ES2767062T3 - Métodos y composiciones para producir células similares a hepatocitos - Google Patents

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Abstract

Un método para producir una población de células similares a hepatocitos a partir de una población de células madre procedentes de adipocitos (ASC), comprendiendo el método: (a) poner una población de ASC en un cultivo tridimensional seleccionado entre el grupo que consiste en: cultivo en suspensión agitado, cultivo en suspensión en gota colgante, cultivo celular de alta densidad, cultivo en matraz de agitación, cultivo en microtransportador y cultivo en biorreactor, durante un periodo de tiempo suficiente para producir un agregado celular derivado de ASC; (b) poner en contacto las células del agregado celular derivado de ASC con un primer medio de cultivo que comprende Activina A y un factor de crecimiento de fibroblastos (FGF) para producir una población de células precursoras; y (c) poner en contacto las células de la población de células precursoras con un segundo medio de cultivo que comprende factor de crecimiento de hepatocitos (HGF) para producir una población de células inducidas que comprende células similares a hepatocitos inducidas (iHep).

Description

DESCRIPCIÓN
Métodos y composiciones para producir células similares a hepatocitos
DERECHOS GUBERNAMENTALES
La presente invención se realizó con soporte del Gobierno con el contrato SBIR DK090992, otorgada por el National Institutes of Health. El Gobierno tiene ciertos derechos sobre la presente invención.
Antecedentes
Uno de los principales objetivos de la medicina regenerativa es facilitar el reemplazo de tejidos humanos mediante el trasplante de células madre que pueden recogerse de tejidos fácilmente accesibles. Por ejemplo, el trasplante ortóptico de hígado es el único tratamiento eficaz para la enfermedad hepática terminal o la lesión hepática grave, pero su utilidad se ve gravemente limitada por la falta de tejido de hígado donante y por la necesidad de inmunosupresión de por vida.
Puede obtenerse un gran número de células madre derivadas de adipocitos (ASC) usando un procedimiento que se efectúa comúnmente, la liposucción. Además, se han desarrollado métodos para inducir la diferenciación de ASC en células similares a hepatocitos (iHep). La regeneración del hígado mediante el trasplante de iHep (por ejemplo, iHep autólogas) es una posibilidad altamente atractiva para la medicina regenerativa. Mediante este método, se induce la diferenciación de las ASC obtenidas mediante liposucción en iHep in vitro y después, se trasplantan las iHep al hígado donante. La abundancia y accesibilidad de tejido adiposo asegura que hay una fuente de ASC fácilmente disponibles. Además, la regeneración del hígado usando iHep autólogas no requeriría inmunosupresión.
Sin embargo, debido a que un paciente puede morir rápidamente tras una insuficiencia hepática aguda (por ejemplo, provocada por la toxicidad del acetaminofeno), el prolongado periodo de cultivo asociado con el método conocido en la actualidad para producir iHep a partir de ASC limita gravemente su utilidad clínica para producir iHep. Además, el método conocido para producir iHep a partir de ASC también se caracteriza por una baja eficacia y un bajo rendimiento.
La producción de células similares a hepatocitos a partir de células madre derivadas de adipocitos para su uso en terapia y/o investigación se beneficiará de un coste reducido, un tiempo de cultivo reducido, una eficacia aumentada y un rendimiento aumentado.
Publicaciones
Amos et al., Tissue Eng Part A. mayo de 2010;16(5):1595-606; Maclsaac et al., Exp Cell Res. 15 de febrero de 2012; 318(4): 416-423; Kapur et al, Biofabrication. junio de 2012;4(2):025004; Gutierrez et al., Exp Hematol. octubre de 2005;33(10):1083-91; Banerjee et al, Cytotechnology. mayo de 2006;51(1):1-5. -2006; Banas et al., Hepatology. julio de 2007;46(1):219-28; Banas et al., J Gastroenterol Hepatol. enero de 2009;24(1):70-7; Green et al., 2011. Nat Biotechnol 29:267-272; So et al., Biol Open. 15 de enero de 2013;2(1):30-6; Payne et al., Vitam Horm. 2011;85:207-16; Hay et al., Proc Natl Acad Sci USA. 26 de agosto de 2008;105(34):12301-6; Lue et al, Liver Int. julio de 2010;30(6):913-22; Hasegawa et al, Biochem Biophys Res Commun. 18 de febrero de 2011;405(3):405-10; Haraguchi et al, J Tissue Eng Regen Med. 3 de junio de 2013; Cameron et al, Biotechnol Bioeng. 5 de agosto de 2006;94(5):938-48; documento WO2007089798; documento US20100098739; y documento US20100112031. Sumario
Se proporcionan métodos para producir una población de células similares a hepatocitos (iHep) a partir de una población de células madre procedentes de adipocitos (ASC). Los aspectos de los métodos incluyen colocar una población de ASC en un cultivo tridimensional (por ejemplo, cultivo en suspensión en gota colgante, cultivo de alta densidad, cultivo en matraz de agitación, cultivo en microtransportador, etc.) y poner en contacto las células con un primer y un segundo medio de cultivo. También se proporcionan métodos para tratar a un individuo, que incluyen producir una población de iHep a partir de una población de ASC y administrar un número eficaz de iHep en el individuo.
Un aspecto de la invención proporciona un método para producir una población de células similares a hepatocitos a partir de una población de células madre derivadas de adipocitos (ASC) como se expone en la reivindicación 1. La presencia de iHep puede confirmarse mediante diversos métodos, incluyendo, por ejemplo, poner en contacto la población de células inducidas con un anticuerpo específico para una proteína marcadora de hepatocitos y determinar el porcentaje de células positivas para la expresión. En algunas divulgaciones del presente documento, un 15 % o más de las células de la población de células inducidas son células similares a hepatocitos. En algunos casos, un 37 % o más de las células de la población de células inducidas son células similares a hepatocitos. En algunas divulgaciones del presente documento, el tiempo transcurrido para generar iHep a partir de a Sc es menor de 13 días (por ejemplo, menos de 10 días). La alta eficacia de la producción de iHep y el corto espacio de tiempo en el que pueden producirse las iHep mediante los presentes métodos facilitan los métodos de tratamiento debido a que el daño hepático (por ejemplo, insuficiencia hepática, por ejemplo, debido a la toxicidad del acetaminofeno) puede provocar la muerte rápidamente (por ejemplo, en 2 semanas o menos). También se proporcionan kits para poner en práctica los métodos de la divulgación.
Breve descripción de los dibujos
La divulgación se entiende mejor a partir de la siguiente descripción detallada cuando se lee junto con los dibujos adjuntos. Se hace hincapié en que, de acuerdo con la práctica común, las diversas características de los dibujos no están representadas a escala. Por el contrario, las dimensiones de las diversas características están aumentadas o reducidas de manera arbitraria por claridad. En los dibujos se incluyen las siguientes figuras.
Las figuras 1A-E proporcionan una comparación de SCi-Hep con Chi-Hep y una comparación de los métodos para generar SCi-Hep y Chi-Hep. (A) Se muestran los dos métodos diferentes para inducir la diferenciación de ASC en iHep. El panel superior muestra el método para diferenciar químicamente ASC en Chi-Hep. Las células aisladas a partir de lipoaspirados son células ASC cultivadas durante 3-15 días. Posteriormente, estas células se diferencian de células de mesodermo a endodérmicas a lo largo de un periodo de 3 días (estadio 1) y después, se diferencian adicionalmente en Chi-Hep (estadio 2) usando medios definidos que contienen factores de crecimiento. El panel inferior muestra una realización de uno de los presentes métodos para producir SCi-Hep. (B) Imágenes de campo brillante (100x) que muestran el cambio en la morfología de las ASC con forma de huso a medida que se diferencian en Chi-Hep (mediante diferenciación química) o SCi-Hep usando uno de los presentes métodos para producir SCi-Hep. En relación con las Chi-Hep, las SCi-Hep tienen una mayor densidad celular y morfología similar a colonias que se asemeja más estrechamente a los hepatocitos. (C) El porcentaje de ASC, Chi-Hep, SCi-Hep e iPS-Hep que expresan el marcador CK8/18 encontrado en hepatocitos maduros. Se usaron ASC no teñidas para caracterizar el nivel de tinción de fondo (control) y un 100% de los hepatocitos humanos expresan este marcador. (D) Imágenes de tinción de inmunofluorescencia (a 100x) de las ASC de control, Chi-Hep, SCi-Hep o hepatocitos para la expresión de CK8/18 humano, la captación de LDL o la tinción de PAS. Las Chi-Hep y SCi-Hep, pero no las ASC, pueden endocitar LDL y pueden sintetizar glucógeno (tinción de PAS). (E) La cantidad de albúmina humana o urea secretada en el sobrenadante por Chi-Hep, SCi-Hep y ASC cultivadas durante el periodo de tiempo indicado. Las SCi-Hep produjeron albúmina y urea mucho antes de que las Chi-Hep produjeran cantidades detectables de estos analitos, mientras que las ASC no producen albúmina o urea. En los paneles C y E, cada barra representa la media (+EEM) de 4 muestras biológicamente independientes analizadas.
La figura 2 A-C representa la expresión génica en Chi-Hep, SCi-Hep y adipocitos. (A) Las iHep tienen niveles aumentados de ARNm específicos de hepatocitos y niveles reducidos de ARNm específicos de adipocitos. Se usó análisis por RT-PCR para medir el nivel de expresión de ARNm específicos de hepatocitos (FoxA2, AFP, ALB, AAT, t Do2) o específicos de adipocitos (CD37) en Chi-Hep, SCi-Hep, iPS-Hep o ASC. Para cada gen, los niveles de ARNm en Chi-Hep (después de 15 días de diferenciación), SCi-Hep (después de 9 días de diferenciación) e iPS-Hep (después de 30 días de diferenciación) se normalizan en relación con los de las ASC. (B) Análisis por RT-PCR de la expresión génica en ASC y en SCi-Hep después de 3, 6 y 12 días de diferenciación inducida. El nivel de expresión de ARNm de CD105 (que es un marcador de ASC) se redujo 35 veces (p = 0,001); mientras que el nivel de expresión de ARNm de hepatocitos (FoxA2 y ALB) aumentó en 25 y 51 veces, respectivamente (p=0,0007 y 9x10'5, respectivamente), en SCi-Hep después de 12 días de diferenciación en hepatocitos. Los niveles de ARNm en SCi-Hep se normalizaron en relación con el de las ASC. Cada punto de datos en los paneles A-B representa la media ± EEM para 3 determinaciones independientes. Como se muestra en la figura 11, hubo cambios significativos en el nivel de expresión de cada gen en SCi-Hep después de 3, 6 y 12 días de diferenciación. (C) Una ilustración de la relación espacial entre los perfiles de expresión génica obtenidos de ASC, Chi-Hep, SCi-Hep, iPS-Hep y hepatocitos. Los datos de expresión génica global basados en micromatrices se analizaron como se describe en la sección de métodos. La longitud de cada borde conector (y el número mostrado) indica la distancia entre los perfiles de expresión para los tipos celulares en cada uno de los vértices correspondientes. Esta distancia se determina sumando los cuadrados de las diferencias en el nivel de expresión para cada gen en la matriz para los dos tipos celulares en los vértices de cada línea. Este diagrama indica que el patrón de expresión génica en las Chi y SCi-Hep es más próximo al de los hepatocitos que al de las iPS-Hep. Asimismo, la desviación del patrón de iPS-Hep respecto del eje de ASC-hepatocitos es mayor que la de iHep, lo que indica que las iPS-Hep tienen un mayor número de cambios en la expresión génica que son externos tanto para ASC como para hepatocitos que se encuentran en las Chi o SCi-Hep.
Las figuras 3 A-D demuestran el implante (mediante inyección) de SCi-Hep en el hígado de ratones. (A) Una imagen generada por ultrasonidos (en vista transversal) de las SCi-Hep que se inyectan a través de una aguja del calibre 30G directamente en el lóbulo derecho del hígado de un ratón TK-NOG. (B) Los ratones quiméricos produjeron albúmina humana tras el trasplante de SCi-Hep. La cantidad de albúmina humana en plasma se midió en serie a lo largo de un periodo de 8 semanas después del trasplante de SCi-Hep en 4 ratones condicionados con ganciclovir. Cada línea discontinua muestra la cantidad de albúmina humana medida en un ratón quimérico en el momento indicado. En los 4 ratones quiméricos, la seroalbúmina humana fue detectable 4 semanas después del trasplante y la cantidad aumentó con el tiempo después del trasplante. Por el contrario, no se produjo albúmina por cualquiera de los 4 ratones que fueron receptores del control, ASC no diferenciadas (triángulos rojos y línea continua). (C) Tinción inmunofluorescente de secciones de hígado (a una ampliación 100x) obtenidas de ratones TK-NOG 4 semanas después del implante de SCi-Hep, (a-c) o ASC no diferenciadas (d-f). Las secciones de hígado se tiñeron con anticuerpos anti-albúmina (a, d), anti-CK8/18 (b, e) o anti ASGR1 específicos para ser humano y se contratiñeron con DAPI para mostrar los núcleos celulares. (D) Tinción inmunofluorescente de secciones de hígado (ampliación 200x) obtenidas de ratones TK-NOG 4 semanas después del trasplante con SCi-Hep o ASC no diferenciadas. Las secciones de hígado se tiñeron con anticuerpos anti-CK8/18, anti-Ki67 o anti-ZO-1; y se contratiñeron con DAPI para mostrar los núcleos celulares. Las figuras 4 A-B demuestran que las SCi-Hep no forman tumores en ratones inmunocomprometidos, pero las iPS-Hep sí lo hacen. (A) Tan pronto como tres semanas después de implantarse 5x104 iPS-Hep en la cápsula renal de ratones NOG, se formaron tumores palpables en el área del implante. Por el contrario, no se detectaron tumores 2 meses después de implantarse el mismo número de Chi o SCi-Hep (fila superior). Los tumores fueron visibles en secciones de tejido obtenidas del área de implante de las iPS-Hep, mientras que solo había presencia de tejido normal en el área de implante de Chi-Hep (fila intermedia). La ampliación de las imágenes en las filas superiores e intermedias fue de 10x. Las imágenes de las filas inferiores se obtuvieron de las regiones recuadradas de la imagen correspondiente y se muestran con una ampliación de 200x. (B) Formación de tumores después del implante de iPS-Hep. Fila superior: Imágenes de los tumores formados 3 semanas después de implantarse las células iPS-Hep bajo la cápsula renal. Las imágenes a 300x y 100x se obtuvieron de la región indicada (caja rayada) de las imágenes a 40x y 100x correspondientes. Fila inferior: Dos meses después de implantarse las células iPS-iHep, los tumores contenían células de las tres capas de células germinales. Estas imágenes se muestran con una ampliación de 200x. Las barras de escala mostradas son de 50 pm.
Las figuras 5 A-C proporcionan análisis de FACS llevados a cabo usando un anticuerpo anti-Sox 17, que reconoce un marcador para células endodérmicas. Se aislaron ASC de tres donantes diferentes y se indujo su diferenciación usando los métodos de cultivo estándar (Chi-Hep) o esférico (SCi-Hep). Después de 4 días de diferenciación, se llevó a cabo FACS usando un anticuerpo anti-Sox17, que reconoce un marcador para células endodérmicas. El porcentaje de ASC que se diferenciaron en células endodérmicas después del cultivo esférico (61,2 ± 2,4) más que duplicó el obtenido usando el método convencional (25,7 ± 1,3).
Las figuras 6 A-B proporcionan análisis de FACS llevados a cabo usando un anticuerpo anti-CD105, que se une a un marcador para ASC. Las ASC se aislaron de tres donantes diferentes y se indujo su diferenciación en SCi-Hep usando el método de cultivo esférico. Después de 9 días de diferenciación, se llevó a cabo FACS usando un anticuerpo anti-CD105, que se une a un marcador para ASC. Aunque un 98,6 ±0,5 % de las ASC expresaron CD105, el porcentaje de SCi-Hep que expresaron este marcador de ASC fue tan solo del 9,0 ± 0,5 %.
La figura 7 demuestra que las iPS-Hep pueden sintetizar glucógeno (a,b) y endocitar lipoproteínas de baja densidad (LDL) (c,d). La inmunofluorescencia de LDL y las imágenes teñidas con PAS se muestran con un aumento de 100x (a, c) y 400x (b, d). Por el contrario, Las ASC no pudieron endocitar LDL (e, 100x) y tampoco se tiñeron con PAS (f, 100x).
Las figuras 8 A-D demuestran que las iPS-Hep tienen propiedades de los hepatocitos. La cantidad de albúmina humana (A) o de nitrógeno de urea (B) secretada en los sobrenadantes por Chi-Hep, iPS-Hep y ASC se muestran en los puntos de tiempo indicados. Las Chi-Hep produjeron albúmina y urea mucho antes de que las iPS-Hep produjeran cantidades detectables de estos analitos, mientras que las ASC de control no produjeron albúmina o urea. (C) Las Chi-Hep (después de 15 días) y las iPS-Hep (después de 30 días de diferenciación), pero no las ASC, pueden mediar una reacción de biotransformación de fármaco dependiente de CYP3A4. (D) Las iPS-Hep tienen niveles aumentados de ARNm específicos de hepatocitos y niveles reducidos de los específicos para adipocitos. Se usó análisis por RT-PCR para medir el nivel de expresión de ARNm específicos de hepatocitos (FoxA2, AFP, ALB, A1AT, aAt , TDO2) o específicos de adipocitos (CD37, CD29) en Chi-Hep, iPS-Hep o ASC. Para cada gen, se normalizan los niveles de ARNm en Chi-Hep (después de 15 días de diferenciación) e iPS-Hep (después de 30 días de diferenciación) en relación con el nivel de ARNm correspondiente en ASC. Cada barra o punto de datos en los paneles A-D representa la media (±EEM) de 4 muestras biológicamente independientes que se analizaron.
La figura 9 proporciona un análisis de componentes principales para los datos de expresión génica obtenidos de ASC, Chi-Hep, SCi-Hep, iPS-Hep y hepatocitos. Los componentes principales (PC) primero (eje x) y segundo (eje y) explicaron un 46,4 % y un 26,5 %, respectivamente, de la varianza total en el perfil de expresión. Cabe destacar que, las iPS-Hep tuvieron una gran cantidad de desviación a lo largo de PC2 en relación con las ASC y los hepatocitos, mientras que las Chi-Hep y SCi-Hep se encontraron justo en medio de las ASC y hepatocitos. De manera coherente con otros análisis (incluyendo los análisis mostrados en la figura 2C), esta gráfica indica que las iPS-Hep tuvieron un gran número de cambios en la expresión génica que no estaban presentes en los hepatocitos (en relación con las ASC).
La figura 10 demuestra que las SCi-Hep no expresan ASGR-1 in vitro. Los hepatocitos humanos permeabilizados (a-c) o las SCi-Hep (d-f), que se analizaron después de 9 días de diferenciación in vitro, se tiñeron con un anticuerpo anti-ASGR-1 humano y se contratiñeron con DAPI. Las imágenes de inmunofluorescencia (aumento de 200x) muestran que los hepatocitos humanos, pero no las SCi-Hep expresaron ASGR-1. Las barras de escala mostradas son de 50 pm.
La figura 11 presenta una tabla que ilustra los números de genes expresados de manera diferencial en hepatocitos, Chi-Hep, SCi-Hep e iPS-Hep en relación con las ASC. A partir del análisis de datos de micromatrices, se seleccionó el número indicado de genes cuya expresión estaba aumentada significativamente, reducida o sin cambios en hepatocitos en relación con las ASC. (Se consideró que la expresión de un gen estaba alterada en los hepatocitos en caso de que el valor absoluto del múltiplo de cambio era >5 y el valor de p ajustado era <0,01). Cada uno de los 3 paneles indica el número (y el porcentaje) de los genes seleccionados cuya expresión estaba aumentada, reducida o cambiada de manera no significativa (NS) en los perfiles de expresión en Chi-Hep, SCi-Hep o iPS-Hep (en relación con las ASC). Para cada una de estas comparaciones, se consideró que la expresión de un gene estaba alterada en las iHep en caso de que el valor absoluto del múltiplo de cambio fuese >2 y el valor de p ajustado fuese <0,01. Cabe destacar que un 18% de los genes cuya expresión no estaba alterada en hepatocitos tuvo un nivel alterado de expresión en las iPS-Hep.
La figura 12 presenta una tabla que ilustra los cambios en el nivel de expresión de genes (Foxa2, Albúmina) expresados en hepatocitos y en ARNm específicos de adipocitos (CD105) durante la diferenciación inducida de las SCi-Hep. Se usó RT-PCR para medir el nivel de expresión de 3 genes (Foxa2, Albúmina y CD105) en ASC y en SCi-Hep después de 3, 6 y 12 días de diferenciación inducida. Se muestran los niveles medios de expresión para cada gen en las SCi-Hep en el día indicado (en relación con su nivel de expresión en ASC) y los valores de p correspondientes para las diferencias de expresión. Cada valor es el múltiplo de cambio medio para 3 mediciones independientes; un valor positivo indica que su expresión estaba aumentada en SCi-Hep en relación con ASC, mientras que un valor negativo indica que estaba reducido. Se aplicó una prueba de la t en una muestra usando el nivel de expresión transformado logarítmicamente para evaluar la significación estadística (valor de P) de las diferencias de expresión medidas.
Las figuras 13 A-B demuestran que las ASC cultivadas en un cultivo en suspensión agitado (en este caso, cultivo en matraz de agitación) forman una alta densidad de agregados celulares que se asemejan a las esferas formadas durante el cultivo en suspensión en gota colgante. Las imágenes se muestran con una ampliación de 10x. (A) La morfología de los agregados celulares de ASC formados tras el cultivo de las ASC en matraz de agitación durante 24 horas. La morfología de los agregados es muy similar a la de las "esferas" formadas después de cultivar las ASC mediante el método de gota colgante. La densidad celular aumentada (de ahí la expresión "cultivo de alta densidad") en el cultivo en matraz de agitación es fácilmente evidente cuando se compara el panel (A) con el panel (B). (B) "esferas" formadas después de cultivar las ASC mediante el método de gota colgante durante 48 horas.
Las figuras 14 A-B demuestran que las ASC cultivadas mediante cultivo en suspensión con agitación (en este caso, cultivo en matraz de agitación) forman un mayor porcentaje (A) de células CD34+ (células madre adiposas) y un porcentaje aproximadamente igual (B) de células SOX17+ (células precursoras endodérmicas) en comparación con las ASC cultivadas mediante el método de gota colgante. El eje X es la intensidad de la señal detectada.
Las figuras 15 A-B demuestran que las iHep producidas usando cultivo en matraz de agitación (SS-Hep) tenían las enzimas CYP específicas de citocromo CYP3A4 y CYP1A1 y se indujo fuertemente la actividad de CYP3A4 mediante tratamiento con dexametasona (Dex). YJM es una línea celular de hepatocitos humanos. La actividad de CYP se normalizó a la viabilidad celular. Los resultados se presentan con (+) y sin (-) inducción con Dex. La figura 16 demuestra que las iHep producidas usando cultivo en matraz de agitación (SS-Hep) secretaron un nivel aumentado de albúmina humana (hAlb) en comparación con las Chi-Hep y SCi-Hep (aproximadamente 16 veces en relación con las SCi-Hep y aproximadamente 96 veces en relación con las Chi-Hep).
Descripción detallada de las realizaciones
Se proporcionan métodos para producir una población de células similares a hepatocitos (iHep) a partir de una población de células madre procedentes de adipocitos (ASC). Los aspectos de los métodos incluyen colocar una población de ASC en un cultivo tridimensional (por ejemplo, cultivo en suspensión en gota colgante, cultivo de alta densidad, cultivo en matraz de agitación, cultivo en microtransportador, etc.) y poner en contacto las células con un primer y un segundo medio de cultivo. También se proporcionan métodos para tratar a un individuo, que incluyen producir una población de iHep a partir de una población de ASC y administrar un número eficaz de iHep en el individuo. En el presente documento también se describen kits para poner en práctica los métodos.
Antes de describir los presentes métodos y composiciones, ha de entenderse que la presente invención no se limita al método o composición particular descrita, ya que pueden, por supuesto, variar. También debe entenderse que la terminología usada en este documento es con el fin de describir realizaciones particulares únicamente y no pretende ser limitante, ya que el alcance de la presente invención estará limitado únicamente por las reivindicaciones adjuntas.
Cuando se proporciona un intervalo de valores, se entiende que se divulga específicamente cada valor intermedio, hasta la décima parte de la unidad del límite inferior, a menos que el contexto dicte claramente lo contrario, entre los límites superior e inferior de dicho intervalo. Está abarcado en la invención cada intervalo menor entre cualquier valor indicado o valor intermedio en un intervalo indicado y cualquier otro valor indicado o intermedio en dicho intervalo. Pueden incluirse o excluirse en el intervalo independientemente los límites superior e inferior de estos intervalos menores y también está abarcado por la invención cada intervalo donde uno de los dos, ninguno o ambos límites están incluidos en los intervalos menores, sujetos a cualquier límite específicamente excluido en el intervalo indicado. Cuando el intervalo indicado incluye uno o ambos de los límites, también se incluyen en la invención los intervalos que excluyan uno cualquiera o ambos de los límites incluidos.
A menos que se definan de otro modo, todos los términos técnicos y científicos utilizados en el presente documento tienen el mismo significado que el que entiende comúnmente un experto habitual en la materia a la que pertenece la presente invención. Aunque puede usarse cualquier método y material similar o equivalente a los descritos en este documento en la práctica o ensayo de la presente invención, a continuación se describen algunos métodos y materiales potenciales y preferidos.
Tal como será evidente para los expertos en la técnica tras la lectura de la presente divulgación, cada una de las realizaciones individuales descritas e ilustradas en el presente documento tiene características y componentes discretos que fácilmente pueden separarse o combinarse con las características de cualquiera de las otras realizaciones sin apartarse de la presente invención. Cualquier método citado puede llevarse a cabo en el orden de los eventos citados o en cualquier otro orden que sea posible lógicamente.
Cabe destacar que tal como se usa en el presente documento y en las reivindicaciones adjuntas, las formas en singular "un", "uno" y "el" incluyen referencias en plural a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Por lo tanto, por ejemplo, la referencia a "una célula" incluye una pluralidad de dichas células y la referencia a "el péptido" incluye la referencia a uno o más péptidos y equivalentes de los mismos, por ejemplo, polipéptidos, conocidos por los expertos en la materia y así sucesivamente.
Las publicaciones descritas en el presente documento se proporcionan únicamente por su divulgación antes de la fecha de presentación de la presente solicitud. Además, las fechas de publicación proporcionadas pueden ser diferentes a las fechas de publicación reales, lo que podría necesitar ser confirmado de manera independiente. Definiciones
Las expresiones "unión específica", "se une de manera específica", y similares, se refieren a la unión preferencial covalente o no covalente a una molécula en relación con otras moléculas o restos en una solución o mezcla de reacción (por ejemplo, un anticuerpo se une específicamente a un polipéptido o epítopo particular en relación con otros polipéptidos disponibles). En algunas divulgaciones del presente documento, la afinidad de una molécula por otra molécula a la que se une específicamente se caracteriza por una Kd (constante de disociación) de 10-5 M o menos (por ejemplo, 10-6 M o menos, 10-7 M o menos, 10-8 M o menos, 10-9 M o menos, 10-10 M o menos, 10-11 M o menos, 10-12 M o menos, 10-13 M o menos, 10-14 M o menos, 10-15 M o menos o 10-16 M o menos). La "afinidad" se refiere a la fuerza de la unión, correlacionándose una afinidad de unión aumentada con una KD menor.
La expresión "miembro de unión específica" como se usa en el presente documento se refiere a un miembro de un par de unión específica (es decir, dos moléculas, normalmente dos moléculas diferentes, donde una de las moléculas, por ejemplo, un primer miembro del par de unión específica, se une específicamente por medios no covalentes a la otra molécula, por ejemplo, un segundo miembro de unión específica).
La expresión "agente de unión específica", como se usa en el presente documento, se refiere a cualquier agente que se une específicamente a una biomolécula (por ejemplo, un marcador, tal como una molécula marcadora de ácido nucleico, una molécula marcadora de proteína, etc.). En algunos casos, se usa un "agente de unión específica" para una molécula marcadora (por ejemplo, una molécula marcadora de hepatocitos). Los agentes de unión específica pueden ser cualquier tipo de molécula. En algunos casos, un agente de unión específica es un anticuerpo o un fragmento del mismo. En algunos casos, un agente de unión específica es una sonda de ácido nucleico (por ejemplo, una sonda de ARN; una sonda de ADN; una sonda de ARN/ADN; una sonda de ácido nucleico modificado, por ejemplo, una sonda de ácido nucleico bloqueado (LNA), una sonda de morfolino, etc.; y similares).
