ITMI952342A1

ITMI952342A1 - Metodo per la determinazione di anticorpo antistreptolisina o

Info

Publication number: ITMI952342A1
Application number: IT95MI002342A
Authority: IT
Inventors: Kenji Arai; Yoshitaka Kagimoto
Original assignee: Asahi Chemical Ind
Priority date: 1994-11-15
Filing date: 1995-11-15
Publication date: 1997-05-15
Also published as: IT1276134B1; ITMI952342A0; JP3337575B2; DE19542549A1; JPH08146004A; FR2726912B1; DE19542549C2; FR2726912A1; US5856202A

Abstract

Un metodo per la determinazione immunologica di anticorpo antistreptolisina o comprende le operazioni di mettere in contatto una soluzione del campione sperimentale contenente anticorpo antistreptolisina o con un agente legante in modo da legare selettivamente l'anticorpo antistreptolisina o all'agente legante, e di determinare la quantità dell'anticorpo antistreptolisina o legato, dove l'agente legante comprende un supporto portante streptolisina o immobilizzata ottenuto mettendo in contatto una soluzione contenente streptolisina o con un supporto sul quale è immobilizzato almeno uno steroide rappresentato mediante la formula (1):nella quale R1 è una porzione di catena laterale del colesterolo o una porzione di catena laterale dell'acido colico, in cui ciascuna delle porzioni di catena laterale è indipendentemente non sostituita o sostituita e, indipendentemente, satura o insatura; R2 è idrogeno o idrossile; e ciascuna linea tratteggiata rappresenta indipendentemente un legame singolo o nessun legame.Il metodo della presente invenzione può venire utilizzato per determinare in modo specifico anticorpo antistreptolisina o accuratamente e facilmente e può venire messo in pratica non solo mediante un'operazione manuale ma anche mediante un'operazione automatizzata.

Description

Descrizione dell'invenzione industriale dal titolo: "METODO PER LA DETERMINAZIONE DI ANTICORPO ANTISTREP-TOLISINA O"

Campo dell'invenzione

La presente invenzione riguarda un metodo per la determinazione di anticorpo antistreptolisina 0. Più in particolare, la presente invenzione riguarda un metodo per la determinazione di anticorpo antistreptolisina 0 che comprende le operazioni di mettere in contatto una soluzione del campione sperimentale contenente anticorpo antistreptolisina 0 con un agente legante in grado di legare specificamente a sè il suddetto anticorpo antistreptolisina 0, legando così in modo selettivo 1'anticorpo antistreptolisina 0 all'agente legante mediante una reazione antigeneanticorpo, e determinare la quantità del suddetto anticorpo antistreptolisina 0 legato al suddetto agente legante, in cui il suddetto agente legante comprende supporto portante streptolisina 0 immobilizzata ottenuto mettendo in contatto una soluzione contenente streptolisina 0 con un supporto sul quale è immobilizzato almeno uno steroide specifico.

L'agente legante da usarsi nel metodo della presente invenzione è in grado di legare a se stesso in modo specifico 1'anticorpo antistreptolisina 0, di modo che la determinazione dell'anticorpo antistreptolisina O può venire condotta facilmente con elevata specificità ed accuratezza. Inoltre, il metodo della presente invenzione non richiede l'uso di eritrociti, che sono instabili e che hanno qualità differenti secondo il lotto di eritrociti. A motivo dei vantaggi citati sopra, il metodo della presente invenzione permette l'automatizzazione e la determinazione accurata e specifica dell'anticorpo antistreptolisina 0, a differenza dei metodi di determinazione convenzionali che non possono venire impiegati per automatizzare una determinazione specifica o accurata dell 'anticorpo antistreptolisina O. Il metodo della presente invenzione può venire utilizzato con vantaggio per la diagnosi di infezioni causate da streptococchi emolitici del gruppo A.

Descrizione dell'arte correlata

L'anticorpo antistreptolisina 0 è un anticorpo contro la streptolisina O. La streptolisina 0 è una tossina (che fa parte del gruppo delle citolisine batteriche attivate mediante tiolo) prodotta, per esempio, da streptococchi emolitici del gruppo A classificati secondo la classificazione sierologica di Lancefield (si veda Lancefield, R.C., J. Exp. Med. , Vol. 57, pagine 571-595, 1933), ed è nota in generale come una proteina avente un peso molecolare nell'intervallo da 50.000 a 70.000. La streptolisina 0 è noto che interagisce con il colesterolo e con gli steroli correlati (si veda Prigent, D. et al., BBA, voi. 443, pagine 288-300, 1976), e che esercita effetti citolitici su un'ampia gamma di cellule di mammifero. La streptolisina 0 lisa gli eritrociti, usualmente in condizioni riduttive, per esempio in presenza di mercaptoetanolo, oppure per un'interazione con il colesterolo della membrana. E' noto che il livello di anticorpo antistreptolisina O è elevato nel siero di un paziente infetto da streptococchi emolitici del gruppo A.

Gli streptococchi emolitici del gruppo A sono microrganismi patogeni che sono gli agenti causali di varie malattie che includono tonsillite, faringite, purulenza cutanea e scarlattina, e malattie secondarie, come la febbre reumatica, la glomerulonefrite, e simili. La maggior parte di queste malattie non manifestano sintomi clinici specifici dai quali sia possibile identificare i microorganismi patogeni che provocano la malattia e, pertanto, per la diagnosi clinica di infezioni dovute a streptococchi emolitici del gruppo A si sono finora utilizzate, in generale, la conferma della presenza di anticorpo antistreptolisina 0 e la determinazione del titolo anticorpale [si veda Tomika Nagata, "Rinshokensa (Esami di Laboratorio)", Voi. 23, Edizione Supplementare, pagine 1172-1175, 1919] .

Come metodi per la determinazione del titolo antistreptolisina 0, sono stati ampiamente usati convenzionalmente in analisi di routine il metodo di Rantz-Randall che utilizza eritrociti di coniglio, eritrociti di pecora o eritrociti umani di tipo 0 (si veda L.A. Rantz et al., Proc. Soc. Exp. Biol. Med., Voi. 59, pagine 22-25, 1945), e una modifica del metodo di Rantz-Randall, cioè il metodo di microtitolazione (si veda Edwards, E.A.; J. Bacteriol., Voi.

87, pagine 1254-1255, 1964). Ambedue i metodi di determinazione sono basati sul principio che l'anticorpo antistreptolisina 0 in una soluzione di campione sperimentale neutralizza l'attività emolitica della streptolisina 0.

Gli streptococchi emolitici del gruppo A che hanno corpi viventi infettati producono non solo streptolisina 0, ma anche vari altri antigeni, come tossina eritrogena, streptochinasi, streptodornasi, ialuronidasi , ribonucleasi e neuroamminidasi e, in aggiunta, vari anticorpi contro questi antigeni si presentano nel sangue [si veda "Rensakyukin-kansensho II: Sono Kiso-to-Rinsho (Streptococcosi, volume II: fondamenti e aspetti clinici); a cura di Yuichi Shiokawa, Morimasa Yoshioka e Shigeyuki Hamada; pagine 317-359, Hirokawa Shoten K.K., Giappone, 25 giugno 1992]. Tuttavia, poiché i metodi di determinazione visti sopra utilizzano la caratteristica di attività emolitica della streptolisina 0, la streptolisina 0 da usarsi come reagente per i metodi di determinazione visti sopra non è necessario che sia una streptolisina 0 purificata, e nei metodi di determinazione visti sopra si può utilizzare streptolisina 0 non purificata per riconoscere in modo specifico e determinare solo anticorpi contro la streptolisina O, cioè 1'anticorpo antistreptolisina 0, tra anticorpi contro un certo numero di antigeni [Fujimoto et al., "Rinsho-byori (Patologia clinica)", Voi. 40, pagine 21-27, 1992].

Tuttavia, questi metodi di determinazione richiedono l'uso di eritrociti freschi. Gli eritrociti sono instabili e differenti come qualità da un lotto all'altro, di modo che questi metodi di determinazione che utilizzano eritrociti è probabile siano instabili. Inoltre, questi metodi di determinazione implicano necessariamente operazioni complicate. Pertanto, è molto difficile automatizzare questi metodi di determinazione (si veda la domanda di brevetto europeo con pubblicazione No. 0.475.786 A2 che corrisponde al fascicolo disponibile all'ispezione del pubblico della domanda di brevetto giapponese non esaminata No. Hei 6-186233).

In anni recenti, è stato utilizzato un metodo di determinazione per il titolo di anticorpo antistreptolisina 0 che è basato sul principio della immunoagglut inazione e che utilizza un supporto (come particelle di lattice colloidale) sul quale è immobilizzata streptolisina 0 (si veda T. Miura et al., "Eisei-kensa (Escimi Igienici)", Voi. 36, pagine 36-40, 1987]. Questo metodo convenzionale di determinazione che utilizza un supporto portante streptolisina O immobilizzata è migliorato in quanto non occorre utilizzare eritrociti instabili e per il fatto che questo metodo può venire automatizzato, differendo in questo modo dai metodi di determinazione convenzionali precedentemente citati che utilizzano come criterio l'attività emolitica della streptolisina O.

Tuttavia, il metodo convenzionale di determinazione che utilizza supporto portante streptolisina O immobilizzata presenta gli svantaggi seguenti. La streptolisina 0 viene in generale preparata da una miscela di colture di streptococchi emolitici del gruppo A. E' molto difficile ottenere una streptolisina 0 molto purificata da una tale miscela di coltura, di modo che la streptolisina 0 ottenuta da una tale miscela di colture di streptococchi emolitici del gruppo A contiene usualmente un'ampia varietà di altri antigeni prodotti dagli streptococchi emolitici del gruppo A. Pertanto, quando tale streptolisina 0 viene immobilizzata su un supporto, vengono immobilizzati sul supporto, insieme con la streptolisina 0, anche altri antigeni prodotti dagli streptococchi emolitici del gruppo A. In questo modo, il titolo anticorpale che può venire ottenuto mediante il metodo convenzionale di determinazione con l'utilizzo del supporto con streptolisina 0 immobilizzata succitato è un titolo che viene ottenuto relativamente a tutti gli anticorpi che reagiscono con i vari antigeni immobilizzati sul supporto. Pertanto, questo metodo convenzionale di determinazione che utilizza un supporto portante streptolisina 0 immobilizzata presenta il problema che esso è insoddisfacente come specificità della reazione nei confronti dell'anticorpo antistreptolisina 0 [si veda Fujimoto et al., "Rinsho-byori (Patologia Clinica)", Voi. 40, pagine 21-27, 1992].

In queste situazioni, si desiderava sviluppare un metodo di determinazione che risolvesse i problemi che accompagnano i metodi convenzionali per la determinazione di anticorpo antistreptolisina 0. Ovvero, si desiderava sviluppare un metodo per la determinazione dell'anticorpo antistreptolisina 0 che potesse venire utilizzato per determinare in modo accurato e facile 1'anticorpo antistreptolisina 0 con elevata specificità di reazione e che potesse venire svolto mediante un'operazione automatica oltre che mediante un'operazione manuale.

