CN115887478B - 一种组合物在制备治疗脑缺血的药物中的应用及治疗脑缺血的药物 - Google Patents
一种组合物在制备治疗脑缺血的药物中的应用及治疗脑缺血的药物 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于中药领域技术领域，具体涉及一种组合物在制备治疗脑缺血的药物中的应用及治疗脑缺血的药物。本发明提供了一种组合物在制备治疗脑缺血的药物中的应用，所述组合物为丹参素和芍药苷，所述组合物中丹参素和芍药苷的质量比为(0.1～5):1。本发明所述丹参素和芍药苷组合物具有抗氧化应激的作用，可以上调Nrf2的表达。实施例结果表明：本发明组合物可以改善脑缺血大鼠的神经功能损伤，减少脑梗死面积，增强脑组织抗氧化能力；该作用可能与药物调控Nrf2/Keap1信号通路从而减轻氧化应激有关。
Description
技术领域
本发明属于中药领域技术领域，具体涉及一种组合物在制备治疗脑缺血的药物中的应用及治疗脑缺血的药物。
背景技术
方剂遵循中医药理论的指导，以中药(饮片)配伍来组方制药，具有理论优势和丰富的临床应用经验。但由于中药饮片成分繁杂，质量难以控制，疗效机理很难说清，导致对方剂发挥疗效的规律认识不足，影响了方剂疗效的稳定发挥，也阻碍了中药产品质量的提升。随着中药现代化进程不断发展，越来越多的研究者利用现代先进的分离技术，将中药中的有效成分/部位分离出来，进行配伍组合以实现增效减毒的目的，这将为现代中药创新药研制开拓了新的范式和领域。
中药有效成分配伍实现的基本方法之一是针对病理环节的配伍，是指应用中药的现代知识，结合传统的中医理论，针对主要病理环节，选择针对性的药物，设计出一定的中药有效成分复方，并对组方进行优化研究，其关键问题是根据药效指标群寻找最优的中药有效成分配伍的剂量和比例。现代研究发现，丹参素和芍药苷均具有减轻缺血性脑损伤的作用，但是关于丹参素和芍药苷的联合应用治疗脑缺血还未见报道。
发明内容
本发明的目的提供一种组合物在制备治疗脑缺血的药物中的应用和一种治疗脑缺血的药物，本发明所述的组合物可以改善脑缺血大鼠的神经功能损伤，减少脑梗死面积，增强抗氧化能力；该作用可能与药物调控Nrf2/Keap1信号通路从而减轻氧化应激有关。
为了解决上述问题，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种组合物在制备治疗脑缺血的药物中的应用，所述组合物为丹参素和芍药苷，所述组合物中丹参素和芍药苷的质量比为(0.1～5):1。
优选的，所述组合物中丹参素的摩尔浓度为40～160μmol/L，所述组合物中芍药苷的摩尔浓度为40～160μmol/L。
优选的，所述治疗脑缺血包括减轻缺血性脑神经损伤、降低脑梗死面积和增强脑组织抗氧化能力中的一种或几种。
优选的，所述治疗脑缺血包括制备以下1)～6)一个或者几个方面药物中的应用：
1)降低丙二醛(MDA)水平；
2)增强超氧化物歧化酶(SOD)活性；
3)增强谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性；
4)增强总抗氧化能力(T-AOC)活性；
5)上调Nrf2的表达；
6)调控Nrf2/Keap1通路。
本发明提供了一种治疗脑缺血的药物，包括上述技术方案所述的组合物和药学上可接受的辅料。
优选的，所述药物的剂型包括口服剂型、注射剂和栓剂中的一种或两种以上。
