那些對金屬蛋白酶呈陽性反應的細胞就是移植的華頓氏膠幹細胞，如圖7-1所示，對人類肝臟成長因子呈陽性反應的細胞沿著華頓氏膠幹細胞群組受損肝臟的膠質纖維被觀察到，但是在偽治療群組中並未觀察到，這顯示移植的華頓氏膠幹細胞能夠在受損的肝臟中表現人類肝臟成長因子。

結論

一個用來研究的硫乙醯胺誘發的肝損傷系統已先被建立，在本發明的研究中，華頓氏膠幹細胞在與化學性肝損傷的細胞共同培養時，能夠在試管中分化成類肝臟細胞，來自於活體實驗的肝功能生化指數以及組織病理學的分析顯示，人類的華頓氏膠幹細胞能夠促進硫乙醯胺誘發的肝臟損傷復原，因此可以使用於細胞治療。

有數種理論可以解釋為何華頓氏膠幹細胞能夠促進硫乙醯胺誘發的肝臟損傷的復原，參照圖5-1及5-2，首先，在硫乙醯胺誘發的纖維化肝臟中的華頓氏膠幹細胞的免疫染色，顯示華頓氏膠幹細胞能夠分化成製造白蛋白的類肝臟細胞，參考圖2，此一體外研究顯示，當華頓氏膠幹細胞與化學性肝損傷共同培養時，他們能夠表現具有肝臟專一性的基因，這些分化自Wyss的類肝臟細胞在肝功能的復原中扮演一個重要的角色，在動物試驗中，衍伸自華頓氏膠幹細胞的類肝臟細胞似乎可以促進硫乙醯胺誘發的細胞損傷復原，其次，肝臟生長因子在加速復原中扮演一個重要的角色，由於肝臟生長因子能夠藉由其c-met訊號管道而具有抗細胞凋亡的效果，所以肝臟生長因子能夠促進損傷肝臟的再生，參考圖2及圖7，本發明所使用的華頓氏膠幹細胞能夠表現肝臟生長因子的mRNA，並且在肝臟纖維化的位置分泌肝臟生長因子，這意味著華頓氏膠幹細胞所分泌的肝臟生長因子能夠加速肝臟的復原，其三，在華頓氏膠幹細胞群組中，膠原的含量逐週減少，在移植後的第21天已經少有膠原在肝臟切片中被發現，而在偽治療組中，並沒有膠原減少的現象被發現，如第4圖及表1所示，本發明的研究是第一個描述華頓氏膠幹細胞治療導致膠原沉積減少的現象。

金屬蛋白酶家族(matrix metalloproteinase family)在膠原的降解中扮演重要的角色(Gordon et al.,2006,Stem Cells 24(7)：1822-1830 and Iimuro et al.,2008,Pharm.Res.25(2)：249-258)，如圖6所示，金屬蛋白酶的濃度在華頓氏膠幹細胞處理的老鼠中，在第21天明顯的下降，在本發明的研究中，可觀察到在經常有Wyss被觀察到的周邊微血管區域，金屬蛋白酶的表現有明顯的增加，而金屬蛋白酶會出現在沒有華頓氏膠幹細胞出現的增生的膽管中，一個可能的解釋是，華頓氏膠幹細胞產生了一個促進金屬蛋白酶在膽管表現的環境，兩種誘發金屬蛋白酶表現的途徑，對硫乙醯胺誘發的肝纖維化中的膠原纖維的降解中做出貢獻。

總結來說，上面的研究結果顯示，華頓氏膠幹細胞能夠分化成類肝臟細胞，也能夠表現金屬蛋白酶及肝臟成長因子，在一活體研究中，華頓氏膠幹細胞也被觀察到能夠分化成類肝臟細胞，同時華頓氏膠幹細胞能夠表現肝臟生長因子及金屬蛋白酶，在活體研究中，在膽管的周圍亦有觀察到此一現象，在未分化的華頓氏膠幹細胞以及在以華頓氏膠幹細胞為媒介並分化形成的類肝臟細胞中，肝臟生長因子及金屬蛋白酶的表現能夠促進因硫乙醯胺誘發的肝臟纖維化的受損肝臟的復原，因此，華頓氏膠幹細胞有潛力成為一種用來治療肝纖維化、肝硬化及其他肝臟疾病的細胞來源。