I presenti inventori hanno effettuato studi intensi ed estesi con l'obiettivo di risolvere i problemi succitati dell'arte anteriore. Come risultato, essi hanno inaspettatamente scoperto che mettendo in contatto una soluzione contenente streptolisina 0 con un supporto sul quale è immobilizzato fisicamente o chimicamente almeno uno steroide rappresentato mediante la formula (1):

nella quale è scelto all'interno del gruppo costituito da una porzione di catena laterale del colesterolo e una porzione di catena laterale dell'acido colico, in cui ciascuna delle porzioni di catena laterale è, indipendentemente, non sostituita o sostituita e, indipendentemente, satura o insatura; R<2 >è idrogeno o idrossile; e ciascuna linea tratteggiata rappresenta indipendentemente un legame singolo o nessun legame, in modo tale che ciascuna linea tratteggiata e una linea continua adiacente ad essa, insieme e indipendentemente, formano un doppio legame o un legame singolo, solo la streptolisina 0 nella soluzione può venire immobilizzata in modo selettivo sul supporto, ottenendo in questo modo un supporto portante streptolisina 0 immobilizzata, e la streptolisina O immobilizzata ha ancora la capacità di reagire con anticorpo antistreptolisina 0 ed è in grado di legare in modo specifico l'anticorpo antistreptolisina O ad essa. Essi hanno inoltre scoperto che, mediante l'utilizzo del supporto portante streptolisina O immobilizzata suddetto, la determinazione specifica dell 'anticorpo antistreptolisina 0 può venire condotta in modo accurato e facile. La presente invenzione è stata completata sulla base delle scoperte suddette.

Di conseguenza, un oggetto primario della presente invenzione è quello di mettere a disposizione un metodo per la determinazione immunologica di anticorpo antistreptolisina 0 che può venire utilizzato per determinare in modo specifico anticorpo antistreptolisina 0 accuratamente e facilmente e che può venire eseguito non solo mediante un'operazione manuale ma anche mediante un'operazione automatizzata.

L'oggetto suddetto e altri oggetti, caratteristiche e vantaggi della presente invenzione, risulteranno evidenti alle persone esperte nell'arte dalla descrizione che segue e dalle rivendicazioni allegate prese in combinazione con i disegni allegati.

Nei disegni allegati:

Figura 1 mostra diagrammi di elettroforesi ottenuti nell'esempio 1 che includono un diagramma (striscia 3) ottenuto sottoponendo ad elettroforesi su gel di SDS-poliacrilammide una miscela di reazione che viene ottenuta mettendo in contatto una soluzione contenente streptolisina 0 con un supporto sul quale è immobilizzato colesterolo;

Figura 2 è un grafico che mostra i risultati di una prova condotta nell'esempio 2 per rivelare un complesso immunologico di streptolisina 0 immobilizzata con anticorpo antistreptolisina 0;

Figura 3 è un grafico che mostra una curva di taratura utilizzata nell'esempio 3 che illustra la relazione esistente tra il titolo di anticorpo antistreptolisina 0 e l'assorbanza a 590 nm, in cui la curva di taratura è stata ottenuta mediante il metodo della presente invenzione utilizzando una soluzione standard contenente anticorpo antistreptolisina 0 come soluzione campione di prova e utilizzando particelle di lattice con streptolisina 0 immobilizzata come agente legante;

Figura 4 è un grafico che mostra la relazione esistente tra il titolo di anticorpo antistreptolisina 0 determinato nell'esempio 3 mediante il metodo della presente invenzione con l'utilizzo di particelle di lattice con streptolisina 0 immobilizzata come agente legante, e il titolo di anticorpo antistreptolisina O determinato mediante il metodo di Rantz-Randall;

Figura 5 è un grafico che mostra una curva di taratura utilizzata nell'esempio 4 che illustra la relazione esistente tra il titolo di anticorpo antistreptolisina 0 e l'assorbanza a 405 nm, in cui la curva di taratura è stata ottenuta mediante il metodo della presente invenzione utilizzando una soluzione standard contenente anticorpo antistreptolisina O come soluzione campione di prova e utilizzando una piastra di microtitolazione con streptolisina O immobilizzata come agente legante; e

Figura 6 è un grafico che mostra la relazione esistente tra il titolo di anticorpo antistreptolisina 0 determinato nell'esempio 4 mediante il metodo della presente invenzione con l'utilizzo di piastra di microtitolazione con streptolisina 0 immobilizzata come agente legante, e il titolo di anticorpo antistreptolisina 0 determinato mediante il metodo di Rantz-Randall.

DESCRIZIONE DETTAGLIATA DELL'INVENZIONE Essenzialmente, secondo la presente invenzione, viene messo a disposizione un metodo per la determinazione immunologica di anticorpo antistreptolisina 0 che comprende le operazioni di:

(a) mettere in contatto una soluzione del campione sperimentale contenente anticorpo antistreptolisina 0 con un agente legante in grado di legare specificamente a sè il suddetto anticorpo antistreptolisina 0, legando cosi in modo selettivo 1'anticorpo antistreptolisina 0 all'agente legante mediante una reazione antigene-anticorpo, e

(b) determinare la quantità del suddetto anticorpo antistreptolisina 0 legato al suddetto agente legante,

in cui il suddetto agente legante comprende un supporto portante streptolisina 0 immobilizzata ottenuto mettendo in contatto una soluzione contenente streptolisina 0 con un supporto sul quale è immobilizzato almeno uno steroide rappresentato mediante la formula (1):

(1)

nella quale R<1 >è scelto all'interno del gruppo costituito da una porzione di catena laterale del colesterolo e una porzione di catena laterale dell'acido colico, in cui ciascuna delle porzioni di catena laterale è, indipendentemente, non sostituita o sostituita e, indipendentemente, satura o insatura; è idrogeno o idrossile; e ciascuna linea tratteggiata rappresenta indipendentemente un legame singolo o nessun legame, in modo tale che ciascuna linea tratteggiata e una linea continua adiacente ad essa, insieme, indipendentemente, formano un doppio legame o un legame singolo,

In R<1 >della formula 1, che è scelto all'interno del gruppo costituito da una porzione di catena laterale del colesterolo e una porzione di catena laterale dell'acido colico, ciascuna delle porzioni di catena laterale è, indipendentemente, non sostituita o sostituita con idrossile, un alchile inferiore avente da 1 a 4 atomi di carbonio, preferibilmente da 1 a 2 atomi di carbonio, o un acile inferiore avente da 2 a 4 atomi di carbonio, preferenzialmente da 2 a 3 atomi di carbonio, e è indipendentemente satura o insatura con uno o due doppi legami.

Un esempio specifico di una tale porzione di catena laterale del colesterolo è un gruppo rappresentato mediante la formula (2):

(2)

nella quale R<3 >rappresenta idrogeno, idrossile, un alchile inferiore avente da 1 a 4 atomi di carbonio, preferibilmente da 1 a 2 atomi di carbonio, o un acile inferiore avente da 2 a 4 atomi di carbonio, preferibilmente da 2 a 3 atomi di carbonio;

rappresenta idrogeno, idrossile, un alchile inferiore avente da 1 a 4 atomi di carbonio, preferibilmente da 1 a 2 atomi di carbonio, o un acile inferiore avente da 2 a 4 atomi di carbonio, preferibilmente da 2 a 3 atomi di carbonio; rappresenta idrogeno, idrossile, un alchile inferiore avente da 1 a 4 atomi di carbonio, preferibilmente da 1 a 2 atomi di carbonio, o un acile inferiore avente da 2 a 4 atomi di carbonio, preferibilmente da 2 a 3 atomi di carbonio? e ciascuna linea tratteggiata rappresenta indipendentemente un legame singolo o nessun legame, di modo che ciascuna linea tratteggiata e una linea continua adiacente ad essa formano insieme indipendentemente un doppio legame o un legame singolo.

In esempi preferiti di un tale gruppo di formula (2), R<3 >e R sono ciascuno idrogeno e R e idrogeno, idrossile, metile o etile. Esempi preferiti specifici di gruppi di formula (2) includono le porzioni corrispondenti di catena laterale del colesterolo, del β-sitosterolo, dello stigmasterolo, del campesterolo, dell'ergosterolo, del cerebrosterolo e del desmosterolo.

Un esempio specifico di una tale porzione di catena laterale dell'acido colico è un gruppo rappresentato mediante la formula (3):

(3)

nella quale la linea tratteggiata rappresenta un legame singolo o nessun legame, di modo che la linea tratteggiata e la linea continua adiacente ad essa formano insieme un legame doppio o un legame singolo.

Esempi specifici di steroidi rappresentati mediante la formula (1) includono colesterolo, 7-deidrocolesterolo, colestanolo, coprostanolo, Δ <7>-colestenolo, Δ -coprostenolo, β-sitosterolo, 7-deidro-/J-sitosterolo, stigmasterolo, 7-deidrostigmasterolo, campesterolo, 7-deidrocampesterolo, stigmastand o, /\‘-stigmastenolo, lla-idrossicolesterolo, Δ <22>-stigmastenolo, α-spinasterolo, campestanolo, Δ<7>-ceunpestenolo, 20a-idrossicolesterolo, brassicasterolo, ergosterolo, cerebrosterolo, 7-deidrocerebrosterolo, cerebrostanolo, Δ <7>-cerebrostenolo, desmosterolo, 7-deidrodesmosterolo, acido 3/3-idrossicolanico e acido 3β-idrossi-/\<5>-colenico.

Esempi preferiti di steroidi di formula (1) includono colesterolo, 7-deidrocolesterolo, colestanolo, coprostanolo, /\<7>-colestenolo, /\<7>-coprostenolo, β-sitosterolo, 7-deidro-/3-sitosterolo, stigmasterolo, 7-deidrostigiuasterolo, campesterolo e 7-deidrocampesterolo. Tra questi steroidi, sono maggiormente preferiti colesterolo, 7-deidrocolesterolo, colestanolo, coprostanolo, /\<7>'-colestenolo e /\<7 >-coprostenolo.

Questi steroidi possono venire impiegati individualmente oppure in combinazione.

Lo steroide di formula (1) può venire immobilizzato sulla superficie del supporto mediante un metodo ben noto nell'arte. Per esempio, l'immobilizzazione dello steroide su un supporto può venire effettuata adsorbendo fisicamente lo steroide su una superficie del supporto oppure legando per via chimica un derivato reattivo dello steroide ad una superficie del supporto la quale superficie porta un gruppo funzionale che è reattivo con il derivato o che è attivato in modo da essere reattivo con il derivato .

Nel metodo della presente invenzione, si preferisce che lo steroide immobilizzato sia presente in una quantità da 0,025 nmol/cm<2 >a 250 nmol/cm , più preferibilmente da 0,25 nmol/cm<2 >a 25 nmol/cm relativamente all'area superficiale del supporto.

Relativamente al materiale, alla morfologia, alla dimensione e simili del supporto da usarsi nel metodo della presente invenzione, non vi sono particolari limitazioni, a condizione che il metodo della presente invenzione possa venire eseguito in modo soddisfacente. Esempi di materiali per supporti includono polimeri come polistirene, polietilene, polipropilene, un copolimero acrilonitrile-butadienestirene, un copolimero butadiene-stirene, policarbonato, polivinilcloruro, polivinilidencloruro, poliammide, polimetilmetacrilato, polimetilpentene, poliacetale, polivinilacetato, alcol polivinilico, polivinilbutirrale, poliisobutilene, un copolimero cloruro di vinile-acetato di vinile, una fluororesina (politetrafluoroetilene, un copolimero tetrafluoroetilenetilene, un copolimero perfluoroalcossilico, o simili), poliacrilonitrile, polistirenacrilato, polietilentereftalato, polibutilentereftalato, poliuretano, una resina ureica, una resina epossidica, una resina melamminica, una resina fenolica, una resina poliestere insatura, una resina siliconica, nitrocellulosa, acetato di cellulosa, acetato butirrato di cellulosa, acetato propionato di cellulosa, propionato di cellulosa, etilcellulosa, carbossimetilcellulosa, e polivinilidendifluoruro; e polimeri contenenti gruppi funzionali ottenuti, per esempio, mediante un metodo nel quale nella produzione dei polimeri suddetti viene introdotto un composto avente un gruppo funzionale, come carbossile, nitrile, o ammino primario o secondario, nei polimeri mediante copolimerizzazione, introducendo in questo modo un gruppo funzionale nei polimeri, oppure un metodo nel quale viene introdotto un gruppo funzionale alla superficie dei polimeri suddetti mediante un trattamento di superficie. Esempi ulteriori di materiali per i supporti includono vetro e metallo.