Como se usan en el presente documento, una "molécula marcadora" no tiene que ser definitiva (es decir, el marcador no tiene que marcar de manera definitiva la célula como perteneciente a un tipo particular). Por ejemplo, la expresión de una molécula marcadora por una célula puede indicar (es decir, sugiere) que la célula es de un tipo celular particular. Por ejemplo, en caso de que 3 tipos celulares (tipo A, tipo B y tipo C) expresen una molécula marcadora particular (por ejemplo, un ARNm particular, una proteína particular, etc.), la expresión de dicha molécula marcadora por una célula puede no usarse necesariamente en sí para determinar de manera definitiva que la célula es una célula de tipo A. Sin embargo, la expresión de dicho marcador puede sugerir que la célula es una célula de tipo A. En algunos casos, la expresión de dicho marcador, combinada con otras evidencias, puede demostrar de manera definitiva que la célula es una célula de tipo A. A modo de otro ejemplo ilustrativo, en caso de que se sepa que un tipo de célula particular expresa dos o más moléculas marcadoras particulares (por ejemplo, ARNm, proteínas, una combinación de los mismos, etc.) por lo que la expresión por una célula de una de las dos o más moléculas marcadoras particulares puede sugerir, pero no ser definitiva, de que la célula es del tipo particular en cuestión. En dicho caso, el marcador sigue considerándose una molécula marcadora.
El término "anticuerpo" se usa en el sentido más amplio y abarca específicamente anticuerpos monoclonales (incluyendo anticuerpos monoclonales de longitud completa), anticuerpos policlonales, anticuerpos multiespecíficos (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos) y fragmentos de anticuerpo, en tanto que muestren la actividad biológica deseada. Los "anticuerpos" (Ab) y las "inmunoglobulinas" (Ig) son glucoproteínas que tienen las mismas características estructurales. Aunque los anticuerpos muestran especificidad de unión a un antígeno específico, las inmunoglobulinas incluyen tanto anticuerpos como otras moléculas similares a anticuerpos que carecen de especificidad antigénica. Los polipéptidos de este último tipo, por ejemplo, se producen a bajos niveles por el sistema linfático y a niveles aumentados por mielomas.
"Fragmento de anticuerpo" y todas las variantes gramaticales del mismo, como se usan en el presente documento, se definen como una porción de un anticuerpo intacto que comprende el sitio de unión a antígeno o la región variable del anticuerpo intacto, en donde la porción está libre de los dominios constantes de cadena pesada (es decir, CH2, CH3 y CH4, dependiendo del isotipo) de la región Fc del anticuerpo intacto. Los ejemplos de fragmentos de anticuerpos incluyen fragmentos Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2y Fv; diacuerpos; cualquier fragmento de anticuerpo que es un polipéptido que tiene una estructura primaria que consiste en una secuencia ininterrumpida de restos de aminoácidos contiguos (citado en el presente documento como un "fragmento de anticuerpo monocatenario" o "polipéptido monocatenario"), incluyendo, sin limitación (1) moléculas de Fv monocatenario (scFv), (2) polipéptidos monocatenarios que contienen únicamente un dominio variable de cadena ligera o un fragmento del mismo que contiene tres CDR del dominio variable de cadena ligera, sin ningún resto de cadena pesada asociado, (3) polipéptidos monocatenarios que contienen únicamente una región variable de cadena pesada o un fragmento de la misma que contiene tres CDR de la región variable de cadena pesada, sin ningún resto de cadena ligera asociado y (4) nanocuerpos que contienen dominios de Ig individuales de una especie no humana u otras moléculas específicas de unión de un solo dominio; y estructuras multiespecíficas o multivalentes formadas a partir de fragmentos de anticuerpo. En un fragmento de anticuerpo que comprende una o más cadenas pesadas, las cadenas pesadas pueden contener cualquier secuencia de dominio constante (por ejemplo, CH1 en el isotipo IgG) encontrado en una región distinta de Fc de un anticuerpo intacto y/o pueden contener cualquier secuencia de región bisagra hallada en un anticuerpo intacto y/o pueden contener una secuencia de cremallera de leucina fusionada a o situada en la secuencia de la región bisagra o la secuencia del dominio constante de la o las cadenas pesadas.
Como se usa en la presente divulgación, el término "epítopo" significa cualquier determinante antigénico en un antígeno al que se une el parátopo de un anticuerpo. Los determinantes epitópicos normalmente consisten en agrupamientos de superficie químicamente activos de moléculas tales como aminoácidos o cadenas laterales de azúcar y normalmente tienen características estructurales tridimensionales específicas, así como características de carga específicas.
Los términos "polipéptido", "péptido" y "proteína" se utilizan indistintamente en el presente documento para referirse a un polímero de restos de aminoácidos. Los términos también se aplican a polímeros de aminoácidos en los que uno o más restos de aminoácido son un mimético químico artificial de un aminoácido de origen natural correspondiente, así como a polímeros de aminoácidos de origen natural y polímeros de aminoácidos de origen no natural.
Un "ratón TK-NOG", como se usa en el presente documento, se refiere a un ratón en el que se expresa un transgén de timidina cinasa del virus del herpes simple de tipo 1 (HSVtk) en el hígado de un ratón NOG altamente inmunodeficiente. Las células de hígado de ratón que expresan el transgén de HSVtk pueden suprimirse tras una breve exposición a una dosis no tóxica de ganciclovir (GCV). En algunas divulgaciones del presente documento, un individuo que recibe tratamiento puede ser un ratón. Por ejemplo, un ratón TK-NOG con células hepáticas suprimidas puede considerarse un individuo con función hepática reducida (es decir, un individuo con daño hepático) y por lo tanto, puede considerarse que el ratón es un individuo que recibe tratamiento cuando se trasplantan las presentes iHEPS (descritas en detalle más adelante) al ratón. Las células de hígado humanas trasplantadas pueden mantenerse de manera estable en el hígado de ratones TK-NOG y los ratones TK-NOG con células de hígado humano trasplantadas se citan en el presente documento como ratones TK-NOG humanizados. El hígado reconstituido de los ratones TK-NOG humanizados pueden ser un órgano humano maduro y funcional y pueden generar un perfil específico para ser humano del metabolismo del fármaco. El "hígado humanizado" puede mantenerse de manera estable en ratones TK-NOG con un alto nivel de función durante un periodo prolongado (por ejemplo, al menos 8 meses). Para más información acerca de los ratones TK-NOG, consúltese: (i) Hasegawa et al, Biochem Biophys Res Commun. 18 de febrero de 2011;405(3):405-10; (ii)Yamazaki et al, Chem Res Toxicol. 20 de febrero de 2012;25(2):274-6; (iii) Hu et al., Pharmacogenet Genomics. febrero de 2013;23(2):78-83; y (iv) Yamazaki et al, Chem Res Toxicol. 18 de marzo de 2013;26(3):486-9.
La expresión "célula madre" se usa en el presente documento para hacer referencia a una célula de mamífero que tiene la capacidad tanto de auto-renovarse como de generar un tipo celular diferenciado (véase Morrison et al. (1997) Cell 88:287-298). En el contexto de la ontogenia celular, el adjetivo "diferenciada" o la expresión "en diferenciación" es un término relativo. Una "célula diferenciada" es una célula que ha progresado adicionalmente en la vía de desarrollo que la célula con la que se está comparando. Por lo tanto, las células madre pluripotentes pueden diferenciarse en células progenitoras de linaje restringido (por ejemplo, células madre procedentes de adipocitos), que a su vez pueden diferenciarse en células en estadio final (por ejemplo, adipocitos, osteoblastos, condrocitos, etc.), que desempeñan un papel característico en un tipo tisular específico y pueden conservar o no la capacidad de proliferar adicionalmente. Las células madre (y la descendencia diferenciada) puede caracterizarse tanto por la presencia de marcadores específicos (por ejemplo, proteínas, ARN, etc.) y la ausencia de marcadores específicos. También pueden identificarse células madre mediante ensayos funcionales tanto in vitro como in vivo, en particular, ensayos relacionados con la capacidad de las células madre para dar lugar a múltiples descendencias diferenciadas.
Las células madre de interés son de mamífero, refiriéndose el término a células aisladas de cualquier animal clasificado como un mamífero, incluyendo seres humanos, animales domésticos y de granja y animales de zoológico, de laboratorio, de deporte o de compañía, tales como perros, caballos, gatos, vacas, ratones, ratas, conejos, etc. En algunas divulgaciones del presente documento, el mamífero es un ser humano y las células de mamífero (por ejemplo, una población de células madre procedentes de adipocitos) son por tanto células humanas (por ejemplo, una población de células madre procedentes de adipocitos humanos).
Los términos "pasar" o "pase" (es decir, división o dividir), en el contexto del cultivo celular, se conocen en la técnica y se refieren a la transferencia de un pequeño número de células a un nuevo vaso. Las células pueden cultivarse si se dividen regularmente debido a que se evita la senescencia asociada con la alta densidad celular. Para las células adherentes, se desprenden las células de la superficie de cultivo como parte del protocolo de pase. El desprendimiento se efectúa normalmente con la enzima tripsina y/u otros reactivos disponibles comercialmente (por ejemplo, TrypLE, EDTA (ácido etilendiaminotetraacético), una varilla de policía (por ejemplo, una varilla de policía de goma) para raspar físicamente las células de la superficie, etc.). Después, puede usarse un pequeño número de células desprendidas (por ejemplo, tan pocas como una célula) para sembrar una nueva población celular, por ejemplo, después de la dilución con medio adicional. Por lo tanto, pasar una población celular significa disociar al menos una parte de las células de la población celular, diluir las células disociadas y emplacar las células disociadas diluidas (es decir, sembrar una nueva población celular).
Los términos "medios" y "medio" se usan indistintamente en el presente documento. El medio de cultivo celular es la mezcla líquida que baña a las células durante el cultivo in vitro.
El término "población", por ejemplo, "población celular" o "población de células", como se usa en el presente documento, se refiere a una agrupación (es decir, una población) de dos o más células que se separan (es decir, aíslan) a partir de otras células y/o agrupamientos celulares. Por ejemplo, una placa de cultivo de 6 pocillos puede contener 6 poblaciones celulares, residiendo cada población en un pocillo individual. Las células de una población celular pueden ser, pero no necesariamente, derivados clonales entre sí. Una población celular puede proceder de una célula individual. Por ejemplo, en caso de que se coloquen células individuales en un solo pocillo de una placa de cultivo de 6 pocillos y cada célula se divida una vez, la placa contendrá 6 poblaciones celulares. Una población de células puede tener cualquier tamaño deseado y contener cualquier número de células mayor de una célula. Por ejemplo, una población de células puede ser de 2 o más, 10 o más, 100 o más, 1.000 o más, 5.000 o más, 104 o más, 105 o más, 106 o más, 107 o más, 108 o más, 109 o más, 1010 o más, 1011 o más, 1012 o más, 1013 o más, 1014 o más, 1015 o más, 1016 o más, 1017 o más, 1018 o más, 1019 o más o 1020 o más células.
MÉTODOS
Los aspectos de la divulgación incluyen métodos para producir una población de células similares a hepatocitos a partir de una población de células madre procedentes de adipocitos (ASC). Los métodos implican generalmente colocar una población de ASC en un cultivo tridimensional (por ejemplo, cultivo en suspensión de gota colgante, cultivo de alta densidad, cultivo en matraz de agitación, cultivo en microtransportador, etc.) para producir un agregado celular derivado de ASC (por ejemplo, esfera); poner en contacto las células del agregado celular derivado de ASC con un primer medio de cultivo que comprende Activina A y un factor de crecimiento de fibroblastos (FGF) para producir una población de células precursoras; y poner en contacto las células de la población de células precursoras con un segundo medio de cultivo que comprende factor de crecimiento de hepatocitos (HGF) para producir una población de células inducidas que comprende células similares a hepatocitos inducidas (iHep).
Células madre derivadas de tejido adiposo (ASC). La expresión "células madre derivadas de tejido adiposo" se refiere a una población de células de tejido adiposo halladas en mamíferos después de su nacimiento que son pluripotentes y tienen el potencial de diferenciarse en varios tipos celulares que incluyen, pero sin limitación, células de los linajes osteogénico, adipogénico y condrogénico. Las ASC también pueden diferenciarse en células similares a hepatocitos. Las ASC se han citado en la bibliografía como células madre adultas procedentes de tejido adiposo (ADAS), células estromales adultas procedentes de tejido adiposo, células estromales procedentes de tejido adiposo (ADSC), células estromales de tejido adiposo (ASC), células madre mesenquimales de tejido adiposo (AdMSC), lipoblastos, pericitos, preadipocitos y células de lipoaspirado procesadas (PLA). La International Fat Applied Technology Society (IFATS) acordó por consenso adoptar la expresión "células madre derivadas de tejido adiposo" (ASC) para identificar la población de células multipotentes, adherentes en plástico y aisladas. Por lo tanto, la expresión "célula madre derivada de tejido adiposo" (ASC) se usa en el presente documento de acuerdo con el consenso de la IFATS, que será conocido por un experto habitual en la materia. A diferencia de las líneas celulares, las ASC no se someten a inmortalización.
Una serie de publicaciones científicas ha descrito la biología subyacente a las ASC, se han llevado a cabo estudios preclínicos para el uso de ASC en diversos campos de medicina regenerativa y se ha determinado la eficacia de las ASC en varios ensayos clínicos.
Las ASC para su uso en los presentes métodos pueden aislarse mediante cualquier método conveniente, que será conocido por un experto habitual en la materia. Generalmente, pueden obtenerse muestras de tejido adiposo subcutáneo bajo anestesia local. Los métodos actuales usados para aislar ASC incluyen generalmente digestión con colagenasa, seguido de separación por centrifugación para aislar la fracción estromal vascular a partir de adipocitos primarios.
A modo de ejemplo no limitante, para aislar ASC, puede digerirse tejido adiposo obtenido en forma de especímenes quirúrgicos extraídos (por ejemplo, una biopsia) o en forma de lipoaspirados con una enzima colagenasa (por ejemplo, una colagenasa de origen bacteriano) en presencia de calcio para liberar los componentes celulares individuales. Posteriormente, pueden separarse los adipocitos maduros (por ejemplo, mediante centrifugación diferencial), de las células restantes, que forman un sedimento de la fracción vascular estromal (SVF). La población celular de la SVF incluye células endoteliales, fibroblastos, linfocitos B y T, macrófagos, células mieloides, pericitos, preadipocitos, células de músculo liso y las ASC en cultivo adherente. Después del cultivo (por ejemplo, de 4 a 6 días) con medio que contiene aproximadamente un 10 % de suero bovino fetal (puede usarse cualquier medio de cultivo conveniente), un solo mililitro de lipoaspirado humano proporcionará de 0,25 a 0,375 x 106 ASC capaces de diferenciarse a lo largo de los linajes adipogénico (adipocitos), condrogénico (condrocitos) y osteogénico (osteoblastos) in vitro. Las ASC presentan una morfología similar a los fibroblastos y carecen de las gotas de lípido intercelulares observadas en los adipocitos. Las ASC aisladas normalmente se expanden en cultivo monocapa en plásticos de cultivo tisular convencionales con un medio basal que contiene suero fetal bovino al 10 %. Debido a que la liposucción de un solo paciente normalmente da como resultado > 1 l de tejido, es factible generar cientos de millones de ASC de un solo donante en un solo pase de cultivo celular in vitro. A diferencia de las células de SVF, las ASC son relativamente homogéneas basándose en su perfil de expresión de antígenos de superficie.
En general, el aislamiento de ASC de un lipoaspirado puede incluir: (1) lavar el lipoaspirado en solución salina tamponada; (2) someter al lipoaspirado a digestión con colagenasa; (3) centrifugar y aislar el sedimento de la fracción vascular estromal (SVF); (4) cultivar las células heterogéneas de la SFV sobre una superficie adherente; y (5) aislar ASC adherentes. El cultivo de células de la SVF en condiciones estándar acaba dando como resultado (en los primeros pases) la aparición de ASC, que es una población relativamente homogénea de células mesodérmicas o mesenquimales. Las ASC pueden verificarse, por ejemplo, demostrando que las células pueden diferenciarse en múltiples linajes diferentes (por ejemplo, los adipocitos pueden diferenciarse usando, por ejemplo, tinción de Oil Red O; los osteoblastos pueden identificarse usando, por ejemplo, tinción de Alizarin Red; y los condrocitos pueden identificarse usando, por ejemplo, tinción de Alcian Blue). También pueden usarse marcadores de proteínas y ácidos nucleicos para verificar la diferenciación en múltiples linajes.
La International Society for Cellular Therapy (ISCT) y la IFATS han establecido los criterios mínimos que definen las células de la SVF y las ASC basándose en criterios funcionales y cuantitativos. Los cuatro criterios usados en el presente documento son: (1) las ASC son adherentes a plásticos cuando se mantienen en condiciones de cultivo convencionales; (2) las ASC tienen la capacidad de diferenciación osteogénica, adipogénica y condrogénica; (3) las ASC expresan los marcadores (es decir, marcadores moleculares) CD29, CD34, CD36, CD49f, CD73, CD90 (Thy-1), CD105, CD133, c-kit y c-met; y (4) las ASC son negativas para Cd45, CD106 y CD31. Pueden usarse los ensayos de diferenciación adipocítica, condroblástica y osteoblástica (por ejemplo, tinción de Oil Red O, tinción de Alcian Blue y tinción de Alizarin Red, respectivamente) para evaluar la potencia y la capacidad de diferenciación y pueden usarse junto con una evaluación cuantitativa de la diferenciación bioquímicamente o mediante reacción en cadena de la polimerasa de retrotranscripción. La IFATS recomienda el ensayo de unidad formadora de colonias-fibroblastos (CFU-F) para calcular la capacidad de duplicaciones de la población.
Para más información acerca de la naturaleza de las ASC, incluyendo el aislamiento y cultivo de ASC, véase (i) Gimble et al., Circ Res. 11 de mayo de 2007;100(9):1249-60: "Adipose-derived stem cells for regenerative medicine"; (ii) Gimble et al., Organogenesis. 1 de enero de 2013;9(1): "Adipose-derived stromal/stem cells: A primer"; (iii) Bourin et al, Cytotherapy. junio de 2013;15(6):641-8: "Stromal cells from the adipose tissue-derived stromal vascular fraction and culture expanded adipose tissue-derived stromal/stem cells: a joint statement of the International Federation for Adipose Therapeutics and Science (IFATS) and the International Society for Cellular Therapy (ISCT)"; (iv) Gentile et al, Stem Cells Transl Med. marzo de 2012;1(3):230-6: "Concise review: adipose-derived stromal vascular fraction cells and platelet-rich plasma: basic and clinical implications for tissue engineering therapies in regenerative surgery"; y (v) Mizuno et al., Stem Cells. mayo de 2012;30(5):804-10: "Concise review: Adipose-derived stem cells as a novel tool for future regenerative medicine".
Como se usa en el presente documento, la expresión "tejido adiposo" se refiere a grasa que incluye el tejido conectivo que almacena la grasa. El tejido adiposo contiene múltiples tipos celulares regenerativos, incluyendo ASC y células progenitoras y precursoras endoteliales.
Cultivo tridimensional. Los métodos de la divulgación incluyen poner una población de ASC en cultivo tridimensional para producir un agregado celular derivado de ASC (por ejemplo, esfera). La expresión "cultivo tridimensional", como se usa en el presente documento, se refiere al cultivo de células de un modo que incluye baja fuerza de cizalladura (y por consiguiente, baja turbulencia) y alta transferencia de masa de nutrientes. Un ejemplo no limitante de "cultivo tridimensional" es el cultivo de células en forma de agregados (por ejemplo, esferas, es decir, formación de esferoides). La colocación de una población de células (por ejemplo, ASC) en un cultivo tridimensional puede hacer que las células formen agregados celulares (por ejemplo, esferas celulares). Por lo tanto, las presentes células (por ejemplo, una población de ASC) pueden colocarse en un cultivo tridimensional para producir un agregado celular procedente de ASC (por ejemplo, esfera). Los agregados celulares (por ejemplo, esferas) pueden producirse mediante una serie de técnicas de cultivo tridimensional, incluyendo, pero sin limitación, cultivo en suspensión de gota colgante, cultivo celular de alta densidad (por ejemplo, cultivo en suspensión con agitación, tal como cultivo en matraz de agitación, por ejemplo, con o sin microtransportadores; cultivo en biorreactor, por ejemplo, con o sin microtransportadores; etc.) y similares (véase la sección de ejemplos).
En algunas divulgaciones del presente documento, las células pueden colocarse en un cultivo tridimensional a cualquier densidad conveniente (por ejemplo, mediante dilución o concentración). Por ejemplo, en algunos casos, las células se colocan en un cultivo tridimensional a una densidad celular en el intervalo de 1x102 células/ml a 1x107 células/ml (por ejemplo, de 5x102 células/ml a 5x106 células/ml, de 1x103 células/ml a 5x106 células/ml, de 5x103 células/ml a 5x106 células/ml, de 5x103 células/ml a 1x105 células/ml, de 5x103 células/ml a 5x104 células/ml, de 7x103 células/ml a 3x104 células/ml, de 8x103 células/ml a 3x104 células/ml, 1x104 células/ml, de 1x104 células/ml a 1x106 células/ml, de 5x104 células/ml a 1x106 células/ml, de 7x104 células/ml a 7x105, de 1x105 células/ml a 7x105, de 3x105 células/ml a 7x105, de 4x105 células/ml a 6x105 o 5x105).
En la práctica de los métodos de la divulgación, las ASC pueden cultivarse en cultivo tridimensional durante un periodo de tiempo suficiente para la formación de agregados celulares (por ejemplo, esferas, que pueden asemejarse a cuerpos embrioides). En algunas divulgaciones del presente documento, las ASC se cultivan usando cultivo tridimensional (es decir, las ASC se colocan en un cultivo tridimensional) durante 3 días o menos (por ejemplo, 2,5 días o menos, 2 días o menos, 1,5 días o menos, 1 día o menos, 12 horas o menos, 8 horas o menos, 6 horas o menos o 4 horas o menos). En algunas divulgaciones del presente documento, las ASC se cultivan usando cultivo tridimensional durante un periodo de tiempo en el intervalo de 2 horas a 3 días (por ejemplo, de 2 horas a 3 días, de 2 horas a 2,5 días, de 2 horas a 2 días, de 2 horas a 1,5 días, de 2 horas a 1 día, de 6 horas a 3 días, de 6 horas a 2,5 días, de 6 horas a 2 días, de 6 horas a 1,5 días, de 6 horas a 1 día, de 6 horas a 12 horas, de 8 horas a 3 días, de 8 horas a 2,5 días, de 8 horas a 2 días, de 8 horas a 1,5 días, de 8 horas a 1 día, de 8 horas a 12 horas, de 12 horas a 2,5 días, de 12 horas a 2 días, de 12 horas a 1,5 días, de 12 horas a 1 día, de 1 día a 3 días, de 1 día a 2,5 días, de 1 día a 2 días, de 1 día a 1,5 días, de 1,5 días a 3 días, de 1,5 días a 2,5 días, de 1,5 días a 2 días, de 2 días a 3 días, de 1 día, 1,5 días, de 2 días, de 2,5 días o 3 días).
Cultivo en suspensión en gota colgante. En algunas divulgaciones del presente documento, el cultivo tridimensional es un cultivo en suspensión en gota colgante. Por lo tanto, en algunas divulgaciones del presente documento, se forman agregados de las presentes células (por ejemplo, ASC) mediante la colocación de las células en un cultivo en suspensión en gota colgante. El cultivo en suspensión en gota colgante. es una técnica normalmente usada para formar cuerpos embrioides a partir de células madre embrionarias (ESC). Las células en fluido se colocan en microgotas (normalmente en el intervalo de 5-50 pl de tamaño) sobre una superficie (por ejemplo, superficie de una placa de Petri, un portaobjetos, vidrio, plástico, etc.) y se invierte la superficie, de tal forma que las células están suspendidas de la superficie. Después, se cultivan las células bajo la superficie en una microgota suspendida en lugar de cultivarse por encima de la superficie. Las microgotas en suspensión en ocasiones se citan como gotas colgantes. Algunas células forman agregados (citados como "esferas" y/o "esferoides") cuando se cultivan usando el cultivo en suspensión en gota colgante.
En algunas divulgaciones del presente documento, las células pueden colocarse en cultivo en suspensión en gota colgante a una densidad seleccionada (por ejemplo, mediante dilución o concentración). Por ejemplo, en algunos casos, las células se colocan en un cultivo en suspensión en gota colgante a una densidad celular en el intervalo de 1x102 células/ml a 1x107 células/ml (por ejemplo, de 5x102 células/ml a 5x106 células/ml, de 1x103 células/ml a 5x106 células/ml, de 5x103 células/ml a 5x106 células/ml, de 5x103 células/ml a 1x105 células/ml, de 5x103 células/ml a 5x104 células/ml, de 7x103 células/ml a 3x104 células/ml, de 8x103 células/ml a 3x104 células/ml, 1x104 células/ml, de 1x104 células/ml a 1x106 células/ml, de 5x104 células/ml a 1x106 células/ml, de 7x104 células/ml a 7x105, de 1x105 células/ml a 7x105, de 3x105 células/ml a 7x105, de 4x105 células/ml a 6x105 o 5x105).
En la práctica de los métodos de la divulgación, Las ASC pueden cultivarse mediante el método en gota colgante (es decir, se cultivan usando cultivo en suspensión en gota colgante) durante un periodo de tiempo suficiente para la formación de agregados celulares (por ejemplo, esferas, que pueden asemejarse a cuerpos embrioides). En algunas divulgaciones del presente documento, las ASC se cultivan usando cultivo en suspensión en gota colgante (es decir, las ASC se colocan en un cultivo en suspensión en gota colgante) durante 3 días o menos (por ejemplo, 2,5 días o menos, 2 días o menos, 1,5 días o menos, 1 día o menos, 12 horas o menos, 8 horas o menos, 6 horas o menos o 4 horas o menos). En algunas divulgaciones del presente documento, las ASC se cultivan usando cultivo en suspensión en gota colgante durante un periodo de tiempo en el intervalo de 2 horas a 3 días (por ejemplo, de 2 horas a 3 días, de 2 horas a 2,5 días, de 2 horas a 2 días, de 2 horas a 1,5 días, de 2 horas a 1 día, de 6 horas a 3 días, de 6 horas a 2,5 días, de 6 horas a 2 días, de 6 horas a 1,5 días, de 6 horas a 1 día, de 6 horas a 12 horas, de 8 horas a 3 días, de 8 horas a 2,5 días, de 8 horas a 2 días, de 8 horas a 1,5 días, de 8 horas a 1 día, de 8 horas a 12 horas, de 12 horas a 2,5 días, de 12 horas a 2 días, de 12 horas a 1,5 días, de 12 horas a 1 día, de 1 día a 3 días, de 1 día a 2,5 días, de 1 día a 2 días, de 1 día a 1,5 días, de 1,5 días a 3 días, de 1,5 días a 2,5 días, de 1,5 días a 2 días, de 2 días a 3 días, de 1 día, 1,5 días, de 2 días, de 2,5 días o 3 días).
En algunas divulgaciones del presente documento, se retira un agregado celular procedente de ASC (por ejemplo, esfera) del cultivo tridimensional (por ejemplo, cultivo en suspensión en gota colgante, cultivo de alta densidad, cultivo en matraz de agitación, cultivo en microtransportador, etc.). Por ejemplo, puede suspenderse un agregado celular (por ejemplo, esfera) en fluido y sembrarse sobre una superficie bidimensional que no se considera un cultivo tridimensional. En algunos casos, los agregados (por ejemplo, esferas) se recogen (por ejemplo, mediante centrifugación) y se suspenden. En algunos casos, los agregados (por ejemplo, esferas) se recogen y suspenden a una densidad en un intervalo de 15 agregados/ml a 45 agregados/ml (por ejemplo, de 20 agregados/ml a 40 agregados/ml, de 25 agregados/ml a 35 agregados/ml o 30 agregados/ml). Los agregados pueden suspenderse en cualquier medio conveniente (por ejemplo, medio de estadio 1, descrito más adelante). En algunos casos, los agregados (por ejemplo, esferas) recogidos (suspendidos) se siembran (es decir, emplacan, por ejemplo, sobre discos recubiertos con matrigel). En algunas divulgaciones del presente documento, se retira un agregado celular procedente de ASC (por ejemplo, esfera) del cultivo tridimensional (por ejemplo, cultivo en suspensión en gota colgante, cultivo de alta densidad, cultivo en matraz de agitación, cultivo en microtransportador, etc.) de manera simultánea con o antes de, poner en contacto las células del agregado celular procedente de ASC (por ejemplo, esfera) con un medio de estadio 1. Por lo tanto, en algunos casos, las células se cultivan en (por ejemplo, se ponen en contacto con) un medio de estadio 1 después de retirarse del cultivo tridimensional. En algunas divulgaciones del presente documento, las células del agregado celular derivado de ASC (por ejemplo, esfera) se ponen en contacto con un medio de estadio 1 mientras que sigue en el cultivo tridimensional (por ejemplo, para transferir las células a condiciones de cultivo sin inversión).
