CN1701787A - 丹参素在制备治疗脑血管疾病的药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了丹参素在制备治疗脑血管疾病的药物中的应用，具体地涉及丹参素在制备治疗缺血性脑中风的药物中的应用，丹参素在制备治疗NMDA受体诱导脑神经细胞损伤的药物中的应用，丹参素在制备治疗脑缺血或脑缺血再灌注的药物中的应用，丹参素在制备治疗脑外伤的药物中的应用。本发明还提供了含有丹参素的用于脑血管疾病的药物组合物，其单元剂量为50－200mg。

Description

丹参素在制备治疗脑血管疾病的药物中的应用

技术领域

本发明涉及丹参素在制备治疗脑血管疾病的药物中的应用。

背景技术

随着人口老龄化进程的加速以及生活方式的改变，脑血管疾病已成为一个全球性的健康问题，脑血管意外的死亡率在世界范围居第2位，极大的危害人民的健康。新型有效的防治脑血管病药物的开发已是临床亟需。

丹参素为中药丹参的水溶性成分，具有扩张血管、增加冠脉血流量、抗血栓形成等作用，为复方丹参滴丸、丹参注射液等的有效成分。

                    丹参素结构式

中药丹参广泛的应用于心脑血管疾病治疗，大量的文献资料报导了丹参对心肌缺血、脑缺血以及再灌注损伤的保护作用【韩畅，王孝铭，张国义.丹参对缺血和再灌注损伤心肌脂质过氧化和局部血流量的影响.哈尔滨医科大学学报.1990，24(4)：262～267；徐洪涛，陈士良，李兰荪.丹参对冠状动脉狭窄时左心室舒张功能的影响中西医结合杂志，1990，10(12)：737～739；郑若玄，方三曼，韩宝铭.丹参水提物对化学引起大白鼠心肌缺血的保护作用.中西医结合杂志.1990，10(10)：609～611；陶月玉，郭松铎，卢步峰，等.复方丹参对缺血心肌磷脂肌醇代谢的影响.中国中西医结合杂志.1993，13(6)：354～355】；李承珠等报导了丹参素的抗凝血作用【李承珠，杨诗春，赵凤娣.丹参素抗凝血作用的研究.中西医结合杂志.1983，3(5)：297-299】；李跃华等报导了丹参素对实验性肝损伤的保护作用【李跃华，吴翠贞，阙玲莉.丹参素增强肝细胞生长及其在药物性肝细胞损伤中的保护作用.南京医科大学学报.1996，16(4)：346～348；李菁，李跃华，薛隆翠等丹参素对实验性肝细胞损伤的防护作用.中西医结合肝病杂志.1996，6(3)：29～30】；匡培根等研究发现丹参可能通过影响HSP70的表达从而对局灶性缺血再灌注损伤具有保护作用【匡培根，吴卫平，刘军，等.局灶性缺血再灌注时丹参对热休克蛋白70的影响—免疫细胞化学及病理学研究.卒中与神经疾病.1995，3(2)：61～64】。但关于丹参素在体内具有治疗脑血管疾病的作用未见报道；鉴于此，本发明人通过大量的实验研究，发现丹参素具有治疗脑血管疾病的医药用途。

发明内容

本发明提供了丹参素在制备治疗脑中风的药物中的应用。

本发明提供了丹参素对脑缺血、NMDA受体诱导脑神经细胞损伤的保护作用。

本发明提供了丹参素在制备治疗脑缺血/再灌注损伤的药物中的应用。

本发明提供了丹参素在制备治疗脑外伤的药物中的应用。

本发明提供了以丹参素为活性成分的用于治疗脑血管疾病的药物组合物。

本发明所述的丹参素在用于上述任一用途时，其使用剂量范围为10mg～1000mg/天，优选剂量范围为100mg～500mg/天。

本发明中使用的丹参素按文献【邓喜玲，陈学敏.丹参素的合成和药理作用.农垦医学.2002，24(5)：362～364】所述方法制备。

本发明中使用的丹参素可以单独使用或以药物组合物形式使用。药物组合物包括作为活性成分的丹参素及药用载体，该药物组合物含有50mg～200mg单位剂量的丹参素和药用载体，优选为含有50mg～100mg单位剂量的丹参素和药用载体。该药物组合物可以通过口服、舌下、经皮、经肌肉或皮下、皮肤粘膜、静脉途径给药。药物组合物可以以粉针剂、注射液、片剂、胶囊、软胶囊、滴丸或口服液的形式存在。本发明所提供的各种药物剂型均可以以药学常规方法制备而成。