Nella presente invenzione, il materiale, la morfologia, la dimensione e simili del supporto possono essere uguali a quelli di supporti generalmente noti che vengono utilizzati abitualmente in metodi di determinazione immunologici convenzionali.

Si preferisce che il supporto da usarsi nella presente invenzione sia una particella colloidale, una perlina, una sfera, una piastra di microtitolazione, una provetta o una membrana. Il diametro di una particella colloidale è in generale da circa 0,01 pm a circa 10 pm. Il diametro di una perlina è in generale non superiore a circa 7 mm. Il diametro di una sfera è in generale non superiore a circa 10 irmi.

Un esempio di metodi specifici per l'immobilizzazione dello steroide di formula (1) su un supporto mediante adsorbimento fisico viene spiegato nel seguito. Per esempio, quando come supporto si usa una particella di lattice colloidale, lo steroide viene messo in contatto con le particelle di lattice colloidale in un solvente idrofilo o lipofilo, con la massima idoneità etanolo o metanolo, che può disciogliere, disperdere o sospendere lo steroide senza influire svantaggiosamente sulla struttura o simili della particella di lattice colloidale. Lo steroide e le particelle di lattice colloidale vengono poi fatti reagire l'uno con le altre sotto agitazione, scuotimento oppure lasciandoli a riposo in generale a temperatura da 0°C a 60°C, preferibilmente da 4°C a 30°C, in generale per da 30 minuti a 24 ore, preferibilmente da 1 ora a 10 ore. Dopo di ciò, se desiderato, le particelle di lattice risultanti sulle quali è immobilizzato lo steroide vengono lavate con acqua o con un tampone appropriato.

Nella reazione suddetta, la concentrazione dei solidi, cioè la concentrazione delle particelle di lattice, nel sistema di reazione è in generale dallo 0,01 (p/v) % al 10 (p/v) %, preferibilmente dallo 0,05 (p/v) % al 5 (p/v) %, e la concentrazione dello steroide nella miscela di reazione è in generale da 0,1 pg/ml a 10 mg/ml, preferibilmente da 1 pg/ml a 1 mg/ral. Il sistema di reazione può contenere acqua oppure esso può contenere qualsiasi altro solvente nei limiti in cui la struttura della particella di lattice colloidale e la reazione non vengano influenzate svantaggiosamente. Esempi di tali altri solventi includono cloroformio, acetone, esano, dicloroetano, propanolo, isopropanolo, xilene, toluene, benzene, etere, etere di petrolio, acetato di metile e acetato d'etile.

Quando si utilizza una perlina o una sfera come supporto, l'immobilizzazione dello steroide sul supporto può venire condotta mediante un metodo simile al metodo descritto sopra per l'immobilizzazione dello steroide sulla particella di lattice colloidale, in condizioni di reazione che non danneggino la struttura della perlina o della sfera, tenendo in considerazione fattori come l'area superficiale, il volume e il numero di perline o di sfere.

Inoltre, quando si utilizza una piastra di microtitolazione come supporto, l'immobilizzazione dello steroide su un supporto può venire condotta per esempio mediante il metodo seguente. Lo steroide viene disciolto, disperso o sospeso in un solvente idrofilo o lipofilo, con la massima idoneità etanolo o metanolo, che è in grado di sciogliere, disperdere 0 sospendere lo steroide senza influire svantaggiosamente sulla struttura o simili della piastra di microtitolazione, in generale ad una concentrazione da 1 μg/ml a 10 mg/mi, preferibilmente da 10 μg/ml a 1 mg/ml. Poi, la soluzione, dispersione o sospensione ottenuta viene posta nei pozzetti della piastra di microtitolazione in una quantità in generale da 25 μl a 200 μl per pozzetto, preferibilmente da 50 μl a 100 μl per pozzetto, e viene lasciata a riposo in generale a temperatura da 0°C a 60°C, preferibilmente a temperatura da 4°C a 30°C, in generale per da 30 minuti a 24 ore, preferibilmente da 1 ora a 6 ore, effettuando in questo modo una reazione. Dopo di ciò, i pozzetti vengono lavati con acqua o con un tampone appropriato.

Nella reazione vista sopra, il sistema di reazione può contenere acqua oppure può contenere qualsiasi altro solvente nei limiti in cui la struttura della piastra di microtitolazione e la reazione non vengano influenzate svantaggiosamente.

Esempi di tali altri solventi includono cloroformio, acetone, esano, dicloroetano, propanolo, isopropanolo, xilene, toluene, benzene, etere, etere di petrolio, acetato di metile e acetato d'etile.

Un altro esempio di un metodo per l'immobilizzazione dello steroide su un supporto viene spiegato ora nel seguito. Lo steroide viene disciolto, disperso o sospeso in un solvente idrofilo o lipofilo, con la massima idoneità etanolo o metanolo, che è in grado di sciogliere, disperdere o sospendere lo steroide senza influire svantaggiosamente sulla struttura o simili della piastra di microtitolazione, in generale ad una concentrazione da 100 ng/ml a 1 mg/ml, preferibilmente da 1 pg/ml a 100 pg/ml. Poi, la soluzione, dispersione o sospensione ottenuta viene posta nei pozzetti della piastra di microtitolazione in una quantità in generale da 25 μl a 200 pi per pozzetto, preferibilmente da 50 pi a 100 pi per pozzetto, e viene lasciata a riposo a temperatura da 20°C a 90°C, preferibilmente da 40°C a 70°C, evaporando in questo modo il solvente e rimuovendolo. Dopo di ciò i pozzetti vengono lavati con acqua o con un tampone appropriato.

Inoltre, per esempio, quando si utilizza una provetta come supporto, l'immobilizzazione dello steroide su un supporto può venire condotta mediante un metodo simile al metodo descritto sopra per l'immobilizzazione dello steroide sulla piastra di microtitolazione, in condizioni che non disturbino la struttura della provetta, tenendo in considerazione fattori come il volume interno della provetta.

Ancora ulteriormente, per esempio, quando come supporto si usa una membrana, l'immobilizzazione dello steroide su un supporto può venire condotta per esempio mediante il metodo seguente. Lo steroide viene sciolto, disperso o sospeso in un solvente idrofilo o lipofilo, con la massima idoneità etanolo o metanolo, che è in grado di sciogliere, disperdere o sospendere lo steroide senza influire svantaggiosamente sulla struttura della membrana. La soluzione, la dispersione o sospensione ottenuta viene messa in contatto con la membrana mediante un metodo abituale, per esempio mediante un metodo nel quale si usa la tecnica dot-blot (a macchie rotonde) in modo tale che lo steroide sia immobilizzato sulla membrana in una quantità in generale da 0,025 nmol/cm a 250 nmol/cm<2 >, preferibilmente da 0,25 nmol/cm<2 >a 25 nmol/cm<2 >rispetto all'area superficiale della membrana.

Nel metodo di immobilizzazione suddetto che utilizza la tecnica di dot-blotting, la dimensione della macchia non è particolarmente limitata e può venire scelta in un intervallo appropriato e la soluzione, dispersione o sospensione dello steroide può contenere acqua e può anche contenere qualsiasi altro solvente nei limiti in cui non vengano influenzate svantaggiosamente la struttura della membrana e la reazione. Esempi di questi altri solventi includono cloroformio, acetone, esano, dicloroetano, propanolo, isopropanolo, xilene, toluene, benzene, etere, etere di petrolio, acetato di metile e acetato d'etile.

La formazione del legame chimico dello steroide con un supporto può venire condotta mediante un metodo nel quale un gruppo funzionale, come per esempio carbossile, idrossile, tiolo, ammina primaria, ammina secondaria, ammido, nitro o aldeide, viene introdotto nello steroide ad ottenere in questo modo un derivato reattivo dello steroide e poi il derivato reattivo ottenuto dello steroide viene legato chimicamente ad una superficie del supporto, in cui la superficie del supporto contiene un gruppo funzionale che è in grado di reagire con il gruppo funzionale del derivato reattivo dello steroide o in cui la superficie del supporto è attivata in modo che sia reattiva con il derivato, secondo un metodo convenzionale, per esempio un metodo descritto in "Jikken-to-oyo: Affinity Chromatography (Esperimenti e Applicazione: Cromatografia di Affinità)", Chibata, I., Tosa, T., Matsuo, Y: pagine 30-109, Kodansha K.K., Giappone, 10 settembre 1976, o un metodo descritto in "Roso Men-eki Sokuteiho (Saggio Enzimoimmunologico) "; a cura di Ishikawa, E·, Kawai, T., Muroi, K., Terza Edizione, pagine 75-151, Igaku Shoin K.K., Giappone, 15 maggio 1987.

Un esempio di un metodo per legare chimicamente lo steroide ad un supporto viene spiegato qui sotto.

Uno steroide rappresentato mediante la formula (4)

(4)

nella quale è scelto all'interno del gruppo costituito da una porzione di catena laterale del colesterolo e una porzione di catena laterale dell'acido colico, in cui ciascuna delle porzioni di catena laterale è indipendentemente non sostituita o sostituìta e satura; R è idrogeno o idrossile; e ciascuna linea tratteggiata rappresenta un legame singolo o nessun legame in modo tale che ciascuna linea tratteggiata e una linea continua adiacente ad essa formano insieme un doppio legame o un legame singolo, con la condizione che almeno una linea tratteggiata rappresenti un legame singolo,

viene utilizzato come materiale di partenza. Un gruppo funzionale, come carbossile, ammino primario, animino secondario, ammido, nitro o aldeide, viene introdotto nello steroide di formula (4) mediante un metodo nel quale si prepara un derivato di tipo 5,6-epossi, 7,8-epossi o 14,15-epossi dello steroide e poi si introduce un gruppo funzionale e lo si lega alla 6<^>, 7<^ >o 15<^ >posizione dello steroide attraverso un legame tioetere mediante una reazione di apertura ad anello del derivato epossidico dello steroide, secondo un metodo descritto da Hosoda, H., et al.; Chem. Phar. Bull., Voi. 28, pagine 1294-1299, 1980. Successivamente, il derivato dello steroide risultante viene legato alla superficie di un supporto, dove la superficie del supporto presenta un gruppo funzionale in grado di reagire con il derivato.

Questo metodo viene spiegato in modo più specifico più avanti in maniera esemplificativa.

Ovvero, per esempio, uno steroide, rappresentato mediante la formula (4), avente un doppio legame tra la 7<A >e l'8<A >posizione, come /\ -colestenolo, /\<7>-coprostenolo, /\<7>-stiqmastenolo, /\<7>-campestend o o /\ '-cerebrostenolo. viene impiegato come materiale di partenza e poi viene introdotto un gruppo carbossilico nella 7<A >posizione del materiale di partenza per ottenere in questo modo un derivato reattivo dello steroide.

Detto in maniera illustrativa, lo steroide suddetto come materiale di partenza viene messo in contatto con un perossido (preferibilmente perossido di idrogeno) e un reagente alcalino (preferibilmente idrossido di sodio o idrossido di potassio) in un solvente organico idrofilo (preferibilmente metanolo o etanolo) che è in grado di sciogliere, disperdere o sospendere lo steroide, e la miscela risultante viene sottoposta a reazione sotto agitazione, scuotimento oppure lasciandola a riposo in generale a temperatura da 0°C a 40°C, preferibilmente da 0°C a 10°C, in generale per da 30 minuti a 12 ore, preferibilmente da 1 a 6 ore, ad ottenere in questo modo una miscela di reazione contenente un derivato epossidico del materiale di partenza. Successivamente la miscela di reazione viene neutralizzata.