Cultivo de alta densidad - cultivo en microtransportador. En algunas divulgaciones del presente documento, el cultivo tridimensional es un cultivo de alta densidad. Por lo tanto, los agregados (por ejemplo, esferas) de las presentes células (por ejemplo, ASC) se forman colocando las células en un cultivo de alta densidad. En algunas divulgaciones del presente documento, un cultivo de alta densidad es un cultivo en microtransportador. En algunas divulgaciones del presente documento, el cultivo tridimensional es un cultivo en microtransportador. Por lo tanto, los agregados (por ejemplo, esferas) de las presentes células (por ejemplo, ASC) se forman colocando las células en un cultivo en microtransportador. La expresión "cultivo en microtransportador" se usa en el presente documento para hacer referencia al cultivo de células sobre una matriz de soporte (por ejemplo, una matriz de soporte esférica). En este sistema, las células se propagan sobre la superficie de pequeñas partículas sólidas suspendidas en el medio de crecimiento mediante agitación lenta. Las células se unen y crecen hasta la confluencia sobre la superficie de los microtransportadores.
Los microtransportadores pueden producirse con varias formas y tamaños, siendo la esférica más común y su densidad permite que se mantengan en suspensión con agitación suave. Cada microtransportador debería tener unas dimensiones que pueden facilitar el crecimiento celular durante varias duplicaciones. De este modo, al final del cultivo celular, cada microtransportador dará soporte a varios cientos de células sobre su superficie. Los microtransportadores esféricos normalmente tienen diámetros de 100-250 pm. En algunas divulgaciones del presente documento, los microtransportadores son esferas con un diámetro en un intervalo de 100 pm a 250 pm. La distribución de tamaños de los microtransportadores esféricos debe ser baja (por ejemplo, ±25 pm) a fin de prevenir una distribución desigual de las células sobre los microtransportadores. La densidad de los microtransportadores debe encontrarse ligeramente por encima de 1 (por ejemplo, 1,02-1,05 g/ml) a fin de mantener los microtransportadores en suspensión con una velocidad de agitación mínima.
Los microtransportadores pueden fabricarse de una serie de materiales diferentes, incluyendo dietilaminoetanol (DEAE)-dextrano, dextrano, vidrio, plástico de poliestireno, acrilamida (por ejemplo, poliacrilamida), colágeno, etc. En algunos casos, pueden usarse microtransportadores biodegradables como armazón para el trasplante de células in vivo. La superficie del MC está disponible para el crecimiento celular, a la vez que la movilidad del MC en el medio genera una homogeneidad que es similar al ambiente de suspensión usado en los cultivos sumergidos tradicionales de mamífero y microbianos.
La superficie de un microtransportador puede derivatizarse con grupos funcionales, tales como proteínas recombinantes, aminas terciarias, cuaternarias o primarias cargadas positivamente, gelatina, colágeno, otras proteínas y péptidos de la matriz extracelular (ECM) (por ejemplo, péptido de RGD). Los MC cargados positivamente atraen a las células (que están cargadas negativamente), mediante fuerzas electrostáticas. Se ha observado que la cantidad óptima de carga positiva es de entre 1 y 2 miliequivalentes/g de materiales secos (para perlas de dextrano o de poliacrilamida reticulados derivatizados con aminas terciarias). A este nivel, las células se unen a los microtransportadores eficientemente (aproximadamente un 90 % en menos de 1 h) sin un efecto negativo en el crecimiento celular. El recubrimiento con colágeno o proteína de la ECM da como resultado una menor unión, pero normalmente soporta mejor el crecimiento de las células a bajos niveles de inoculación.
Hay disponibles comercialmente varios tipos de microtransportadores, incluyendo microtransportadores a base de dextrano (Cytodex, GE Healthcare), a base de colágeno (Cultispher, Percell) y a base de poliestireno (SoloHill Engineering). Estos difieren en su porosidad, peso específico, propiedades ópticas, presencia de componentes de origen animal y química de superficie. Es posible clasificar los microtransportadores en seis grupos:
Grupo 1: Microtransportadores lisos no porosos (por ejemplo, microtransportadores de poliestireno) o microporosos (por ejemplo, Cytodex 1) con cargas positivas. Estos microtransportadores son adecuados para cultivar células adherentes que forman una monocapa continua de células sobre la superficie de los microtransportadores en cultivos en agitación. Este grupo incluye también celulosas de intercambio aniónico de Whatman (DE-53), microtransportadores con forma cilíndrica que se han usado con éxito en el cultivo de líneas celulares (BHK y MDCK).
Grupo 2: Microtransportadores recubiertos de colágeno (por ejemplo, Cytodex 3 y FACT 102-L). Estos microtransportadores están acoplados químicamente con colágeno y son adecuados para cultivar células sensibles con una baja eficiencia de emplacado. El recubrimiento con colágeno también está diseñado para facilitar la recogida de células.
Grupo 3: Microtransportadores recubiertos de ECM (Pro-F 102-L). Pro-F 102-L está recubierto de fibronectina recombinante, que está diseñado para el cultivo de células sensibles en condiciones sin suero.
Grupo 4: Microtransportadores no cargados (por ejemplo, perlas de vidrio y poliestireno para cultivo tisular MC P 102-L). Estos microtransportadores tienen propiedades de superficie similares a las superficies de cultivo tisular en 2D clásicas.
Grupo 5: Microtransportadores macroporosos (por ejemplo, Cytopore y Cultispher). Microtransportadores macroporosos con tamaños de poro en el intervalo de 10-70 pm sobre la superficie. Proporcionan mayores áreas de superficie celular para el cultivo y ofrecen una mejor protección mecánica a las células frente al estrés de cizalladura generado por los agitadores, burbujeadores o filtros de centrifugación.
Grupo 6: Microtransportadores lastrados (Cytoline). Estos microtransportadores están diseñados para su uso en cultivos de perfusión en lecho fluidificado. Estos microtransportadores comerciales se han diseñado de acuerdo con las necesidades para propagar líneas celulares dependientes de anclaje usadas en la producción de vacunas y agentes biofarmacéuticos.
En la práctica de los métodos de la divulgación, las ASC pueden cultivarse mediante cultivo en microtransportador (es decir, cultivarse usando cultivo en microtransportador) durante un periodo de tiempo suficiente para la formación de agregados celulares (por ejemplo, esferas, que pueden asemejarse a cuerpos embrioides). En algunas divulgaciones del presente documento, las ASC se cultivan usando cultivo en microtransportador (es decir, las ASC se colocan en un cultivo en microtransportador) durante 3 días o menos (por ejemplo, 2,5 días o menos, 2 días o menos, 1,5 días o menos, 1 día o menos, 12 horas o menos, 8 horas o menos, 6 horas o menos o 4 horas o menos). En algunas divulgaciones del presente documento, las ASC se cultivan usando cultivo en microtransportador durante un periodo de tiempo en el intervalo de 2 horas a 3 días (por ejemplo, de 2 horas a 3 días, de 2 horas a 2,5 días, de 2 horas a 2 días, de 2 horas a 1,5 días, de 2 horas a 1 día, de 6 horas a 3 días, de 6 horas a 2,5 días, de 6 horas a 2 días, de 6 horas a 1,5 días, de 6 horas a 1 día, de 6 horas a 12 horas, de 8 horas a 3 días, de 8 horas a 2,5 días, de 8 horas a 2 días, de 8 horas a 1,5 días, de 8 horas a 1 día, de 8 horas a 12 horas, de 12 horas a 2,5 días, de 12 horas a 2 días, de 12 horas a 1,5 días, de 12 horas a 1 día, de 1 día a 3 días, de 1 día a 2,5 días, de 1 día a 2 días, de 1 día a 1,5 días, de 1,5 días a 3 días, de 1,5 días a 2,5 días, de 1,5 días a 2 días, de 2 días a 3 días, de 1 día, 1,5 días, de 2 días, de 2,5 días o 3 días).
Para ejemplos del uso de microtransportadores (por ejemplo, usando matraces de agitación, biorreactores, etc.) para varios fines y con diversos tipos de células, remítase a la bibliografía científica, tal como: (i) Chen et al, Biotechnol Adv. 24 de marzo de 2013. pii: S0734-9750(13)00065-7: Application of human mesenchymal and pluripotent stem cell microcarrier cultures in cellular therapy: Achievements and future direction; (ii) Pacak et al, PLoS One.
2013;8(1):e55187: Microcarrier-based expansion of adult murine side population stem cells; (iii) Torgan et al, Med Biol Eng Comput. septiembre de 2000;38(5):583-90: Differentiation of mammalian skeletal muscle cells cultured on microcarrier beads in a rotating cell culture system; y (iv) Park et al, Tissue Eng Part B Rev. abril de 2013;19(2): 172­ 90: Microcarriers designed for cell culture and tissue engineering of bone; así como referencias de patentes, tales como las Patentes de los Estados Unidos: 8524492, 8426176, 7947471, 7670839, 7361493, 6214618 y 5153133, 4910142 y 4824946;
El cultivo en microtransportador normalmente requiere la agitación de los microtransportadores (por ejemplo, los microtransportadores cargados de células). La agitación puede incluir sencillamente agitación o remoción, agitación usando un matraz de agitación y/o agitación usando un biorreactor (también conocido como sistema de cultivo celular rotatorio (RCCS), un sistema de cultivo celular rotatorio (RCCS) o un sistema de cámara rotatoria).
Cultivo de alta densidad - Cultivo en matraz de agitación. En algunas divulgaciones del presente documento, el cultivo tridimensional es un cultivo de alta densidad. Por lo tanto, los agregados (por ejemplo, esferas) de las presentes células (por ejemplo, ASC) se forman colocando las células en un cultivo de alta densidad. En algunas divulgaciones del presente documento, un cultivo de alta densidad es un cultivo en matraz de agitación. El cultivo en matraz de agitación es un ejemplo de un cultivo en suspensión agitado. El cultivo en suspensión agitado (es decir, cultivo de suspensión de masa) (por ejemplo, cultivo en matraz de agitación, cultivo en biorreactor, etc.) puede usarse para cultivar células en ausencia de microtransportadores o en presencia de microtransportadores. Por lo tanto, en algunas divulgaciones del presente documento, un cultivo en microtransportador se agita usando un matraz de agitación. En algunas divulgaciones del presente documento, un cultivo tridimensional (por ejemplo, un cultivo de alta densidad) es un cultivo en matraz de agitación sin (es decir, en ausencia de) microtransportadores. En ausencia de microtransportadores, las ASC colocadas en un cultivo en suspensión agitado (por ejemplo, cultivo en matraz de agitación, cultivo en biorreactor) siguen formando agregados celulares (por ejemplo, esferas) (figura 13). Por lo tanto, en algunas divulgaciones del presente documento, un cultivo tridimensional (por ejemplo, un cultivo de alta densidad) es un cultivo en matraz de agitación sin (es decir, en ausencia de) microtransportadores.
Los matraces de agitación (es decir, frascos de agitación) están diseñados generalmente para facilitar el cultivo de altos volúmenes de células proporcionando una circulación homogénea de las células (por ejemplo, células en ausencia de microtransportadores, células o microtransportadores, etc.) y medio (es decir, nutrientes) y un intercambio superior de gas (por ejemplo, oxigenación). Los matraces de agitación pueden estar hechos de cualquier material conveniente (por ejemplo, vidrio de borosilicato, plásticos de grado de cultivo tisular, etc.) y normalmente son un matraz de fondo plano con un dispositivo de agitación (por ejemplo, normalmente un impulsor vertical o una barra de agitación colgante) que puede controlarse usando una placa de agitación magnética. Un matraz de agitación también puede incluir brazos laterales en dos ángulos para permitir la introducción de pipetas. Puede usarse cualquier matraz de agitación conveniente que posibilite el cultivo de alta densidad en la práctica de los presentes métodos.
En algunas divulgaciones del presente documento, las células pueden colocarse en un cultivo en matraz de agitación a cualquier densidad conveniente (por ejemplo, mediante dilución o concentración). Por ejemplo, en algunos casos, las células se colocan en un cultivo en matraz de agitación a una densidad celular en el intervalo de 1x102 células/ml a 1x107 células/ml (por ejemplo, de 5x102 células/ml a 5x106 células/ml, de 1x103 células/ml a 5x106 células/ml, de 5x103 células/ml a 5x106 células/ml, de 5x103 células/ml a 1x105 células/ml, de 5x103 células/ml a 5x104 células/ml, de 7x103 células/ml a 3x104 células/ml, de 8x103 células/ml a 3x104 células/ml, 1x104 células/ml, de 1x104 células/ml a 1x106 células/ml, de 5x104 células/ml a 1x106 células/ml, de 7x104 células/ml a 7x105, de 1x105 células/ml a 7x105, de 3x105 células/ml a 7x105, de 4x105 células/ml a 6x105 o 5x105).
En la práctica de los métodos de la divulgación, las ASC pueden cultivarse mediante cultivo en matraces de agitación (es decir, cultivarse usando cultivo en matraces de agitación) durante un periodo de tiempo suficiente para la formación de agregados celulares (por ejemplo, esferas, que pueden asemejarse a cuerpos embrioides). En algunas divulgaciones del presente documento, las ASC se cultivan usando cultivo en matraz de agitación (es decir, las ASC se colocan en un cultivo en matraz de agitación) durante 3 días o menos (por ejemplo, 2,5 días o menos, 2 días o menos, 1,5 días o menos, 1 día o menos, 12 horas o menos, 8 horas o menos, 6 horas o menos o 4 horas o menos). En algunas divulgaciones del presente documento, las ASC se cultivan usando cultivo en matraz de agitación durante un periodo de tiempo en el intervalo de 2 horas a 3 días (por ejemplo, de 2 horas a 3 días, de 2 horas a 2,5 días, de 2 horas a 2 días, de 2 horas a 1,5 días, de 2 horas a 1 día, de 6 horas a 3 días, de 6 horas a 2,5 días, de 6 horas a 2 días, de 6 horas a 1,5 días, de 6 horas a 1 día, de 6 horas a 12 horas, de 8 horas a 3 días, de 8 horas a 2,5 días, de 8 horas a 2 días, de 8 horas a 1,5 días, de 8 horas a 1 día, de 8 horas a 12 horas, de 12 horas a 2,5 días, de 12 horas a 2 días, de 12 horas a 1,5 días, de 12 horas a 1 día, de 1 día a 3 días, de 1 día a 2,5 días, de 1 día a 2 días, de 1 día a 1,5 días, de 1,5 días a 3 días, de 1,5 días a 2,5 días, de 1,5 días a 2 días, de 2 días a 3 días, de 1 día, 1,5 días, de 2 días, de 2,5 días o 3 días).
Cultivo de alta densidad - Cultivo en biorreactor. En algunas divulgaciones del presente documento, el cultivo tridimensional es un cultivo de alta densidad. Por lo tanto, los agregados (por ejemplo, esferas) de las presentes células (por ejemplo, ASC) se forman colocando las células en un cultivo de alta densidad. En algunas divulgaciones del presente documento, un cultivo de alta densidad es un cultivo en biorreactor. El cultivo en biorreactor es un ejemplo de un cultivo en suspensión agitado. El cultivo en suspensión agitado (es decir, cultivo de suspensión de masa) (por ejemplo, cultivo en matraz de agitación, cultivo en biorreactor, etc.) puede usarse para cultivar células en ausencia de microtransportadores o en presencia de microtransportadores. Por lo tanto, en algunas divulgaciones del presente documento, un cultivo en microtransportador se agita usando un biorreactor. En algunas divulgaciones del presente documento, un cultivo tridimensional (por ejemplo, un cultivo de alta densidad) es un cultivo en biorreactor sin (es decir, en ausencia de) microtransportadores. En ausencia de microtransportadores, las ASC colocadas en un cultivo en suspensión agitado (por ejemplo, cultivo en matraz de agitación, cultivo en biorreactor) siguen formando agregados celulares (por ejemplo, esferas). Por lo tanto, en algunas divulgaciones del presente documento, un cultivo tridimensional (por ejemplo, un cultivo de alta densidad) es un cultivo en biorreactor sin (es decir, en ausencia de) microtransportadores.
Los biorreactores (también conocidos como sistema de cultivo celular rotatorio (RCCS), un sistema de cultivo celular rotatorio (RCCS) o un sistema de cámara rotatoria) pueden controlar las condiciones ambientales, tales como caudales de gas (por ejemplo, aire, oxígeno, nitrógeno y dióxido de carbono), temperatura, pH, niveles de oxígeno disuelto, velocidad de agitación/velocidad de circulación y similares. Como en los matraces de agitación, los biorreactores están diseñados para facilitar el cultivo de altos volúmenes de células proporcionando una circulación homogénea de las células (por ejemplo, células en ausencia de microtransportadores, células o microtransportadores, etc.) y medio (es decir, nutrientes) y un intercambio superior de gas (por ejemplo, oxigenación). Puede usarse cualquier biorreactor conveniente que posibilite el cultivo celular a alta densidad con los métodos divulgados y se conocen en la técnica diversos biorreactores adecuados. Los ejemplos de biorreactores adecuados incluyen, pero sin limitación: biorreactores de microgravedad de pared rotatoria, biorreactores de vaso de pared rotatoria (RWVB), biorreactores de tanque de agitación, biorreactores perfundidos, biorreactores de lecho fluidizado. Los biorreactores pueden estar hechos de una gran variedad de materiales diferentes, incluyendo, pero sin limitación: acero inoxidable, politetrafluoroetileno (PTFE), vidrio y similares.
Los biorreactores pueden permitir aumentar la escala del cultivo en, por ejemplo, biorreactores convencionales de acero inoxidable o desechables que se usan para propagar células de mamífero en suspensión. Los biorreactores pueden ser de diversos tamaños. En algunos casos, un cultivo en biorreactor es un cultivo en el intervalo de 5 litros a 105 litros (por ejemplo, de 5 litros a 15 litros, de 8 litros a 12 litros, de 15 litros a 25 litros, de 25 litros a 40 litros, de 40 litros a 50 litros, de 45 litros a 55 litros, de 55 litros a 65 litros, de 65 litros a 75 litros, de 75 litros a 85 litros, de 85 litros a 95 litros o de 95 litros a 105 litros).
En algunas divulgaciones del presente documento, las células pueden colocarse en un cultivo en biorreactor a cualquier densidad conveniente (por ejemplo, mediante dilución o concentración). Por ejemplo, en algunos casos, las células se colocan en un cultivo en biorreactor a una densidad celular en el intervalo de 1x102 células/ml a 1x107 células/ml (por ejemplo, de 5x102 células/ml a 5x106 células/ml, de 1x103 células/ml a 5x106 células/ml, de 5x103 células/ml a 5x106 células/ml, de 5x103 células/ml a 1x105 células/ml, de 5x103 células/ml a 5x104 células/ml, de 7x103 células/ml a 3x104 células/ml, de 8x103 células/ml a 3x104 células/ml, 1x104 células/ml, de 1x104 células/ml a 1x106 células/ml, de 5x104 células/ml a 1x106 células/ml, de 7x104 células/ml a 7x105, de 1x105 células/ml a 7x105, de 3x105 células/ml a 7x105, de 4x105 células/ml a 6x105 o 5x105).
En la práctica de los métodos de la divulgación, las ASC pueden cultivarse en cultivo en biorreactor durante un periodo de tiempo suficiente para la formación de agregados celulares (por ejemplo, esferas, que pueden asemejarse a cuerpos embrioides). En algunas divulgaciones del presente documento, las ASC se cultivan usando cultivo en biorreactor (es decir, las ASC se colocan en un cultivo en biorreactor) durante 3 días o menos (por ejemplo, 2,5 días o menos, 2 días o menos, 1,5 días o menos, 1 día o menos, 12 horas o menos, 8 horas o menos, 6 horas o menos o 4 horas o menos). En algunas divulgaciones del presente documento, las ASC se cultivan usando cultivo en biorreactor durante un periodo de tiempo en el intervalo de 2 horas a 3 días (por ejemplo, de 2 horas a 3 días, de 2 horas a 2,5 días, de 2 horas a 2 días, de 2 horas a 1,5 días, de 2 horas a 1 día, de 6 horas a 3 días, de 6 horas a 2,5 días, de 6 horas a 2 días, de 6 horas a 1,5 días, de 6 horas a 1 día, de 6 horas a 12 horas, de 8 horas a 3 días, de 8 horas a 2,5 días, de 8 horas a 2 días, de 8 horas a 1,5 días, de 8 horas a 1 día, de 8 horas a 12 horas, de 12 horas a 2,5 días, de 12 horas a 2 días, de 12 horas a 1,5 días, de 12 horas a 1 día, de 1 día a 3 días, de 1 día a 2,5 días, de 1 día a 2 días, de 1 día a 1,5 días, de 1,5 días a 3 días, de 1,5 días a 2,5 días, de 1,5 días a 2 días, de 2 días a 3 días, de 1 día, 1,5 días, de 2 días, de 2,5 días o 3 días).
Cultivo de células en medios de diferenciación. La expresión "medios de diferenciación", como se usa en el presente documento, se refiere a medios que pueden usarse para inducir la diferenciación de las células. Por ejemplo, los medios de estadio 1 y de estadio 2 (descrito más adelante) son dos tipos de medio de diferenciación usados para inducir la diferenciación de ASC en células similares a hepatocitos. En algunas divulgaciones del presente documento, los métodos incluyen retirar el agregado celular procedente de las ASC (por ejemplo, esfera) del cultivo tridimensional (por ejemplo, cultivo en suspensión en gota colgante, cultivo de alta densidad, cultivo en matraz de agitación, cultivo en biorreactor, cultivo en suspensión agitado, cultivo en microtransportador, etc.) y poner en contacto las células del agregado celular procedente de ASC (por ejemplo, durante 3 días o menos) con un primer medio de cultivo celular (por ejemplo, medio de estadio 1) que comprende activina A y un factor de crecimiento de fibroblastos (FGF) para producir una población de células precursoras. En algunas divulgaciones del presente documento, las células de la población de células precursoras se ponen en contacto con un segundo medio de cultivo (por ejemplo, medio de estadio 2) que comprende factor de crecimiento de hepatocitos (HGF) (por ejemplo, durante 7 días o menos) para producir una población de células inducidas que comprende células similares a hepatocitos inducidas (iHep). Todas las proteínas listadas a continuación que pueden incluirse en un medio de diferenciación adecuado, pueden proporcionarse a partir de cualquier fuente conveniente (por ejemplo, purificadas de tejido, recombinantes, etc.).
En algunas divulgaciones del presente documento, las células de un agregado celular derivado de ASC (por ejemplo, esfera) se ponen en contacto con medios de estadio 1 (como se definen más adelante, por ejemplo, un medio de cultivo que tiene activina A y un FGF) durante 3 días o menos (por ejemplo, 2,5 días o menos, 2 días o menos, 1,5 días o menos, 1 día o menos o 12 horas o menos) para producir una población de células precursoras. En algunas divulgaciones del presente documento, las células de un agregado celular derivado de ASC (por ejemplo, esfera) se ponen en contacto con medios de estadio 1 durante un periodo de tiempo en un intervalo de 12 horas a 3 días (por ejemplo, de 12 horas a 2,5 días, de 12 horas a 2 días, de 12 horas a 1,5 días, de 12 horas a 1 día, de 1 día a 3 días, de 1 día a 2,5 días, de 1 día a 2 días, de 1 día a 1,5 días, de 1,5 días a 3 días, de 1,5 días a 2,5 días, de 1,5 días a 2 días, de 2 días a 3 días, 1 día, 1,5 días, 2 días, 2,5 días o 3 días) para producir una población de células precursoras.
En algunas divulgaciones del presente documento, las células de la población de células precursoras se ponen en contacto con medio de estadio 2 (como se define más adelante, por ejemplo, un medio de cultivo que tiene factor de crecimiento de hepatocitos (HGF)) durante 8 días o menos (por ejemplo, 7,5 días o menos, 7 días o menos, 6,5 días o menos, 6 días o menos, 5,5 días o menos, 5 días o menos, 4,5 días o menos, 4 días o menos, 3,5 días o menos, 3 días o menos, 2,5 días o menos, 2 días o menos, 1,5 días o menos, 1 día o menos o 12 horas o menos) para producir una población de células inducidas que comprende células similares a hepatocitos inducidas. En algunas divulgaciones del presente documento, las células de la población de células precursoras se ponen en contacto con medios de estadio 2 durante un periodo de tiempo en un intervalo de 12 horas a 8 días (por ejemplo, de 12 horas a 8 días, de 1 día a 8 días, de 2 días a 8 días, de 3 días a 8 días, de 4 días a 8 días, de 5 días a 8 días, de 6 días a 8 días, de 2 días a 7 días, de 3 días a 7 días, de 4 días a 7 días, de 5 días a 7 días, de 6 días a 7 días, de 5,5 días a 8 días, de 5,5 días a 7,5 días, de 5,5 días a 6,5 días, de 6 días a 7,5 días, de 6,5 días a 7,5 días, 1 día, 2 días, 3 días o 3 días) para producir una población de células inducidas que comprende células similares a hepatocitos inducidas.
En algunas divulgaciones del presente documento, el tiempo total transcurrido desde que (i) se coloca una población de ASC en un cultivo tridimensional, hasta que (ii) se produce una población de células inducidas que comprende células similares a hepatocitos inducidas (iHep), es menor de 13 días (por ejemplo, menor de 12,5 días, menor de 12 días, menor de 11,5 días, menor de 11 días, menor de 10,5 días, menor de 10 días, menor de 9,5 días, menor de 9 días, menor de 8,5 días, menor de 8 días, menor de 7,5 días, menor de 7 días, menor de 6,5 días, menor de 6 días, menor de 5,5 días, menor de 5 días, menor de 4,5 días o menor de 4 días).
En algunas divulgaciones del presente documento, el tiempo total transcurrido desde que (i) se coloca una población de ASC en un cultivo tridimensional, hasta que (ii) se produce una población de células inducidas que comprende células similares a hepatocitos inducidas (iHep), es de 13 días o menos (por ejemplo, 12,5 días o menos, 12 días o menos, 11,5 días o menos, 11 días o menos, 10,5 días o menos, 10 días o menos, 9,5 días o menos, 9 días o menos, 8,5 días o menos, 8 días o menos, 7,5 días o menos, 7 días o menos, 6,5 días o menos, 6 días o menos, 5,5 días o menos, 5 días o menos, 4,5 días o menos o 4 días o menos).
En algunas divulgaciones del presente documento, el tiempo total transcurrido desde que (i) se coloca una población de ASC en un cultivo tridimensional, hasta que (ii) se produce una población de células inducidas que comprende células similares a hepatocitos inducidas (iHep), se encuentra en un intervalo de 12 horas a 13 días (por ejemplo, de 1 día a 13 días, de 2 días a 13 días, de 3 días a 13 días, de 4 días a 13 días, de 4,5 días a 13 días, de 5 días a 13 días, de 5,5 días a 13 días, de 6 días a 13 días, de 6,5 días a 13 días, de 7 días a 13 días, de 7,5 días a 13 días, de 8 días a 13 días, de 8,5 días a 13 días, de 9 días a 13 días, de 9,5 días a 13 días, de 10 días a 13 días, de 10,5 días a 13 días, de 11 días a 13 días, de 11,5 días a 13 días, de 12 horas a 12,5 días, de 1 día a 12,5 días, de 2 días a 12.5 días, de 3 días a 12,5 días, de 4 días a 12,5 días, de 4,5 días a 12,5 días, de 5 días a 12,5 días, de 5,5 días a 12.5 días, de 6 días a 12,5 días, de 6,5 días a 12,5 días, de 7 días a 12,5 días, de 7,5 días a 12,5 días, de 8 días a 12.5 días, de 8,5 días a 12,5 días, de 9 días a 12,5 días, de 9,5 días a 12,5 días, de 10 días a 12,5 días, de 10,5 días a 12,5 días, de 11 días a 12,5 días, de 11,5 días a 12,5 días, de 12 horas a 12 días, de 1 día a 12 días, de 2 días a 12 días, de 3 días a 12 días, de 4 días a 12 días, de 4,5 días a 12 días, de 5 días a 12 días, de 5,5 días a 12 días, de 6 días a 12 días, de 6,5 días a 12 días, de 7 días a 12 días, de 7,5 días a 12 días, de 8 días a 12 días, de 8,5 días a 12 días, de 9 días a 12 días, de 9,5 días a 12 días, de 10 días a 12 días, de 10,5 días a 12 días, de 11 días a 12 días, de 3 días a 11 días, de 3 días a 10 días, de 3 días a 9,5 días, de 3 días a 9 días, de 6 días a 10 días o de 4 días a 10 días).