本发明人通过下列试验证实了丹参素具有治疗脑血管疾病的作用，下面的实施例用来更详细的说明本发明，但并不意味着本发明仅限于此。试验所用的丹参素由山东省天然药物工程技术研究中心现代中药研究室按文献【邓喜玲，陈学敏.丹参素的合成和药理作用.农垦医学.2002，24(5)：362～364】所述方法制备，经HPLC检测含量＞95％。

具体实施方式

制备例1：丹参素冻干粉针的制备

精密称取丹参素原料20.0g及药用甘露醇40.0g，溶于1000ml注射用水中，充分搅拌使溶解，补加注射用水至2000ml，加入针用活性碳2.0g，加热至60℃搅拌30分钟，碳棒过滤，滤液经0.25μm微孔滤膜过滤除菌，分装于1000支西林瓶中，装量2.0ml/支，冷冻干燥，即得。每支含丹参素20mg。

制备例2：丹参素注射液的制备

精密称取丹参素原料20.0g，溶于1000ml注射用水中，充分搅拌使溶解，补加注射用水至2000ml，加入针用活性碳2.0g，加热至60℃搅拌30分钟，碳棒过滤，滤液经0.25μm微孔滤膜过滤除菌，分装于1000支西林瓶中，装量2.0ml/支，封口，灭菌，即得。每支含丹参素20mg。

试验例1：丹参素对N-甲基-D-门冬氨酸所致大鼠神经细胞损伤的保护作用

(1)材料

丹参素：按文献【邓喜玲，陈学敏.丹参素的合成和药理作用.农垦医学.2002，24(5)：362～364】所述方法制备，用时以生理盐水稀释至合适浓度。多聚赖氨酸为Sigma公司产品。DMEM培养基为Gibco公司产品；其余试剂均为分析纯。

实验动物：普通级Sprague Dawley大鼠18只，♂，体重250g-280g，山东省天然药物工程技术研究中心实验动物中心提供，合格证号：鲁动质字200106005号。

(2)方法

(2.1)神经细胞原代培养

怀孕15d大鼠水合氯醛麻醉，75％乙醇消毒胸腹部，在无菌条件下取出胎鼠，剥出，分离两侧皮层组织，用手术刀切成糜状，移入含0.125％胰蛋白酶的磷酸缓冲液中消化30min(37℃)后弃去消化液，加入含10％胎牛血清，10％马血清，100μ/ml青霉素，100μ/ml链霉素的DMED培养液，用小口径吸管反复吹打分散，200目细胞筛过滤后，以DMEM调整细胞浓度至106个/ml，接种至预先涂有0.01％多聚赖氨酸的35mm培养皿中，每皿2ml，置CO₂培养箱中37℃孵育，于培养第3天在培养液中加入细胞分裂抑制剂阿糖胞普储备液(6μl/皿)以抑制非神经元细胞的过度增殖，作用48h后换新鲜培养液，以后每周换液2次，每次更换半量液。

(2.2)NMDA诱导神经细胞损伤

细胞培养至d14后，随机分正常对照组，NMDA 50μmol·L^-1组，  丹参素组(10、100μmol·L^-1)；各组换以含不同药物的低血清DMEM(5％胎牛血清，5％马血清，30mmol·L^-1HEPES)继续培养6h，再加50mmol·L^-1NMDA，孵育12h后按文献【阎超华，冯亦璞.丁基苯酞对低糖低氧诱导的大鼠皮层神经细胞损伤的保护作用.药学学报.1998，33(7)：486-492.】所述方法观察细胞形态，计算细胞死亡率。