La reazione suddetta viene condotta in condizioni tali che la concentrazione dello steroide come materiale di partenza sia in generale da 0,01 mmol/ml a 1 mmol/ml, preferibilmente da 0,05 mmol/ml a 0,5 mmol/ml, la concentrazione del perossido sia in generale da 0,1 (p/v) % a 10 (p/v) %, preferibilmente da 0,5 (p/v) % a 5 (p/v) %, la concentrazione del reagente alcalino sia in generale da 0,5 (p/v) % a 10 (p/v) %, preferibilmente da 1 (p/v) % a 5 (p/v) %, e il contenuto d'acqua sia preferibilmente non superiore al 20 (v/v)%.

L'isolamento del derivato epossidico prodotto può venire condotto secondo un metodo convenzionale descritto, per esempio, in "Sei-kagaku Kenkyu-ho I (Metodi di Ricerca Biochimica I)", Settima Edizione; a cura di Ando E., Terayama, H., Nishizawa, K., e Yamakawa, T. e pubblicato da Asakura Shoten K.K., Giappone, pagine 49-96 (20 marzo 1973).

Successivamente, il derivato epossidico ottenuto viene messo in contatto con acido mercaptomonocarbossilico (preferibilmente acido 2-mereaptoacetico, acido 3-mercaptopropionico e simili) e un reagente alcalino (preferibilmente idrossido di sodio o idrossido di potassio) in un solvente organico idrofilo, con la massima idoneità metanolo o etanolo, che è in grado di sciogliere, disperdere o sospendere il derivato epossidico, e la miscela risultante viene sottoposta a reazione sotto agitazione, scuotimento o lasciandola a riposo, in generale a temperatura da 0°C a 60°C, preferibilmente da 10°C a 40°C, in generale per da 30 minuti a 12 ore, preferibilmente da 1 a 6 ore, operazione seguita da modifica del valore del pH della miscela di reazione su un valore nell'intervallo acido, ottenendo in questo modo un derivato dello steroide (che deve venire utilizzato come materiale di partenza) avente legato ad esso un carbossile sulla settima posizione attraverso un legame tioetere.

La reazione suddetta viene condotta in condizioni tali che, nel sistema di reazione, la concentrazione del derivato epossidico sia in generale da 0,01 mmol/ml a 1 mmol/ml, preferibilmente da 0,05 mmol/ml a 0,5 mmol/ml, la concentrazione dell'acido mercaptomonocarbossilico sia in generale da 0,05 mmol/ml a 5 mmol/ml, preferibilmente da 0,1 mmol/ml a 1 mmol/ml, la concentrazione del reagente alcalino sia in generale dallo 0,5 (p/v) % al 10 (p/v) %, preferibilmente dall'l (p/v) % al 5 (p/v) %, e il contenuto d'acqua sia preferibilmente non maggiore del 20 (v/v)%.

Il sistema di reazione può contenere diossano e simili. L'isolamento del derivato contenente gruppi funzionali prodotto può venire effettuato secondo lo stesso metodo dell'isolamento del derivato epossidico.

Nel metodo visto sopra, tra gli steroidi rappresentati mediante la formula (4), come materiale di partenza si impiega uno steroide avente un doppio legame tra la settima e l'ottava posizione, come /\<7>-colestenolo, /\<7>-coprostenolo, /\<7>-stigmastenolo, /^<7>-campestenolo o /.\<7>-cerebrostenolo, e poi viene introdotto il carbossile nella settima posizione del materiale di partenza per ottenere in questo modo un derivato reattivo dello steroide, come un derivato di colestenolo, un derivato di coprostenolo, un derivato di stigmastenolo, un derivato di carapestenolo o un derivato di cerebrostenolo avente il carbossile legato nella settima posizione attraverso un legame tioetere.

Inoltre, secondo il metodo visto sopra, è possibile che uno steroide, rappresentato mediante la formula (4), avente un doppio legame tra la quinta e la sesta posizione, come colesterolo, β-sitosterolo, campesterolo o cerebrosterolo, venga impiegato come materiale di partenza e poi venga introdotto carbossile nella sesta posizione del materiale di partenza per ottenere in questo modo un derivato reattivo dello steroide, come un derivato di colestanolo, un derivato di stigmastanolo, un derivato di campestanolo o un derivato di cerebrostanolo avente carbossile legato alla sesta posizione attraverso un legame tioetere .

Il derivato reattivo dello steroide in cui è introdotto il carbossile può venire fatto reagire con e legato ad un gruppo amminico presente su una superficie di un supporto mediante un metodo noto, come il metodo all'anidride di acido, il metodo alla carbodiimmide o il metodo della N-idrossisuccinimmide, per immobilizzare in questo modo lo steroide sulla superficie del supporto.

L'immobilizzazione della streptolisina O sulla superficie del supporto sul quale è immobilizzato lo steroide può venire condotta per esempio facendo reagire il supporto sul quale è immobilizzato lo steroide con streptolisina 0 in acqua o in un tampone appropriato.

Nella presente invenzione, si preferisce che la streptolisina 0 immobilizzata del supporto portante streptolisina O immobilizzata sia presente in una quantità da 0,001 pmol/cm<2 >a 1 nmol/cm<2>, più preferìbilmente da 0,01 pmol/cm<2 >a 100 pmol/cm<2 >relativamente all'area superficiale del supporto.

La streptolisina O da usarsi nella presente invenzione può essere di qualsiasi tipo nei limiti in cui essa presenti un'attività di legame nei confronti dello steroide utilizzato nella presente invenzione e sia in grado di dare una reazione antigene-anticorpo con anticorpo antistreptolisina 0. La streptolisina 0, o un suo derivato e una sua variante, possono tutti venire utilizzati. Questi materiali possono essere quelli che vengono prodotti, per esempio, da streptococchi emolitici dei gruppi A, B o C o che sono prodotti mediante tecnologie genetiche ricombinanti da cellule ospite, per esempio microorganismi trasformati, come Escherichia coli, lievito e simili.

Nella presente invenzione, qualsiasi sostanza simile alla streptolisina O che presenta un'attività di legame nei confronti dello steroide utilizzato nella presente invenzione e che sia in grado di dare reazione antigene-anticorpo con l'anticorpo antistreptolisina 0 può venire utilizzata al posto della streptolisina O. Per esempio, si può utilizzare una proteina sintetizzata o un peptide sintetizzato avente una struttura amminoacidica tale che la streptolisina 0 manchi parzialmente o completamente del suo sito dotato di attività emolitica. La streptolisina O utilizzata nella presente invenzione non è necessario che sia di elevata purezza. Tuttavia, quando la streptolisina O contiene una sostanza inibitrice che è in grado di inibire la reazione di legame della streptolisina 0 con uno steroide di formula (1) o con l'anticorpo antistreptolisina 0, è desiderabile purificare in modo appropriato la streptolisina O per rimuovere la sostanza inibitrice.

E' conveniente utilizzare streptolisina O disponibile in commercio. Esempi di prodotti disponibili in commercio di tipo streptolisina 0 includono quelli che sono venduti rispettivamente da Eiken Chemical Co., Ltd., Giappone; Nissui Pharmaceutical Co., Ltd., Giappone; Corporation Japan Lyophilization Laboratory, Giappone; Difco Laboratories, U.S.A.; e Sigma Chemical Company, U.S.A..

Relativamente ai tamponi da usarsi nella presente invenzione, non vi sono particolari limitazioni e si possono impiegare tamponi che sono abitualmente utilizzati. E' desiderabile utilizzare tamponi aventi un pH nell'intervallo da 5 a 9, preferibilmente da 6 a 8. Per esempio, si possono utilizzare tampone fosfato, tampone acido borico, tampone acido carbonico, tampone tris, tampone Veronal e tamponi di Good (per esempio tampone HEPES, tampone PIPES e tampone MES).

Se desiderato per la stabilizzazione della streptolisina 0 o per prevenire un adsorbimento aspecifico di proteine su supporto, si possono aggiungere, all'acqua o al tampone da usare, additivi come sieroalbumina bovina (bovine serum albumin (BSA)), gelatina, latte scremato, proteine (per esempio proteine derivate dal latte), saccaridi, glicerolo, glicol etilenico, un agente chelante, un agente riducente. Questi additivi possono venire utilizzati in quantità come vengono utilizzate nei metodi di determinazione immunologici convenzionali per l'anticorpo antistreptolisina 0, i quali metodi utilizzano la reazione antigene-anticorpo. La streptolisina 0 è relativamente instabile in soluzione acquosa e pertanto per la sua stabilizzazione è desiderabile aggiungere all'acqua o ad un tampone che devono venire usati un additivo, come sieroalbumina bovina (BSA), gelatina, latte scremato o proteine (per esempio proteine derivate dal latte) ad una concentrazione in generale dallo 0,01 (p/v)% al 10 (p/v)%, preferibilmente dallo 0,1 (p/v)% all'l (p/v)%.

Se desiderato, allo scopo di prevenire l'adsorbimento aspecifico di proteine sul supporto, un supporto sul quale è immobilizzato lo steroide può venire trattato con una soluzione di trattamento ottenuta sciogliendo un additivo, come sieroalbumina bovina (bovine serum albumin (BSA)), gelatina, latte scremato o proteina (come proteina derivata dal latte) in acqua o in un tampone. La concentrazione dell'additivo nella soluzione di trattamento può venire scelta appropriatamente negli intervalli di concentrazione normalmente utilizzati per una tale soluzione di trattamento, per esempio nei metodi di determinazione immunologici convenzionali che utilizzano una reazione antigene-anticorpo. Per esempio, la concentrazione dell'additivo nella soluzione di trattamento è in generale dallo 0,05 (p/v)% al 10 (p/v)%, preferibilmente dallo 0,5 (p/v)% al 5 (p/v)%.

Nella presente invenzione, le condizioni per la messa in pratica del metodo per l'immobilizzazione di streptolisina 0 su un supporto sul quale è immobilizzato lo steroide possono venire variate secondo fattori come la purezza della streptolisina 0, la concentrazione della streptolisina O in una soluzione contenente streptolisina 0 da usarsi, il tipo di supporto, e il principio di un rispettivo metodo di dosaggio utilizzato per la determinazione dell'anticorpo antistreptolisina 0 legato all'agente legante. Per esempio, prendendo in considerazione i fattori visti sopra, l'immobilizzazione della streptolisina 0 su un supporto sul guale è immobilizzato lo steroide può venire condotta conformemente alla procedura descritta qui sotto.

Quando si desidera che streptolisina 0 venga immobilizzata su particelle di lattice colloidale sulle quali è immobilizzato lo steroide, l'immobilizzazione della streptolisina 0 può venire condotta per esempio mediante il metodo seguente.

Una soluzione acquosa avente un contenuto di proteine da 0,5 mg/mi a 1 mg/mi, in cui la proteina presenta un contenuto di streptolisina O dal 5% al 10% in peso, viene innanzitutto preparata e la soluzione di streptolisina O viene diluita con acqua o con il tampone nominato piò su da 1 a 10.000 volte, preferibilmente da 10 a 1.000 volte. Nella soluzione diluita di streptolisina O risultante vengono sospese particelle di lattice sulle quali è immobilizzato lo steroide in una quantità tale che la concentrazione delle particelle di lattice (cioè la concentrazione di solidi) sia in generale dallo 0,01 (p/v)% al 10 (p/v)%, preferibilmente dallo 0,05 (p/v)% al 5 (p/v)%. La sospensione risultante viene sottoposta ad una reazione lasciandola a riposo, mettendola sotto agitazione o sbattendola in generale a temperatura da 0°C a 40°C, preferibilmente da 4°C a 30°C, in generale per da 10 minuti a 24 ore, preferibilmente da 30 minuti a 12 ore. Dopo di ciò, se desiderato, le particelle di lattice portanti streptolisina O immobilizzata risultanti possono venire lavate con acqua o con un tampone.