Medio de cultivo celular basal. Las presentes células (por ejemplo, ASC, iHep, ASC en diferenciación, etc.) se cultivan en un medio nutriente líquido adecuado, citado en el presente documento como "medio de cultivo celular basal". Los medios de estadio 1 y estadio 2 son medio de cultivo basal suplementado con al menos un componente adicional, como se describe más adelante. Se encuentran disponibles varias formulaciones de medio basal (por ejemplo, medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM), RPMI, medio de Iscove, medio de cultivo de hepatocitos (Hc M) (Lonza, n.° de cat: cc-3198) etc.).
Cualquier medio de cultivo conveniente puede servir como medio de cultivo basal. Por ejemplo, un medio de cultivo tisular adecuado puede contener componentes, tales como una vitamina; un aminoácido (por ejemplo, un aminoácido esencial, un aminoácido no esencial, etc.); un agente tamponador del pH; una sal; un agente antimicrobiano (por ejemplo, un agente antibacteriano, un agente antimicótico, etc.); suero (por ejemplo, suero fetal bovino, suero humano, suero de ternero, suero de caballo, suero de cabra, etc.); una fuente de energía (por ejemplo, un azúcar); un nucleósido; un lípido; metales traza; una citocina; un factor de crecimiento; un factor estimulador; aditivos (por ejemplo, piruvato (0,1-5 mM), glutamina (0,5-5 mM), etc.) y similares. Puede usarse cualquier medio de cultivo celular conveniente y como es sabido en la técnica, diversos tipos celulares crecen mejor en preparaciones de medio particulares. Por ejemplo, en algunos casos, se han optimizado formulaciones de medios particulares para cultivar tipos de células específicos (por ejemplo, ASC, hepatocitos (medio de cultivo de hepatocitos (HCM) (Lonza, n.° de cat: cc-3198)), progenitores neurales, células madre embrionarias, etc.). Por consiguiente, puede usarse cualquier medio de cultivo celular conveniente como medio de cultivo basal y puede modificarse para el cultivo de ASC y/o su descendencia en diferenciación.
Un medio basal adecuado ilustrativo no limitante es RPMI (Roswel Park Memorial Institute) 1640, que es bien conocido en la técnica como medio basal que permite el cultivo de células de mamífero con suplementación de suero (suero fetal bovino (FBS)). Otro medio de cultivo basal adecuado es RPMI 1640 avanzado, que es similar al RPMI 1640 clásico, pero permite reducir la suplementación con suero en un 50-90 % sin cambio en la velocidad de crecimiento o la morfología. El RPMI 1640 avanzado puede contener, por ejemplo, glucosa, aminoácidos no esenciales, piruvato de sodio y rojo de fenol. La formulación completa se encuentra fácilmente disponible (por ejemplo, en línea) para un experto habitual en la materia para el RPMI 1640, para el RPMI 1640 avanzado y para diversos medios de cultivo basal disponibles comercialmente. Otro medio de cultivo basal adecuado es el medio de cultivo de hepatocitos (HCM™) de CLONETICS™ (disponible, por ejemplo, de Lonza - número de catálogo 3198).
Medio de estadio 1. El "medio de estadio 1" también se cita en el presente documento como "primer medio de cultivo". Un medio de estadio 1 adecuado es un medio de cultivo basal (por ejemplo, RPMI 1640 avanzado, RPMI 1640, etc.) adecuado para el cultivo de células (por ejemplo, ASC, ASC en diferenciación, etc.) suplementado con al menos activina A (por ejemplo, 100ng/ml) y un factor de crecimiento de fibroblastos (por ejemplo, FGF4, por ejemplo, 20 ng/ml). En algunos casos, el medio de estadio 1 incluye un agonista de la señalización de Wnt (por ejemplo, Wnt3a, por ejemplo, 50 ng/ml). En algunos casos, el medio de estadio 1 incluye un suplemento, tal como B27 (por ejemplo, al 20 %), que es conocido en la técnica. En algunos casos, un medio de estadio 1 incluye un agonista de señalización de Wnt y un suplemento (por ejemplo, B27). En algunos casos, el medio de cultivo basal usado para el medio de estadio 1 es RPMI 1640 avanzado y se suplementa con activina A (por ejemplo, 100 ng/ml), FGF4 (por ejemplo, 20 ng/ml), Wnt3a (por ejemplo, 50 ng/ml) y un 20 % de B27. En general, el medio de estadio 1 impulsa la diferenciación de las ASC hacia el linaje endodérmico.
Las activinas son proteínas diméricas que consisten en subunidades p, que se conectan mediante enlaces disulfuro. Existen tres formas diferentes de activina: (i) activina A homodimérica (2 subunidades Pa); (ii) activina B homodimérica (2 subunidades pB); y (iii) activina AB heterodimérica (1 subunidad pA y 1 subunidad pB). La expresión "activina A" como se usa en el presente documento, se refiere a un homodímero de subunidades Pa. Una subunidad Pa es el polipéptido también citado como "cadena A de inhibina beta" o "INHBA". La secuencia de aminoácidos de la cadena A de inhibina beta es:
MPLLWLRGFLLASCWIIVRSSPTPGSEGHSAAPDCPSCALAALPKDVPNSQPEMVEAVKK
HILNMLHLKKRPDVTQPVPKAALLNAIRKLHVGKVGENGYVEIEDDIGRRAEMNELMEQTS
EIITFAESGTARKTLHFEISKEGSDLSVVERAEVWLFLKVPKANRTRTKVTIRLFQQQKHPQ
GSLDTGEEAEEVGLKGERSELLLSEKWDARKSTWHVFPVSSSIQRLLDQGKSSLDVRIAC
EQCQESGASLVLLGKKKKKEEEGEGKKKGGGEGGAGADEEKEQSHRPFLMLQARQSED
HPHRRRRRGLECDGKVNICCKKQFFVSFKDIGWNDWIIAPSGYHANYCEGECPSHIAGTS
GSSLSFHSTVINHYRMRGHSPFANLKSCCVPTKLRPMSMLYYDDGQNIIKKDIQNMIVEEC
GCS (SEQ ID NO: 1)
En algunas divulgaciones del presente documento, uno de los presentes medios de estadio 1 comprende activina A a una concentración en un intervalo de aproximadamente 50 ng/ml a aproximadamente 150 ng/ml (por ejemplo, de aproximadamente 60 ng/ml a aproximadamente 140 ng/ml, de aproximadamente 70 ng/ml a aproximadamente 130 ng/ml, de aproximadamente 80 ng/ml a aproximadamente 120 ng/ml, de aproximadamente 85 ng/ml a aproximadamente 115 ng/ml, de aproximadamente 90 ng/ml a aproximadamente 110 ng/ml, de aproximadamente 95 ng/ml a aproximadamente 105 ng/ml, de aproximadamente 97,5 ng/ml a aproximadamente 102,5 ng/ml o aproximadamente 100 ng/ml).
Los factores de crecimiento de fibroblastos (FGF) son una familia de proteínas bien descrita (relacionadas por secuencia, estructura y función), con 18 miembros de mamífero. Los FGF se agrupan en 6 subfamilias basándose en las diferencias en la homología de secuencia y la filogenia: los FGF 1 y 2; los fGf 3, 7, 10 y 22; los FGF 4-6; los FGF 8, 17 y 18; los FGF 9, 16 y 20; y los FGF 19, 21 y 23. En algunos casos, un FGF adecuado es el FGF 1,2, 3, 4, 5, 6 , 7, 8, 9, 10, 16, 17, 18, 20 y/o 22. En algunos casos, un FGF adecuado es FGF4, FGF5 y/o FGF6. En algunos casos, un FGF adecuado es FGF4.
Las secuencias de aminoácidos de los FGF a modo de ejemplo son:
FGF1:
MAEGEITTFTALTEKFNLPPGNYKKPKLLYCSNGGHFLRILPDGTVDGTRDRSDQHIQLQ
LSAESVGEVYIKSTETGQYLAMDTDGLLYGSQTPNEECLFLERLEENHYNTYISKKHAEK
NWFVGLKKNGSCKRGPRTHYGQKAILFLPLPVSSD (SEQ ID NO: 2)
FGF2:
MVGVGGGDVEDVTPRPGGCQISGRGARGCNGIPGAAAWEAALPRRRPRRHPSVNPRSR AAGSPRTRGRRTEERPSGSRLGDRGRGRALPGGRLGGRGRGRAPERVGGRGRGRGTA APRAAPAARGSRPGPAGTMAAGSITTLPALPEDGGSGAFPPGHFKDPKRLYCKNGGFFLR IHPDGRVDGVREKSDPHIKLQLQAEERGVVSIKGVCANRYLAMKEDGRLLASKCVTDECFF FERLESNNYNTYRSRKYTSWYVALKRTGQYKLGSKTGPGQKAILFLPMSAKS
(SEQ ID NO: 3)
FGF3:
MGLIWLLLLSLLEPGWPAAGPGARLRRDAGGRGGVYEHLGGAPRRRKLYCATKYHLQLH PSGRVNGSLENSAYSILEITAVEVGIVAIRGLFSGRYLAMNKRGRLYASEHYSAECEFVER IHELGYNTYASRLYRTVSSTPGARRQPSAERLWYVSVNGKGRPRRGFKTRRTQKSSLFLP RVLDHRDHEMVRQLQSGLPRPPGKGVQPRRRRQKQSPDNLEPSHVQASRLGSQLEASA
H (SEQ ID NO: 4)
FGF4:
MSGPGTAAVALLPAVLLALLAPWAGRGGAAAPTAPNGTLEAELERRWESLVALSLARLPV AAQPKEAAVQSGAGDYLLGIKRLRRLYCNVGIGFHLQALPDGRIGGAHADTRDSLLELSPV ERGVVSIFGVASRFFVAMSSKGKLYGSPFFTDECTFKEILLPNNYNAYESYKYPGMFIALSK
NGKTKKGNRVSPTMKVTHFLPRL (SEQ ID NO: 5)
FGF5:
MSLSFLLLLFFSHLILSAWAHGEKRLAPKGQPGPAATDRNPRGSSSRQSSSSAMSSSSAS SSPAASLGSQGSGLEQSSFQWSPSGRRTGSLYCRVGIGFHLQIYPDGKVNGSHEANMLS VLEIFAVSQGIVGIRGVFSNKFLAMSKKGKLHASAKFTDDCKFRERFQENSYNTYASAIHR TEKTGREWYVALNKRGKAKRGCSPRVKPQHISTHFLPRFKQSEQPELSFTVTVPEKKKPP SPIKPKIPLSAPRKNTNSVKYRLKFRFG (SEQ ID NO: 6)
FGF6:
MALGQKLFITMSRGAGRLQGTLWALVFLGILVGMWPSPAGTRANNTLLDSRGWGTLLSR SRAGLAGEIAGVNWESGYLVGIKRQRRLYCNVGIGFHLQVLPDGRISGTHEENPYSLLEIST VERGWSLFGVRSALFVAMNSKGRLYATPSFQEECKFRETLLPNNYNAYESDLYQGTYIAL SKYGRVKRGSKVSPIMTVTHFLPRI (SEQ ID NO: 7)
FGF7:
MHKWILTWILPTLLYRSCFHIICLVGTISLACNDMTPEQMATNVNCSSPERHTRSYDYMEG GDIRVRRLFCRTQWYLRIDKRGKVKGTQEMKNNYNIMEIRTVAVGIVAIKGVESEFYLAMN KEGKLYAKKECNEDCNFKELILENHYNTYASAKWTHNGGEMFVALNQKGIPVRGKKTKKE QKTAHFLPMAIT (SEQ ID NO: 8)
FGF8:
MGSPRSALSCLLLHLLVLCLQAQEGPGRGPALGRELASLFRAGREPQGVSQQHVREQSL VTDQLSRRLIRTYQLYSRTSGKHVQVLANKRINAMAEDGDPFAKLIVETDTFGSRVRVRGA ETGLYICMNKKGKLIAKSNGKGKDCVFTEIVLENNYTALQNAKYEGWYMAFTRKGRPRKG SKTRQHQREVHFMKRLPRGHHTTEQSLRFEFLNYPPFTRSLRGSQRTWAPEPR
(SEQ ID NO: 9)
FGF9:
MAPLGEVGNYFGVQDAVPFGNVPVLPVDSPVLLSDHLGQSEAGGLPRGPAVTDLDHLKGI LRRRQLYCRTGFHLEIFPNGTIQGTRKDHSRFGILEFISIAVGLVSIRGVDSGLYLGMNE KGELYGSEKLTQECVFREQFEENWYNTYSSNLYKHVDTGRRYYVALNKDGTPREGTRTK RHQKFTHFLPRPVDPDKVPELYKDILSQS (SEQ ID NO: 10)
FGF10:
MWKWILTHCASAFPHLPGCCCCCFLLLFLVSSVPVTCQALGQDMVSPEATNSSSSSFSSP
SSAGRHVRSYNHLQGDVRWRKLFSFTKYFLKIEKNGKVSGTKKENCPYSILEITSVEIGV
VAVKAINSNYYLAMNKKGKLYGSKEFNNDCKLKERIEENGYNTYASFNWQHNGRQMYVAL NGKGAPRRGQKTRRKNTSAHFLPMVVHS (SEQ ID NO: 11)
FGF16:
MAEVGGVFASLDWDLHGFSSSLGNVPLADSPGFLNERLGQIEGKLQRGSPTDFAHLKGIL RRRQLYCRTGFHLEIFPNGTVHGTRHDHSRFGILEFISLAVGLISIRGVDSGLYLGMNER GELYGSKKLTRECVFREQFEENWYNTYASTLYKHSDSERQYYVALNKDGSPREGYRTKR HQKFTHFLPRPVDPSKLPSMSRDLFHYR (SEQ ID NO: 12)
FGF17:
MGAARLLPNLTLCLQLLILCCQTQGENHPSPNFNQYVRDQGAMTDQLSRRQIREYQLYSR TSGKHVQVTGRRISATAEDGNKFAKLIVETDTFGSRVRIKGAESEKYICMNKRGKLIGKPSG KSKDCVFTEIVLENNYTAFQNARHEGWFMAFTRQGRPRQASRSRQNQREAHFIKRLYQG QLPFPNHAEKQKQFEFVGSAPTRRTKRTRRPQPLT (SEQ ID NO: 13)
MYSAPSACTCLCLHFLLLCFQVQVLVAEENVDFRIHVENQTRARDDVSRKQLRLYQLYSRT
SGKHIQVLGRRISARGEDGDKYAQLLVETDTFGSQVRIKGKETEFYLCMNRKGKLVGKPD
GTSKECVFIEKVLENNYTALMSAKYSGWYVGFTKKGRPRKGPKTRENQQDVHFMKRYPK
GQPELQKPFKYTTVTKRSRRIRPTHPA (SEQ ID NO: 14)
FGF20:
MAPLAEVGGFLGGLEGLGQQVGSHFLLPPAGERPPLLGERRSAAERSARGGPGAAQLAH
LHGILRRRQLYCRTGFHLQILPDGSVQGTRQDHSLFGILEFISVAVGLVSIRGVDSGLYLG
MNDKGELYGSEKLTSECIFREQFEENWYNTYSSNIYKHGDTGRRYFVALNKDGTPRDGAR
SKRHQKFTHFLPRPVDPERVPELYKDLLMYT (SEQ ID NO: 15)
FGF22:
MRRRLWLGLAWLLLARAPDAAGTPSASRGPRSYPHLEGDVRWRRLFSSTHFFLRVDPGG
RVQGTRWRHGQDSILEIRSVHVGVWIKAVSSGFYVAMNRRGRLYGSRLYTVDCRFRERI
EENGHNTYASQRWRRRGQPMFLALDRRGGPRPGGRTRRYHLSAHFLPVLVS
(SEQ ID NO: 16)
En algunas divulgaciones del presente documento, uno de los presentes medios de estadio 1 comprende un FGF (por ejemplo, FGF4, FGF5, FGF6, etc.) a una concentración en un intervalo de 5 ng/ml a 50 ng/ml (por ejemplo, de 5 ng/ml a 40 ng/ml, de 10 ng/ml a 40 ng/ml, de 10 ng/ml a 30 ng/ml, de 15 ng/ml a 25 ng/ml, de 17,5 ng/ml a 22,5 ng/ml, 15 ng/ml, 17,5 ng/ml, 20 ng/ml, 22,5 ng/ml, 25 ng/ml o 30 ng/ml).
Agonista de la señalización de Wnt - En algunas divulgaciones del presente documento, un "medio de estadio 1" adecuado incluye un agonista de la señalización de Wnt. Un agonista de la señalización de Wnt desencadena la localización nuclear de p-catenina y da como resultado la activación de la señalización canónica de Wnt. Hay dos ramificaciones principales de la vía de señalización de Wnt: (1) la vía de señalización de Wnt canónica dependiente de p-catenina y (2) las vías no canónicas independientes de p-catenina, que incluyen la señalización de polaridad de célula planar (PCP), así como la señalización de calcio (Gao, et. al, Cell Signal. mayo de 2010;22(5):717-27. Epub 13 de diciembre de 2009). Como se usan en el presente documento, las expresiones "señalización de Wnt" y "señalización de Wnt/p-catenina" se usan indistintamente para hacer referencia a la vía de señalización de Wnt canónica dependiente de p-catenina. Como tal, un "agonista de señalización de Wnt" aumenta la producción de la vía de señalización de Wnt dependiente de p-catenina. La activación de la vía de Wnt culmina cuando la proteína pcatenina entra en el núcleo celular (para una revisión reciente de la vía de señalización de Wnt canónica dependiente de p-catenina véase Clevers et. al., Cell. 8 de junio de 2012;149(6):1192-205: Wnt/p-catenin signaling and disease). Sin embargo, en ausencia de señalización de Wnt, la p-catenina citosólica libre se incorpora en un complejo, conocido en la técnica como el complejo de destrucción de p-catenina, que incluye las proteínas axina, poliposis adenomatosa coli (APC) y glucógeno sintasa cinasa (GSK-3p). La fosforilación de p-catenina por GSK-3p marca el destino de la p-catenina hacia la vía de ubiquitina y la degradación por proteasomas (mediante pTRCP).
La unión de una Wnt canónica a su receptor (una proteína Frizzled) da lugar a la activación de las proteínas Dishevelled (Dvl), que inhiben la actividad de la glucógeno sintasa cinasa-3p (GSK-3p) (es decir, la fosforilación de p-catenina), que da lugar a la estabilización citosólica de la p-catenina. Posteriormente, la p-catenina estabilizada entra en el núcleo y se asocia con la familia de factores de transcripción TCF/lEF (factor de transcripción específico de linfocitos T / factor potenciador linfoide) para inducir la transcripción de importantes genes diana aguas abajo. Por lo tanto, en ausencia de señalización de Wnt, los niveles citosólicos (y por lo tanto nucleares) de p-catenina se mantienen bajos por medio de componentes reguladores negativos de la vía mientras están en presencia de señalización de Wnt, los niveles citosólicos (y por lo tanto nucleares) de p-catenina se estabilizan por medio de componentes reguladores positivos de la vía.
Por "componentes reguladores negativos" de la vía de Wnt, se hace referencia a proteínas que funcionan antagonizando la vía de Wnt, dando como resultado de este modo una producción de la vía reducida (es decir, expresión de gen diana reducida). Los ejemplos de componentes reguladores negativos conocidos de la vía de Wnt incluyen, pero no se limitan de ningún modo a: WIF, sFRP, Dkk, APCDD1, Notum, SOST, Axina, APC, GSK-3p, CK1y, WTX y pTrCP.
Por "componentes reguladores negativos" de la vía de Wnt, se hace referencia a proteínas que funcionan potenciando la vía de Wnt, dando como resultado de este modo una producción de la vía aumentada (es decir, expresión de gen diana aumentada). Los ejemplos de componentes reguladores positivos conocidos de la vía de Wnt incluyen, pero no se limitan de ningún modo a: Wnt (por ejemplo, Wnt1, Wnt3, Wnt3a, Wnt7a y/o Wnt8), Norrina, R-espondina, PORCN, Wls, Frizzled, LRP5 y LRP6, Tspan12, Lgr4, Lgr5, Lgr6, Dvl, p-catenina y TCF/lEF. En algunas divulgaciones del presente documento, uno de los presentes agonistas de la señalización de Wnt es un componente regulador positivo de la vía de señalización canónica de Wnt (por ejemplo, Wnt1, Wnt3, Wnt3a, Wnt7a, Wnt8, etc.).
En algunas divulgaciones del presente documento, uno de los presentes agonistas de la señalización de Wnt es "específico para" o "se une específicamente a" un componente de la vía de señalización de Wnt, de tal forma que la unión da como resultado una producción aumentada de la vía (es decir, transcripción de genes diana). La unión de un agonista puede estar mediada por interacciones covalentes o no covalentes o por una combinación de interacciones covalentes y no covalentes. Cuando la interacción del agonista con el componente al que se une específicamente produce un complejo unido de manera no covalente, la unión que se produce es normalmente electrostática, de unión de hidrógeno o el resultado de interacciones lipófilas. En particular, la unión específica se caracteriza por la unión preferencial de un miembro de un par a una especie particular en relación con otra especie dentro de la familia de compuestos a la que pertenece el miembro correspondiente del miembro de unión. Por lo tanto, por ejemplo, un agonista de la señalización de Wnt que es específico para el componente regulador negativo GSK-3 se une preferencialmente a GSK-3 en relación con otras proteínas en la célula.
Uno de los presentes agonistas de la señalización de Wnt es cualquier molécula (por ejemplo, un compuesto químico; un ácido nucleico no codificante, por ejemplo, un ARN no codificante; un polipéptido; un ácido nucleico que codifica un polipéptido, etc.) que da como resultado una producción aumentada (Es decir, expresión de gen diana aumentada) de la vía de señalización de Wnt. Por ejemplo, un agonista de la señalización de Wnt puede funcionar estabilizando, potenciando la expresión o potenciando la función de un componente regulador positivo de la vía o desestabilizando, reduciendo la expresión o inhibiendo la función de un componente regulador negativo de la vía. Por lo tanto, un agonista de la señalización de Wnt puede ser un componente polipeptídico regulador positivo (por ejemplo, Wnt3, wnt3a, Wnt1 y similares) y/o un ácido nucleico que codifica uno o más componentes reguladores positivos de la vía. Un agonista de la señalización de Wnt también puede ser una molécula pequeña o un ácido nucleico que estabiliza un componente regulador positivo de la vía ya sea a nivel de ARNm o de proteína.
En algunas divulgaciones del presente documento, un agonista de la señalización de Wnt funciona estabilizando a la p-catenina, permitiendo de este modo el aumento de los niveles nucleares de p-catenina. La p-catenina puede estabilizarse de múltiples modos diferentes. Debido a que múltiples componentes reguladores negativos de la vía de señalización de Wnt funcionan facilitando la degradación de la p-catenina, uno de los presentes agonistas de la señalización de Wnt puede ser un inhibidor de molécula pequeña o de ácido nucleico (por ejemplo, mircroARN, ARNhc, etc.) (que funciona a nivel de ARNm o proteína) de un componente regulador negativo de la vía. Por ejemplo, en algunas divulgaciones del presente documento, el agonista de la señalización de Wnt es un inhibidor de GSK-3p. En algunas de dichas divulgaciones en el presente documento, el inhibidor de GSK-3p es un compuesto químico de molécula pequeña (por ejemplo, TWS1I 9, BIO, CHIR-99021, SB 216763, SB 415286, CHIR-98014 y similares).
TWS119: 3-(6-(3-aminofenil)-7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-iloxi)fenol (Ding et. al, Proc Natl Acad Sci USA. 24 de junio de 2003;100(13):7632-7. Epub 6 de junio de 2003)
BIO: 6-bromo-3-[(3E)-1,3-dihidro-3-(hidroximino)-2H-indol-2-iliden]-1,3-dihidro-(3Z)-2H-indol-2-ona o (2'Z,3'E)-6-Bromoindirubin-3'-oxima
(Meijer et. al, Chem Biol. diciembre de 2003;10(12):1255-66)
CHIR-99021: 6-[[2-[[4-(2,4-diclorofenil)-5-(5-metil-1H-imidazol-2-il)-2-pirimidinil]amino]etil]amino]-3-pirimidincarbonitrilo
(Bennett et al., J Biol Chem. 23 de agosto de 2002;277(34):30998-1004. Epub 7 de junio de 2002)
Sb 216763: 3-(2,4-diclorofenil)-4-(1-metil-1H-indol-3-il)-lH-pirrol-2,5-diona (Cross et al., J Neurochem. abril de 2001;77(1):94-102)
SB 415286: 3-(3-cloro-4-hidroxifenilamino)-4-(2-nitrofenil)-1H-pirrol-2,5-diona (Cross et al., J Neurochem. abril de 2001;77(1):94-102)
CHIR-98014: N2-(2-(4-(2,4-diclorofenil)-5-(1H-imidazol-1-il)pirimidin-2-ilamino)etil)-5-nitropiridin-2,6-diamina
(Ring et al., Diabetes. marzo de 2003;52(3):588-95)
Puede usarse cualquier agonista de Wnt conveniente. En algunas divulgaciones del presente documento, el agonista de Wnt es Wnt3a. La secuencia de aminoácidos de Wnt3a humano es:
MAPLGYFLLLCSLKQALGSYPIWWSLAVGPQYSSLGSQPILCASIPGLVPKQLRFCRNYVEI
MPSVAEGIKIGIQECQHQFRGRRWNCTTVHDSLAIFGPVLDKATRESAFVHAIASAGVAFA
VTRSCAEGTAAICGCSSRHQGSPGKGWKWGGCSEDIEFGGMVSREFADARENRPDARS
AMNRHNNEAGRQAIASHMHLKCKCHGLSGSCEVKTCWWSQPDFRAIGDFLKDKYDSASE
MVVEKHRESRGWVETLRPRYTYFKVPTERDLVYYEASPNFCEPNPETGSFGTRDRTCNV
SSHGIDGCDLLCCGRGHNARAERRREKCRCVFHWCCYVSCQECTRVYDVHTCK
(SEQ ID NO: 17).
En algunos casos, uno de los presentes medios de estadio 1 comprende Wnt3a a una concentración en un intervalo de aproximadamente 20 ng/ml a aproximadamente 80 ng/ml (por ejemplo, de aproximadamente 20 ng/ml a aproximadamente 80 ng/ml, de aproximadamente 25 ng/ml a aproximadamente 75 ng/ml, de aproximadamente 30 ng/ml a aproximadamente 70 ng/ml, de aproximadamente 35 ng/ml a aproximadamente 65 ng/ml, de aproximadamente 40 ng/ml a aproximadamente 60 ng/ml, de aproximadamente 45 ng/ml a aproximadamente 55 ng/ml, de aproximadamente 47,5 ng/ml a aproximadamente 52,5 ng/ml o aproximadamente 50 ng/ml).
Medio de estadio 2. El "medio de estadio 2" también se cita en el presente documento como "segundo medio de cultivo". Un medio de estadio 2 adecuado es un medio de cultivo basal (por ejemplo, medio de cultivo de hepatocitos (HCM™), RPMI 1640 avanzado, RPMI 1640, etc.) adecuado para el cultivo de células (por ejemplo, ASC en diferenciación, hepatocitos, etc.) suplementado con al menos un factor de crecimiento de hepatocitos (HGF). En algunos casos, el medio de estadio 2 incluye un factor de crecimiento de fibroblastos (por ejemplo, FGF4, por ejemplo, 25 ng/ml).