本发明的有益效果：本发明提供了一种组合物在制备治疗脑缺血的药物中的应用和一种治疗脑缺血的药物，所述组合物为丹参素和芍药苷，所述组合物中丹参素和芍药苷的质量比为(0.1～5):1。本发明所述丹参素对脑缺血损伤的保护机制主要有抗氧化应激、抗炎、保护神经细胞、抑制血小板聚集、抗细胞凋亡、调节神经递质等。芍药苷通过抗氧化应激、抑制细胞凋亡、促进神经增长、减轻细胞钙超载损伤、平衡离子通道等作用机制挥发保护脑缺血损伤的作用。丹参素和芍药苷之间存在相互协同促进作用，在特定的配比下实现了“改善其神经功能损伤，减少脑梗死面积，增强抗氧化能力”的技术效果。实施例结果表明：本发明组合物可以改善脑缺血大鼠的神经功能损伤，减少脑梗死面积，增强抗氧化能力；丹参素和芍药苷联合应用可显著促进Nrf2的核转移，调控Nrf2/Keap1信号通路。该丹参素和芍药苷联合应用增强抗氧化能力作用可能与药物调控Nrf2/Keap1信号通路从而减轻氧化应激有关。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1为实施例2各组大鼠脑组织的TTC染色后结果；
图2为实施例2各组大鼠脑组织的HE染色后结果。
具体实施方式
本发明提供了一种组合物在制备治疗脑缺血的药物中的应用，所述组合物为丹参素和芍药苷，所述组合物中丹参素和芍药苷的质量比为(0.1～5):1。
在本发明中，所述组合物中丹参素和芍药苷的质量比为(0.1～5):1，优选为(0.2～4.5):1，更优选为1.65:1。
本发明所述丹参素的分子式为C9H10O5，分子量198.17，CAS号为：76822-21-4，结构式如式I所示，丹参素对脑缺血损伤的保护机制主要有抗氧化应激、抗炎、保护神经细胞、抑制血小板聚集、抗细胞凋亡、调节神经递质。
本发明所述芍药苷的分子式为C23H28O11，分子量480.45，CAS号为：23180-57-6，结构式如式Ⅱ所示，丹参素对脑缺血损伤的保护机制主要有抗氧化应激、抗炎、保护神经细胞、抑制血小板聚集、抗细胞凋亡、调节神经递质。
如无特殊要求，本发明对丹参素和芍药苷来源没有特殊限定，采用丹参素和芍药苷纯度≥98％即可。
在本发明中，所述组合物中丹参素的摩尔浓度优选为40～160μmol/L，进一步优选为50～150μmol/L，更优选为140μmol/L，所述组合物中芍药苷的摩尔浓度为40～160μmol/L，进一步优选为45～100μmol/L，更优选为55μmol/L。在本发明实施例中，所述组合物中丹参素的摩尔浓度优选为160μmol/L，芍药苷的摩尔浓度为40μmol/L，即丹参素和芍药苷质量比1.65:1配伍时抗氧化作用最强。
在本发明中，所述制备治疗脑缺血优选包括减轻缺血性脑损伤、降低脑梗死面积和增强脑组织抗氧化能力中的一种或几种，所述治疗脑缺血包括制备以下1)～6)一个或者几个方面药物中的应用：
1)降低MDA水平；
2)增强SOD活性；
3)增强GSH-Px活性；
4)增强T-AOC活性；
5)上调Nrf2的表达；
6)调控Nrf2/Keap1通路。
本发明提供了治疗脑缺血的药物，所述药物为上述技术方案所述的组合物或包括上述技术方案所述的组合物和药学上可接受的辅料。
在本发明中，所述药物的剂型优选包括口服剂型、注射剂和栓剂，所述口服剂型优选包括口服液、颗粒剂、片剂和粉剂中的一种或两种以上。
本发明对所述组合物剂型的制备方法无特殊限定，本领域已知的药物剂型均在本发明的保护范围内。
本发明的技术方案丹参素和芍药苷配伍后可显著提高氧糖剥夺的小鼠小胶质细胞的存活率，增强SOD活性，降低MDA(氧化应激标志产物)水平，其中以丹参素和芍药苷质量比为1.65:1时配伍抗氧化作用最强；以此比例干预脑缺血大鼠，可明显改善其神经功能损伤，减少脑梗死面积，增强抗氧化能力，丹参素-芍药苷可显著促进Nrf2的核转移，调控Nrf2/Keap1信号通路。该丹参素和芍药苷增强抗氧化能力的作用可能与药物调控Nrf2/Keap1信号通路从而减轻氧化应激有关。
为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的技术方案进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1丹参素和芍药苷的配伍比例优化