Le particelle di lattice portanti streptolisina 0 immobilizzata ottenute mediante il metodo succitato possono venire utilizzate con vantaggio per determinare 1'anticorpo antistreptolisina O sulla base del principio, per esempio, dei saggi di immunoagglutinazione .

Quando una perlina portante uno steroide immobilizzato o una sfera portante uno steroide immobilizzato viene utilizzata come supporto, l'immobilizzazione della streptolisina O su un supporto portante immobilizzato uno steroide può venire condotta mediante un metodo simile al metodo precedentemente descritto per l'immobilizzazione di streptolisina O sulle particelle di lattice colloidale portanti immobilizzato uno steroide, tenendo in considerazione fattori come l'area superficiale, il volume e il numero delle perline o delle sfere.

La perlina o sfera portante streptolisina 0 immobilizzata ottenuta mediante il metodo suddetto può venire utilizzata con vantaggio per determinare l'anticorpo antistreptolisina 0, per esempio, mediante il saggio enzimoimmunometrico, il saggio radioimmonumetrico o il saggio fluoroimmunometrico.

Quando si desidera che la streptolisina 0 venga immobilizzata su una piastra di microtitolazione sulla quale è immobilizzato lo steroide, l'immobilizzazione della streptolisina 0 può venire condotta, per esempio, mediante il metodo seguente.

Una soluzione acquosa avente un contenuto di proteine da 0,5 mg/ml a 1 mg/ml, in cui la proteina presenta un contenuto di streptolisina 0 dal 5% al 10% in peso, viene innanzitutto preparata e la soluzione di streptolisina O viene diluita, con acqua o con il tampone suddetto, in generale da 10 a 10.000 volte, preferibilmente da 100 a 1.000 volte. La soluzione diluita viene posta nei pozzetti della piastra di microtitolazione con immobilizzato lo steroide in una quantità in generale da 25 pi a 200 pi per pozzetto, preferibilmente da 50 pi a 100 pi per pozzetto, e viene lasciata a riposo in generale a temperatura da 0°C a 40°C, preferibilmente da 4°C a 30°C, in generale per da 10 minuti a 24 ore, preferibilmente da 30 minuti a 10 ore (effettuando in questo modo una reazione). Dopo di ciò, i pozzetti vengono lavati con acqua o con un tampone appropriato.

La piastra di microtitolazione con streptolisina 0 immobilizzata ottenuta mediante il metodo suddetto può venire utilizzata con vantaggio per la determinazione dell'anticorpo antistreptolisina O, per esempio, mediante il saggio enzimoimmunometrico, il saggio radioimmunometrico o il saggio fluoroimmunometrico .

Per esempio, inoltre, quando come supporto si utilizza una provetta portante immobilizzato lo steroide, l'immobilizzazione della streptolisina 0 su un supporto avente lo steroide immobilizzato può venire condotta mediante un metodo simile al metodo descritto sopra per l'immobilizzazione della streptolisina 0 sulla piastra di microtitolazione portante steroide immobilizzato, tenendo in considerazione fattori come il volume interno della provetta.

La provetta con streptolisina 0 immobilizzata ottenuta mediante il metodo suddetto può venire utilizzata con vantaggio per determinare 1'anticorpo antistreptolisina O, per esempio, mediante il saggio enzimoinununometrico, il saggio radioimmunometrico o il saggio fluoroimmunometrico.

Inoltre, quando si desidera che la streptolisina 0 venga immobilizzata su una membrana sulla quale è immobilizzato lo steroide, 1'immobilizzazione della streptolisina O può venire condotta per esempio mediante il metodo seguente.

Una soluzione acquosa avente un contenuto di proteine da 0,5 mg/ml a 1 mg/ml, in cui la proteina presenta un contenuto di streptolisina 0 dal 5% al 10% in peso, viene innanzitutto messa a disposizione e la soluzione di streptolisina O viene diluita, con acqua o con il tampone suddetto, in generale da 10 a 10.000 volte, preferibilmente da 100 a 1.000 volte. La soluzione diluita viene messa in contatto con la membrana sulla quale è immobilizzato lo steroide, per esempio in un appropriato recipiente di reazione, oppure viene messa in contatto con la membrana portante immobilizzato lo steroide facendo sgocciolare la soluzione su porzioni della membrana. Poi, la membrana viene lasciata a riposo o sbattuta in generale a temperatura da 0°C a 40°C, preferibilmente da 4°C a 30°C, in generale per da 5 minuti a 24 ore, preferibilmente da 10 minuti a 10 ore. Dopo di ciò, la membrana portante streptolisina 0 immobilizzata risultante viene lavata con acqua o con il tampone suddetto.

La membrana con streptolisina 0 immobilizzata ottenuta mediante il metodo suddetto può venire utilizzata con vantaggio per determinare l'anticorpo antistreptolisina 0 per esempio mediante il metodo di immunocolorazione .

Nel metodo della presente invenzione per la determinazione immunologica di anticorpo antistreptolisina 0, una soluzione del campione sperimentale contenente anticorpo antistreptolisina 0 viene messa in contatto con un agente legante specifico (cioè il supporto portante streptolisina 0 immobilizzata specifico descritto più su) e viene fatto reagire con esso, in condizioni adatte per la formazione di un complesso antigene-anticorpo, legando in questo modo selettivamente 1'anticorpo antistreptolisina 0 all'agente legante mediante una reazione antigeneanticorpo , e poi viene determinata la quantità dell 'anticorpo antistreptolisina 0 legato all'agente legante.

Esempi delle soluzioni del campione sperimentale da usarsi nel metodo della presente invenzione includono fluidi corporei, come siero, plasma, saliva e urina, un estratto tissutale e un surnatante di una coltura tissutale. Queste soluzioni di campioni sperimentali possono venire utilizzate tali quali come sono oppure possono venire utilizzate dopo averle appropriatamente diluite con acqua o con il tampone suddetto, tenendo in considerazione fattori come il principio per la determinazione dell'anticorpo antistreptolisina 0 legato all'agente legante, la sensibilità della rivelazione e l'intervallo di misura.

Per quanto si riferisce alle condizioni di reazione nelle quali il metodo della presente invenzione per la determinazione immunologica di anticorpo antistreptolisina 0 viene messo in pratica, non vi sono particolari limitazioni purché la reazione antigene-anticorpo non venga inibita e le proprietà dei reagenti da usarsi non vengano sminuite (per esempio quando si utilizza una sostanza marcata, le proprietà di rivelabilità della sostanza marcata non dovrebbero risultare peggiorate). Tenendo in considerazione fattori come il principio per la determinazione dell'anticorpo antistreptolisina 0 legato all'agente legante, si possono selezionare appropriatamente condizioni di reazione adatte tra le condizioni di reazione generalmente utilizzate nei metodi di determinazione convenzionali.

Nella presente invenzione, per esempio, quando come agente legante vengono utilizzate particelle di lattice colloidali con streptolisina 0 immobilizzata, il metodo della presente invenzione può venire applicato con vantaggio per esempio ai saggi di agglutinazione di lattice, come il metodo di agglutinazione del lattice su vetrino [si veda Satomi Shibata et al., "Kiki-Shiyaku (Apparecchiature e Reagenti)", Voi. 11, pagine 338-342, 1988]. Specificamente, in questo caso, particelle di lattice con streptolisina 0 immobilizzata e una soluzione del campione sperimentale vengono miscelate le une con l'altra su una piastra di valutazione e si esamina visivamente il verificarsi o il non verificarsi di agglutinazione delle particelle di lattice per la reazione antigene-anticorpo. Inoltre, quando particelle di lattice colloidale con streptolisina 0 immobilizzata vengono utilizzate come agente legante, il metodo della presente invenzione può venire applicato con vantaggio al saggio immunometrico fotometrico su lattice [latex photometric immunoassay (LPIA)] [si veda Ikunosuke Sakurabayashi et al., "Nìppon Rinsho (Chimico giapponese)", Voi. 48, Edizione Supplementare (Voi. II), pagine 1356-1361, 1990]. In questo caso, le particelle di lattice con streptolisina O immobilizzata e una soluzione del campione sperimentale vengono miscelate fra di loro e si misura per via ottica la torbidità prodotta dalla reazione antigene-anticorpo. L'anticorpo antistreptolisina 0 viene determinato facendo riferimento ad una curva di taratura ottenuta relativamente ad una soluzione standard contenente anticorpo antistreptolisina 0.

In aggiunta, quando come agente legante vengono utilizzate particelle di lattice colloidale con streptolisina 0 immobilizzata, il metodo della presente invenzione può venire applicato con vantaggio al saggio immunometrico nefelometrico [nephelometric immunoassay (NIA)] [si veda Yasuko Yamagishi, "Rinsho-kensa (Esami di laboratorio)", Voi. 23, Edizione supplementare, pagine 1286-1289, 1979]. In questo caso, le particelle di lattice con streptolisina 0 immobilizzata e una soluzione del campione sperimentale vengono miscelate le une con l'altra e un aggregato prodotto mediante la reazione antigeneanticorpo viene irraggiato con luce (fascio laser) e si misura l'intensità del raggio diffratto, dopo di che si determina l'anticorpo antistreptplisina 0 mediante riferimento ad una curva di taratura ottenuta relativamente ad una soluzione standard contenente anticorpo antistreptolisina 0.

Inoltre, quando particelle di lattice colloidale con streptolisina 0 immobilizzata vengono utilizzate come agente legante, il metodo della presente invenzione può venire applicato con vantaggio al saggio immunometrico di conteggio [si veda Kouichi Hashimoto et al., "Kensa-to-gijutsu (Esami e tecniche)", Voi. 22, No. 5, pagine 67-68, Edizione supplementare, 1994]. In questo caso, le particelle di lattice con streptolisina 0 immobilizzata e la soluzione di campione sperimentale vengono miscelate le une con l'altra e poi si misura un aggregato prodotto dalla reazione antigene-anticorpo relativamente alla dimensione e al numero. L'anticorpo antistreptolisina 0 viene determinato facendo riferimento ad una curva di taratura ottenuta relativamente ad una soluzione standard contenente anticorpo antistreptolisina 0.

D'altra parte, quando come agente legante si impiega una piastra di microtitolazione portante streptolisina 0 immobilizzata, una perlina portante streptolisina 0 immobilizzata, una sfera portante streptolisina 0 immobilizzata o una provetta portante streptolisina 0 immobilizzata, il metodo della presente invenzione può venire applicato con vantaggio per esempio al saggio enzimoimmunometrico. In questo caso, il supporto portante streptolisina 0 immobilizzata e una soluzione del campione sperimentale vengono fatti reagire uno con l'altra a formare un complesso antigene-anticorpo e poi un anticorpo (contro un anticorpo antistreptolisina 0) marcato con un agente di marcatura viene fatto reagire con il complesso, dopo di che si misura l'attività dell'agente di marcatura legato al supporto attraverso il complesso. L'anticorpo antistreptolisina 0 viene determinato facendo riferimento ad una curva di taratura ottenuta relativamente ad una soluzione standard contenente anticorpo antistreptolisina 0.