En algunas divulgaciones del presente documento, un medio de estadio 2 incluye además un componente seleccionado entre: un FGF (por ejemplo, FGF4, por ejemplo, 25 ng/ml), oncostatina M (OSM, por ejemplo, 30 ng/ml), dexametasona (Dex, por ejemplo, 2x10-5 M), dimetilsulfóxido (DMSO, por ejemplo, al 0,1 %) y una combinación de los mismos. En algunos casos, el medio de cultivo basal usado para el medio de estadio 2 es CLONETICS™ (disponible, por ejemplo, de Lonza - número de catálogo 3198) y está suplementado con HGF (por ejemplo, 150 ng/ml), un FGF (por ejemplo, FGF4, por ejemplo, 25 ng/ml), oncostatina M (por ejemplo, 30 ng/ml), dexametasona (por ejemplo, 2x10-5 M) y DMSO (por ejemplo, al 0,1 %).
El factor de crecimiento de hepatocitos (HGF) es una proteína que funciona como un potente mitógeno, factor hepatotrófico y/o un factor de crecimiento. La secuencia de aminoácidos de HGF humano es:
MWVTKLLPALLLQHVLLHLLLLPIAIPYAEGQRKRRNTIHEFKKSAKTTLIKIDPALKIKTKKVN
TADQCANRCTRNKGLPFTCKAFVFDKARKQCLWFPFNSMSSGVKKEFGHEFDLYENKDYI
RNCIIGKGRSYKGTVSITKSGIKCQPWSSMIPHEHSFLPSSYRGKDLQENYCRNPRGEEGG
PWCFTSNPEVRYEVCDIPQCSEVECMTCNGESYRGLMDHTESGKICQRWDHQTPHRHK
FLPERYPDKGFDDNYCRNPDGQPRPWCYTLDPHTRWEYCAIKTCADNTMNDTDVPLETT
ECIQGQGEGYRGTVNTIWNGIPCQRWDSQYPHEHDMTPENFKCKDLRENYCRNPDGSE
SPWCFTTDPNIRVGYCSQIPNCDMSHGQDCYRGNGKNYMGNLSQTRSGLTCSMWDKNM
EDLHRHIFWEPDASKLNENYCRNPDDDAHGPWCYTGNPLIPWDYCPISRCEGDTTPTIVN
LDHPVISCAKTKQLRVVNGIPTRTNIGWMVSLRYRNKHICGGSLIKESWVLTARQCFPSRD
LKDYEAWLGIHDVHGRGDEKCKQVLNVSQLVYGPEGSDLVLMKLARPAVLDDFVSTIDLP
NYGCTIPEKTSCSVYGWGYTGLINYDGLLRVAHLYIMGNEKCSQHHRGKVTLNESEICAGA
EKIGSGPCEGDYGGPLVCEQHKMRMVLGVIVPGRGCAIPNRPGIFVRVAYYAKWIHKIILTY
KVPQS (SEQ ID NO: 18).
En algunas divulgaciones del presente documento, uno de los presentes medios de estadio 2 incluye HGF a una concentración en un intervalo de 75 ng/ml a 250 ng/ml (por ejemplo, de 100 ng/ml a 200 ng/ml, de 120 ng/ml a 180 ng/ml, de 125 ng/ml a 175 ng/ml, de 130ng/ml a 170ng/ml, de 135ng/ml a 165ng/ml, de 140ng/ml a 160 ng/ml, de 145 ng/ml a 155 ng/ml, 120 ng/ml, 125 ng/ml, 130 ng/ml, 135 ng/ml, 140 ng/ml, 145 ng/ml, 150 ng/ml, 155 ng/ml, 160 ng/ml o 175 ng/ml).
En algunas divulgaciones del presente documento, uno de los presentes medios de estadio 2 incluye un FGF (por ejemplo, FGF4) a una concentración en un intervalo de 5 ng/ml a 55 ng/ml (por ejemplo, de 5 ng/ml a 45 ng/ml, de 10 ng/ml a 45 ng/ml, de 10 ng/ml a 35 ng/ml, de 15 ng/ml a 35 ng/ml, de 20 ng/ml a 30 ng/ml, de 22,5 ng/ml a 27,5 ng/ml, 15 ng/ml, 17,5 ng/ml, 20 ng/ml, 22,5 ng/ml, 25 ng/ml, 27,5 ng/ml o 30 ng/ml).
La oncostatina M (OSM) es un polipéptido que funciona como una citocina y pertenece al grupo de citocinas de la interleucina 6. La secuencia de aminoácidos de OSM humana es:
MGVLLTQRTLLSLVLALLFPSMASMAAIGSCSKEYRVLLGQLQKQTDLMQDTSRLLDPYIRI
QGLDVPKLREHCRERPGAFPSEETLRGLGRRGFLQTLNATLGCVLHRLADLEQRLPKAQD
LERSGLNIEDLEKLQMARPNILGLRNNIYCMAQLLDNSDTAEPTKAGRGASQPPTPTPASD
AFQRKLEGCRFLHGYHRFMHSVGRVFSKWGESPNRSRRHSPHQALRKGVRRTRPSRKG
KRLMTRGQLPR (SEQ ID NO: 19)
En algunas divulgaciones del presente documento, uno de los presentes medios de estadio 2 incluye oncostatina M (OSM) a una concentración en un intervalo de 10 ng/ml a 50 ng/ml (por ejemplo, de 15 ng/ml a 45 ng/ml, de 20 ng/ml a 40 ng/ml, de 22,5 ng/ml a 37,5 ng/ml, de 25 ng/ml a 35 ng/ml, de 27,5 ng/ml a 32,5 ng/ml, 25 ng/ml, 27,5 ng/ml, 30 ng/ml, 32,5 ng/ml o 35 ng/ml).
La dexametasona (Dex) es un miembro sintético de la clase de fármacos esteroides glucocorticoides que tiene propiedades antiinflamatorias e inmunosupresoras. La Dex también se conoce como (11p,16a)-9-fluoro-11,17,21-trihidroxi-16-metil-pregna-1,4-dieno-3,20-diona, 9a-fluoro-16a-metil-11p,17a,21-trihidroxi-1,4-pregnadieno-3,20-diona, 9a-fluoro- 16a-metilprednisolona y prednisolona F. La Dex tiene el número CAS 50-02-2 y la estructura química:
Figure imgf000022_0001
En algunas divulgaciones del presente documento, uno de los presentes medios de estadio 2 comprende dexametasona (Dex) a una concentración en un intervalo de 1x10-6 M a 1x10-4 M (por ejemplo, de 5x10-6 a 5x10-5 M, de 1x10-5 M a 3x10-5 M, de 1,5x10-5 M a 2,5x10-5 M o 2X10-5 M).
El dimetilsulfóxido (DMSO) es un compuesto de organoazufre con la fórmula (CH3)2SO que es un líquido incoloro y es un disolvente aprótico polar que disuelve compuestos tanto polares como no polares. El DMSO también se conoce como sulfóxido de metilo, tiene el número CAS 67-68-5 y tiene la estructura química:
O II
h3c.s. ch3
En algunas divulgaciones del presente documento, uno de los presentes medios de estadio 2 comprende DMSO a una concentración en un intervalo del 0,01 % al 1 % (por ejemplo, del 0,025 % al 0,5 %, del 0,05 % al 0,2 % o del 0,1 %).
Células similares a hepatocitos. La expresión "célula similar a hepatocitos", como se usa en el presente documento, se refiere a una célula (por ejemplo, de una población celular, por ejemplo, una célula que se induce de acuerdo con los presentes métodos) que es positiva para (es decir, exhibe) una o más características de los hepatocitos. Las características de los hepatocitos (es decir, características de las células similares a hepatocitos) incluyen, pero sin limitación:
(i) expresión de (es decir, positividad para) uno o más marcadores de hepatocitos (por ejemplo, glucosa-6-fosfatasa, albúmina (ALB), alfa-1-antitripsina (AAT, también conocido como SERPINA1), citoqueratina 8 (CK8), citoqueratina 18 (CK18), citoqueratina 8/18 (CK8/18), receptor 1 de asialoglucoproteínas (ASGR1), alcohol deshidrogenasa 1, arginasa de tipo I, citocromo p450 3A4 (CYP3A4), transportador de aniones orgánicos específico de hígado (LST-1), proteína A2 de la caja de forkhead (FoxA2), alfa-fetoproteína (AFP), triptófano 2,3-dioxigenasa (TDO2) o una combinación de los mismos);
(ii) actividad de enzimas hepáticas, tales como glucosa-6-fosfatasa, CYP3A4 y/o CYP1A1;
(iii) producción y/o secreción de productos hepáticos (por ejemplo, medidos en fluidos corporales, tales como sangre, suero, plasma, etc.) (por ejemplo, bilis, urea y/o albúmina);
(iv) exhibición de propiedades metabólicas de hepatocitos (por ejemplo, capacidad de detoxificar agentes xenobióticos; endocitosis de LDL, síntesis de glucógeno, actividad de detoxificación de citocromo P450 1A2 y similares);
(v) exhibición de características morfológicas de hepatocitos;
(vi) capacidad para injertarse en el hígado de un individuo inmunodeficiente (por ejemplo, un ratón, un ser humano, etc.); y
(vii) ausencia de expresión de (negativas para) uno o más marcadores de no hepatocitos (por ejemplo, marcadores de adipocitos, por ejemplo, CD37, CD29, etc.; marcadores de ASC, por ejemplo, documento CD105; y similares).
Una de las presentes células similares a hepatocitos no tiene por qué ser positiva para todas las características de hepatocitos ensayadas para que la célula se considere una célula similar a hepatocitos. Por ejemplo, en algunos casos, una de las presentes células similares a hepatocitos es positiva para todas las características de hepatocitos evaluadas. Sin embargo, en algunos casos, una de las presentes células similares a hepatocitos es positiva para una o más características de hepatocitos; y también es negativa para una o más de las características de hepatocitos. En algunos casos (descritos en más detalle más adelante), se trasplanta una de las células similares a hepatocitos a un individuo. En dichos casos, la célula similar a hepatocitos puede ser (i) positiva para todas las características de hepatocitos evaluadas; o (ii) positiva para una o más de las características de hepatocitos; y negativa para una o más de las características de hepatocitos.
Por lo tanto, en algunos casos, las células similares a hepatocitos no expresan todos los marcadores de hepatocitos conocidos y/o arrojan resultados de ensayo positivos para todas las pruebas funcionales de hepatocitos. Por ejemplo, en algunos casos, las células similares a hepatocitos que se inducen de acuerdo con los presentes métodos no expresan ASGR1. Sin embargo, como se demuestra en la sección de ejemplos más adelante (por ejemplo, la figura 3C), en algunos casos, las células similares a hepatocitos muestran una característica de hepatocitos (por ejemplo, expresan un marcador de hepatocitos, tal como ASGR1) después del trasplante (por ejemplo, en un individuo, tal como un ratón y/o un ser humano) que no mostraban antes del trasplante. Por ejemplo, en algunos casos, las células similares a hepatocitos que se inducen de acuerdo con los presentes métodos no expresan el marcador de hepatocitos ASGR1 antes del trasplante a un individuo, pero expresan ASGR1 después del trasplante. Por lo tanto, en algunos casos, no es necesario que las células similares a hepatocitos inducidas de acuerdo con los presentes métodos muestren todas las características de hepatocitos conocidas (por ejemplo, producción de un producto hepático, expresión de un marcador de hepatocitos, etc.) o incluso mostrar todas las características de hepatocitos ensayadas antes del uso de las células para el trasplante. Por ejemplo, en algunos casos, las células similares a hepatocitos que se inducen de acuerdo con los presentes métodos son positivas para una o más características de hepatocitos y son negativas para una o más características de hepatocitos, pero se siguen considerando células similares a hepatocitos y pueden seguir trasplantándose a un individuo.
En algunas divulgaciones del presente documento, los presentes métodos incluyen la etapa de verificar la presencia de células similares a hepatocitos (iHep) en la población de células inducidas. La verificación puede basarse en fenotipos celulares (por ejemplo, expresión génica o de proteínas, perfil de metabolismo de fármacos, sensibilidad a fármacos particulares, etc.) conocidos en la técnica como característicos de hepatocitos. Por ejemplo, la verificación puede llevarse a cabo evaluando una cualquiera o más de las características de hepatocitos enunciadas anteriormente (por ejemplo, expresión de un marcador de hepatocitos, ausencia de expresión de un marcador de no hepatocitos, producción y/o secreción de un producto hepático, actividad de una enzima hepática, posesión de una propiedad metabólica de hepatocitos, etc.). En algunos casos, la verificación comprende determinar el porcentaje de células de la población de células inducidas que son iHep.
En algunas divulgaciones del presente documento, la verificación incluye poner en contacto las células de la población de células inducida con un agente de unión específico (por ejemplo, una sonda de ácido nucleico, un anticuerpo, etc.) específico para un marcador de hepatocitos (por ejemplo, ARNm, proteína, etc.) y determinar el porcentaje de células positivas para la expresión, en donde las células positivas para la expresión son iHep. Los marcadores adecuados se han listado anteriormente. En algunas divulgaciones del presente documento, la verificación incluye poner en contacto la población de células inducida con un agente de unión (por ejemplo, una sonda de ácido nucleico, un anticuerpo, etc.) específico para un marcador de no hepatocitos (por ejemplo, ARNm, proteína, etc.) y determinar el porcentaje de células negativas para la expresión, en donde las células negativas para la expresión son iHep. Los marcadores adecuados se han listado anteriormente. En algunos casos, se determina que un 10 % o más de las células de la población de células inducidas son iHep (por ejemplo, un 10,5 % o más, un 11 % o más, un 12,5 % o más, un 15 % o más, un 17,5 % o más, un 20 % o más, un 22,5 % o más, un 25 % o más, un 27,5 % o más, un 30 % o más, un 32,5 % o más, un 35 % o más, un 37 % o más, un 40 % o más, un 45 % o más, un 50 % o más, un 55 % o más, un 60 % o más, un 65 % o más, un 70 % o más, un 75 % o más, un 80 % o más, un 85 % o más, un 90 % o más, un 95 % o más, un 98 % o más, un 99 % o más o un 100 %). En algunas divulgaciones del presente documento, el porcentaje de células de la población de células inducidas que se determina que son iHep se encuentra en un intervalo de un 10 % a un 100 % (por ejemplo, de un 10 % a un 90 %, de un 10 % a un 80 %, de un 10 % a un 70 %, de un 10 % a un 60 %, de un 10 % a un 50 %, de un 10 % a un 45 %, de un 10 % a un 100 %, de un 40 % a un 100 %, de un 10 % a un 37,5 %, de un 10 % a un 37 %, de un 15 % a un 90 %, de un 15 % a un 80 %, de un 15 % a un 70 %, de un 15 % a un 60 %, de un 15 % a un 50 %, de un 15 % a un 45 %, de un 15 % a un 100 %, de un 40 % a un 100 %, de un 15 % a un 37,5 %, de un 15 % a un 37 %, de un 20 % a un 90 %, de un 20 % a un 80 %, de un 20 % a un 70 %, de un 20 % a un 60 %, de un 20 % a un 50 %, de un 20 % a un 45 %, de un 20 % a un 100 %, de un 40 % a un 100 %, de un 20 % a un 37,5 %, de un 20 % a un 37 %, de un 25 % a un 90 %, de un 25 % a un 80 %, de un 25 % a un 70 %, de un 25 % a un 60 %, de un 25 % a un 50 %, de un 25 % a un 45 %, de un 25 % a un 100 %, de un 40 % a un 100 %, de un 25 % a un 37,5 %, de un 25 % a un 37 %, de un 30 % a un 90 %, de un 30 % a un 80 %, de un 30 % a un 70 %, de un 30 % a un 60 %, de un 30 % a un 50 %, de un 30 % a un 45 %, de un 30 % a un 100 %, de un 40 % a un 100 %, de un 30 % a un 37,5 % o de un 30 % a un 37 %).
Los expertos en la materia entenderán que los niveles de expresión reflejan cantidades detectables del marcador (por ejemplo, ácido nucleico o proteína) sobre y/o dentro de la célula. Una célula que es negativa para la tinción (por ejemplo, el nivel de unión de un reactivo específico para un marcador no es diferente de manera detectable respecto de un control emparejado) puede aun así expresar cantidades menores del marcador. Aunque en la técnica es frecuente hacer referencia a las células como "positivas" o "negativas" para un marcador particular, los niveles de expresión reales son rasgos cuantitativos. El número de moléculas detectadas puede variar en varios grados logarítmicos, y aun así caracterizarse como "positivas".
Cuando se usa una proteína marcadora, puede monitorizarse la intensidad de la tinción (por ejemplo, de un anticuerpo específico para un marcador) mediante citometría de flujo, donde los láseres detectan los niveles cuantitativos de fluorocromo (que son proporcionales a la cantidad de marcador celular al que se unen los reactivos específicos, por ejemplo, anticuerpos). La citometría de flujo o FACS, también puede usarse para separar poblaciones celulares basándose en la intensidad de la unión a un reactivo específico, así como otros parámetros, tales como el tamaño celular y la dispersión de luz. Aunque el nivel absoluto de tinción puede diferir con un fluorocromo y una preparación de reactivo particular, los datos pueden normalizarse a un control.
A fin de normalizar la distribución respecto de un control, cada célula se registra como un punto de datos que tiene una intensidad de tinción particular. Estos puntos de datos pueden presentarse de acuerdo con una escala logarítmica, donde la unidad de medición es una intensidad de tinción arbitraria. En un ejemplo, las células con una tinción más brillante en una muestra pueden tener una intensidad tan elevada como de 4 log mayor que las células no teñidas. Cuando se presentan de esta manera, resulta evidente que las células que se encuentran en el mayor grado logarítmico de intensidad de tinción son positivas, mientras que aquellas en el de menor intensidad son negativas. Las células con tinción positiva "baja" tienen un nivel de tinción más brillante que las de un control de isotipo emparejado, pero no son tan intensas como las células con tinción más brillante normalmente halladas en la población. Un control alternativo puede utilizar un sustrato que tiene una densidad definida de marcador sobre su superficie, por ejemplo, una perla fabricada o una línea celular, que proporciona la intensidad del control positivo.
Enriquecimiento de células similares a hepatocitos. Para aumentar la fracción de células obtenidas que son iHep, normalmente resulta ventajoso enriquecer respecto de (es decir, purificar) las iHep producidas. En aspectos particulares, las células similares a hepatocitos proporcionadas en el presente documento pueden seleccionarse o enriquecerse usando un casete de expresión indicador de exploración o de selección que comprende un elemento regulador transcripcional específico de hepatocitos maduros unido operativamente a un gen indicador o mediante clasificación celular (por ejemplo, clasificación celular magnética, clasificación celular activadas por fluorescencia (FACS) y similares) usando un anticuerpo contra un marcador específico de hepatocitos (por ejemplo, un antígeno de la superficie celular, tal como ASGR1).
Para ayudar en la selección o el enriquecimiento, las ASC, pueden comprender un casete de expresión indicador de selección o de exploración que comprende un gen indicador. El casete de expresión indicador puede comprender un elemento regulador transcripcional específico de hepatocitos unido operativamente a un gen indicador (por ejemplo, cualquiera de las proteínas fluorescentes, por ejemplo, azul, amarilla, roja, verde, etc.). Los ejemplos no limitantes de elementos reguladores transcripcionales específicos de hepatocitos incluyen un promotor de glucosa-6-fosfatasa, albúmina (ALB), alfa-1-antitripsina (AAT, también conocida como SERPINA1), citoqueratina 8 (CK8), citoqueratina 18 (CK18), receptor 1 de asialoglucoproteínas (ASGR1), alcohol deshidrogenasa 1, arginasa de tipo I, citocromo p450 3A4 (CYP3A4), transportador de aniones orgánicos específico de hígado (LST-1), proteína a 2 de la caja de forkhead (FoxA2), alfa fetoproteína (AFP) y triptófano 2,3-dioxigenasa (TDO2).
El enriquecimiento usando anticuerpos (por ejemplo, clasificación celular magnética, FACS y similares) específicos para marcadores de la superficie celular de las a Sc (por ejemplo, CD29, CD34, CD36, CD49f, CD73, CD90 (Thy-1), CD105, CD133, c-kit, c-met y similares), células precursoras endodérmicas (por ejemplo, SOX17), células precursoras/progenitoras de hepatocitos (por ejemplo, N-cadherina, E-cadherina, EpCAM y NCAM) y/o hepatocitos (por ejemplo, ASGR1) tienen la ventaja de no requerir la modificación genética de las células para su enriquecimiento. La clasificación celular magnética y mediante FACS tiene la capacidad de analizar múltiples marcadores de la superficie de manera simultánea y pueden usarse para clasificar ASC, células precursoras endodérmicas, células precursoras/progenitoras de hepatocitos y/o hepatocitos (por ejemplo, iHep) basándose en la expresión de un marcador de la superficie celular. En algunos casos, las iHep no expresan ASGR1. Sin embargo, en algunos casos, por ejemplo, en caso de que se cultiven durante más tiempo y/o se diferencien adicionalmente, las iHep expresan ASGR1. En los casos donde las células que (i) no expresan ASGR1; y/o (ii) expresan marcadores de células precursoras de hepatocitos y/o células precursoras endodérmicas, se administran a un individuo, las células pueden diferenciarse adicionalmente después de la administración al individuo (como se demuestra en la sección de ejemplos más adelante).
En algunos casos, las células que se producen mediante los presentes métodos pueden enriquecerse (por ejemplo, clasificarse) usando un marcador expresado en la superficie celular. Por ejemplo, las células de la población de células precursoras (por ejemplo, ASC que se han puesto en contacto con un medio de estadio 1) y/o las células de la población de células inducidas (por ejemplo, células de la población de células precursoras que se han puesto en contacto con medio de estadio 2) pueden enriquecerse usando cualquier marcador que se expresa por las células precursoras/progenitoras de hepatocitos (por ejemplo, N-cadherina, E-cadherina, EpCAM y NCAM) y/o células precursoras endodérmicas (por ejemplo, SOX17). Las células de la población celular inducida (por ejemplo, células de la población de células precursoras que se han puesto en contacto con medio de estadio 2) pueden enriquecerse usando cualquier marcador que se expresa por las células precursoras/progenitoras de hepatocitos (por ejemplo, N-cadherina, E-cadherina, EpCAM, NCAM, etc.), células precursoras endodérmicas (por ejemplo, SOX17) y/o hepatocitos (por ejemplo, ASGR1) antes de su cultivo adicional (por ejemplo, para facilitar la diferenciación adicional) y/o antes de la administración a un individuo. Una población de células que incluye ASC (por ejemplo, una población de células procedentes de una liposucción) pueden enriquecerse respecto de ASC usando marcadores de la superficie celular de ASC (por ejemplo, CD29, CD34, CD36, CD49f, CD73, CD90 (Thy-1), CD105, CD133, c-kit, cmet y similares).
Criopreservación. En algunas divulgaciones del presente documento, las presentes células (por ejemplo, iHep) se conservan para su uso futuro. Específicamente, las iHep pueden criopreservarse llevando a cabo las siguientes etapas: (i) Desprender las células de la superficie de crecimiento celular, (ii) enjuagar las células (por ejemplo, lavado con PBS mediante centrifugación), (iii) resuspender las células (por ejemplo, sedimento celular) en medio con DMSO al 10% y (vi) congelar las células y almacenarlas en nitrógeno líquido usando técnicas de cultivo tisular convencionales comúnmente usadas en la técnica para conservar células. Las células pueden congelarse a 1-50 millones de células por vial. Cuando están listas para su uso, las iHep se deben descongelar de un modo comúnmente conocido en la técnica para descongelar células cultivadas congeladas.
Métodos de tratamiento
Los aspectos de la divulgación incluyen métodos para tratar a un individuo. Los presentes métodos de tratamiento incluyen generalmente producir una población de células similares a hepatocitos a partir de una población de células madre procedentes de tejido adiposo (por ejemplo, usando los métodos descritos anteriormente) y administrar (por ejemplo, inyectar, trasplantar, etc.) un número eficaz de células similares a hepatocitos en un individuo. Las ASC pueden proceder de cualquier fuente y pueden obtenerse mediante cualquier método conveniente. Los métodos a modo de ejemplo para aislar/extraer/obtener ASC se han descrito anteriormente. En algunos casos, las ASC son autólogas (es decir, del mismo individuo al que se van a administrar las iHep) (por ejemplo, para reducir la posibilidad y/o la gravedad de una respuesta inmunitaria). En algunos casos, las ASC son de un individuo relacionado (por ejemplo, para reducir la posibilidad y/o gravedad de una respuesta inmunitaria). En algunos casos, las ASC proceden de un individuo no relacionado. En algunos casos, las ASC proceden de un individuo de otra especie (por ejemplo, ASC humanas administradas a un ratón).
Los términos "tratamiento", "que trata", "tratar" y similares se usan en el presente documento para hacer referencia generalmente a la obtención de un efecto farmacológico y/o fisiológico deseado. El efecto puede ser profiláctico en cuanto a la prevención completa o parcial de una enfermedad o de los síntomas de la misma y/o puede ser terapéutico en cuanto a la estabilización o curación parcial o completa para una enfermedad y/o un efecto adverso atribuible a la enfermedad. El término "tratamiento" abarca cualquier tratamiento de una enfermedad en un mamífero, particularmente un ser humano, e incluye: (a) prevenir que aparezca la enfermedad y/o los síntomas en un sujeto que puede tener predisposición a la enfermedad o los síntomas pero al que aún no se le ha diagnosticado que la tenga; (b) inhibir la enfermedad y/o los síntomas, es decir, detener el desarrollo de una enfermedad y/o los síntomas asociados; o (c) aliviar la enfermedad y los síntomas asociados, es decir, provocar la regresión de la enfermedad y/o los síntomas. Aquellos que necesitan tratamiento pueden incluir aquellos ya afectados (por ejemplo, aquellos con insuficiencia hepática, enfermedad hepática, daño hepático, etc.), así como aquellos en los que se desea la prevención.
Los términos "receptor", "individuo", "sujeto", "hospedador" y "paciente", se usan indistintamente en el presente documento y hacen referencia a cualquier sujeto mamífero para el que se desea el diagnóstico, el tratamiento o la terapia, en particular en seres humanos. "Mamífero" a efectos del tratamiento, se refiere a cualquier animal clasificado como mamífero, incluyendo seres humanos, animales domésticos y de granja y animales de zoológico, de deporte o de compañía, tales como perros, caballos, gatos, vacas, ovejas, cabras, cerdos, camellos, etc. En algunas divulgaciones del presente documento, el mamífero es un ser humano.
Un tratamiento terapéutico es uno en el que el sujeto está afectado antes de la administración y un tratamiento profiláctico es uno en el que el sujeto no está afectado antes de la administración. En algunas divulgaciones del presente documento, el sujeto tiene una probabilidad aumentada de verse afectado o se sospecha que está afectado antes del tratamiento. En algunas divulgaciones del presente documento, se sospecha que el sujeto tiene una probabilidad aumentada de verse afectado.
En algunas divulgaciones del presente documento, el individuo que se va a tratar es un individuo con función hepática reducida (por ejemplo, un sujeto con daño hepático). La expresión "daño hepático", como se usa en el presente documento, se refiere a cualquier daño (por ejemplo, causado por una enfermedad, traumatismo, sin explicación, etc.) que dé como resultado una función hepática reducida. Un individuo con función hepática reducida (por ejemplo, reducida en relación con el nivel o la función basal del individuo; reducida en relación con un individuo sano de una edad, peso, sexo, etc. comparable; y similares) se cita en el presente documento como un individuo con un hígado dañado (es decir, un individuo con daño hepático). Por lo tanto, las expresiones "daño hepático" y "función hepática reducida" se usan como sinónimos en el presente documento. En algunos casos, un individuo con "daño hepático" es un individuo con enfermedad hepática.