建立氧糖剥夺小鼠小胶质细胞(BV2)模型，基于基线等比增减设计方法给予不同配比的丹参素和芍药苷干预，检测各组细胞存活率、SOD活性和MDA水平，筛选丹参素和芍药苷的最优配伍比例。
(1)建立氧糖剥夺小鼠小胶质细胞模型
氧糖剥夺的小鼠小胶质细胞模型，小鼠小胶质细胞(BV2)购买于北京中科质检生物技术有限公司：将DMEM高糖培养基更换为DMEM无糖培养基，并将BV2细胞至于低氧培养箱(93％N2，5％CO2，2％O2)缺糖缺氧培养16h，培养箱温度为37℃；氧糖剥夺处理结束后，换成DMEM高糖培养基，转入普通培养箱培养24h。DMEM无糖培养基和高糖培养基均购买自ThermoFisher Scientific公司。
(2)试验分组
实验分8组：以200μmol/L为丹参素和芍药苷的总浓度，基于基线等比增减设计方法，设计了6组丹参素和芍药苷不同配比组，同时另设空白组和模型组，具体的各组药物摩尔浓度见表1，各药物用去离子水配置。
表1各组的药物摩尔浓度
(3)配伍比例筛选
空白组细胞为BV2细胞，以1×104个/孔接种于96孔中，37℃常规培养箱中培养16h后，换DMEM高糖培养基于常规细胞培养箱中培养，按照表1中的设置不加相应药物干预，在37℃培养24h。空白组设置3个复孔。
模型组、5:0组、4:1组、3:2组、2:3组、1:4组、0:5组的BV2细胞以1×104个/孔接种于96孔中，按照氧糖剥夺模型的方法进行处理后，换成DMEM高糖培养基，按照表1中的剂量各组分别加入相应药物干预，其中5:0组的丹参素体积5μL和芍药苷体积0μL、4:1组的丹参素体积5μL和芍药苷体积5μL、3:2组的丹参素体积5μL和芍药苷体积5μL、2:3组的丹参素体积5μL和芍药苷体积5μL、1:4组的丹参素体积5μL和芍药苷体积5μL、0:5组的丹参素体积0μL和芍药苷体积5μL，添加药物之后在37℃培养24h。每组设置3个复孔。
24h后，空白组细胞、模型组、5:0组、4:1组、3:2组、2:3组、1:4组、0:5组的细胞采用CCK-8法检测各组细胞存活率，SOD活性和MDA水平用相应的试剂盒进行检测。SOD试剂盒(WST-1法)和MDA(Cell Samples)试剂盒购买于武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司。
CCK-8法检测步骤：空白组、模型组、5:0组、4:1组、3:2组、2:3组、1:4组、0:5组的每个细胞培养孔中加入10μL CCK-8溶液，37℃培养2h，采用酶标仪测定450nm处的吸光度值，计算细胞存活率(细胞存活率＝培养完成后实验组吸光度值/空白组吸光度值×100％)。
结果如表2所示：与空白组比较，模型组细胞存活率和SOD活性显著降低(P<0.01)，MDA水平显著升高(P<0.01)；与模型组比较，丹参素和芍药苷不同配比均能不同程度的提高细胞存活率，增强SOD活性，降低MDA水平，其中以丹参素-芍药苷的摩尔浓度比为4:1(即质量比1.65:1)时作用最强，在后续动物实验中将采用该比例进行动物给药。
表2各组细胞存活率
| 分组 | 细胞存活率(％) | SOD活性(U/mL) | MDA水平(nmol/mL) |
| 空白组 | 99.99±1.55 | 196.23±7.57 | 1.38±0.35 |
| 模型组 | 71.49±3.95** | 114.80±5.84** | 5.83±0.18** |
| 5:0组 | 86.12±4.46## | 143.27±11.07#& | 3.90±0.44##&& |
| 4:1组 | 92.31±2.78## | 173.31±6.07## | 1.85±0.39## |
| 3:2组 | 89.01±1.32## | 153.98±8.14## | 3.13±0.08##& |