(2.3)统计学处理

数据用 x±SD表示，组内给药前后、组间均以参比差值法(ANOVA)进行统计学处理。

(3)结果

(3.1)对培养神经细胞形态变化的影响

正常神经细胞培养至d14时，生长良好，胞体呈锥形、梭形或三角形，突触粗而长，呈树根状交织成网；当细胞在含50μmol·L^-1NMDA的培养基中孵育12h时，细胞出现肿胀、轮廓模糊，神经元突触断裂、消失、甚至细胞崩解；如细胞同时与10、100μmol·L^-1丹参素孵育，则细胞损伤程度明显减轻，细胞形态基本保持完整，但细胞密度有所降低，仍可见突触断裂等现象；表明丹参素对NMDA诱导的大鼠神经细胞损伤有显著的保护作用。

(3.2)对培养神经细胞死亡率的影响

神经细胞在含50μmol·L^-1NMDA的培养基中孵育12h后，台盼蓝染色着色细胞明显增多(NMDA 50μmol·L^-1组：86％vs正常对照组：10％，P＜0.001)，提示细胞死亡率增加；于培养基中同时加入10、100μmol·L^-1丹参素(分别为38％、24％)可明显降低细胞死亡率，与NMDA50μmol·L^-1组相比有显著差异。

试验例2：丹参素对大鼠局部脑缺血导致神经细胞损伤的影响

(1)材料：

丹参素注射剂：按制备例1方法制备。红四氮唑：美国Sigma公司产品，临用前用生理盐水配成4％溶液。实验动物：普通级Wistar大鼠，雄性，体重280g-350g，山东省天然药物工程技术研究中心动物实验中心提供。合格证号：鲁动质字200106005号。

(2)方法与结果：

动物随机分为假手术组(等容量溶剂)，模型对照组(等容量溶剂)，尼莫地平组(Nim，1.5mg/kg)，丹参素1mg/kg组，丹参素5mg/kg组，丹参素10mg/kg组，丹参素25mg/kg组，丹参素50mg/kg组，丹参素100mg/kg组，每组10只。禁食12小时后，水合氯醛(350mg/kg，i.p.)麻醉，分离右侧颈总动脉，夹闭颈内、颈总动脉，颈外动脉近心端及远心端结扎，中间剪断。将颈外动脉游离端拉至与颈内动脉成一条直线，将栓线(选用直径0.24mm尼龙线，长度5.0cm)由颈外动脉插入至颅内，遇轻微阻力时停止，插入深度约为2cm。结扎颈外动脉开口，并打开颈总动脉动脉夹，消毒缝合伤口，造成左侧大脑中动脉缺血模型；假手术组仅进行右侧颈总动脉、颈内动脉、颈外动脉的分离(以上实验均在23℃～25℃进行)。术后各组动物静脉注射相应药物(给药体积1ml/200g)。24小时后按文献【刘小光，徐理纳，一种能评价溶栓和抗溶栓的大鼠脑中动脉模型，药学学报，1995，30：662】所述方法及标准观察并记录大鼠的行为障碍：(A)提鼠尾观察前肢屈曲情况，如双前肢对称伸向地面，计为0分，如手术对侧前肢出现腕屈曲计为1分，肘屈曲计为2分，肩内旋计为3分，既有腕屈曲和/或肘屈曲，又有肩内旋者，计为4分。(B)将动物置于平地面上，分别推双肩向对侧移动，检查阻力。如双侧阻力对等且有力，计为0分，如向手术对侧推动时阻力下降者，根据下降程度不同分为轻、中、重三度，分别计为1，2和3分。(C)将动物双前肢置一金属网上，观察双前肢的肌张力。双前肢肌张力对等且有力者计为0分。同样根据手术对侧肌张力下降程度不同计为1，2和3分。(D)动物有不停地向一侧转圈者，计为1分。根据标准评分，满分为11分，分数越高，表示动物行为障碍越严重。

行为评分后处死大鼠，取脑，去掉嗅球、小脑和低位脑干，冠状切成5片，脑片用红四氮唑(TTC)染色，正常组织经染色后呈红色，梗塞组织呈白色，染色后照相，用中国航空航天大学病理图像分析软件求梗塞面积比。数据用 X±s表示，以组间t检验进行统计学处理。

结果如表1所示，缺血24小时后，大鼠表现出明显的行为障碍，大鼠脑组织也出现明显的灶状缺血区，达到全脑的25％左右；给予不同剂量的丹参素，动物行为障碍有不同程度的减轻，大鼠脑缺血区也有明显好转，且呈剂量依赖性。