Inoltre, utilizzando la proprietà della biotina (che è un tipo di vitamina B) che si lega specificamente all'avidina, che è una glicoproteina basica presente nell'albume, il metodo di determinazione suddetto mediante saggio enzimoimmunometrico può venire modificato nel modo seguente. Anticorpo (contro anticorpo antistreptolisina 0) al quale è legata biotina viene utilizzato al posto dell'anticorpo marcato, e avidina o streptavidina marcata con un agente marcante viene fatta reagire con la biotina legata all'anticorpo, dopo di che si misura l'attività dell'agente marcante legato al supporto attraverso il complesso antigene-anticorpo. L'anticorpo antistreptolisina O viene determinato facendo riferimento ad una curva di taratura ottenuta relativamente ad una soluzione standard contenente anticorpo antistreptolisina O.

Relativamente ai tipi dell'anticorpo marcato e dell 'anticorpo legato a biotina da usarsi nel metodo di determinazione che utilizza il saggio enzimoimmunometrico, non vi sono limitazioni purché essi possano legarsi ad anticorpo antistreptolisina O contenuto nella soluzione del campione sperimentale. Si può utilizzare qualsiasi anticorpo policlonale, anticorpo monoclonale e loro frammenti enzimolitici [per esempio F(ab')2r F(ab)2/ Fab' e Fab]. L'anticorpo può essere un anticorpo che è stato derivato da qualsiasi specie animale e può essere un anticorpo che è stato prodotto mediante tecniche genetiche ricombinanti da cellule ospite, per esempio microorganismi trasformati, come Escherichia coli. lievito e simili.

Relativamente all'agente marcante, esso può venire scelto in modo appropriato tra quelli generalmente utilizzati nel saggio enzimoimmunometrico. Esempi preferiti degli agenti marcanti includono perossidasi, fosfatasi alcalina, β-galattosidasi e glucosio-ossidasi.

La rivelazione dell'attività di enzimi può venire condotta secondo la procedura descritta per esempio in "Kouso Men-eki Sokutei-ho (Saggio enzimoinununometrico) ", "Tanpakushitsu-Kakusan-Kouso (Proteine/acidi nucleici/enzimi) " Supplemento No. 31? a cura di Tsunehiro Kitagawa, Toshio Nambara, Akio Tsuji, e Eiji Ishikawa; e pubblicato da Kyoritsu Shuppan K.K., Giappone, pagine 51-63 (10 settembre 1987) .

Inoltre, quando come agente legante si usa una piastra di microtitolazione con streptolisina O immobilizzata, una perlina con streptolisina 0 immobilizzata, una sfera con streptolisina 0 immobilizzata o una provetta con streptolisina 0 immobilizzata, il metodo della presente invenzione può venire applicato con vantaggio al saggio enzimoimmunometrico basato sul principio del saggio di legame competitivo, che è uno dei metodi di determinazione per gli anticorpi descritti in "Roso Men-eki Sokuteiho (Saggio enzimoimmunometrico)"; a cura di Ishikawa, E., Kawai, T., e Muroi, K., Terza Edizione, pubblicato da Igaku Shoin K.K., Giappone, pagine 31-54 (15 maggio 1987).

Nel saggio enzimoimmunoraetrico suddetto basato sul principio del saggio di legame competitivo, si impiega anticorpo antistreptolisina 0 marcato con enzima. L'anticorpo antistreptolisina 0 marcato con enzima può venire ottenuto marcando un anticorpo derivato dal siero di un paziente infettato con streptococchi emolitici del gruppo A o marcando un anticorpo derivato dall'antisiero ottenuto immunizzando un animale con un immunogeno comprendente streptolisina 0, secondo i metodi descritti in "Kouso-Men-eki Sokutei-ho (Saggio enzimoimmunometrico)fl, "Tanpakushitsu-Kakusan-Kouso (Proteine/acidi nucleici/enzimi)" Supplemento No. 31; a cura di Tsunehiro Kitagawa, Toshio Nambara, Akio Tsuji, e Eiji Ishikawa, e pubblicato da Kyoritsu Shuppan K.K., Giappone, pagine 37-45 (10 settembre 1987).

L'anticorpo antistreptolisina O marcato con enzima può anche venire ottenuto marcando un anticorpo monoclonale preparato contro streptolisina O secondo i metodi descritti in "Men-eki-kenkyu-ho Handbook (Manuale di ricerca immunologica) "; a cura di Hiromi Fujiwara e Junji Yodoi, e pubblicato dalla Chugai-Iyaku-Sha K.K., Giappone, pagine 61-75 (20 settembre 1992). La determinazione dell'enzima marcato e la rivelazione dell'attività dell'enzima possono venire condotte secondo i metodi suddetti.

In aggiunta al saggio enzimoimmunologico suddetto, si può impiegare anche gualsiasi altro metodo convenzionale, per esempio il saggio radioi mmunometrico, il saggio fluoroimmunometrico e simili. Nel saggio radioimmunometrico e nel saggio fluoroimmunometrico , si usano una sostanza radioattiva e una sostanza fluorescente, rispettivamente, al posto dell'enzima come agente marcante usato nel saggio enzimoimmunometrico .

Inoltre, quando come agente legante si impiega una membrana con streptolisina O immobilizzata, il metodo della presente invenzione può venire applicato con vantaggio, per esempio, al saggio di immunocolorazione . In questo caso, la membrana con streptolisina 0 immobilizzata e una soluzione del campione sperimentale vengono fatte reagire una con l'altra a formare un complesso antigene-anticorpo e poi l'anticorpo (contro anticorpo antistreptolisina 0) marcato con un agente marcante viene fatto reagire con il complesso, dopo di che si esamina visivamente o si misura mediante un densitometro l'attività dell'agente marcante legato al supporto attraverso il complesso.

Il metodo per confermare o determinare un prodotto di una reazione antigene-anticorpo non è particolarmente limitato. Si possono impiegare non solo metodi manuali, ma anche metodi automatizzati con l'utilizzo di un analizzatore automatico. Per esempio, quando il metodo della presente invenzione viene applicato al saggio immunometrico per fotometria su lattice (latex photometric immunoassay (LPIA)), si possono utilizzare analizzatori automatici come Hitachi 705, 7050, 7150, 736 e 7070 (fabbricati e venduti dalla Hitachi, Ltd., Giappone). Questi analizzatori automatici eseguono automaticamente operazioni come l'erogazione di una soluzione di campione sperimentale, l'erogazione di un reagente, il lavaggio, la misurazione dell'assorbanza e l'elaborazione dei dati. Specificamente, per esempio, questi analizzatori automatici svolgono le operazioni seguenti. Particelle di lattice con streptolisina 0 immobilizzata e una soluzione di campione sperimentale vengono miscelate le une con l'altra in una cella di reazione. Dopo un periodo di tempo predeterminato, si misura l'assorbanza ad una lunghezza d'onda appropriata scelta tra condizioni di misurazione convenzionali, preferibilmente ad una lunghezza d'onda da 400 nm a 950 nm, mentre si esegue anche una correzione del bianco. Poi, i risultati della misura dell'assorbenza vengono confrontati con una curva di taratura ottenuta relativamente ad una soluzione standard contenente anticorpo antistreptolisina O, determinando in questo modo l'anticorpo antistreptolisina 0 nella soluzione del campione sperimentale.

Inoltre, per esempio, quando il metodo della presente invenzione viene applicato al saggio enzimoimmunometrico utilizzando come agente legante una piastra di microtitolazione portante streptolisina 0 immobilizzata o una provetta portante streptolisina 0 immobilizzata, si può usare un sistema di dosaggio automatizzato come la BECKMAN Biomek 1000 Automated Laboratory Workstation (fabbricata e venduta dalla Beckman Instruments, Ine., U.S.A.) o il CELL ASSAY-2000 ROBOTIC ASSAY SYSTEM (fabbricato e venduto dalla Moritex Corporation, Giappone). Questi sistemi di dosaggio automatizzati svolgono automaticamente operazioni come l'erogazione di una soluzione di campione sperimentale, l'erogazione di un reagente, il lavaggio, la misurazione dell'assorbanza e l'elaborazione dei dati. Specificamente, questi sistemi di dosaggio automatizzati svolgono per esempio le seguenti operazioni. Una piastra di microtitolazione portante streptolisina 0 immobilizzata o una provetta portante streptolisina 0 immobilizzata viene fatta reagire in successione con una soluzione di campione sperimentale, anticorpo marcato con enzima e una soluzione di substrato, e tra queste operazioni vi è un'operazione di lavaggio inserita tra le rispettive reazioni viste sopra. Se desiderato, si aggiunge una soluzione di inibitore dell'enzima alla miscela di reazione risultante per arrestare la reazione. Poi, la colorazione prodotta mediante la reazione enzimatica tra l'enzima marcante e il substrato utilizzato viene misurata ad una lunghezza d'onda appropriata scelta tra condizioni di misurazione convenzionali. I risultati della misurazione della colorazione vengono confrontati con una curva di taratura ottenuta su una soluzione standard contenente anticorpo antistreptolisina O, determinando in questo modo l 'anticorpo antistreptolisina 0 nella soluzione di campione sperimentale .

Quando il metodo della presente invenzione viene applicato per esempio al saggio enzimoimmunometrico, utilizzando come agente legante una perlina con streptolisina 0 immobilizzata, si può utilizzare un sistema di dosaggio automatizzato come il sistema Aloka AEC-2000 POSEIDON II (fabbricato e venduto dalla Aloka Co., Ltd., Giappone). Questo sistema di dosaggio automatizzato svolge automaticamente operazioni come l'erogazione di una soluzione del campione sperimentale, l'erogazione di un reagente, il lavaggio, la misurazione dell'assorbanza e l'elaborazione dei dati. Specificamente, questo sistema di dosaggio automatizzato svolge per esempio le operazioni seguenti. Una perlina con streptolisina 0 immobilizzata viene fatta reagire in successione con una soluzione di campione sperimentale, anticorpo marcato con enzima e una soluzione del substrato, e vi è una operazione di lavaggio inserita tra le reazioni rispettive viste sopra. Se desiderato, si aggiunge una soluzione di inibitore dell'enzima alla miscela di reazione risultante per arrestare la reazione. Poi, la colorazione prodotta mediante la reazione enzimatica tra l'enzima marcante e il substrato utilizzato viene misurata ad una lunghezza d'onda appropriata scelta tra condizioni di misurazione convenzionali. I risultati della misurazione della colorazione vengono confrontati con una curva di taratura ottenuta su una soluzione standard contenente anticorpo antistreptolisina 0, determinando in questo modo 1'anticorpo antistreptolisina 0 nella soluzione di campione sperimentale

Dal punto di vista della convenienza, si preferisce che alcuni o tutti tra i reagenti necessari per mettere in pratica il metodo della presente invenzione vengano forniti nella forma di un "kit” (corredo completo) dei reagenti. Un tale corredo completo di reagenti è vantaggioso anche quando si utilizza un analizzatore automatico nel mettere in pratica il metodo della presente invenzione.

Un esempio di un tale corredo completo di reagenti è un corredo comprendente (A) un supporto sul quale è immobilizzato lo steroide da usarsi nella presente invenzione e (B) una soluzione contenente streptolisina 0. Si preferisce in particolare, in aggiunta o al posto dei reagenti (A) e (B) suddetti, che il corredo completo dei reagenti comprenda (C) un supporto portante streptolisina 0 immobilizzata come agente legante che è stato preparato facendo reagire i reagenti (A) e (B) suddetti l'uno con l'altro. Il corredo completo dei reagenti nella presente invenzione può anche contenere altri reagenti appropriati, per esempio un tampone, una sostanza standard, anticorpo marcato, un substrato, un solvente per un substrato e un terminatore di reazione.

ESEMPI

Nel seguito, la presente invenzione verrà illustrata con riferimento ai seguenti esempi e alle figure da 1 a 6, che tuttavia non devono essere considerati come limitativi della portata della presente invenzione.