| 2:3组 | 89.39±4.08## | 164.49±10.19## | 2.71±0.37## |
| 1:4组 | 81.80±5.74 | 136.02±7.17&& | 4.93±0.55&& |
| 0:5组 | 87.43±3.96## | 135.37±12.92&& | 4.56±0.58#&& |
注：与空白组比较，**P＜0.01；与模型组比较，#P＜0.05，##P＜0.01；与4:1组比较，&P＜0.05，&&P＜0.01。
实施例2丹参素和芍药苷配伍对脑缺血大鼠的作用
建立大鼠脑缺血模型，给药结束后，对各组大鼠神经功能评分、脑梗死面积、脑组织病理学、氧化应激因子水平进行检测，明确丹参素和芍药苷配伍减轻缺血性脑损伤的作用。
(1)实验对象
1)建立大鼠脑缺血模型
大鼠术前禁食12h，自由饮水，用1％戊巴比妥钠麻醉后，仰卧固定。颈部皮肤消毒、备皮，沿正中剪开皮肤，钝性分离肌肉，暴露并分离右侧颈总动脉(CCA)、颈外动脉(ECA)和颈内动脉(ICA)。结扎ECA与CCA近心端，用动脉夹夹闭ICA远心端，于ECA与ICA分叉处作一切口，插入丝线，去除动脉夹，继续推进，插入深度为18mm左右，实现右侧大脑中动脉阻塞导致脑缺血，逐层缝合；90min后拔出线栓，实现缺血再灌注，完成手术。
2)建立大鼠假手术组：大鼠术前禁食12h，自由饮水，用1％戊巴比妥钠麻醉后，仰卧固定。颈部皮肤消毒、备皮，沿正中剪开皮肤，钝性分离肌肉，暴露并分离CCA、ECA和ICA。结扎ECA与CCA近心端，用动脉夹夹闭ICA远心端，于ECA与ICA分叉处作一切口，去除动脉夹，逐层缝合，完成手术。
3)分组与给药
大鼠分为模型组、依达拉奉组、丹参素组、芍药苷组、丹参素-芍药苷低剂量组、丹参素-芍药苷高剂量组、假手术组，每组14只大鼠，各组大鼠的给药剂量按照大鼠的体重计算。
依达拉奉组(购于国药集团国瑞药业有限公司)给予依达拉奉(5.4mg/Kg)、丹参素组给予丹参素(21.2mg/Kg)、芍药苷组给予芍药苷(21.2mg/Kg)、丹参素-芍药苷低剂量组给予丹参素(6.6mg/Kg)和芍药苷(4mg/Kg)、丹参素-芍药苷高剂量组给予丹参素(13.2mg/Kg)和芍药苷(8mg/Kg)干预，分别于大鼠造模前30min、再灌注即刻(0h)、再灌注24h、48h、72h经腹腔注射给药。各组药物用去离子水配置。模型组大鼠注射生理盐水5mL/Kg。假手术组大鼠注射生理盐水5mL/Kg。
(2)大鼠神经功能评分
末次给药30min后，参照Longa评分法对假手术组、模型组、依达拉奉组、丹参素组、芍药苷组、丹参素-芍药苷低剂量组、丹参素-芍药苷高剂量组大鼠进行神经功能评分：0分-正常，无神经损害的症状；1分-不能伸展脑缺血对侧的前肢；2分-向缺血对侧转圈；3分-向缺血对侧倾倒；4分-不能自发行走，意识丧失。
参照Longa评分法对大鼠进行神经功能评分，结果见表3所示：模型组大鼠均表现出严重的神经功能损伤情况，左侧肢体无力，行走时身体向左侧偏斜或旋转，甚至不能自发行走，提尾悬空时左前肢屈曲；与模型组相比，各给药组大鼠活动增多，神经功能明显改善，各组的评分均不同程度的降低，其中依达拉奉、丹参素、低、高剂量组的神经功能评分降低显著(P<0.05，P<0.01)。
表3各组大鼠神经功能评分结果
注：与假手术组比较，**P＜0.01；与模型组比较，#P＜0.05，##P＜0.01。
(3)大鼠脑梗死面积测定
对假手术组、模型组、依达拉奉组、丹参素组、芍药苷组、丹参素-芍药苷低剂量组、丹参素-芍药苷高剂量组各组大鼠进行神经功能评分后，分别取脑，将脑于-20℃下冷冻20min后沿冠状面将大脑切成厚度均匀的5份，置于提前预热的1％TTC染色液中，37℃避光孵育15min后置于4％多聚甲醛溶液中固定24h，取出切片吸干，拍照。采用Image-pro plus6.0图像分析软件分析大鼠的脑梗死面积，计算梗死组织百分比，公式如下：梗死脑组织百分比＝梗死面积/组织面积×100％。