丹参素50mg/kg抗脑缺血作用强于25mg/kg(P＜0.05)，但是与100mg/kg比较无明显差别(P＞0.05)。提示当剂量≥50mg/kg时，药效并没有继续增加。

        表1  丹参素对大鼠局部脑缺血损伤的影响( χ±SD，n＝10)

组别	行为障碍		缺血面积(％)
				假手术组	0		0
模型对照组	10.10±1.37		24.26±4.13
				Nim组	6.90±2.33**		13.09±7.11**
丹参素组	1mg/kg	7.90±1.24*	18.21±2.73*
				5mg/kg	7.70±2.44*	17.06±3.20*
	10mg/kg	7.50±3.03*	16.41±2.84*
				25mg/kg	7.31±1.08**Δ	14.22±3.14**Δ
	50mg/kg	5.34±1.28**	10.18±3.64**
				100mg/kg	5.20±1.93**#	10.27±4.73**#

与模型对照组比较^*P＜0.05，^**P＜0.01；与50mg/kg组比较^ΔP＜0.05，^#P＞0.05。

试验例3：丹参素对大鼠脑缺血/再灌注导致神经细胞损伤的影响

(1)材料：

丹参素注射剂：按制备例2方法制备。红四氮唑：美国Sigma公司产品，临用前用生理盐水配成4％溶液。实验动物：普通级Wistar大鼠，雄性，体重280g-350g，山东省天然药物工程技术研究中心动物实验中心提供。合格证号：鲁动质字200106005号。

(2)方法与结果：

动物随机分为假手术组(等容量溶剂)，模型对照组(等容量溶剂)，尼莫地平组(Nim，1.5mg/kg)，丹参素1mg/kg组，丹参素5mg/kg组，丹参素10mg/kg组，丹参素25mg/kg组，丹参素50mg/kg组，丹参素100mg/kg组，每组10只。禁食12小时后，按实验例1所述方法造成左侧大脑中动脉缺血；术后10min各组动物静脉注射相应药物(给药体积1ml/200g)。缺血2小时后，抽出尼龙线，造成大鼠脑缺血/再灌注损伤；再灌24h后处死大鼠，取脑，去掉嗅球、小脑和低位脑干，冠状切成5片，脑片置10％福尔马林中固定，经脱水、浸蜡、包埋、切片等步骤后，制成8um厚的组织切片，甲苯胺蓝染色，选择每只大鼠视交叉与漏斗柄连线中点处按文献【刘小光，冯亦璞.丁基苯酞对局部脑缺血大鼠行为和病理改变的保护作用.药学学报.1995，30(12)：896-903】所述方法用细胞计数器进行细胞计数，细胞核消失、细胞体暗染作为神经元坏死的指标，计算坏死神经元数占总神经元数的百分比。

数据用 x±SD表示，组内给药前后、组间均以参比差值法(ANOVA)进行统计学处理。

结果显示，模型对照组大鼠神经元周围间隙扩大，出现散在的暗染神经元，神经细胞出现不同程度的皱缩。给予丹参素组动物有不同程度的减轻。我们以相同切面的脑片半影区来进行细胞计数。由表2可见，不同剂量丹参素治疗组皮层、纹状体神经元坏死百分比明显减少，与模型对照组比较差异显著(P＜0.05或P＜0.01)。

丹参素50mg/kg抗脑缺血/再灌损伤作用强于25mg/kg(P＜0.05)，但是与100mg/kg比较无明显差别(P＞0.05)。提示当剂量≥50mg/kg时，药效并没有继续增加。

表2丹参素对局部脑缺血大鼠神经元坏死百分比的影响( χ+SD，n＝10)

组别		神经元坏死百分比(％)
				皮层神经元	纹状体神经元
		假手术组				0	0
模型对照组				44±12％	32±9％
		尼莫地平组				29±6％*	21±8％*
丹参素组	1mg/kg			24±7％*	18±5％*
		5mg/kg	22±5％*			16±5％*
	10mg/kg			21±6％*	15±3％*
		25mg/kg	19±3％*Δ			14±2％*Δ
	50mg/kg			13±4％**	10±3％**
		100mg/kg	12±6％**#			9±2％**#