其他實施例

本專利說明書所揭露的所有特徵均可以任何的方式加以組合，每一揭露於此專利說明書中的特徵均可以用一個達成相同、均等或類似目標的特徵加以取代。因此，除非特定的加以闡明，此一專利說明的每一個特徵只是一系列相同、均等或類似的特徵中的一個例子，此一專利說明書已描述很多本發明的實施例，然而，應該了解的是，該些實施例的任何均等修改或變化並未脫離本發明的精神與範圍而應該被包含於下列的申請專利範圍之內。

圖1-1至圖1-13是針對CD13(1A),CD14(1B),CD29(1C),CD 34(1D),CD44(1E),CD45(1F),CD49b(1G),CD49d(1H),CD73(1I),CD90(1J),CD105(1K),HLA-DR(1L)和IgG2a-FITC(1M,as a positive control)以抗體進行免疫組織化學染色的結果；圖1-14是華頓氏膠幹細胞的代表性形態照片，左為低密度培養，右為高密度培養，Bar=500μm。

圖2-1及圖2-2分別為一照片顯示以RT-PCR及凝膠電泳測量肝臟專一性基因表現(圖2-1)及一表格顯示半定量RT-PCR試驗結果(圖2-2)，其以肝臟專一性基因表現做為華頓氏膠幹細胞在與硫乙醯胺損傷的肝臟組織共同培養0，2，4天後的肝細胞分化程度的量測尺度。

圖3-1至圖3-4為以蘇木色素及曙紅染料染色的肝臟切片的照片；圖3-1是正常老鼠肝臟切片；圖3-2是纖維化肝臟切片取自於注射硫乙醯胺200mg/kg的老鼠，每3天注射一次，共60天；圖3-3是華頓氏膠幹細胞群組肝臟切片，在華頓氏膠幹細胞移殖後21天取得；圖3-3是偽治療群組肝臟切片，在注射食鹽水後21天取得；Bar=50μm。

圖4-1至圖4-8為以麻省三色(Masson’s trichrome)染色的肝臟切片的照片；圖4-1是正常老鼠肝臟切片；圖4-2是肝臟纖維化老鼠肝臟切片；圖4-3是華頓氏膠幹細胞群組肝臟切片，在華頓氏膠幹細胞移殖後7天取得；圖4-4是偽治療群組肝臟切片，在7天後取得；圖4-5是華頓氏膠幹細胞群組肝臟切片，在華頓氏膠幹細胞移殖後7天取得；圖4-6是偽治療群組肝臟切片，在14天後取得；圖4-7是華頓氏膠幹細胞群組肝臟切片，在華頓氏膠幹細胞移殖後21天取得；圖4-8是偽治療群組肝臟切片，在21天後取得；Bar=200μm。

圖5-1至圖5-4為以免疫染色法染色的肝臟切片的照片；圖5-1及圖5-2是華頓氏膠幹細胞群組肝臟切片；圖5-1及圖5-2是偽治療群組肝臟切片；均在21天後取得；Bar=50μm(圖5-1及圖5-3)，Bar=20μm(圖5-2及圖5-4)。

圖6-1至圖6-4為以免疫染色法針對人類金屬蛋白酶及人類粒腺體染色的在移殖21天後取得的華頓氏膠幹細胞群組及偽治療群組的肝臟切片的照片；圖6-1免疫染色法針對金屬蛋白酶染色的華頓氏膠幹細胞群組老鼠肝臟切片；圖6-2免疫染色法針對金屬蛋白酶染色的偽治療群組老鼠肝臟切片；圖6-3免疫染色法針對人類粒腺體染色的華頓氏膠幹細胞群組老鼠肝臟切片；圖6-4免疫染色法針對人類粒腺體染色的偽治療群組老鼠肝臟切片；黑箭號及白箭號為金屬蛋白酶及人類粒腺體陽性反應細胞，箭頭為金屬蛋白酶陽性反應的膽管細胞；Bar=10μm。