经TTC染色后，正常脑组织呈红色，缺血梗死脑组织呈白色。染色后结果如图1所示：假手术组未见明显白色梗死区域，模型组大鼠脑组织呈现出明显较大范围的梗死区域；与模型组相比，各给药组大鼠脑梗死区域明显缩小。根据梗死脑组织百分比的计算公式对各组大鼠脑组织的梗死面积进行计算，结果见表4所示：与模型组相比，各给药组大鼠脑梗死面积均显著减少(P<0.05，P<0.01)；与单独给药组相比，配伍高剂量组对缺血灶的改善作用明显增强(P<0.05，P<0.01)。
表4各组大鼠脑梗死面积结果
| 分组 | 大鼠脑梗死面积(％) |
| 假手术组 | 0 |
| 模型组 | 28.51±5.12** |
| 依达拉奉组 | 12.59±2.10## |
| 丹参素组 | 21.22±2.54# |
| 芍药苷组 | 23.18±3.30 |
| 丹参素-芍药苷低剂量组 | 18.37±4.55## |
| 丹参素-芍药苷高剂量组 | 14.66±2.52##&$$ |
注：与假手术组比较，**P＜0.01；与模型组比较，#P＜0.05，##P＜0.01；与丹参素组比较，&P＜0.05；与芍药苷组比较，$$P＜0.01。
(4)脑组织病理学观察
对假手术组、模型组、依达拉奉组、丹参素组、芍药苷组、丹参素-芍药苷低剂量组、丹参素-芍药苷高剂量组各组大鼠进行神经功能评分后，分别取脑，部分放于-80℃冰箱保存，剩余以4％多聚甲醛固定。将固定好的脑组织进行石蜡包埋、切片、HE染色后，进行脑组织病理学观察。
经过HE染色并于光学显微镜下观察，如图2所示：假手术组神经细胞形态基本正常，结构完整、排列整齐；模型组脑组织可见明显梗死灶，细胞排列紊乱、疏松，细胞肿胀，细胞核固缩深染，部分呈现空泡样坏死；与模型组比较，各给药组脑组织梗死灶明显缩小，尤其是丹参素-芍药苷高剂量组，细胞排列较整齐，细胞核较清晰，胞质较丰富，提示丹参素-芍药苷可改善脑缺血大鼠的脑损伤。
(5)氧化应激因子检测
按照试剂盒说明，分别检测假手术组、模型组、依达拉奉组、丹参素组、芍药苷组、丹参素-芍药苷低剂量组、丹参素-芍药苷高剂量组大鼠脑组织中T-AOC、SOD、GSH-Px和MDA水平。T-AOC(总抗氧化能力)、SOD(超氧化物歧化酶)、GSH-Px(谷胱甘肽过氧化物酶)和氧化应激产物丙二醛(MDA)检测试剂盒均购买于武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司。
分别对各组大鼠脑组织中SOD、MDA、GSH-Px、T-AOC活性进行检测，结果如表5：与假手术组相比，模型组大鼠脑组织中SOD、GSH-Px和T-AOC活性均显著减弱(P<0.01)，MDA水平显著升高(P<0.01)；与模型组相比，各给药组大鼠脑组织中SOD、GSH-Px和T-AOC活性均不同程度的增强，MDA水平均不同程度的降低；与丹参素组相比，丹参素和芍药苷高剂量配伍后MDA水平显著降低(P<0.05)，T-AOC活性显著增强(P<0.05)；与芍药苷组相比，丹参素和芍药苷高剂量配伍后MDA水平显著降低(P<0.05)。
表5各组大鼠脑组织氧化应激指标水平的比较结果
| SOD(U/mL) | MDA(μmol/L) | GSH-Px(U/mg) | T-AOC(mM) | |
| 假手术组 | 135.74±5.68 | 3.69±0.63 | 62.58±3.20 | 12.52±1.15 |
| 模型组 | 85.05±8.33** | 9.88±1.52** | 37.92±7.50** | 6.77±1.13** |
| 依达拉奉组 | 128.34±10.59## | 3.33±1.25## | 58.07±3.48# | 10.55±0.76## |