La causa de la función hepática reducida puede ser conocida o desconocida. El modo para determinar si un individuo dado tiene función hepática reducida (y por lo tanto, también cómo determinar si un individuo que recibe tratamiento está recuperando o ha recuperado la función hepática) será conocido por un experto habitual en la materia. Las pruebas de función hepática pueden incluir análisis de enzimas hepáticas, también conocidas como pruebas de función hepática (LFT), un grupo de análisis de sangre que detectan la inflamación y el daño en el hígado. Los marcadores proteicos en sangre de daño hepático pueden incluir, por ejemplo: aspartato aminotransferasa (AST) aumentada, también conocida como SGOT; alanina aminotransferasa (ALT) aumentada, también conocida como SGPT; fosfatasa alcalina aumentada; nucleotidasa 5' aumentada; albúmina reducida; globulina reducida; y gamma-glutamil transpeptidasa (GGT) aumentada. En caso de que, por ejemplo, se detecten en sangre cantidades (y/o actividades) elevadas de los marcadores proteicos anteriores (o un nivel reducido de albúmina y/o globulina), puede haber presencia de daño hepático. Las pruebas de función hepática adicionales incluyen: (i) tiempo de protrombina (PT), una prueba del tiempo que tarda una muestra de sangre en coagular (por ejemplo, en caso de que haya niveles reducidos de factores de coagulación, el tiempo de protrombina es mayor), que puede comunicarse como índice internacional normalizado (INR) (una forma estandarizada para que los laboratorios comuniquen el PT, de tal forma que los resultados pueden compararse con precisión entre distintos laboratorios); y (ii) una prueba de bilirrubina: los niveles sanguíneos de bilirrubina pueden estar elevados en personas con flujo biliar deteriorado, lo que puede producirse en la enfermedad hepática grave, la enfermedad de vesícula biliar u otras afecciones del sistema biliar.
Los ejemplos de síntomas, enfermedades y/o afecciones que pueden considerarse indicativas de "daño hepático" (y que pueden tratarse mediante el trasplante de las presentes células similares a hepatocitos inducidas en un individuo que tiene los síntomas, la enfermedad y/o la afección), incluyen, pero sin limitación: insuficiencia hepática aguda, enfermedad hepática relacionada con el alcohol, síndrome de Alagille, deficiencia en alfa 1 -antitripsina, enfermedad hidatídica alveolar, hepatitis autoinmunitaria, púrpura bacilar, atresia biliar, síndrome de Budd-Chiari, enfermedad hepática crónica, cirrosis, fibrosis hepática congénita, hepatopatía congestiva, lipidosis hepática, galactosemia, ectasia vascular antral gástrica, síndrome de Gilbert, hemocromatosis, hepatitis (A, B y/o C), encefalopatía hepática, enfermedades hepatobiliares, hepatolitiasis, síndrome hepatopulmonar, síndrome hepatorrenal, hepatoesplenomegalia, hepatotoxicidad, carcinoma hepatocelular, encefalopatía hepática, ictericia, cirrosis de Laennec, absceso hepático, quiste hepático, cáncer de hígado, insuficiencia hepática, síndrome de Lyngstadaas, enfermedad del hígado graso no alcohólico, enfermedad hepática terminal pediátrica, púrpura hepática, enfermedad hepática poliquística, cirrosis biliar primaria, colangitis esclerosante primaria (PSC), colestasis intrahepática familiar progresiva, síndrome de Reye, enfermedad de almacenamiento de glucógeno de tipo I, hepatitis vírica, enfermedad de Wilson, infarto de Zahn y síndrome de Zieve.
En algunos casos, las iHep se cultivan durante un periodo de tiempo antes del trasplante (por ejemplo, en HCM™ durante 2 días). Las células (por ejemplo, iHep) pueden proporcionarse al individuo (es decir, administrarse al individuo) solas o con un sustrato o matriz adecuado, por ejemplo, para soportar su crecimiento y/u organización en el tejido al que se están trasplantando (por ejemplo, hígado). En algunas divulgaciones del presente documento, la matriz es un armazón (por ejemplo, un armazón de órgano). En algunas divulgaciones del presente documento, se administrarán (por ejemplo, trasplantarán) 1x103 o más células, por ejemplo, 5x103 o más células, 1x104 o más células, 5x104 o más células, 1x105 o más células, 5x105 o más células, 1 x 106 o más células, 5x106 o más células, 1x107 o más células, 5x107 o más células, 1x108 o más células, 5x108 o más células, 1 x 109 o más células, 5x109 o más células o 1x1010 o más células. En algunas divulgaciones del presente documento, las presentes células se administran al individuo sobre microtransportadores (por ejemplo, células cultivadas sobre microtransportadores biodegradables).
Las células inducidas mediante los presentes métodos (iHep) pueden administrarse en cualquier excipiente fisiológicamente aceptable (por ejemplo, medio E de Williams), donde las células pueden encontrar un sitio adecuado para su supervivencia y función (por ejemplo, reconstitución del órgano). Las células pueden introducirse mediante cualquier método conveniente (por ejemplo, inyección, catéter o similares).
Las células pueden introducirse en el sujeto (es decir, administrarse al individuo) por cualquiera de las siguientes vías: parenteral, subcutánea, intravenosa, intracraneal, intraespinal, intraocular o en el líquido cefalorraquídeo. Las células pueden introducirse mediante inyección (por ejemplo, inyección local directa), catéter o similares. Los ejemplos de métodos de suministro local (por ejemplo, suministro al hígado) incluyen, por ejemplo, mediante inyección en bolo, por ejemplo, mediante una jeringa, por ejemplo, en una articulación u órgano; por ejemplo, mediante infusión continua, por ejemplo, mediante canulación, por ejemplo, con convección (véase, por ejemplo, la Solicitud de los Estados Unidos n.° 20070254842); o implantando un dispositivo sobre el que se han fijado de manera reversible las células (véanse, por ejemplo, las Solicitudes de los Estados Unidos n.° 20080081064 y 20090196903).
En algunos casos, las iHep se administran a un individuo mediante inyección hepática guiada por ultrasonidos. De esta manera, las células pueden colocarse directamente en un lóbulo hepático (por ejemplo, en seres humanos o incluso en ratones usando un sistema de ultrasonidos para animales pequeños). Puede usarse el modo de brillantez (modo B) para tomar imágenes bidimensionales de un área de interés con un transductor y las células pueden inyectarse en solución (por ejemplo, de 100 pl a 300 pl, por ejemplo, 200 pl de, por ejemplo, medio E de William) en un sitio o diversos sitios (por ejemplo, 1-30 sitios) en el hígado usando, por ejemplo, una guja del calibre 30G. El número de administraciones del tratamiento a un sujeto puede variar. La introducción de células en un individuo puede ser un evento único; pero en ciertas situaciones, dicho tratamiento puede proporcionar una mejora durante un periodo de tiempo limitado y requerir una serie continua de tratamientos repetidos. En otras situaciones, pueden ser necesarias múltiples administraciones de iHep antes de que se observe un efecto. Como entenderá fácilmente un experto habitual en la materia, los protocolos exactos dependen de la enfermedad o afección, el estadio de la enfermedad y los parámetros del individuo que se esté tratando.
Una "dosis terapéuticamente eficaz" o "dosis terapéutica" es una cantidad suficiente para efectuar los resultados clínicos deseados (es decir, lograr eficacia terapéutica). Puede administrarse una dosis terapéuticamente eficaz en una o más administraciones. A efectos de la presente divulgación, una dosis terapéuticamente eficaz de iHep es una cantidad que es suficiente, cuando se administra a (por ejemplo, se trasplanta en) el individuo, para paliar, mejorar, estabilizar, revertir, prevenir, frenar o retrasar la progresión de la patología (por ejemplo, daño hepático), por ejemplo, proporcionando las funciones normalmente proporcionadas por un hígado sano. En algunos casos, las iHep trasplantadas se integran en el hígado del individuo y se convierten en parte del hígado. En algunos casos, las iHep trasplantadas no se integran en el hígado del individuo, pero pueden seguir proporcionando las funciones normalmente proporcionadas por un hígado sano.
En algunas divulgaciones del presente documento, una dosis terapéuticamente eficaz de iHep es de aproximadamente 1x103 o más células (por ejemplo, 5x103 o más, 1x104 células, 5x104 o más, 1x105 o más, 5x105 o más, 1 x 106 o más, 5x106 o más, 1x107 células, 5x107 o más, 1x108 o más, 5x108 o más, 1 x 109 o más, 5x109 o más o 1x1010 o más). En algunas divulgaciones del presente documento, una dosis terapéuticamente eficaz de iHep se encuentra en el intervalo de aproximadamente 1x103 células a aproximadamente 1x1010 células (por ejemplo, de aproximadamente 5x103 células a aproximadamente 1x1010 células, de aproximadamente 1x104 células a aproximadamente 1x1010 células, de aproximadamente 5x104 células a aproximadamente 1x1010 células, de aproximadamente 1x105 células a aproximadamente 1x1010 células, de aproximadamente 5x105 células a aproximadamente 1x1010 células, de aproximadamente 1x106 células a aproximadamente 1x1010 células, de aproximadamente 5x106 células a aproximadamente 1x1010 células, de aproximadamente 1x107 células a aproximadamente 1x1010 células, de aproximadamente 5x107 células a aproximadamente 1x1010 células, de aproximadamente 1x108 células a aproximadamente 1x1010 células, de aproximadamente 5x108 células a aproximadamente 1x1010, de aproximadamente 5x103 células a aproximadamente 5x109 células, de aproximadamente 1x104 células a aproximadamente 5x109 células, de aproximadamente 5x104 células a aproximadamente 5x109 células, de aproximadamente 1x105 células a aproximadamente 5x109 células, de aproximadamente 5x105 células a aproximadamente 5x109 células, de aproximadamente 1x106 células a aproximadamente 5x109 células, de aproximadamente 5x106 células a aproximadamente 5x109 células, de aproximadamente 1x107 células a aproximadamente 5x109 células, de aproximadamente 5x107 células a aproximadamente 5x109 células, de aproximadamente 1x108 células a aproximadamente 5x109 células, de aproximadamente 5x108 células a aproximadamente 5x109, de aproximadamente 5x103 células a aproximadamente 1x109 células, de aproximadamente 1x104 células a aproximadamente 1x109 células, de aproximadamente 5x104 células a aproximadamente 1x109 células, de aproximadamente 1x105 células a aproximadamente 1x109 células, de aproximadamente 5x105 células a aproximadamente 1x109 células, de aproximadamente 1x106 células a aproximadamente 1x109 células, de aproximadamente 5x106 células a aproximadamente 1x109 células, de aproximadamente 1x107 células a aproximadamente 1x109 células, de aproximadamente 5x107 células a aproximadamente 1x109 células, de aproximadamente 1x108 células a aproximadamente 1x109 células, de aproximadamente 5x108 células a aproximadamente 1x109, de aproximadamente 5x103 células a aproximadamente 5x108 células, de aproximadamente 1x104 células a aproximadamente 5x108 células, de aproximadamente 5x104 células a aproximadamente 5x108 células, de aproximadamente 1x105 células a aproximadamente 5x108 células, de aproximadamente 5x105 células a aproximadamente 5x108 células, de aproximadamente 1x106 células a aproximadamente 5x108 células, de aproximadamente 5x106 células a aproximadamente 5x108 células, de aproximadamente 1x107 células a aproximadamente 5x108 células, de aproximadamente 5x107 células a aproximadamente 5x108 células o de aproximadamente 1x108 células a aproximadamente 5x108 células).
Las células de la presente divulgación pueden suministrarse en forma de una composición farmacéutica, que comprende un excipiente isotónico preparado en condiciones lo suficientemente estériles para la administración a seres humanos. Para principios generales en la formulación médica, se remite al lector a Cell Therapy: Stem Cell Transplantation, Gene Therapy, and Cellular Immunotherapy, por G. Morstyn y W. Sheridan eds, Cambridge University Press, 1996; y Hematopoietic Stem Cell Therapy, E. D. Ball, J. Lister y P. Law, Churchill Livingstone, 2000. La elección del excipiente celular y cualquier elemento adjunto de la composición se adaptará de acuerdo con la ruta y el dispositivo usado para la administración. La composición también puede comprender o ir acompañada de uno o más ingredientes que facilitan el injerto o la movilización funcional de las células. Los ingredientes adecuados incluyen proteínas de la matriz que soportan o promueven la adhesión de las células o tipos celulares complementarios.
Las células de los presentes métodos pueden alterarse genéticamente a fin de introducir genes útiles en los hepatocitos diferenciados, por ejemplo, reparación de un defecto genético en un individuo, marcador de selección, etc. Las células también pueden modificarse genéticamente para potenciar la supervivencia, el control de la proliferación y similares. Las células pueden alterarse genéticamente mediante transfección o transducción con un vector adecuado, recombinación de homólogos u otra técnica adecuada, de tal forma que expresan un gen de interés. En algunas divulgaciones del presente documento, se introduce un marcador de selección, a fin de proporcionar una mayor pureza de la célula en diferenciación deseada.
Las células de la presente divulgación también pueden alterarse genéticamente a fin de potenciar su capacidad para implicarse en la regeneración de tejidos o para suministrar un gen terapéutico a un sitio de administración. Un vector se diseña usando la secuencia codificante conocida para el gen deseado, unido operativamente a un promotor que es o bien panespecífico o específicamente activo en hepatocitos.
Se encuentran disponibles diversos vectores útiles para transferir genes exógenos a células de mamífero diana. Los vectores pueden ser episómicos, por ejemplo, plásmidos, vectores procedentes de virus, tales como citomegalovirus, adenovirus, etc. o pueden estar integrados en el genoma de la célula diana, a través de recombinación de homólogos o integración aleatoria, por ejemplo, vectores derivados de retrovirus tales como MMLV, VIH-1, ALV, etc. Para la modificación de células madre, se prefieren vectores lentivíricos. Los vectores lentivíricos, tales como aquellos basados en las secuencias de gag del VIH o FIV, pueden usarse para transfectar a células que no se encuentren en división, tal como en la fase de reposo de las células madre humanas (véase Uchida et al., (1998) P.N.A.S. 95(20):11939-44).
También pueden ser útiles combinaciones de retrovirus y una línea empaquetadora adecuada, en los casos donde las proteínas de la cápside serán funcionales para infectar a las células diana. Normalmente, las células y virus se incubarán durante al menos aproximadamente 24 horas en el medio de cultivo. Después, se deja que las células crezcan en el medio de cultivo durante intervalos cortos en algunas aplicaciones, por ejemplo, 24-73 horas o durante al menos dos semanas y pueden dejarse crecer durante cinco semanas o más, antes de su análisis. Los vectores retrovíricos comúnmente usados son "defectuosos", es decir, incapaces de producir proteínas virales requeridas para una infección productiva. La replicación del vector requiere el crecimiento en la línea celular empaquetadora. La especificidad de célula hospedadora del retrovirus se determina mediante la proteína de envoltura, env (p120). La proteína de envoltura se proporciona por la línea celular empaquetadora. Las proteínas de envoltura son de al menos tres tipos, ecotrópicas, anfotrópicas y xenotrópicas. Los retrovirus empaquetados con proteína de envoltura ecotrópica, por ejemplo, MMLV, son capaces de infectar a la mayoría de tipos celulares murinos y de rata. Las líneas celulares empaquetadoras ecotrópicas incluyen BOSC23 (Pear et al. (1993) P.N.A.S. 90:8392-8396). Los retrovirus que portan proteína de envoltura anfotrópica, por ejemplo, 4070A (Danos et al, anteriormente citado), son capaces de infectar a la mayoría de los tipos celulares de mamíferos, incluyendo seres humanos, perros y ratones. Las líneas celulares empaquetadoras anfortróficas incluyen PA12 (Miller et al. (1985) Mol. Cell. Biol. 5:431-437); PA317 (Miller et al. (1986) Mol. Cell. Biol. 6:2895-2902) GRIP (Danos et al. (1988) PNAS 85:6460-6464). Los retrovirus empaquetados con proteína de envoltura xenotrópica, por ejemplo, AKR env, son capaces de infectar a la mayoría de los tipos celulares de mamíferos, excepto a las células murinas.
Los vectores pueden incluir genes que han de retirarse posteriormente, por ejemplo, usando un sistema de recombinasa, tal como Cre/lox o destruirse las células que los expresan, por ejemplo, incluyendo genes que permiten una toxicidad selectiva, tales como TK de herpesvirus, bcl-xs, etc. Los promotores inducibles adecuados se activan en un tipo celular diana deseado, ya sea la célula transfectada o la descendencia de la misma. Por activación transcripcional, se da a entender que la transcripción aumentará por encima de los niveles basales en la célula diana en al menos aproximadamente 100 veces, más generalmente en al menos aproximadamente 1000 veces.
UTILIDAD
Los resultados descritos en los ejemplos más adelante demuestran que puede producirse tejido hepático humano funcional in vivo después del implante directo de células similares a hepatocitos, procedentes de a Sc usando los presentes métodos, en el hígado. Las SCi-Hep (iHep inducidas usando los presentes métodos) se produjeron a partir de ASC mediante diferenciación in vitro durante un periodo corto en medio químicamente definido. Las SCi-Hep mostraron muchas de las propiedades funcionales in vitro de los hepatocitos maduros y fueron capaces de reconstituir de manera estable un hígado humano funcional in vivo en un sistema de modelo murino y los estudios de implantación demostraron que las SCi-Hep tienen un potencial maligno muy bajo. Por lo tanto, se usaron células madre fácilmente accesibles para construir rápidamente un tejido hepático humano funcional in vivo. El tiempo para generar iHep a partir de ASC se reduce en gran medida mediante los presentes métodos hasta menos de 13 días (por ejemplo, 9 días). Además, la eficiencia de la producción de iHep aumenta en gran medida mediante los presentes métodos en más de un 10 % (por ejemplo, un 37 %). Estas dos características facilitan los métodos de tratamiento debido a que el daño hepático (por ejemplo, insuficiencia hepática, por ejemplo, debido a la toxicidad del acetaminofeno) puede provocar la muerte rápidamente (por ejemplo, en 2 semanas o menos).
Estos procedimientos pueden escalarse para permitir la regeneración de hígado autólogo en seres humanos. Debido a que hay ~140 x 106 hepatocitos por gramo de tejido hepático humano o de ratón; un hígado humano adulto de 1500 gramos tiene ~2 x1011 hepatocitos, mientras que un hígado de ratón de 1,8 gramos tiene 2,5 x 108 células. Después de trasplantar 1 millón de hepatocitos humanos a un ratón TK-NOG, se obtiene rutinariamente un reemplazo de ~50 % de los hepatocitos de ratón, lo que representa ~1,2 x 108 hepatocitos humanos funcionales en el hígado del ratón. Esto representa un aumento de 120 veces (o 7 duplicaciones de población) en el número de hepatocitos humanos generados in vivo en relación con el número de células trasplantadas. En caso de lograrse una eficiencia de regeneración similar en seres humanos, podrían trasplantarse 800 millones de SCi-Hep (1011/120) para reemplazar un 50 % de las células en un hígado humano. De manera relevante para esta cuestión, puede obtenerse fácilmente 1 litro (1000 g) de lipoaspirado a partir de un solo procedimiento de liposucción. Se estima que este volumen contiene 2-10 x 109 células, de las cuales, se estima que un 1-10% son ASC. Por lo tanto, un litro de lipoaspirado contiene entre 2 x 107 y 109 ASC, que pueden proporcionar un número de células suficiente para posibilitar el reemplazo de hígado humano autólogo. Los procedimientos regenerativos de hígado humano, incluyendo el implante de hígado directo guiado por ultrasonidos (usado en los ejemplos más adelante), son escalables y adecuados para uso clínico en seres humanos.
Los ejemplos más adelante demuestran que el cultivo esférico acoplado con un proceso de diferenciación química puede aumentar en 7 veces la producción de SCi-Hep en comparación con otros métodos conocidos. Por lo tanto, el método de cultivo esférico ayuda a asegurar que puede obtenerse un número de SCi-Hep suficiente para permitir la regeneración del hígado en un sujeto humano. El método de cultivo esférico también reduce el volumen de cultivo en 12 veces y reduce el tiempo en cultivo en un 40 %; reduciendo estos factores drásticamente el coste de la diferenciación de ASC en iHep. El coste estimado del medio y los factores de crecimiento necesarios para producir Chi-Hep es de ~49.000 $ por litro de lipoaspirado procesado, pero el presente método reduce estos costes en más de 20 veces (hasta 2400 $ por litro de lipoaspirado procesado).
El hecho de que las SCi-Hep implantadas no forman tumores (véanse los ejemplos más adelante) indica que estas células tienen un riesgo marcadamente reducido de provocar tumores. A diferencia de los resultados obtenidos con las SCi-Hep, se observaron tumores fácilmente palpables menos de 3 semanas después del implante de las iPS-Hep. La rápida aparición del tumor no debería ser sorprendente, ya que esta población celular procedente de iPS tiene un gran porcentaje de células no diferenciadas. Sin embargo, se han de trasplantar ~109 células para regenerar un hígado humano, pero incluso tan pocas como 100-1000 células con potencial maligno en esta población podrían provocar la formación de tumores. Estos números crean una complicación muy significativa para cualquier método selectivo usado para preparar células procedentes de iPS para la regeneración hepática. El hecho de que las SCi-Hep implantadas no formaron tumores indica que estas células tienen un riesgo notablemente reducido de formación de tumores. Debido a que el daño hepático inducido por ganciclovir en ratones TK-NOG modificados por ingeniería genética se asemeja a la insuficiencia hepática aguda que está provocada por toxinas exógenas o la sobredosis de fármacos, Los métodos divulgados en el presente documento pueden proporcionar células que pueden usarse para tratar un hígado dañado (por ejemplo, un paciente con insuficiencia hepática aguda).
Las células similares a hepatocitos producidas mediante los presentes métodos proporcionan una fuente de células donantes para el reemplazo de células en hígados dañados. Como tal, las células similares a hepatocitos pueden usarse para la reconstitución o regeneración de tejidos en un paciente humano, un individuo que necesita dicho tratamiento y/o para la reconstitución de tejido hepático humano en un animal no humano (por ejemplo, un ratón, que después puede usarse, por ejemplo, con una finalidad de investigación, incluyendo la exploración de fármacos, ensayos de fármacos, etc.). Las células se administran de un modo que les permite injertarse o migrar al tejido previsto y reconstituir o regenerar el área funcionalmente deficiente.
Las células diferenciadas de la presente divulgación también pueden usarse para preparar anticuerpos que son específicos para marcadores de hepatocitos. Pueden prepararse anticuerpos policlonales inyectando a un animal vertebrado células de la presente divulgación en una forma inmunogénica. La producción de anticuerpos monoclonales se describe en referencias estándar, tales como las Patentes de los Estados Unidos n.° 4.491.632, 4.472.500 y 4.444.887 y en Methods in Enzymology 73B:3 (1981). También pueden producirse moléculas de anticuerpo específicas poniendo en contacto una biblioteca de células inmunocompetentes o de partículas víricas con el antígeno diana y cultivar los clones seleccionados positivamente. Véase Marks et al., New Eng. J. Med.
335:730, 1996 y McGuiness et al., Nature Biotechnol. 14:1449, 1996. Una alternativa adicional es el reensamblaje de fragmentos de ADN aleatorios en regiones codificantes de anticuerpo, como se describe en la Solicitud de Patente EP 1.094.108 A.
La expresión génica puede examinarse antes, durante y/o después de la producción de células similares a hepatocitos mediante los presentes métodos. El conjunto de genes expresados puede compararse frente a otros subconjuntos de células, frente a células progenitoras, frente a hepatocitos diferenciados terminalmente, frente a ASC y similares, como se conoce en la técnica. Puede usarse cualquier método cualitativo o cuantitativo conocido en la técnica para detectar ARNm específicos. El ARNm puede detectarse mediante, por ejemplo, hibridación con una micromatriz, secuenciación de última generación, hibridación in situ, mediante reacción en cadena de la polimerasa de retrotranscriptasa (rtPCR) o en transferencias de Northen que contienen ARNm de poli A. Un experto en la materia puede usar fácilmente estos métodos para determinar diferencias en el tamaño o la cantidad de transcritos de ARNm entre dos muestras.
Puede usarse cualquier método adecuado para detectar y comparar los niveles de expresión en una muestra en conexión con los métodos de la divulgación. Por ejemplo, puede secuenciarse el ARNm de una muestra mediante métodos de secuenciación de última generación conocidos en la técnica, tales como secuenciación de Nanopore (por ejemplo, como se describe en Soni et al Clin Chem 53: 1996-2001 2007 o como se describe por Oxford Nanopore Technologies), el método de terminador reversible de Illumina, el método de pirosecuenciación de Roche (454), secuenciación por ligamiento de Life Technologies (la plataforma SOLiD) o la plataforma Ion Torrent de Life Technologies. Los ejemplos de dichos métodos se describen en las siguientes referencias: Margulies et al (Nature 2005 437: 376-80); Ronaghi et al (Analytical Biochemistry 1996 242: 84-9); Shendure (Science 2005 309: 1728); Imelfort et al (Brief Bioinform. 2009 10:609-18); Fox et al (Methods Mol Biol. 2009;553:79-108); Appleby et al (Methods Mol Biol. 2009;513:19-39) y Morozova (Genomics. 200892:255-64).
Como alternativa, puede detectarse la expresión génica en una muestra usando análisis de hibridación, que se basa en la especificidad de las interacciones entre nucleótidos. Pueden usarse oligonucleótidos o ADNc para identificar de manera selectiva o capturar ADN o ARN con una composición de secuencia específica y determinarse cualitativa o cuantitativamente la cantidad de ARN o ADNc hibridado a una secuencia de captura conocida, para proporcionar información acerca de la representación relativa de un mensaje particular dentro del grupo de mensajes celulares en una muestra. El análisis de hibridación puede diseñarse para posibilitar la exploración concurrente de la expresión relativa de cientos a miles de genes usando, por ejemplo, tecnologías basadas en matriz que tienen formatos de alta densidad, incluyendo filtros, portaobjetos para microscopio o microchips o tecnologías basadas en solución que usan análisis espectroscópico (por ejemplo, espectrometría de masas).
Puede llevarse a cabo hibridación a matrices, donde los análisis pueden producirse de acuerdo con cualquier método adecuado conocido en la técnica. Por ejemplo, se describen métodos para producir grandes matrices de oligonucleótidos en los documentos U.S. 5.134.854 y U.S. 5.445.934 usando técnicas de síntesis dirigidas por luz. Usando un sistema controlado por ordenador, se convierte una matriz heterogénea de monómeros, mediante acoplamiento simultáneo en una serie de sitios de reacción, en una matriz heterogénea de polímeros. Como alternativa, las micromatrices se generan mediante deposición de oligonucleótidos presintetizados sobre un sustrato sólido, por ejemplo, como se describe en la solicitud publicada PCT n.° WO 95/35505.
Los métodos para la recogida de datos a partir de la hibridación de muestras a una matriz también se conocen bien en la técnica. Por ejemplo, pueden generarse los polinucleótidos de las muestras de células usando un marcador fluorescente detectable y la hibridación de los polinucleótidos en las muestras se detecta escaneando las micromatrices respecto de la presencia del marcador detectable. Se conocen en la técnica métodos y dispositivos para detectar dianas marcadas fluorescentemente sobre dispositivos. En general, dichos dispositivos de detección incluyen un microscopio y una fuente de luz para dirigir la luz a un sustrato. Un contador de fotones detecta la fluorescencia del sustrato, mientras que una platina de desplazamiento x-y varía la localización del sustrato. Un dispositivo de detección confocal que puede usarse en los presentes métodos se describe en la Patente de los Estados Unidos n.° 5.631.734. Se describe un microscopio de láser de barrido en Shalon et al., Genome Res. (1996) 6:639. Se lleva a cabo un escaneo usando la línea de excitación adecuada para cada fluoróforo usado. Las imágenes digitales generadas a partir del escaneo se combinan posteriormente para su análisis posterior. Para cualquier elemento de la matriz, se compara la relación de la señal fluorescente de una muestra con la señal fluorescente de otra muestra y se determina la intensidad de señal relativa.
Se conocen bien en la técnica métodos para analizar los datos recogidos de la hibridación a matrices. Por ejemplo, cuando la detección de la hibridación implica un marcador fluorescente, el análisis de datos puede incluir las etapas de determinar la intensidad fluorescente en función de la posición del sustrato a partir de los datos recogidos, eliminar los valores anómalos, es decir, datos que se desvían respecto de una distribución estadística predeterminada y calcular la afinidad de unión relativa de las dianas a los datos restantes. Los datos resultantes pueden presentarse como una imagen, variando la intensidad en cada región de acuerdo con la afinidad de unión entre dianas y sondas.
El emparejamiento de patrones puede efectuarse manualmente o puede llevarse a cabo usando un programa informático. Los métodos para la preparación de matrices de sustrato (por ejemplo, matrices), el diseño de oligonucleótidos para su uso con dichas matrices, el marcaje de las sondas, las condiciones de hibridación, el escaneo de las matrices hibridadas y el análisis de los patrones generados, incluyendo análisis de comparación, se describen en, por ejemplo, el documento U.S. 5.800.992.