圖7-1及圖7-2為以免疫染色法針對HGF染色的在移殖21天後取得的華頓氏膠幹細胞群組(圖7-1)及偽治療群組(圖7-2)的肝臟切片的照片；Bar=20μm。

Claims

一種提供肝祖細胞的方法，包含提供一含有被培養的多功能動物細胞，該多功能動物細胞是CD29、CD44、CD49b、CD49d、CD73、CD90、CD105、CD13和HLA-DR的標記呈陽性反應，並對CD14、CD34和CD45的標記呈陰性反應，將該多功能動物細胞與一肝臟組織共培養於一培養液中一段時間後，收集共培養的多功能動物細胞的後代以取得肝祖細胞，其中，該多功能動物細胞是一第一對象臍帶的華頓氏膠所提供。
如申請專利範圍第1項所述的方法，其中，該第一對象是一人類。
如申請專利範圍第1項所述的方法，其中，該共培養肝臟組織是一受損的肝臟組織。
如申請專利範圍第3項所述的方法，其中，該受傷的肝臟組織是第二對象所提供的肝臟組織受一肝臟毒性試劑的作用。
如申請專利範圍第4項所述的方法，其中，該肝毒性試劑是一化學試劑。
如申請專利範圍第5項所述的方法，其中，該化學試劑是硫乙醯胺或四氯甲烷。
如申請專利範圍第1項所述的方法，其中，該肝祖細胞表現CK18、白蛋白、色胺酸2,3雙加氧酶、α-胎兒蛋白、CYP7A1、NANOG、Oct-4、c-Kit、肝臟生長因子和金屬蛋白酶的基因。
如申請專利範圍第1項所述的方法，其中，該多功能動物細胞對肝臟生長因子或金屬蛋白酶呈陽性反應。
一種包含肝祖細胞的製備物，其中，該製備物所包含之肝祖細胞表現CK18、白蛋白、色胺酸2,3雙加氧酶、α-胎兒蛋白、CYP7A1、NANOG、Oct-4、c-Kit、肝臟生長因子和金屬蛋白酶。
如申請專利範圍第9項所述的製備物，其中，該製備物所包含之肝祖細胞是由申請專利範圍第1項所述的方法製備。
一包含一製備物與一肝臟組織的組成物，該製備物包含有被培養的多功能動物細胞，該多功能動物細胞是對CD29、CD44、CD49b、CD49d、 CD73、CD90、CD105、CD13和HLA-DR的標記呈陽性反應，並對CD14、CD34和CD45的標記呈陰性反應。
如申請專利範圍第11項所述的組成物，其中，該肝臟組織是一分離的肝臟組織。
如申請專利範圍第11項所述的組成物，其中，該肝臟組織是一受一肝毒性試劑作用而受損之肝臟組織。
如申請專利範圍第11項所述的組成物，其中，該多功能動物細胞是一第一實驗對象臍帶的華頓氏膠所提供。
如申請專利範圍第14項所述的組成物，其中，該第一實驗對象是一人類。
一種有效劑量的(一)第一製備物或(二)第二製備物作為製備治療肝纖維化或肝硬化的藥物中的應用，其中，第一製備物包含被培養的多功能動物細胞，第二製備物包含有肝祖細胞，所述多功能動物細胞是對CD29、CD44、CD49b、CD49d、CD73、CD90、CD105、CD13的標記呈陽性反應，並對CD14、CD34、CD45和HLA-DR的標記呈陰性反應。
如申請專利範圍第16項所述的應用，其中，該多功能動物細胞或該肝祖細胞一旦施用於該對象，即會分化成表現白蛋白的細胞。
如申請專利範圍第16項所述的應用，其中，該肝祖細胞是由申請專利範圍第1項所述的方法製備。
一種有效劑量的(一)第一製備物或(二)第二製備物作為製備增加肝臟中白蛋白、肝臟生長因子或金屬蛋白酶含量的藥物中的應用，其中，所述第一製備物含有培養的多功能動物細胞，所述第二製備品包含有肝祖細胞，所述多功能動物細胞是對CD29、CD44、CD49b、CD49d、CD73、CD90、CD105、CD13的標記呈陽性反應，並對CD14、CD34、CD45和HLA-DR的標記呈陰性反應。
如申請專利範圍第19項所述的應用，其中，該肝祖細胞是由申請專利範圍第1項所述的方法製備。