| 丹参素组 | 116.26±9.84# | 6.96±0.97# | 48.93±8.86 | 7.53±0.88 |
| 芍药苷组 | 114.10±6.53# | 6.44±0.72# | 50.21±6.27 | 8.54±0.70 |
| 丹参素-芍药苷低剂量组 | 115.84±9.72# | 4.35±0.97## | 53.77±4.30 | 9.84±0.91# |
| 丹参素-芍药苷高剂量组 | 125.75±10.71## | 3.59±0.67##&$ | 56.94±5.25# | 10.44±1.08##& |
注：与假手术组比较，**P＜0.01；与模型组比较，#P＜0.05，##P＜0.01；与丹参素组比较，&P＜0.05；与芍药苷组比较，$P＜0.05。
实施例3基于Nrf2/Keap1信号通路探讨丹参素和芍药苷配伍减轻缺血性脑损伤的作用机制
考察各组大鼠脑组织中Nrf2/Keap1信号通路相关蛋白的表达水平；并通过细胞实验，加入Nrf2抑制剂鸦胆子苦醇抑制Nrf2的表达，进一步验证丹参素和芍药苷配伍减轻缺血性脑损伤的作用与Nrf2/Keap1信号通路有关。
(1)各组大鼠脑组织Nrf2、Keap1、HO-1、NQO1蛋白水平表达检测
分别取适量各组大鼠脑组织，加入裂解液并充分匀浆，离心后吸取上清，检测总蛋白含量。SDS-PAGE凝胶电泳后，转膜，分别加入相应一抗Nrf2、Keap1、HO-1、NQO1(均购于武汉三鹰生物技术有限公司)，于4℃孵育过夜，用β-actin作为内参，再加入辣根过氧化物酶标记羊抗兔二抗(购于碧云天生物科技有限公司)在37℃孵育90min，进行Western Blot分析。
分别对实施例2各组大鼠脑组织Nrf2、Keap1、HO-1、NQO1的蛋白表达水平进行检测，结果如表6所示：与假手术组相比，模型组大鼠脑组织中Nrf2、Keap1、HO-1、NQO1蛋白表达水平升高，其中NQO1蛋白表达水平显著升高(P<0.05)；与模型组相比，各给药组大鼠脑组织中Nrf2、HO-1和NQO1蛋白表达水平均不同程度的升高，Keap1蛋白表达水平不同程度的降低；其中，丹参素-芍药苷低剂量可显著升高HO-1和NQO1蛋白表达水平(P<0.05，P<0.01)，丹参素-芍药苷高剂量可显著升高Nrf2、HO-1和NQO1蛋白表达水平(P<0.05，P<0.01)，显著降低Keap1蛋白表达水平(P<0.05)。
表6各组大鼠脑组织Nrf2/Keap1信号通路主要蛋白的表达水平比较结果
| Nrf2 | Keap1 | HO-1 | NQO1 | |
| 假手术组 | 0.39±0.06 | 0.77±0.23 | 0.59±0.14 | 0.11±0.04 |
| 模型组 | 0.67±0.18 | 1.05±0.29 | 0.90±0.16 | 0.87±0.11* |
| 依达拉奉组 | 1.29±0.24# | 0.52±0.19# | 1.33±0.13# | 1.84±0.25## |
| 丹参素组 | 0.93±0.23 | 0.84±0.09 | 1.13±0.14 | 1.38±0.19 |
| 芍药苷组 | 0.93±0.16 | 0.86±0.19 | 1.19±0.20 | 1.42±0.23 |
| 丹参素-芍药苷低剂量组 | 1.20±0.28 | 0.68±0.14 | 1.31±0.09# | 1.69±0.30## |
| 丹参素-芍药苷高剂量组 | 1.35±0.29# | 0.50±0.13# | 1.44±0.16## | 1.83±0.34## |
注：与假手术组比较，*P＜0.05；与模型组比较，#P＜0.05，##P＜0.01。
(2)鸦胆子苦醇处理对BV2细胞Nrf2、Keap1蛋白水平表达检测