与模型对照组比较^*P＜0.05，^**P＜0.01；与50mg/kg组比较^ΔP＜0.05，^#P＞0.05。

试验例4：丹参素对小鼠闭合性脑外伤的保护作用

(1)材料：

丹参素注射剂：按制备例2方法制备。清洁级昆明系小鼠，18～22g，雌雄各半，由山东省天然药物工程技术研究中心动物实验中心提供。合格证号：鲁动质字200106003号。

(2)方法与结果

取小鼠80只，随机分为正常对照组(等容量溶剂)，模型对照组(等容量溶剂)，丹参素2mg/kg组，丹参素10mg/kg组，丹参素20mg/kg组，丹参素50mg/kg组，丹参素100mg/kg组，丹参素200mg/kg组，每组10只。按文献【王超云，蒋王林，智红英，等.黄芩苷对脑损伤的保护作用.中草药，2004，35(2)：188～190】所述方法造成小鼠闭合性脑外伤模型，各组静脉给药，24小时后剥取鼠脑，称量湿重，70℃烘干24小时，称干重，计算脑含水量；脑含水量高于正常值表示脑部水肿。

结果如表3所示，闭合性脑外伤造成小鼠脑严重水肿，给予不同剂量的丹参素，小鼠脑水肿有不同程度的减轻，且呈剂量依赖性。

丹参素100mg/kg降低脑水肿作用强于50mg/kg(P＜0.05)，但是与200mg/kg比较无明显差别(P＞0.05)。提示当剂量≥100mg/kg时，药效并没有继续增加。

表3丹参素对闭合性脑外伤的影响( χ±SD，n＝10)

组别		脑含水量(％)
			正常对照组		79.1±0.3**
模型对照组		82.5±1.3
			丹参素组	2mg/kg	81.6±0.4*
10mg/kg	81.1±0.6*
		20mg/kg		80.9±0.5*
50mg/kg	80.7±0.4**Δ
		100mg/kg		79.4±0.4**
200mg/kg	79.5±0.3**#

与模型对照组比较^*P＜0.05，^**P＜0.01；与100mg/kg组比较^ΔP＜0.05，^#P＞0.05。

试验例5：丹参素急性毒性试验

(1)材料：

丹参素注射剂：按制备例1制备。清洁级昆明系小鼠，18～22g，雌雄各半，由山东省天然药物工程技术研究中心动物实验中心提供。合格证号：鲁动质字200106003号。饲料由中国药品生物制品鉴定检验所提供。

(2)方法

根据预试验设计给药剂量并分组空白对照组、100mg/kg、150mg/kg、225mg/kg、337.5mg/kg、506.25mg/kg、759.375mg/kg、1139.0625mg/kg组，共8组，每组10只。称重后，按0.2ml/10g的体积静脉注射，对照组给予等体积溶剂。给药后密切观察小鼠的毒性反应和7天内死亡情况，并按改进寇氏法测定LD₅₀。

(3)结果

丹参素注射剂的LD₅₀为688.7±78.6mg/kg；LD₅₀的95％可信限：589.2～729.5mg/kg。

Claims (10)

1.丹参素在制备治疗脑血管疾病的药物中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，丹参素在制备治疗缺血性脑中风的药物中的应用。

3.根据权利要求1所述的应用，丹参素在制备治疗NMDA受体诱导脑神经细胞损伤的药物中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，丹参素在制备治疗由脑缺血或脑缺血再灌注引起的NMDA受体诱导脑神经细胞损伤的药物中的应用。

5.根据权利要求1所述的应用，丹参素在制备治疗脑缺血或脑缺血再灌注的药物中的应用。

6.根据权利要求1所述的应用，丹参素在制备治疗脑外伤的药物中的应用。

7.根据权利要求1～6任一所述的应用，丹参素的使用剂量范围为10mg～1000mg/日。

8.根据权利要求7所述的应用，丹参素的使用剂量范围优选为100mg～500mg/日。

9.一种用于治疗脑血管疾病的药物组合物，其特征在于含有50mg～200mg的丹参素和药用载体。

10.根据权利要求9所述的药物组合物，其特征在于含有50mg～100mg的丹参素和药用载体。