Las células similares a hepatocitos inducidas in vitro (iHep) producidas mediante los presentes métodos también proporcionan una fuente de células para el descubrimiento, el desarrollo y las pruebas de seguridad de fármacos hepáticos. El uso de iHep producidas in vitro mediante los presentes métodos ofrece a la industria farmacéutica una herramienta de valor incalculable para la exploración preclínica de fármacos candidatos para tratar la cardiomiopatía, la arritmia y la insuficiencia cardíaca, así como agentes terapéuticos para combatir la toxicidad cardíaca secundaria. El desarrollo de nuevas exploraciones usando iHep in vitro producidas mediante los presentes métodos reduciría el tiempo y el coste de lanzar nuevos fármacos al mercado.
En los ensayos de exploración para agentes biológicamente activos (por ejemplo, compuestos de molécula pequeña, péptidos, virus, etc.) de las presentes células similares a hepatocitos, normalmente se pone en contacto un cultivo que comprende las presentes células similares a hepatocitos con el agente de interés y se evalúa el efecto del agente monitorizando parámetros de producción, tales como expresión de marcadores, viabilidad celular, metabolismo de fármacos y similares.
Los agentes de interés para la exploración incluyen compuestos conocidos y desconocidos que abarcan numerosas clases químicas, principalmente moléculas orgánicas, que pueden incluir moléculas organometálicas, moléculas inorgánicas, secuencias genéticas, etc. Un aspecto importante de la divulgación es evaluar fármacos candidatos, que incluyen controles de toxicidad; y similares.
Además de agentes biológicos complejos, tales como virus, los agentes candidatos incluyen moléculas orgánicas que comprenden grupos funcionales necesarios para las interacciones estructurales, particularmente enlaces de hidrógeno y normalmente incluyen al menos un grupo amina, carbonilo, hidroxilo o carboxilo, frecuentemente, al menos dos de los grupos químicos funcionales. Normalmente, los agentes candidatos comprenden estructuras cíclicas de carbono o heterocíclicas y/o estructuras aromáticas o poliaromáticas sustituidas con uno o más de los grupos funcionales anteriores. Los agentes candidatos también se encuentran entre las biomoléculas, incluyendo péptidos, polinucleótidos, sacáridos, ácidos grasos, esteroides, purinas, pirimidinas, derivados, análogos estructurales o combinaciones de los mismos.
Se incluyen fármacos farmacológicamente activos, moléculas genéticamente activas, etc. Los compuestos de interés incluyen agentes quimioterapéuticos, hormonas o antagonistas de hormonas, etc. Los ejemplos de agentes farmacéuticos adecuados para la presente divulgación son aquellos descritos en, "The Pharmacological Basis of Therapeutics", Goodman y Gilman, McGraw-Hill, Nueva York, Nueva York, (1996), novena edición, en las secciones: Water, Salts and Ions; Drugs Affecting Renal Function and Electrolyte Metabolism; Drugs Affecting Gastrointestinal Function; Chemotherapy of Microbial Diseases; Chemotherapy of Neoplastic Diseases; Drugs Acting on Blood-Forming organs; Hormones and Hormone Antagonists; Vitamins, Dermatology; y Toxicology.
Los compuestos de ensayo incluyen todas las clases de moléculas descritas anteriormente y pueden comprender además muestras de contenido desconocido. Son interesantes mezclas complejas de compuestos de origen natural procedentes de fuentes naturales, tales como plantas. Aunque muchas muestras comprenderán compuestos en solución, también pueden ensayarse muestras sólidas que pueden disolverse en un disolvente adecuado. Las muestras de interés incluyen muestras de fabricación, agentes farmacéuticos, bibliotecas de compuestos preparados para análisis y similares. Las muestras de interés incluyen compuestos que se evalúan respecto de su potencial valor terapéutico, es decir, candidatos a fármacos.
Los compuestos, incluyendo agentes candidatos, se obtienen de una gran variedad de fuentes que incluyen bibliotecas de compuestos sintéticos o naturales. Por ejemplo, se encuentran disponibles numerosos medios para la síntesis aleatoria y dirigida de una gran variedad de compuestos orgánicos, incluyendo biomoléculas, que incluyen la expresión de oligonucleótidos y oligopéptidos aleatorizados. Como alternativa, se encuentran disponibles o se producen fácilmente bibliotecas de compuestos naturales en forma de extractos bacterianos, vegetales y animales. Además, las bibliotecas y compuestos naturales o sintéticamente producidos se modifican fácilmente por medios químicos, físicos y bioquímicos convencionales y pueden usarse para producir bibliotecas combinatorias. Los agentes farmacológicos conocidos pueden someterse a modificaciones químicas dirigidas o aleatorias, tales como acilación, alquilación, esterificación, amidación, etc. para producir análogos estructurales.
La actividad biológica de los agentes se evalúa añadiendo el agente a al menos uno y normalmente a una pluralidad de muestras de células, normalmente junto con células que carecen del agente. Se mide el cambio en los parámetros en respuesta al agente y se evalúa el resultado en comparación con los cultivos de referencia, por ejemplo, en presencia y ausencia del agente, obtenido con otros agentes, etc.
Los agentes se añaden convenientemente en solución o en forma fácilmente soluble, al medio de las células en cultivo. Los agentes se pueden añadir en un sistema de flujo continuo, como una corriente, intermitente o continua o como alternativa, añadiendo un bolo del compuesto, de manera individual o incremental, a una solución de otra manera estática. En un sistema de flujo continuo, se utilizan dos fluidos, donde uno es una solución fisiológicamente neutra y el otro es la misma solución con el compuesto de ensayo añadido. Se hace pasar el primer fluido sobre las células, seguido del segundo. En un único método de solución, se añade un bolo del compuesto de prueba al volumen del medio que rodea las células. Las concentraciones globales de los componentes del medio de cultivo no deberían cambiar significativamente con la adición del bolo o entre las dos soluciones en un método de flujo continuo.
Las formulaciones de agentes preferidas no incluyen componentes adicionales, tales como conservantes, que pueden tener un efecto significativo en la formulación general. Por lo tanto, las formulaciones preferidas consisten esencialmente en un compuesto biológicamente activo y un vehículo fisiológicamente aceptable, por ejemplo, agua, etanol, DMSO, etc. Sin embargo, en caso de que un compuesto sea líquido sin un disolvente, la formulación puede consistir esencialmente en el compuesto en sí.
Se puede realizar una pluralidad de ensayos en paralelo con diferentes concentraciones del agente para obtener una respuesta diferencial a las diversas concentraciones. Como se conoce en la técnica, la determinación de la concentración eficaz de un agente normalmente utiliza un intervalo de concentraciones resultantes de diluciones 1:10 u otras escalas logarítmicas. Las concentraciones pueden refinarse aún más con una segunda serie de diluciones, en caso necesario. Normalmente, una de estas concentraciones sirve como un control negativo, es decir, a una concentración cero o por debajo del nivel de detección del agente o a la concentración del agente o una inferior que no produce un cambio detectable en el fenotipo.
Las células pueden aislarse frescas, cultivarse, alterarse genéticamente como se ha descrito anteriormente o similares. Las células pueden ser variantes inducidas ambientalmente de cultivos clonales: por ejemplo, divididas en cultivos independientes y cultivadas en distintas condiciones, por ejemplo, con o sin virus; en presencia o ausencia de otros agentes biológicos. El modo en el que las células responden a un agente, en particular, un agente farmacológico, incluyendo el tiempo de las respuestas, es un reflejo importante del estado fisiológico de la célula. Los parámetros son componentes cuantificables de las células, particularmente componentes que se pueden medir con precisión, deseablemente en un sistema de alto rendimiento. Un parámetro puede ser cualquier componente celular o producto celular, incluido el determinante de la superficie celular, receptor, proteína o modificación conformacional o postraduccional de los mismos, lípido, hidrato de carbono, molécula orgánica o inorgánica, ácido nucleico, por ejemplo, ARNm, ADN, etc. o una porción que procede de dicho componente celular o combinaciones de los mismos. Si bien la mayoría de los parámetros proporcionarán una lectura cuantitativa, en algunos casos será aceptable un resultado semicuantitativo o cualitativo. Las lecturas pueden incluir un solo valor determinado o pueden incluir la media, el valor de la mediana o la varianza, etc. Característicamente, se obtendrá un intervalo de valores de lectura de parámetros para cada parámetro a partir de una multiplicidad de los mismos ensayos. Se espera una variabilidad y se obtendrá un intervalo de valores para cada uno de los conjuntos de parámetros de prueba utilizando métodos estadísticos estándar con un método estadístico común utilizado para proporcionar valores únicos.
Para un desarrollo adicional de las técnicas generales útiles en la práctica de la presente divulgación, el experto puede consultar libros de texto convencionales y revisiones de biología celular, cultivo de tejidos y embriología. Con respecto al cultivo de tejidos y células madre, el lector puede desear consultar Teratocarcinomas and embryonic stem cells: A practical approach (E. J. Robertson, ed., IRL Press Ltd. 1987); Guide to Techniques in Mouse Development (P. M. Wasserman et al. eds., Academic Press 1993); Embryonic Stem Cell Differentiation in Vitro (M. V. Wiles, Meth. Enzymol. 225:900, 1993); Properties and uses of Embryonic Stem Cells: Prospects for Application to Human Biology and Gene Therapy (P. D. Rathjen et al., Reprod. Fertil. Dev. 10:31, 1998).
KITS
Asimismo, se proporcionan kits para su uso en los presentes métodos. Los presentes kits incluyen cualquier combinación de componentes para su uso en medios de estadio 1 y/o estadio 2. Por ejemplo, en algunos casos, un kit incluye un agonista de la señalización de Wnt (por ejemplo, Wnt3a), activina A, un FGF (por ejemplo, FGF4, FGF5, FGF6, etc.) y HGF. En algunas divulgaciones del presente documento, un kit puede incluir además oncostatina M, dexametasona y/o dimetilsulfóxido. En algunas divulgaciones del presente documento, uno de los presentes kits incluye un medio basal (por ejemplo, RPMI 1640). En algunas divulgaciones del presente documento, uno de los presentes kits incluye un anticuerpo específico para una proteína marcadora de hepatocitos para su uso en una etapa de verificación (o una etapa de enriquecimiento). En algunas de dichas divulgaciones en el presente documento, la proteína marcadora de hepatocitos se selecciona entre el grupo que consiste en: glucosa-6-fosfatasa, albúmina (ALB), alfa-1-antitripsina (AAT, también conocido como SERPINA1), citoqueratina 8 (CK8), citoqueratina 18 (CK18), citoqueratina 8/18 (CK8/18), receptor 1 de asialoglucoproteínas (ASGR1), alcohol deshidrogenasa 1, arginasa de tipo I, citocromo p4503A4 (CYP3A4), transportador de aniones orgánicos específico de hígado (LST-1), proteína A2 de la caja de forkhead (FoxA2), alfa-fetoproteína (AFP), triptófano 2,3-dioxigenasa (TDO2) y una combinación de los mismos. En algunas divulgaciones del presente documento, uno de los presentes kits incluye reactivos de ensayo (por ejemplo, para medir la bilis, la albúmina y/o la urea; para llevar a cabo ensayos con hepatocitos, tales como ensayos de endocitosis de LDL, ensayos de síntesis de glucógeno, ensayos de actividad detoxificante de citocromo P4501A2; y similares) para su uso en una etapa de verificación.
Además de los componentes anteriores, los presentes kits pueden incluir además (en ciertas divulgaciones del presente documento) instrucciones para poner en práctica los presentes métodos. Estas instrucciones pueden estar presentes en los presentes kits en diversas formas, una o más de las cuales pueden estar presentes en el kit. Una forma en la que pueden estar presentes estas instrucciones es como información impresa en un medio o sustrato adecuado, por ejemplo, uno o más trozos de papel en los que se imprime la información, en el empaquetado del kit, en un prospecto y similares. Otra forma más de estas instrucciones es un medio legible por ordenador, por ejemplo, disquete, disco compacto (CD), unidad flash y similares, en el que se ha grabado la información. Otra forma más de estas instrucciones que puede estar presente es una dirección de una página web que puede usarse a través de Internet para acceder a la información en un sitio remoto.
Ejemplos
Los siguientes ejemplos se exponen a fin de proporcionar a los expertos habituales en la materia una divulgación y descripción completa de cómo producir y usar la presente invención y no pretenden limitar el alcance de lo que los inventores consideran su invención y tampoco pretenden representar que los experimentos a continuación sean todos o los únicos experimentos llevados a cabo. Se han realizado esfuerzos para garantizar la precisión con respecto a los números utilizados (por ejemplo, cantidades, temperatura, etc.) pero deben tenerse en cuenta algunos errores y desviaciones experimentales. Salvo que se indique de otro modo, las partes son partes en peso, el peso molecular es el peso molecular promedio en peso, la temperatura está en grados Celsius y la presión es la atmosférica o próxima a esta. Pueden emplearse abreviaturas convencionales, por ejemplo, temperatura ambiente (TA); pares de bases (pb); kilobases (kb); picolitros (pl); segundos (s); minutos (min); horas (h); días (d); semanas (sem); nanolitros (nl); microlitros (ul); mililitros (ml); litros (l); nanogramos (ng); microgramos (ug); miligramos (mg); gramos ((g), en el contexto de masa); kilogramos (kg); equivalentes de la fuerza de la gravedad ((g), en el contexto de la centrifugación); nanomolar (nM); micromolar (uM), milimolar (mM); molar (M); aminoácidos (aa); kilobases (kb); pares de bases (pb); nucleótidos (nt); intramuscular (i.m.); intraperitoneal (i.p.); subcutánea (s.c.); y similares.
En el presente documento se divulga un método eficiente de alto rendimiento y económico para producir células similares a hepatocitos a partir de células madre procedentes de tejido adiposo. Las células similares a hepatocitos producidas mediante este método tienen muchas de las propiedades funcionales de los hepatocitos maduros in vitro y pueden reconstituir fácilmente un hígado humano funcional in vivo en un sistema de modelo murino. Se usaron los siguientes materiales y métodos para los ejemplos 1 y 2 a continuación.
Materiales y métodos
Preparación y diferenciación de ASC. Se obtuvieron lipoaspirados en forma de muestras desidentificadas de donantes humanos que se sometieron a liposucción en el Stanford University Medical Center de acuerdo con un protocolo que había sido aprobado por el Stanford University Medical Center iRb . Las ASC se prepararon a partir de estas muestras del modo descrito (Banas et al, J Gastroenterol Hepatol. enero de 2009;24(1):70-7). Las ASC se cultivaron en medio MESENPRO rS™ (Gibco, 12746-012), se pasaron a un 90 % de confluencia a una relación 1:4 y el medio se cambió cada dos días. Para la preparación de Chi-Hep, después de 2-5 pases, se emplacaron las ASC sobre placas de Matrigel (BD Biosciences, n.° de cat: 354277). Después de que las células alcanzasen una confluencia del 50 %, se indujo la trans-diferenciación endodérmica durante 3 días de cultivo en medio de estadio 1: RPMI1640 (Gibco, n.° de cat: 12633-012) suplementado con 100 ng/ml de Activina A (R&D, 338-AC-010), 50ng/ml de Wnt3a (StemRD, n.° de cat: W3A-H-100), 20 ng/ml de FGF4 (PeproTech, n.° de cat: 100-31) y un 20 % de B27 (Gibco, n.° de cat: 17504-044). Después, se indujo la diferenciación hepática a lo largo de un periodo de 13-15 días mediante cultivo en el medio de estadio 2: medio de cultivo de hepatocitos (HCM) (Lonza, n.° de cat: cc-3198) suplementado con 150 ng/ml de factor de crecimiento de hepatocitos (HGF) (PeproTech, n.° de cat: 100-39), 25 ng/ml de FGF4, 30 ng/ml de oncostatina M (OSM, PeproTech, n.° de cat: 300-10), dexametasona 2X10'5 M (Dex, Sigma, n.° de cat: D4902) y DMSO al 0,1 % (Sigma, n.° de cat: C6164). Después, se cultivaron las células solo en HCM durante 2 días antes de su trasplante en ratones TK-NOG.
Preparación de SCi-Hep. Las ASC primarias se aislaron de lipoaspirados y se suspendieron en medio MesenPRO RS™ (Gibco, n.° de cat: 12746-012) a 5x104 células/ml. Después, las células se cultivaron mediante el método de gota colgante, lo que dio como resultado la formación de agregados celulares esféricos ("esferas") que se asemejaban a cuerpos embrioides. En resumen, las ASC se emplacaron como gotas individuales (cada una de ~40 ul) en filas sobre placas de petri de 150 mm (BD Biosciences, n.° de cat: 354551) usando una pipeta de 8 canales. Después de dos días, se enjuagaron las placas con PBS y se recogieron las esferas mediante centrifugación a 150 x g a 37 °C, se resuspendieron a razón de 30 esferas/ml en el medio de estadio 1 y se sembraron sobre placas recubiertas de matrigel (BD Biosciences, n.° de cat: 354262). Después, se indujo la diferenciación en hepatocitos de las células procedentes de esferas mediante un proceso en 2 etapas. La transdiferenciación endodérmica se indujo a lo largo de un periodo de 2 días cultivando las esferas en el medio de estadio 1. La diferenciación hepática se indujo a lo largo del periodo de 2-9 días posterior mediante cultivo en el medio de estadio 2. Después, se cultivaron las células solo en HCM durante 2 días antes de su trasplante en ratones TK-NOG.
Preparación de iPS-Hep. Las ASC se transfectaron con lentivirus que codifica Oct4, Sox2, Klf4 y c-MYC para generar células iPS. Cuatro días después de la infección, se volvieron a emplacar las células a razón de 5x104 células por cada 100 mm de placa recubierta de matrigel (BD Biosciences, n.° de cat: 354277) en medio mTeSR-1 (StemCell Technologies Inc, n.° de cat: 05850) y el medio se cambió cada dos días. Quince días después de la infección, se recogieron manualmente las colonias individuales y se pasaron sobre nuevas placas recubiertas de matrigel. Después de que las células alcanzasen una confluencia del 50 %, se usó posteriormente un protocolo de diferenciación hepática en tres etapas. (i) Las células iPS se cultivaron durante 4 días en el medio de estadio 1. (ii) A lo largo de los 7 días siguientes, se indujeron las células en medio progenitor de hepatocitos (HP) que contenía RPMI1640 (Gibco, n.° de cat: 12633-012) con un 20% de B27, 20 ng/ml de BMP4 (Pepro Tech, n.° de cat: 120-05ET) y 20 ng/ml de FGF4 (PeproTech, n.° de cat: 100-31). (iii) Después, se colocaron las células durante 15 días en un medio de maduración de hepatocitos (HM), que tenía medio de crecimiento de hepatocitos (Lonza, n.° de cat: cc-3198) con 10 ng/ml de HGF (PeproTech, n.° de cat: 100-39), 10 ng/ml de oncostatina M (OSM, PeproTech, n.° de cat: 300-10) y dexametasona 0,1uM (Dex, Sigma, n.° de cat: D4902). Las células iPS usadas para la diferenciación se encontraban entre los pases 10 y 20.
Tinción de inmunofluorescencia. Las células se fijaron en paraformaldehído al 4% durante 10min, seguido de bloqueo con suero de pollo al 10 % durante 30 min. Después de lavar 3 veces en PBS con Triton-X 100 al 0,05 % (TPBS), se incubaron las células con anticuerpos primarios anti-albúmina humana (Bethyl Laboratories, n.° de cat: A80- 129A, 1:100) o anti-CK8/18 humana (Abcam, n.° de cat: ab17139, 1:100) durante una noche a 4 °C y después se lavaron tres veces con TPBS. Después, se aplicaron anticuerpos secundarios conjugados con Alexa Fluor 488 (Invitrogen, n.° de cat: A21200, 1:1000) o Alexa Fluor 594 (Invitrogen, n.° de cat: A21201, 1:1000) durante una hora en la oscuridad. La tinción nuclear se evaluó usando 4,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI, Sigma, n.° de cat: D9542). Las imágenes se tomaron usando un sistema de obtención de imágenes Nikon Eclipse Ni- E.
Para evaluar la expresión de ASGR1 in vitro, se permeabilizaron las células con Triton-X 100 al 0,2% durante 10 min, seguido de lavado tres veces en PBS con Triton X-100 al 0,05 % (TPBS). Las células se preincubaron con suero de pollo al 10% durante 30 min, seguido de incubación con una dilución 1:50 de anticuerpo primario anti-ASGR1 (Sigma-Aldrich, n.° de cat: HPA012852) durante una noche a 4 °C y después se lavaron tres veces con TPBS. Después, se aplicó una dilución 1:1000 de anticuerpo secundario conjugado con Alexa Fluor 488 (Invitrogen n.° de cat. A21200) durante una hora en la oscuridad. La tinción nuclear se evaluó usando 4,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI, Sigma-Aldrich, n.° de cat: D9542). Las imágenes se tomaron usando un sistema de obtención de imágenes Nikon Eclipse Ni-E.
Tinción de ácido peryódico-Schiff (PAS). La tinción de PAS se llevó a cabo de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Sigma, 395B). En resumen, las células se fijaron con paraformaldehído al 4 % durante 1 min. Después de enjuagar con agua destilada, se tiñeron las células con solución de PAS durante 5 min, después se lavaron con agua destilada y se tiñeron usando reactivo de Schiff durante 15 min. Después, se lavaron las células una vez con agua y se contratiñeron en solución de hematoxilina durante 90 s; seguido de enjuagado 3 veces con agua destilada antes del análisis.
Endocitosis de LDL. Se evaluó la captación de LDL usando el ensayo Dil-LDL (Biomedical Technologies Inc., BT-904) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las células se preincubaron en medio asérico con BSA al 1 % durante 24 h. Después, se añadieron 10ug/ml de Dil-LDL durante al menos cinco horas a 37 °C. Después de lavar 3 veces con DPBS, se obtuvieron imágenes de las células usando un sistema de obtención de imágenes Nikon Eclipse Ni-E.
Citometría de flujo. Se analizó la expresión de CK8/18 mediante citometría de flujo (FACS, Aida, Software Flowjo). En primer lugar, se bloquearon las células con un reactivo de bloqueo del receptor de Fc (Miltenyi Biotech, Alemania) de acuerdo con las instrucciones del fabricante y después se tiñeron con anticuerpo primario anti-CK8/18 humano (Abcam, n.° de cat: ab17139, 1:200) durante 30 min a 4 °C, lo que fue seguido de incubación con un anticuerpo secundario Alexa Fluor 488 (Invitrogen, n.° de cat: A21200, 1:1000). Como controles, se usaron anticuerpos de isotipo emparejado diluidos de manera adecuada (Ebioscience). Se almacenaron datos de 10.000 eventos analizados y se analizaron.
Producción de albúmina humana. Se evaluó la producción de albúmina humana usando un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA, E80-129; Bethyl Laboratories, Montgomery, TX, EE. UU.), que usa un anticuerpo específico para ser humano que no reacciona de manera cruzada con albúmina humana. En resumen, se recogieron sobrenadantes de cultivo celular en el día 0 y cada tres días posteriormente. Los sobrenadantes se concentraron usando unidades de filtro de centrifugación Amicon® Ultra-4 (EMD Millipore, UFC810024). En primer lugar, se centrifugaron muestras de sangre a 2000 g durante 5 min para aislar el suero y después, se diluyeron a 1:10000 para el ensayo. Cada punto de datos es la media±DT de 4 muestras biológicamente independientes analizadas.
Producción de urea y actividad de CYP450. La producción de urea celular se detectó en sobrenadantes de cultivo celular no diluidos usando un kit de ensayo de urea (Abcam, ab83362) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La actividad de CYP450 celular se midió usando el ensayo P450-GloTM CYP3A4 (Promega, n.° de cat: V9002) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. En resumen, las células se cultivaron con medio que contenía un sustrato de CYP luminogénico a 37 °C durante 60 min. Después, se transfirieron 25 pl de sobrenadante a una placa de luminómetro blanca opaca de 96 pocillos a temperatura ambiente y se añadieron 25 pl de reactivo de detección de luciferina para iniciar la reacción luminiscente. Después de una incubación de 20 min, se midió la luminiscencia usando un sistema de obtención de imágenes IVIS l00.
Análisis por RT-PCR. Se extrajo el ARN total usando el kit RNeasy Plus (Qiagen, n.° de cat: 74134) y se retrotranscribió (0,5 pg) usando la retrotranscriptasa SuperScript III (Invitrogen, n.° de cat: 11754-050) de acuerdo con las guías del fabricante. Se llevaron análisis por la PCR usando los siguientes ensayos de expresión génica de TaqMan: FOXA2 (Hs00232764_m1), AFP (Hs00173490_m1), ALB (Hs99999922_s1), AAT (Hs01097800_m1), A1AT (Hs00165475_m1), TDO2 (Hs00194611_m1), CD37 (Hs01099648_m1), CD29 (Hs00559595_m1) y CD105 (Hs00923996_m1). Para el análisis estadístico de los datos de la RT-PCR, se normalizaron los niveles de expresión medidos para cada uno de los genes analizados en relación con su nivel de expresión en ASC. Después, se aplicó una prueba de la t en una muestra usando el nivel de expresión transformado logarítmicamente para evaluar la significación estadística de los cambios de expresión.
Análisis de micromatrices de la expresión génica. Se recogió el ARN total y se procesó por separado a partir de 3 cultivos preparados independientemente de cada tipo celular de acuerdo con las instrucciones del fabricante. En resumen, se desprendieron las células de la placa usando el reactivo de disociación celular StemPro Accutase® (Invitrogen, n.° de cat: A11105-01). El ARN se extrajo usando el kit RNeasy Mini (QIAGEN, n.° de cat: 74104), se marcaron 10 ug de ARN y se hibridaron a microplacas Affymetrix Human Genome U219 y se procesaron de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los archivos de imagen resultantes se analizaron usando el programa informático Affymetrix Microarray Analysis Suite, versión 5.0. Para las ASC, se analizaron tres replicados biológicos, Chi-Hep, SCi-Hep, iPS-Hep y hepatocitos. Los datos de intensidad de la sonda generados a partir de todas las matrices se leyeron en el ambiente informático R ("www.r-project.org", versión 2.15.1) directamente a partir de los archivos .CEL usando el paquete R/affy (Gautier et al, Bioinformatics. 12 de febrero de 2004;20(3):307-15), que también se usó para extraer y manipular los datos del nivel de sonda para evaluar la calidad de los datos y para crear resúmenes de medición de la expresión. La normalización se llevó a cabo usando el robusto método de media multimatriz (RMA) (Irizarry et al, Biostatistics. abril de 2003;4(2):249-64) para generar una medición de la expresión para cada conjunto de sonda en cada matriz. Se aplicó la prueba de la t de Student para identificar los cambios de expresión en las iHep, las iPS-Hep y hepatocitos, en comparación con células ASC. El método empírico de Bayes (Smyth et al, Stat Appl Genet Mol Biol. 2004;3:Artículo 3) para ajustar la estimación de la desviación estándar para cada sonda y se aplicó un ajuste de ensayos múltiples para generar los valores de p finales usando el paquete R/limma. Se seleccionaron los cambios en la expresión génica que cumplen criterios predeterminados (múltiplo de cambio > 2 y valor de p ajustado < 0,01) para su análisis posterior.
Para una ilustración de la relación espacial de los perfiles de expresión génica de estas células, los presentes inventores definieron la distancia entre cualquier par de datos de la matriz como la raíz cuadrada de la suma de los cuadrados de la diferencia en el nivel de expresión para cada gen en la micromatriz: Dist(Matriz1,Matriz2) =
Jn?=i(Eu - E2 i)2 donde N representa el número total de sondas en la matriz y En y E2i presentan el log2 del nivel de expresión normalizado para la sonda i en la matriz 1 y 2, respectivamente. En otras palabras, la distancia para un par de perfiles es la distancia euclídea entre los dos perfiles tratados como un vector de tamaño N. Debido a que hay 3 matrices replicadas para cada tipo celular, los presentes inventores definieron la distancia entre cualesquiera dos tipos celulares como la media de las distancias medidas cuando se comparó cada una de las 3 matrices para un tipo celular con cada una de las 3 matrices para el otro tipo celular (que produce un total de 9 pares de matrices). La ilustración en 2 dimensiones de la relación espacial entre los 4 tipos celulares se creó colocando dos triángulos, que comparten el eje de ASC-hepatocitos común próximos entre sí. La longitud de cada lado de un triángulo es proporcional a la distancia entre los tipos celulares y los vértices indicados.