空白组细胞为小鼠小胶质细胞(BV2)，BV2细胞以1×104个/孔接种于96孔中，细胞不进行氧糖剥夺处理，也不进行药物干预，在培养箱中37℃正常培养48h。设置3个复孔。
模型组细胞为小鼠小胶质细胞(BV2)，BV2细胞以1×104个/孔接种于96孔中，BV2细胞进行氧糖剥夺处理，氧糖剥夺处理方法同实施例1；不进行药物干预，换成DMEM高糖培养基，在培养箱中37℃正常培养24h。设置3个复孔。
丹参素-芍药苷组的BV2细胞以1×104个/孔接种于96孔中，BV2细胞进行氧糖剥夺处理，氧糖剥夺处理方法同实施例1；氧糖剥夺处理后，换成DMEM高糖培养基，再加入药物(丹参素摩尔浓度160μmoL/L+芍药苷组摩尔浓度40μmoL/L)干预，丹参素体积5μL，芍药苷体积5μL，在37℃正常培养24h。设置3个复孔。
丹参素-芍药苷-鸦胆子苦醇组的BV2细胞以1×104个/孔接种于96孔中，先加入质量浓度为0.09μg/mL鸦胆子苦醇(Nrf2抑制剂)干预8h；鸦胆子苦醇干预后进行氧糖剥夺处理，氧糖剥夺处理方法同实施例1；氧糖剥夺处理后，换成DMEM高糖培养基，再加入药物(丹参素摩尔浓度160μmoL/L+芍药苷组摩尔浓度40μmoL/L)干预，丹参素体积5μL，芍药苷体积5μL，在37℃正常培养24h。设置3个复孔。
正常培养24h后，采用Western blot检测各组细胞质和细胞核中Nrf2及Keap1蛋白水平的表达。
分别对空白组、模型组、丹参素-芍药苷组、丹参素-芍药苷-鸦胆子苦醇组的细胞Nrf2、Keap1蛋白表达水平检测，结果如表7所示：与空白组相比，模型组细胞核中Nrf2、Keap1表达水平显著升高(P<0.01)；与模型组相比，丹参素-芍药苷干预后细胞质中Nrf2、Keap1表达水平显著降低(P<0.01)，细胞核中Nrf2表达水平显著升高(P<0.05)；与丹参素-芍药苷组相比，加入鸦胆子苦醇后细胞质中Nrf2、Keap1表达水平显著升高(P<0.01)，细胞核中Nrf2表达水平显著降低(P<0.01)。此结果说明丹参素-芍药苷可显著促进Nrf2的核转移，调控Nrf2/Keap1信号通路。
表7各组细胞质和细胞核中Nrf2及Keap1表达水平比较结果
注：与空白组比较，**P＜0.01；与模型组比较，#P＜0.05，##P＜0.01；与丹参素-芍药苷组比较，△△P＜0.01。
综上所述，本发明组合物可以改善脑缺血大鼠的神经功能损伤，减少脑梗死面积，增强抗氧化能力；该作用可能与药物调控Nrf2/Keap1信号通路从而减轻氧化应激有关。
尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。
Claims (4)
1.一种组合物在制备治疗脑缺血的药物中的应用，其特征在于，所述组合物为丹参素和芍药苷，所述组合物中丹参素和芍药苷的质量比为1.65:1。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述组合物中丹参素的摩尔浓度为160μmol/L，所述组合物中芍药苷的摩尔浓度为40μmol/L。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述治疗脑缺血包括减轻缺血性脑神经损伤、降低脑梗死面积和增强脑组织抗氧化能力中的一种或几种。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述治疗脑缺血包括制备以下1)～6)一个或者几个方面药物中的应用：
1)降低MDA水平；
2)增强SOD活性；
3)增强GSH-Px活性；
4)增强T-AOC活性；
5)上调Nrf2的表达；
6)调控Nrf2/Keap1通路。
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