CN109402042A - 一种大鼠肾小球系膜细胞分离及培养方法 - Google Patents

一种大鼠肾小球系膜细胞分离及培养方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种大鼠肾小球系膜细胞分离及培养方法，包括步骤：（a）含双抗预冷PBS灌洗肾脏；（b）分离肾皮质，剪碎并于重叠筛网上进行研磨，收集筛网上的组织块，清洗数次；（c）混合酶消化，筛网过滤，收集滤液离心；（d）完全培养基重悬细胞沉淀，接种于处理后的培养瓶中；（e）培养数天后更换混合完全培养基继续培养；（f）细胞免疫荧光鉴定分离的肾小球系膜细胞。本发明提供了一种操作简单、高效获得活性高的大鼠肾小球系膜细胞的方法。

Description

一种大鼠肾小球系膜细胞分离及培养方法
技术领域
本发明属于细胞生物学领域，具体涉及一种大鼠肾小球系膜细胞分离及培养方法。
背景技术
肾小球系膜是位于肾小球毛细血管袢之间的一种特殊间充质，是肾小球中最活跃的固有成分，由系膜细胞和系膜基质组成。肾小球系膜细胞具有分泌细胞基质、产生细胞因子、吞噬和清除大分子物质及类似平滑肌细胞收缩的功能。肾小球系膜细胞在肾小球损伤和修复过程中起重要作用。系膜细胞的异常增生并伴有大量系膜基质积聚是各种增生性肾小球疾病的特征，本发明提供一种相对完善的肾小球系膜细胞分离培养的方法，为系膜细胞肾小球疾病发病机理研究提供重要研究方法和工具。
发明内容
本发明的目的是建立一种耗时短、高效获得大鼠肾小球系膜细胞的方法。
为了解决上述所涉及到的问题，本发明采取如下方法获得大鼠肾小球系膜细胞：
本发明提供一种大鼠肾小球系膜细胞分离及培养方法，包括步骤：（a）含双抗预冷PBS灌洗肾脏；（b）分离肾皮质，剪碎并于重叠筛网上进行研磨，收集筛网上的组织块，清洗数次；（c）混合酶消化，筛网过滤，收集滤液离心；（d）完全培养基重悬细胞沉淀，接种于处理后的培养瓶中；（e）培养数天后更换混合完全培养基继续培养；（f）细胞免疫荧光鉴定分离的肾小球系膜细胞；
可选的大鼠为体重150+30g的正常SD大鼠；
可选的重叠筛网为孔径分别为80目、100目和200目的不锈钢筛网；
可选的混合酶液为0.05-0.1%IV胶原酶和0.05-0.1%I型胶原酶，消化时间为15-30min；
可选的多聚赖氨酸浓度为0.1-0.25 mg/ml；
可选的完全培养基为15%FCS和5%FBS的DMEM培养液。
本发明提供原代大鼠肾小球系膜细胞的培养方法，简化了操作步骤，提高了细胞培养的稳定性和可靠性，可重复性强，为后续实验和原代大鼠肾小球系膜细胞培养应用奠定了基础。
附图说明
图1培养18d细胞图片（100×）；
图2 细胞免疫荧光鉴定图片。
具体实施方式
为了使本发明的目的及优势更清晰地展现，现将具体实施方式进一步阐述。此处所阐述的具体实施方式仅针对本发明进行解释，并不用于限定本发明。
本发明选择选择体重150+30g的正常SD大鼠，分离大鼠肾小球系膜细胞。具体操作如下：
1、取正常SD 大鼠，腹腔注射2%戊巴比妥钠处死大鼠，固定大鼠，酒精消毒皮肤，剪开胸腹腔，以无菌的预冷PBS灌洗肾脏至颜色转白(全身循环灌洗) ，取出双肾；
2、在冰上于显微镜下迅速地去除肾脏上的包膜、血细胞及结缔组织等附着物，将剥离后的肾脏转至新的PBS缓冲液中清洗3-4次，分离肾皮质和肾髓质；
3、用无菌眼科剪将肾皮质剪碎至约1mm3的小块，无菌PBS清洗2-3次，1500rpm/min离心5min，弃上清；
4、将组织块置于重叠的，孔径分别为80目、100目和200目的不锈钢筛网上，用注射器内芯在80目筛网上研磨剪碎组织块，无菌PBS充分冲洗筛网，收集200目不锈钢筛网上的组织块，并转至离心管中，充分吹吸后，1500rpm/min离心5min；
5、离心后弃上清液，加入混合酶液于37℃水浴消化，消化时间为15-30min，消化结束后吸管吹打数次，混合酶液为0.05-0.1%胶原酶和0.05-0.01%型胶原酶，收集滤液转移到离心管中，1500rpm/min离心5min；
6、将上述细胞沉淀用无菌PBS离心洗涤2次，1500rpm/min离心5min；
7、细胞沉淀加入含有15%FCS和5%FBS的DMEM培养液，充分吹打混匀后接种于多聚赖氨酸预包被的25 cm2培养瓶中，置37℃、5％（m/v）的CO2、饱和湿度的培养箱中培养，3 d首次换液；
8、贴壁的细胞呈卵圆形上皮样生长，2周左右上皮细胞逐渐减少，系膜细胞逐渐生长，多呈星状或三角形并伴有不规则的突起，18d后细胞生长密集，细胞团簇之间形成网络；
9、细胞免疫荧光鉴定：将肾小球系膜细胞种到放置于24孔板内的盖玻片上，体外培养6-8d，取出盖玻片，PBS洗3次，每次5min。4 %多聚甲醛固定20min，PBS 洗3 次，0.2% 渗透液Triton-100 室温下孵育15 min，PBS 洗3次，5 % BSA室温封闭1 h，吸去封闭液。加入α-SMA抗体于4℃过夜孵育，PBS 洗3次。滴加羊抗鼠PE荧光二抗 IgG(1:100)，在室温下置于湿盒内孵育45 min，PBS 洗3次，自然晾干后在显微镜下观察。
以上已经对本发明创造的较佳实施例进行详细阐述，但本发明创造不限定于上述实施例，凡在本发明的精神和原则之内作出任何修改，等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围内。