Nelle figure 3 e 5, è indicato il termine "IU" (cioè unità internazionale-international unit). Nelle figure 4 e 6, è indicato il termine "Todd Unit" (unità Todd). L'unità internazionale è una unità definita dall'OMS. L'unità Todd significa una quantità di anticorpo antistreptolisina 0 che è in grado di neutralizzare streptolisina 0 in una quantità pari a 2,5 volte una quantità minima (dose emolitica minima) di streptolisina 0 alla quale 0,5 mi di eritrociti di coniglio al 5 (v/v)% vengono lisati compietamente. L'unità internazionale è sostanzialmente equivalente all'unità Todd.

Esempio 1

Esame della reattività di uno steroide immobilizzato con streptolisina 0

(1) Preparazione di streptolisina O Streptococchi emolitici del gruppo A (Streptococcus pyogenes) tipo 3 ceppo D58X (ATCC 12383) sono stati inoculati in 2 litri di brodo di Toddcentrifugazione e vi si è aggiunto PBS per preparare una sospensione di eritrociti all'1% volume su volume.

Sulla soluzione campione ottenuta sopra, contenente streptolisina 0, sono state condotte diluizioni seriali al doppio con PBS. Un mi di ciascuna diluizione in serie è stato miscelato singolarmente con 2 mi della sospensione preparata sopra di eritrociti all'1% volume su volume in una provetta di vetro, operazione seguita da incubazione a 37°C per 30 minuti. Successivamente, relativamente a ciascuna provetta, è stata effettuata la misurazione dell'emolisi per determinare il numero massimo di volte di diluizione a cui veniva presentata visivamente emolisi al 100%. Il numero ottenuto è stato definito come valore di HU per 1 mi di soluzione campione contenente streptolisina O.

(2) Produzione di un supporto con colesterolo immobilizzato.

100 μl Di una soluzione etanolica contenente colesterolo (ottenibile dalla Nakarai Chemical Ltd., Giappone) ad una concentrazione pari a 1 mg/ml sono stati introdotti in ciascun pozzetto di una piastra di microtitolazione (ottenibile dalla Sumitomo Bakelite Co Ltd., Giappone) e poi la piastra è stata lasciata a riposo a 60°C per 2 ore per evaporare e rimuovere il solvente, preparando in questo modo una piastra di microtitolazione con colesterolo immobilizzato. La stessa procedura vista sopra è stata ripetuta, salvo il fatto che si è usato etanolo non contenente colesterolo al posto della soluzione etanolica contenente colesterolo, ottenendo in questo modo una piastra di microtitolazione sulla quale non era immobilizzato colesterolo, che è stata utilizzata come testimone.

(3) Reazione di un supporto con immobilizzato colesterolo con una soluzione contenente streptolisina 0

La soluzione campione contenente streptolisina 0 preparata alla voce (1) qui sopra è stata diluita 20 volte con PBS e 50 μΐ della diluizione risultante sono stati introdotti in ciascun pozzetto di ciascuno di due tipi di piastre di microtitolazione prodotte alla precedente voce (2), sulle quali era immobilizzato colesterolo e rispettivamente non·era immobilizzato colesterolo. Poi, relativamente a ciascuna piastra di microtitolazione, è stata fatta procedere una reazione a temperatura ambiente per 2 ore. La miscela di reazione risultante è stata ricuperata da ciascun pozzetto e sottoposta a prove [cioè elettroforesi su SDS-poliacrilato (SDS-PAGE) e saggio dell'attività emolitica descritta al precedente punto (1)]. I risultati delle prove di ciascuna miscela di reazione sono stati confrontati con quelli ottenuti relativamente alla soluzione campione originale prima della reazione.

L'analisi SDS-PAGE vista sopra è stata condotta utilizzando un gel di poliacrilammide al 12 f5 p/v% sostanzialmente secondo il metodo di Laenunli, U.K. (Nature, 227; pagine 680-685, 1970).

D'altra parte, relativamente allo standard di peso molecolare SDS-PAGE dell'intervallo basso (che include fosforilasi B di peso molecolare 92.500, sieroalbumina bovina avente un peso molecolare di 66.200, ovoalbumina di peso molecolare 45.000, anidrasi carbonica di peso molecolare 31.000, inibitore tripsinico di soia avente un peso molecolare di 21.500, e lisozima di peso 14.400; ottenibili dai Laboratori Bio-Rad, U.S.A.), è stata condotta la stessa SDS-PAGE citata sopra, per ottenere in questo modo un marcante del peso molecolare (striscia 1 in figura 1) per stimare i rispettivi valori del peso molecolare delle proteine contenute nelle miscele di reazione ottenute sopra e nella soluzione campione originale, in cui le proteine erano state separate nello stesso gel. Relativamente al gel, è stata condotta una colorazione con argento utilizzando un corredo completo di colorazione con argento Wako (ottenibile dalla Wako Pure Chemical Industries, Ltd., Giappone), per visualizzare in questo modo le proteine nel gel.

(4) Risultati

Il diagramma SDS-PAGE ottenuto al precedente punto (3) è mostrato in fig. 1. La striscia 2 in fig.

1 mostra un diagramma di separazione di proteine contenute nella soluzione campione originale contenente streptolisina 0, in cui la soluzione campione era stata preparata al precedente punto (1) e diluita 20 volte con PBS.

La striscia 3 in fig. 1 mostra un diagramma di separazione delle proteine contenute nella soluzione ricuperata dalla piastra di microtitolazione con colesterolo immobilizzato. La striscia 4 in fig.

1 mostra un diagramma di separazione di proteine contenute nella soluzione ricuperata dalla piastra di microtitolazione sulla quale non era immobilizzato colesterolo.

Dalla figura 1 è stato confermato che bande di peso molecolare da 66.000 a 69.000 e da 55.000 a 58.000, che sono caratteristiche della streptolisina 0, scomparivano nella striscia 3. Un'attività emolitica presentata dalla soluzione ricuperata dalla piastra di microtitolazione con colesterolo immobilizzato era solo pari allo 0,8% sulla base dell'attività emolitica presentata dalla soluzione campione.

I risultati visti sopra indicano chiaramente che, tra le proteine contenute nella soluzione campione preparata al punto 1, solo streptolisina O avente un'attività biologica era legata in modo specifico al supporto con colesterolo immobilizzato.

Esempio 2

Esame della reattività di streptolisina O immobilizzata con anticorpo antistreptolisina 0

(1) Produzione di un supporto con colesterolo immobilizzato

50 pi Di una soluzione etanolica contenente colesterolo alla concentrazione di 20 ug/ml sono stati introdotti in ciascun pozzetto di una piastra di microtitolazione (ottenibile dalla Sumitomo Bakelite Co., Ltd., Giappone) e poi la piastra è stata lasciata a riposo a 60°C per 2 ore per evaporare e rimuovere il solvente, preparando in questo modo una piastra di microtitolazione con colesterolo immobilizzato. Latte scremato (ottenibile dalla Snow Brand Milk Products Co., Ltd., Giappone) è stato disciolto in tampone tris-cloridrato 20 mM (pH 7,6, contenente cloruro di sodio 0,14 M) in modo tale da preparare una soluzione al 5% peso/volume (a cui si farà qui d'ora in avanti frequentemente riferimento come "soluzione di bloccaggio"). Successivamente, 100 pi della soluzione di bloccaggio sono stati posti in ciascun pozzetto della piastra di microtitolazione. Poi è stata lasciata procedere una reazione a temperatura ambiente per 2 ore. I pozzetti sono stati lavati due volte con tampone tris-cloridrato 20 mM (pH 7,6, contenente cloruro di sodio 0,14 M) (a cui si farà qui d'ora in avanti riferimento come "soluzione di lavaggio"), per preparare in questo modo un supporto portante colesterolo immobilizzato.

(2) Sensibilizzazione di streptolisina O ad un supporto portante colesterolo immobilizzato.

Le stesse soluzioni campione contenenti streptolisina 0 preparate nell'esempio 1, punto (1) più su, sono state diluite rispettivamente 100 volte, 400 volte e 1.600 volte con tampone tris-cloridrato 20 mM (pH 7,6, contenente cloruro di sodio 0,14 M), contenente lo 0,5 p/v% di latte scremato (a cui si farà qui d'ora in avanti riferimento come "soluzione di diluizione"). 50 μl Di ciascuna delle diluizioni preparate sopra e della soluzione di diluizione suddetta (come bianco testimone) sono stati introdotti individualmente in ciascun pozzetto di ciascuna piastra di microtitolazione e poi è stata lasciata procedere una reazione a temperatura ambiente per 2 ore. Successivamente, i pozzetti di ciascuna piastra di microtitolazione sono stati lavati 7 volte con la soluzione di lavaggio, per ottenere in questo modo piastre di microtitolazione sulle quali streptolisina O era sensibilizzata in quantità predeterminate, e una piastra di microtitolazione di bianco testimone.

(3) Rivelazione di un iramunocomplesso della streptolisina 0 con anticorpo antistreptolisina 0

Una soluzione standard contenente anticorpo antistreptolisina 0 (131 IU/ml) (a cui si farà qui d'ora in avanti riferimento frequentemente come "soluzione standard di anticorpo antistreptolisina 0") ottenuta dall'Istituto Nazionale Giapponese della Salute (Japanese National Institute of Health) è stata diluita 500 volte con la soluzione di diluizione suddetta, e 50 μl della diluizione risultante sono stati introdotti in ciascun pozzetto di ciascuna piastra di microtitolazione ottenuta al precedente punto (2) e poi è stata lasciata procedere una reazione a temperatura ambiente per 1 ora. Successivamente, i pozzetti di ciascuna piastra di microtitolazione sono stati lavati sette volte con la soluzione di lavaggio suddetta. F(ab')2 anti IgG umana di capra marcato con fosfatasi alcalina (ottenibile dalla Bio Source International, Inc.-Tago Products, U.S.A.) (anticorpo secondario marcato con enzima) è stato diluito 1.000 volte con la soluzione di diluizione, e 50 pi della diluizione risultante sono stati introdotti in ciascun pozzetto di ciascuna piastra di microtitolazione. Poi è stata lasciata procedere una reazione a temperatura ambiente per 1 ora.

Successivamente, i pozzetti di ciascuna piastra di microtitolazione sono stati lavati 7 volte con la soluzione di lavaggio. 100 μl Di una soluzione a 0,5 mg/ml (substrati) di p-nitrofenilfosfato (ottenibile dalla Wako Pure Chemical Industries, Ltd. , Giappone) in tampone dietanolammina (pH 9,5) sono stati introdotti in ciascun pozzetto. Poi è stata lasciata procedere una reazione a temperatura ambiente per 15 minuti, seguita dall'aggiunta di 100 pi di idrossido di sodio acquoso 0,5N a ciascun pozzetto per terminare in questo modo la reazione enzimatica. Relativamente a ciascuna soluzione prelevata dai pozzetti, sono state misurate le assorbanze (/\E) a 405 nm.

(4) Risultati

Ad una parte in volume della miscela risultante, sono state aggiunte 9 parti in volume di PBS contenente il 2% peso/volume di BSA e poi è stata lasciata procedere una reazione a temperatura ambiente per 2 ore. La miscela risultante è stata centrifugata a 12.000 giri al minuto per 20 minuti per ricuperare in questo modo particelle di lattice. Le particelle di lattice ricuperate sono state risospese in PBS in modo tale da preparare una sospensione di lattice allo 0,2% peso/volume. La soluzione campione contenente streptolisina 0 preparata nell'esempio 1, punto (1) più su, è stata diluita 50 volte con PBS contenente lo 0,4% peso/volume di BSA, e una parte in volume della diluizione risultante è stata aggiunta ad una parte in volume della sospensione di lattice ottenuta sopra e poi è stata lasciata procedere una reazione a temperatura ambiente per 2 ore. Successivamente, la miscela risultante è stata centrifugata a 12.000 giri al minuto per 20 minuti per ricuperare in questo modo particelle di lattice. Le particelle di lattice sono state risospese in PBS in modo tale da preparare una sospensione di lattice allo 0,1% peso/volume. In questo modo, sono state ottenute particelle di lattice con streptolisina 0 immobilizzata nella forma di una sospensione.