También se usó análisis de componentes principales (PCA) para visualizar el grado de relación de los patrones generales de la expresión génica en los diferentes tipos de células analizados. En resumen, se identificó la dimensión que explicó la mayor cantidad de la variación en los perfiles y esta se convirtió en el 1.er componente principal (PC) mostrado en el eje x. Después, se identificó la dimensión que era ortogonal al PC 1 y que explicó la mayor cantidad de la variación restante, lo que se convirtió en el 2.° PC mostrado en el eje y. Como resultado, los primeros dos componentes capturaron la mayor parte de variación en los datos. Por lo tanto, se pudo centrar la visualización en estos componentes para reducir la dimensión sin perder una cantidad significativa de información presente en los datos originales.
Preparación de ratones TK-NOG. Todos los experimentos con animales se llevaron a cabo de acuerdo con protocolos aprobados por el Stanford Institutional Animal Care and Use Committee. Para preparar los ratones TK-NOG para el trasplante, se trató (i.p.) a ratones TK-NOG de 8-10 semanas de edad con 25 mg/kg de ganciclovir (GCV) en el día -7 y -5 antes del trasplante. Después, se recogió una muestra de sangre de 20 pl 6 días después del 1.er tratamiento con GCV, se diluyó a 1:3 en agua y se usaron 10 pl de la muestra diluida para medir el nivel sérico de ALT usando un instrumento Fuji dry-chem 7000 del modo descrito (Hasegawa et al, Biochem Biophys Res Commun. 18 de febrero de 2011;405(3):405-10). Solo se usaron ratones con un nivel de ALT >200 U/l para el trasplante de células en el día 7. Los ratones con niveles de ALT <200 U/l fueron tratados con una dosis adicional de 25 mg/kg de GCV en el día 7, se volvió a examinar el nivel de ALT en el día 13, solo se usaron ratones cuyo nivel de ALT repetido fue > 200 U/I para el trasplante de células en el día 14.
Inyección hepática guiada por ultrasonidos. Las células trasplantadas se colocaron directamente sobre un lóbulo hepático mediante inyección guiada por ultrasonidos usando un sistema de ultrasonidos para animales pequeños Vevo 2100 (Visualsonics, Canadá). Se usó el modo de brillantez (modo B) para tomar imágenes bidimensionales para un área de interés con el transductor MS550s. Se puso a los ratones bajo anestesia con isoflurano al 1,5% durante este procedimiento usando una unidad vaporizadora de un solo animal (EZ-Systems Corp, EZ- 108SA). Después, se suspendieron 5x106 células en 200 pl de medio E de William (Invitrogen, A12176-01), que se inyectaron en 10 sitios distintos en el hígado usando una aguja del calibre 30G.
Análisis de la formación de tumores. Para evaluar la formación de tumores, se recogieron 5x104 Chi-Hep, SCi-Hep o iPS-Hep y se mezclaron con 50 pl de matrigel (BD Biosciences, n.° de cat: 354277). Se anestesió a ratones nOg usando isoflurano al 1,5% usando una unidad vaporizadora individual (EZ-Systems Corp, EZ- 108SA). Se practicó una incisión y se aplicó una presión ligera a ambos lados de la incisión para exponer el riñón. Después, se inyectaron las células bajo la cápsula renal usando una jeringuilla con una aguja del calibre 27. Tras suministrar las células lentamente, se colocó un hisopo seco bajo el sitio de la inyección para prevenir filtraciones. Durante el procedimiento, el riñón se mantuvo húmedo mediante aplicación de suero salino con un hisopo con punta de algodón. Después de tres a 8 semanas, se sacrificó a los animales y se recogió el riñón inyectado para análisis histológico.
Resultados
Ejemplo 1 - Producción de células similares a hepatocitos a partir de células madre procedentes de adipocitos Se proporciona un método para diferenciar células madre procedentes de adipocitos (ASC) en células similares a hepatocitos (iHep) (figura 1A). Las ASC se cultivan en primer lugar usando el método de "gota colgante" para producir agregados celulares esféricos ("esferas") (figura 1B). Como se muestra mediante el análisis de la expresión del factor de transcripción 17 de la caja de HMG relacionado con SRY (Sox17), el cultivo esférico duplica el número de ASC en un lipoaspirado que se diferencian en células precursoras endodérmicas (figura 5). Debido a que la capacidad de las ASC de origen mesenquimal para diferenciarse en endodérmicas puede ser limitante de la velocidad para la generación de hepatocitos, se añadió wnt3a al medio de diferenciación (de estadio 1). En relación con un método descrito anteriormente para generar iHep (Banas et al., J Gastroentero1Hepatol. enero de 2009;24(1):70-7), el presente método produce un aumento de 2,3 veces en el número de ASC obtenidas a partir de un lipoaspirado y un aumento de 3 veces en la eficiencia (% de células similares a hepatocitos obtenidas, como se evalúa usando el marcador CK8/18) después de completarse el proceso de diferenciación en 2 etapas (figura 1C y tabla 1). Este método aumenta en 7 veces el número de iHep obtenidas a partir de un litro de lipoaspirado y reduce el periodo de cultivo in vitro necesario para obtener hepatocitos bioquímicamente definidos con una pureza >37 % en 9 días o menos. Al igual que las Chi-Hep, las células producidas mediante cultivo esferoide, que los presentes inventores se refieren como SCi-Hep, desarrollaron una morfología similar a hepatocitos (figura 1B) y mostraron diversas propiedades de los hepatocitos maduros. Expresaron proteínas (CK8/18) que se encuentran en los hepatocitos (figura 1C) y tuvieron múltiples propiedades metabólicas de los hepatocitos, incluyendo: endocitosis de LDL, síntesis de glucógeno (figura 1D), secreción de albúmina y producción de urea (figura 1E). Además, las SCi-Hep expresaron múltiples ARNm específicos de hepatocitos y tuvieron niveles notablemente reducidos de expresión de múltiples ARNm específicos de adipocitos (figura 2A), junto con expresión reducida de una proteína de la superficie celular específica de ASC (CD105) (figura 6; figura 12).
Tabla 1. Se indujo la diferenciación de ASC preparadas a partir de 3 donantes diferentes en Chi-Hep usando un método anterior (Banas et al., J Gastroenterol Hepatol. enero de 2009;24(1):70-7) o en SCi-Hep (iHep de cultivo esférico) usando el presente método. Se muestran el número de ASC obtenidas después de 3 días (± EEM), el porcentaje de células (± EEM) que expresan un marcador de hepatocitos (CK8/18+) después de la diferenciación durante 12 (Chi-Hep) o 9 (SCi-Hep) días, el número de días necesarios para completar el proceso de diferenciación de los hepatocitos y el número estimado de iHep obtenidas por litro de lipoaspirado.
Tabla 1
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Los presentes inventores también compararon las propiedades de las Chi y SCi-Hep con las iPS-Hep, que son ASC (obtenidas del mismo donante) que se reprogramaron en células iPS después de la transfección de cuatro genes (Oct4, Sox2, Klf4 y c-Myc) y después se indujeron para que se diferenciasen en hepatocitos usando el protocolo de Ochiya (Banas et al., J Gastroenterol Hepatol. enero de 2009;24(1):70-7). Las iPS-Hep expresaron una proteína (CK8/18) hallada en hepatocitos (figura 1C); pudieron endocitar LDL, sintetizar glucógeno (figura 7), secretar albúmina, producir urea y tenían actividad de CYP450 (figura 8). Cabe destacar que, las SCi-Hep produjeron albúmina y urea después de tan solo 3 días de diferenciación in vitro, lo que se produjo 3-6 días antes que las Chi-Hep (figura 1E) y 12 días antes de que las iPS-Hep (figura 8) produjeran estos analitos. En primer lugar, las ASC se tienen que reprogramar y después salir del estado pluripotente antes de que puedan diferenciarse en iPS-Hep. Por el contrario, las SCi-Hep se producen mediante diferenciación directa de las ASSC en endodermo, lo que explica por qué pueden producir estos analitos más rápidamente. De manera coherente con el proceso de diferenciación más rápido, las SCi-Hep expresaron ARNm para genes específicos endodérmicos (molécula de adhesión de células epiteliales, Epcam) y de hepatocitos (albúmina, Foxa2) en menos de 3 días después de iniciarse la diferenciación hepática (figura 2B). Asimismo, las SCi-Hep tuvieron el nivel más elevado de producción de albúmina (basándose en cada célula) entre los 3 tipos de células procedentes de ASC ensayadas. Su nivel aumentado de producción de albúmina es coherente con los resultados de FACS, lo que indica que un 37 % de las SCi-Hep expresaron un marcador de hepatocitos maduros, mientras que solo ~12 % y 20 % de las Chi-Hep y las iPS-Hep, respectivamente, expresaban este marcador (figura 1C). Por lo tanto, el método de las SCi-Hep produce un número aumentado de células similares a hepatocitos a partir de un lipoaspirado y las células se preparan en un espacio de tiempo que hace posible que puedan usarse en una situación clínica aguda, como la que podría producirse después de una sobredosis de acetaminofeno.
Para caracterizar adicionalmente estas células, se elaboró un perfil de expresión génica en las ASC, Chi-Hep, SCi-Hep, iPS-Hep y hepatocitos usando micromatrices y el análisis de datos se describe en la información complementaria. En resumen, múltiples comparaciones indicaron que la diferenciación in vitro alteró significativamente el patrón de expresión génica en las ASC y que las Chi y SCi-Hep expresaron un número muy elevado de genes específicos de hepatocitos (por ejemplo, como se publica en la tabla S2 en Xu et al., Cell Transplantation, 21 de octubre de 2013; DOI: 10.3727/096368913X673432; "Enabling Autologous Human Liver Regeneration With Differentiated Adipocyte Stem Cells"). Además, dos análisis (un diagrama de espacio de las diferencias de expresión génica (figura 2C) y análisis de componentes principales (figura 9)) indican que las Chi y SCi-Hep tenían un perfil de expresión génica que era más próximo al de los hepatocitos que el perfil de las iPS-Hep. Las iPS-Hep expresaron un mayor número de genes que no se expresaban en adipocitos o hepatocitos (figura 11). En resumen, las SCi-Hep tienen un patrón de expresión génica que se asemeja, pero que no imita completamente, al de los hepatocitos. Debido a que tan solo un 37 % de las células Sci-Hep expresó un marcador de hepatocitos maduros (figura 1C), es posible que el patrón de expresión génica en SCi-Hep completamente diferenciadas se asemeje más estrechamente al de los hepatocitos de lo que este análisis sugiere, ya que algunos de los cambios de expresión génica podrían estar enmascarados (diluidos) por la preponderancia de células menos diferenciadas en la población. Aunque se produjeron SCi-Hep mediante un método diferente y se cultivaron durante un periodo de tiempo mucho más corto que las Chi-Hep, sus perfiles de expresión génica fueron extremadamente similares: 48165 de 49395 no mostraron diferencias significativas en la expresión (valor de p ajustado > 0,01 o múltiplo de cambio <2) entre estos dos tipos de iHep. El nivel de expresión de 306 genes (0,6 %) tuvo una diferencia de >3 veces (valor de p ajustado <0,01) y solo 44 genes (0,08 %) tuvo una diferencia >10 veces (valor de p ajustado <0,01) en la expresión en estos dos tipos de células (por ejemplo, como se publica en la tabla S4 en Xu et al., Cell Transplantation, 21 de octubre de 2013; DOI: 10.3727/096368913X673432; "Enabling Autologous Human Liver Regeneration With Differentiated Adipocyte Stem Cells"). Aunque se expresaron diferencialmente unos pocos genes específicos de hígado (por ejemplo, CYP3A4), la gran mayoría de genes tuvo un nivel de expresión similar en las Chi-Hep y SCi-Hep, lo que indica que ambos tipos de células tienen un perfil de expresión génica específico de hígado similar.
Análisis de datos de expresión génica. Se llevó a cabo un análisis basado en micromatrices de la expresión génica global en ASC, Chi-Hep, SCi-Hep, iPS-Hep y hepatocitos. Para eliminar el efecto que pudieran tener las diferencias entre individuos en el perfil de expresión génica, ASC, Chi-Hep, SCi-Hep e iPS-Hep se prepararon a partir de los mismos individuos. Para el presente análisis inicial, se compararon los perfiles de expresión génica de hepatocitos y ASC para permitir la selección de un conjunto de genes que cumplían criterios predeterminados (múltiplo de cambio > 5 y valor de p ajustado < 0,01) para la expresión diferencial. Para asegurar que las comparaciones posteriores evaluaban diferencias de expresión robustas entre ASC y hepatocitos, los presentes inventores seleccionaron genes cuyas diferencias de expresión eran mayores de 5 veces. Basándose en estos criterios, este análisis identificó 1.129 y 1.437 genes cuya expresión estaba aumentada o reducida, respectivamente, en hepatocitos, en relación con las ASC (por ejemplo, como se publica en la tabla S2 en Xu et al., Cell Transplantation, 21 de octubre de 2013; DOI: 10.3727/096368913X673432; "Enabling Autologous Human Liver Regeneration With Differentiated Adipocyte Stem Cells"). Para evaluar cuantitativamente la similitud entre los 3 tipos diferentes de iHep y hepatocitos, los presentes inventores investigaron cuántos de estos genes también tenían un patrón de expresión alterado después de que las ASC se sometiesen a 3 procesos de diferenciación diferentes. Por ejemplo, los presentes inventores observaron que la expresión de 494 (o un 44 %) y 341 (o un 24 %) de los genes seleccionados regulados positiva o negativamente, respectivamente, estaban similarmente alterados en Chi-Hep (múltiplo de cambio > 2 y valor de p ajustado < 0,01) (figura 11). Sin embargo, este resultado indica que el nivel de expresión de 1731 (o un 67 %) de estos 2566 genes seleccionados o bien no estaba cambiado significativamente en las Chi-Hep (en relación con las ASC) o había cambiado en una dirección diferente (en comparación con los hepatocitos). De manera similar, los presentes inventores, usando los mismos criterios, observaron que la expresión de 565 (o un 50 %) y 449 (o un 31 %) de los genes seleccionados regulados positiva o negativamente, respectivamente, estaban alterados de manera similar en las SCi-Hep (figura 11); lo que indica que el nivel de expresión de 1552 (o un 60%) de los 2566 genes seleccionados o bien no habían cambiado significativamente en las SCi-Hep o habían cambiado en una dirección diferente. Estos resultados indican que las Chi y SCi-Hep tienen un perfil de expresión génica similar, que se asemeja, pero que sin duda no imita completamente, al de los hepatocitos. Surgieron resultados similares cuando se efectuó este tipo de comparación usando el perfil de expresión génica de las iPS-Hep (figura 11). Los presentes inventores también usaron una segunda estrategia para comparar los perfiles de expresión génica globales medidos en los 3 tipos de iHep diferentes. Esta vez, los presentes inventores compararon directamente los perfiles de expresión génica en Chi-Hep, SCI-Hep e iPS-Hep con el de las ASC y examinaron el número de cambios en la expresión génica que también estaban presentes de manera consistente en los hepatocitos (en relación con las ASC). Esta estrategia difiere de la usada anteriormente, ya que esta comparación examina todos los genes que se expresan diferencialmente en las iHep en relación con las ASC. De los 1487 genes que se expresaron diferencialmente (múltiplo de cambio >2 y valor de p ajustado < 0,01) en las Chi-Hep en relación con las ASC, un 835 (56 %) de los genes también mostró cambios de expresión consistentes (y significativos) en hepatocitos en relación con ASC (múltiplo de cambio >5 y valor de p < 0,01). De manera similar, de los 2372 genes que se expresaron diferencialmente en SCi-Hep, 1014 (43%) de estos genes también mostraron cambios de expresión consistentes (y significativos) en los hepatocitos en relación con las ASC. Sin embargo, la misma comparación efectuada usando los datos de expresión de iPS-Hep revelaron que solo un 31 % (1372 de 4456) de los genes expresados diferencialmente en las iPS-Hep mostró cambios consistentes en hepatocitos. Las diferencias en el patrón de expresión génica de iPS-Hep también se ejemplifican mediante análisis de los genes cuyo patrón de expresión no cambió en hepatocitos en relación con las ASC. De los 16446 cuyo patrón de expresión permaneció sin cambios en hepatocitos en relación con las ASC, la expresión de un 96 % y 92 % de estos genes también permaneció sin cambios en las Chi y SCi-Hep, respectivamente (figura 11). Sin embargo, el nivel de expresión de un 18% (o 2969) de estos 16446 genes estaba alterado en las iPS-Hep. En resumen, estos análisis indican que aunque su patrón de expresión no refleja completamente al de los hepatocitos, las Chi y SCi-Hep tienen un patrón de expresión génica que se asemeja mejor al de los hepatocitos que las iPS-Hep. Además, hay un número significativo de cambios en la expresión génica en las iPS-Hep que no reflejan el asociado con la diferenciación de hepatocitos.
Ejemplo 2 - Regeneración de hígado humano usando SCi-Hep
Para determinar si las SCi-Hep podrían reconstituir el hígado humano in vivo, se trasplantaron 5x106 SCi-Hep mediante inyección guiada por ultrasonidos directamente al hígado de cuatro ratones TK-NOG condicionados con ganciclovir (figura 3A). Los presentes inventores habían demostrado previamente que la cantidad de albúmina humana en suero de ratones quiméricos es un indicador del alcance de la humanización del hígado (Hasegawa et al, Biochem Biophys Res Commun. 18 de febrero de 2011;405(3):405-10), por lo que se evaluó de manera seriada el nivel sérico de albúmina humana a lo largo de un periodo de 8 semanas después del trasplante de las SCi-Hep. Estos cuatro ratones produjeron cantidades sustanciales y crecientes de seroalbúmina humana cuando se monitorizaron a lo lardo de un periodo de 8 semanas después del trasplante. Estos tenían una concentración media de albúmina humana de 0,29 (± 0,09) mg/ml en suero a las 4 semanas, que aumentó hasta 0,82 (± 0,41) a las 8 semanas después del trasplante de las SCi-Hep (figura 3B). Por el contrario, ninguno de los 3 ratones a los que se trasplantó el mismo número de ASC no diferenciadas produjo seroalbúmina humana detectable.
La histología hepática reveló que las SCi-Hep trasplantadas se integraron en el hígado, produjeron albúmina humana y expresaron marcadores hallados en los hepatocitos humanos maduros (ASGR1, CK8/18) (figura 3C). Debido a que las SCi-Hep no expresan ASGR1 in vitro justo antes del trasplante (figura 10), La expresión de ASGR1 indicó que las SCi-Hep continuaron diferenciándose después del injerto hepático. Debido a que era importante determinar si las SCi-Hep injertadas podían proliferar en el hígado, los presentes inventores investigaron si las SCi-Hep expresaban la proteína nuclear Ki67, que es un marcador específico para la proliferación celular. Un porcentaje significativo de las SCi-Hep injertadas eran positivas para Ki67 (figura 3D), lo que indica que proliferan in situ en el hígado. Además, un porcentaje significativo de las células SCi-Hep injertadas también expresó la proteína de unión estrecha ZO-1 (figura 3D). Esto indica que tienen interacciones de unión estrecha establecidas entre sí, lo que es necesario para la formación del conducto biliar. Por el contrario, los hígados obtenidos de ratones a los que se trasplantaron ASC no diferenciadas no tenían células positivas a Ki67 o ZO-1 (figura 3D).
Las SCi-Hep no forman tumores. Debido a que el potencial maligno es un determinante clave de si las SCi-Hep se podrían usar para la regeneración hepática en sujetos humanos, los presentes inventores examinaron si las SCi-Hep podrían formar tumores después de su implante bajo la cápsula renal de ratones NOG inmunocomprometidos. No se formaron tumores a lo largo de un periodo de observación de 2 meses después de implantarse 5x104 Chi o SCi-Hep en cada uno de los 5 ratones NOG. Además, el análisis de las secciones de tejido indicó que solo el tejido normal estaba presente en el área de implante. Por el contrario, el implante del mismo número de iPS-Hep en cada uno de los 4 ratones NOG dio como resultado la formación de múltiples tumores en menos de 3 semanas, que se pudieron palpar a través de la pared corporal (figura 4A). El análisis del tejido tumoral obtenido dos meses después del trasplante de iPS-Hep reveló que los tumores contenían tejido procedente de las 3 capas de células germinales de los 4 ratones (figura 4B).
Ejemplo 3 - Cultivo de ASC y formación de iHep usando cultivo en suspensión agitado
Las ASC se colocaron en cultivo en matraces de agitación (en ausencia de microtransportadores= usando numerosas tasas de rotación diferentes, en el intervalo de 0 a 150 rotaciones por minuto (rpm). Se identificaron las condiciones de cultivo que permitieron a las ASC formar agregados y proliferar. Después de 24 horas en el sistema de matraz de centrifugación, el número de ASC aumentó de 5x105 (número celular de partida) hasta 7,7± 0,3 x106 (n=4 replicados independientes), lo que es un aumento de aproximadamente 14 veces en el número de células. Por el contrario, se obtuvo un aumento de 6 veces en el número de ASC (de 1x104 a 6,1 0,2 x104) cuando se cultivaron ASC durante un periodo de 48 horas usando el método de gota colgante (es decir, cultivo en suspensión de gota colgante). Además, la morfología de los agregados celulares de ASC en los matraces de agitación se asemejó a las "esferas" formadas usando el método de gota colgante (figura 13).
Además, los agregados celulares pudieron diferenciarse en endodermo con una eficacia similar a la del uso del método de gota colgante. Estos resultados indican que el cultivo de alta densidad (por ejemplo, cultivo en suspensión adecuado, por ejemplo, cultivo en matraz de agitación, cultivo en biorreactor, etc.) soportará el crecimiento y la proliferación de las ASC, que las ASC forman agregados celulares (por ejemplo, esferas) incluso en ausencia de microtransportadores y que las ASC pueden proliferar a una velocidad sustancialmente mayor en cultivo en suspensión agitado (por ejemplo, matraces de agitación). Por lo tanto, el cultivo en suspensión agitada puede proporcionar un mayor número de partida de ASC (por ejemplo, antes de la puesta en contacto con un medio de diferenciación) y una eficiencia de diferenciación similar (o mayor) a la observada con el cultivo en suspensión en gota colgante (por ejemplo, cultivo en matraz de agitación, cultivo en biorreactor, etc.), produciendo de este modo un número total mucho mayor de iHep.
Las ASC cultivadas mediante unión y los agregados celulares (esferas) producidas usando (i) cultivo en matraz de agitación (cultivo de un día, en ausencia de microtransportadores) o (ii) cultivo en suspensión de gota colgante (cultivo de dos días), o bien: (1) se tiñeron con el marcador de superficie de ASC CD34, analizándose después respecto de células positivas para CD34 usando clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) (figura 14A, tabla 4); o (2) se cultivaron en medio de estadio 1 durante dos días, tiñéndose después con el marcador de endodermo Sox17 y se analizaron las células positivas usando FACS (figura 14B, tabla 4). Las figuras 14 A-B demuestran que las ASC cultivadas mediante cultivo en suspensión con agitación (en este caso, cultivo en matraz de agitación en ausencia de microtransportadores) forman un mayor porcentaje (A) de células CD34+ (células madre adiposas) y un porcentaje aproximadamente igual (B) de células SOX17+ (células precursoras endodérmicas) en comparación con las ASC cultivadas mediante el método de gota colgante.
Tabla 4. Esta tabla demuestra que las ASC cultivadas mediante cultivo en suspensión con agitación (en este caso, cultivo en matraz de agitación) forman un mayor porcentaje de células CD34+ (células madre adiposas) y un porcentaje aproximadamente igual de células SOX17+ (células precursoras endodérmicas) en comparación con las ASC cultivadas mediante el método de gota colgante. El porcentaje es el tanto por ciento de células positivas para la ex resión del marcador.
Figure imgf000039_0001
Las figuras 15 A-B demuestran que las iHep producidas usando cultivo en matraz de agitación (SS-Hep) tenían las enzimas CYP específicas de citocromo CYP3A4 y CYP1A1 y se indujo fuertemente la actividad de CYP3A4 mediante tratamiento con dexametasona (Dex). YJM es una línea celular de hepatocitos humanos. La actividad de CYP se normalizó a la viabilidad celular. Los resultados se presentan con (+) y sin (-) inducción con Dex.
La figura 16 y la tabla 5 demuestran que las iHep producidas usando cultivo en matraz de agitación (SS-Hep) secretaron un nivel aumentado de albúmina humana (hAlb) en comparación con las Chi-Hep y SCi-Hep (aproximadamente 16 veces en relación con las SCi-Hep y aproximadamente 96 veces en relación con las Chi-Hep).
Tabla 5. Esta tabla demuestra que las iHep producidas usando cultivo en matraces de agitación (SS-Hep) secretaron un nivel aumentado de albúmina humana (hAlb) en comparación con las Chi-Hep y las SCi-Hep (la hAlb n ni n ml14 ll .
Figure imgf000040_0001

Claims (18)

REIVINDICACIONES
1. Un método para producir una población de células similares a hepatocitos a partir de una población de células madre procedentes de adipocitos (ASC), comprendiendo el método:
(a) poner una población de ASC en un cultivo tridimensional seleccionado entre el grupo que consiste en: cultivo en suspensión agitado, cultivo en suspensión en gota colgante, cultivo celular de alta densidad, cultivo en matraz de agitación, cultivo en microtransportador y cultivo en biorreactor, durante un periodo de tiempo suficiente para producir un agregado celular derivado de ASC;
(b) poner en contacto las células del agregado celular derivado de ASC con un primer medio de cultivo que comprende Activina A y un factor de crecimiento de fibroblastos (FGF) para producir una población de células precursoras; y
(c) poner en contacto las células de la población de células precursoras con un segundo medio de cultivo que comprende factor de crecimiento de hepatocitos (HGF) para producir una población de células inducidas que comprende células similares a hepatocitos inducidas (iHep).
2. El método de la reivindicación 1, en donde el cultivo tridimensional es un cultivo celular de alta densidad seleccionado entre un cultivo en matraz de agitación y un cultivo en biorreactor.
3. El método de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en donde el cultivo tridimensional es un cultivo en microtransportador.
4. El método de la reivindicación 1, en donde el cultivo tridimensional es un cultivo en suspensión en gota colgante.
5. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en donde:
(i) se pone la población de ASC de la etapa (a) en el cultivo tridimensional durante 3 días o menos para producir el agregado celular derivado de ASC; y/o
(ii) la puesta en contacto de la etapa (b) es durante 3 días o menos; y/o
(iii) la puesta en contacto de la etapa (c) es durante 8 días o menos; y/o
(iv) el tiempo total transcurrido desde el comienzo de la etapa (a) hasta la producción de una población celular inducida en la etapa (c) es menor de 13 días.
6. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en donde el FGF es FGF4.
7. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en donde el primer medio de cultivo comprende además un agonista de la señalización de Wnt.
8. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en donde el segundo medio de cultivo comprende además un compuesto seleccionado entre el grupo que consiste en: oncostatina M (OSM), dexametasona (Dex), dimetilsulfóxido (DMSO) y una combinación de los mismos.
9. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-8, que además comprende determinar el porcentaje de células de la población de células inducidas que son iHep.
10. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-9, en donde un 11 % o más de las células de la población de células inducidas son iHep.
11. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-10, que además comprende enriquecer la población de células inducidas respecto de iHep.
12. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-11, que además comprende preservar las iHep para su uso futuro.
13. Una composición que comprende células similares a hepatocitos inducidas (iHep) producidas mediante el método de cualquiera de las reivindicaciones 1-12, en donde un 25 % o más de las células de la población de células inducidas son iHep, para su uso en un método de tratamiento de un individuo, en donde dicho tratamiento comprende una etapa de administrar un número eficaz de las iHep al individuo para mejorar la función hepática.
14. La composición para su uso de acuerdo con la reivindicación 13, en donde las iHep de la composición se preservan para su uso futuro.
15. La composición para su uso de acuerdo con la reivindicación 13 o la reivindicación 14, en donde se administran al menos 1x104 iHep.
16. La composición para el uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 13-15, en donde las iHep se trasplantan en el hígado del individuo.
17. La composición para el uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 13-16, en donde las ASC usadas en el método para producir las iHep son autólogas respecto del individuo que se está tratando.
18. La composición para el uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 13-16, en donde las ASC usadas en el método para producir las iHep no proceden del individuo que se está tratando sino que proceden, en cambio, de un individuo relacionado o no relacionado.
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