Claims (6)

1.一种大鼠肾小球系膜细胞分离及培养方法，包括步骤：（a）含双抗预冷PBS灌洗肾脏；（b）分离肾皮质，剪碎并于重叠筛网上进行研磨，收集筛网上的组织块，清洗数次；（c）混合酶消化，筛网过滤，收集滤液离心；（d）完全培养基重悬细胞沉淀，接种于多聚赖氨酸包被的培养瓶中；（e）培养数天后更换混合完全培养基继续培养；（f）细胞免疫荧光鉴定分离的肾小球系膜细胞。
2.根据权利要求1所述的大鼠肾小球系膜细胞分离及培养方法，其特征在于，所述的大鼠为体重150+30g的正常SD大鼠。
3.根据权利要求1所述的大鼠肾小球系膜细胞分离及培养方法，其特征在于，所述步骤b中重叠筛网为孔径分别为80目、100目和200目的不锈钢筛网。
4.根据权利要求1所述的大鼠肾小球系膜细胞分离及培养方法，其特征在于，所述步骤c中混合酶为0.05-0.1%IV胶原酶和0.05-0.1%I型胶原酶，消化时间为15-30min。
5.根据权利要求1所述的大鼠肾小球系膜细胞分离及培养方法，其特征在于，所述步骤d的多聚赖氨酸浓度为0.1-0.25mg/ml。
6.根据权利要求1所述的大鼠肾小球系膜细胞分离及培养方法，其特征在于，所述步骤d的完全培养基为含15%FCS和5%FBS的DMEM培养液。
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