I risultati della rivelazione di un iiranunocomplesso della streptolisina 0 con anticorpo antistreptolisina 0 sono mostrati in figura 2. La figura 2 indica chiaramente che la streptolisina O immobilizzata su supporto attraverso il colesterolo ha mantenuto una reattività nei confronti dell'anticorpo antistreptolisina 0.

Esempio 3.

Determinazione del titolo di anticorpo antistreptolisina 0

(1) Produzione di un supporto portante streptolisina 0 immobilizzata

Lattice di polistirene avente un diametro delle particelle pari a 0,12 μπι (ottenibile dalla Sekisui Chemical Co., Ltd., Giappone) è stato sospeso in etanolo acquoso al 10 v/v% in modo tale da preparare una sospensione di lattice di polistirene al 2% peso/volume. Una parte in volume di etanolo acquoso al 10 v/v% contenente colesterolo (ottenibile dalla Nakarai Chemical Ltd-, Giappone) ad una concentrazione pari a 200 pg/ml è stata aggiunta ad una parte in volume della sospensione di lattice preparata sopra e il contatto fra queste preparazioni è stato effettuato a temperatura ambiente per 2 ore.

(2) Determinazione del titolo di anticorpo antistreptolisina 0

600 μl Di PBS e 200 pi di siero sperimentale sono stati aggiunti a 200 pi della sospensione di particelle di lattice con streptolisina O immobilizzata preparata al precedente punto (1). Poi, è stata lasciata procedere una reazione a 37°C per 5 minuti, e è stata misurata l'assorbanza (/\E) a 590 nm della miscela di reazione risultante. E' stato determinato un titolo di anticorpo antistreptolisina 0 facendo riferimento ad una curva di taratura precedentemente ottenuta mediante il metodo della presente invenzione utilizzando una soluzione standard contenente anticorpo antistreptolisina 0.

(3) Risultati

La curva di calibrazione mostrata in figura 3 ottenuta mediante il metodo della presente invenzione illustra la relazione esistente tra il titolo di anticorpo antistreptolisina O e l'assorbanza a 590 nm. Dalla figura 3 si può comprendere che è possibile ottenere una curva di taratura affidabile mediante il metodo della presente invenzione. La relazione esistente tra il titolo di anticorpo antistreptolisina O determinato mediante il metodo della presente invenzione e il titolo di anticorpo antistreptolisina 0 determinato mediante il metodo convenzionale di Rantz-Randall è mostrata in figura 4. La figura 4 indica chiaramente che i risultati ottenuti mediante il metodo della presente invenzione sono in buon accordo con quelli ottenuti mediante il metodo di Rantz-Randall per la determinazione dell'anticorpo antistreptolisina 0.

Esempio 4

Determinazione del titolo di anticorpo antistreptolisina 0

(1) Produzione di un supporto portante streptolisina 0 immobilizzata

50 μl Di una soluzione acquosa al 10 v/v% di etanolo contenente colesterolo (ottenibile dalla Nakarai Chemical Ltd., Giappone), ad una concentrazione pari a 100 μg/ml, è stata introdotta in ciascun pozzetto di una piastra di microtitolazione (ottenibile dalla Sumitomo Bakelite Co., Ltd., Giappone) e poi la piastra è stata lasciata a riposo a temperatura ambiente per due ore, operazione seguita dal lavaggio dei pozzetti per due volte con acqua purificata. Latte scremato (ottenibile dalla Snow Brand Milk Products Co., Ltd., Giappone) è stato,disciolto in tampone tris-cloridrato 20 mM (pH 7,6, contenente cloruro di sodio 0,1411) in modo tale da preparare una soluzione al 5% peso/volume (soluzione di bloccaggio) · Successivamente, 100 μΐ della soluzione di bloccaggio sono stati introdotti in ciascun pozzetto della piastra di microtitolazione preparata sopra. Poi è stata lasciata procedere una reazione a temperatura ambiente per 2 ore.

I pozzetti suddetti sono stati lavati due volte con tampone tris-cloridrato 20 mM (pH 7,6, contenente cloruro di sodio 0,14M) (soluzione di lavaggio). La soluzione campione contenente streptolisina 0 preparata nell'esempio 1, punto (1), più su è stata diluita 1.000 volte con tampone cloridrato 20 mM (pH 7,6, contenente cloruro di sodio 0,14M) contenente lo 0,5% peso/volume di latte scremato (soluzione di diluizione). 50 μl Della diluizione così preparata sono stati introdotti in ciascun pozzetto e poi è stata lasciata procedere una reazione a temperatura ambiente per due ore. Successivamente, i pozzetti sono stati lavati 7 volte con la soluzione di lavaggio per preparare in questo modo una piastra di microtitolazione portante streptolisina 0 immobilizzata.

(2) Determinazione del titolo di anticorpo antistreptolisina 0

Il titolo di anticorpo antistreptolisina O è stato determinato utilizzando la stazione di lavoro BECKMAN Biomek 1000 Automated Laboratory (ottenibile dalla Beckman Instruments, Inc., U.S.A.). 50 μΐ Del siero sperimentale diluito 100 volte con la soluzione di diluizione suddetta sono stati introdotti in ciascun pozzetto della piastra di microtitolazione ottenuta al precedente punto (1) è poi stata lasciata procedere una reazione a temperatura ambiente per 1 ora. Successivamente, i pozzetti sono stati lavati 7 volte con la soluzione di lavaggio suddetta. 50 μl Di un reagente di analisi primario [F(ab')2 di capra anti IgG umana marcato con fosfatasi alcalina (ottenibile dalla Bio Source International, Inc.-Tago Products, U.S.A) (anticorpo secondario marcato con enzima) diluito 1.000 volte con la soluzione di diluizione] sono stati introdotti in ciascun pozzetto della piastra di microtitolazione. Poi è stata lasciata procedere una reazione a temperatura ambiente per 1 ora. Successivamente i pozzetti sono stati lavati 7 volte con la soluzione di lavaggio.

100 pi Di un reagente di analisi secondario [una soluzione a 0,5 mg/mi (substrato) di p-nitrofenilfosfato (ottenibile dalla Wako Pure Chemical Industries, Ltd., Giappone) in tampone dietanolammina (pH 9,5)] sono stati introdotti in ciascun pozzetto. E' stata poi lasciata procedere una reazione a temperatura ambiente per 15 minuti. 100 μΐ Di idrossido di sodio acquoso 0,5N sono stati aggiunti a ciascun pozzetto per terminare in questo modo la reazione enzimatica. Relativamente a ciascuna miscela di reazione estratta dai pozzetti, è stata misurata l'assorbanza (A.E) a 405 nm. E' stato determinato un titolo di anticorpo antistreptolisina 0 facendo riferimento ad una curva di taratura precedentemente ottenuta mediante il metodo della presente invenzione utilizzando una soluzione standard contenente anticorpo antistreptolisina O.

(3) Risultati

La curva di calibrazione mostrata in figura 5, ottenuta mediante il metodo della presente invenzione, illustra la relazione esistente tra il titolo di anticorpo antistreptolisina O e 1'adsorbanza a 405 nm. Dalla figura 5 si può comprendere che è possibile ottenere una curva di taratura affidabile mediante il metodo della presente invenzione. La relazione esistente tra il titolo di anticorpo antistreptolisina O determinato mediante il metodo della presente invenzione e il titolo di anticorpo antistreptolisina O determinato mediante il metodo convenzionale di Rantz-Randall è mostrata in figura 6. La figura 6 indica chiaramente che i risultati ottenuti mediante il metodo della presente invenzione sono in buon accordo con quelli ottenuti mediante il metodo di Rantz-Randall per la determinazione dell'anticorpo antistreptolisina 0.

Claims

RIVENDICAZIONI 1. Metodo per la determinazione immunologica di anticorpo antistreptolisina 0 che comprende le operazioni di: (a) mettere in contatto una soluzione del campione sperimentale contenente anticorpo antistreptolisina 0 con un agente legante in grado di legare specificamente a se il suddetto anticorpo antistreptolisina 0, legando così in modo selettivo 1'anticorpo antistreptolisina O all'agente legante mediante una reazione antigene-anticorpo, e (b) determinare la quantità del suddetto anticorpo antistreptolisina 0 legato al suddetto agente legante, in cui il suddetto agente legante comprende un supporto portante streptolisina 0 immobilizzata ottenuto mettendo in contatto una soluzione contenente streptolisina 0 con un supporto sul quale è immobilizzato almeno uno steroide rappresentato mediante la formula (1): (1) nella quale è scelto all'interno del gruppo costituito da una porzione di catena laterale del colesterolo e una porzione di catena laterale dell'acido colico, in cui ciascuna delle porzioni di catena laterale è, indipendentemente, non sostituita o sostituita e, indipendentemente, satura o insatura; R è idrogeno o idrossile; e ciascuna linea tratteggiata rappresenta indipendentemente un legame singolo o nessun legame, in modo tale che ciascuna linea tratteggiata e una linea continua adiacente ad essa, insieme, indipendentemente, formano un doppio legame o un legame singolo.
2. Metodo secondo la rivendicazione 1 nel quale il suddetto steroide immobilizzato è presente in una quantità da 0,025 nmol/cm 0 a 250 runol/cm9 riferita all'area superficiale del supporto.
3. Metodo secondo la rivendicazione 1 nel quale il suddetto steroide immobilizzato è presente in una quantità da 0,25 nmol/cm<2 >a 25 nmol/cm<2 >riferita all'area superficiale del supporto.
4. Metodo secondo la rivendicazione 1 nel quale la suddetta streptolisina 0 immobilizzata è presente in una quantità da 0,001 pmol/cm<2 >a 1 nmol/cm^ riferita all'area superficiale del supporto.
5. Metodo secondo la rivendicazione 1 nel quale la suddetta streptolisina 0 immobilizzata è presente in una quantità da 0,01 pmol/cm<2 >a 100 pmol/cm^ riferita all'area superficiale del supporto.
6. Metodo secondo una qualunque delle rivendicazioni da 1 a 5 nel quale il suddetto steroide immobilizzato rappresentato mediante la formula (1) è colesterolo, 7-deidrocolesterolo, colestanolo, coprostanolo, /\<7 >-colestenolo, /\ -coprostenolo, β-sitosterolo, 7-deidro-β-sitosterolo, stigmasterolo, 7-deidrostigmasterolo, campesterolo, 7-deidrocampesterolo, stigmastanolo, l\ -stigmastenolo, 11α-idrossicolesterolo, /\<22>-stigmastenolo, α-spinasterolo, campestanolo, /\ -campestenolo, 20a-idrossicolesterolo, brassicasterolo, ergosterolo, cerebrosterolo, 7deidrocerebrosterolo, cerebrostanolo, /\ -cerebrostenolo, desmosterolo, 7-deidrodesmosterolo, acido 3/3— idrossicolanico e acido 3/3-idrossi-/\<5>-colenico.
7. Metodo secondo la rivendicazione 1 nel quale il suddetto supporto è una particella colloidale, una perlina, una sfera, una piastra di microtitolazione, una provetta o una membrana.