CN101906476A

CN101906476A - 一种基于悬浮芯片的多重固相扩增检测方法

Info

Publication number: CN101906476A
Application number: CN2010102425402A
Authority: CN
Inventors: 李炯; 曹榕; 吕卓璇; 段德民; 鲍芳; 姜丽
Original assignee: Suzhou Institute of Nano Tech and Nano Bionics of CAS
Current assignee: Suzhou Institute of Nano Tech and Nano Bionics of CAS
Priority date: 2010-07-30
Filing date: 2010-07-30
Publication date: 2010-12-08

Abstract

本发明涉及分子检测领域，具体地，本发明涉及一种基于悬浮芯片的多重固相扩增检测方法。根据本发明的方法包括以下步骤：1)制备带有不同编码的芯片；2)修饰芯片表面，将每对特异性引物分别固定在特定编码的芯片连接上；3)分别制备多种待检测样品的DNA或RNA；4)进行多重固相扩增；5)荧光检测扩增产物。本发明能同时高效检测多个目的片段，且有效避免引物之间的干扰；重复性、特异性、灵敏度都较好；整个方法操作简单，不需要专业人员，在实际使用中有广泛的应用前景。

Description

一种基于悬浮芯片的多重固相扩增检测方法

技术领域

本发明涉及分子检测领域，具体地，本发明涉及一种基于悬浮芯片的多重固相扩增检测方法。

背景技术

近10余年来，随着现代分子生物学的迅猛发展，为临床实验室诊断提供了较为可靠的核酸检测方法，其中主要用到核酸分子杂交与核酸扩增两种技术。核酸扩增技术的典型代表是聚合酶链式反应(polymerase chainreaction，PCR)，该技术作为分子鉴别诊断(molecular differential diagnoses，MDD)的基础以其高效、快速的特点在病原体早期鉴定中发挥重要的作用。并且该技术也在不断的改良和创新以求更好的满足准确和高效地进行分子鉴别诊断和个体化医疗的需要。

常规PCR技术在一次反应中仅能对一个基因片段进行扩增和分析，因此对于多基因调控或由多病原体感染的疾病，如果采用常规方法，则要进行大量的反应，不仅工作量大，耗时长，且可能耽误控制疾病蔓延的时机。

液相多重PCR是在常规PCR基础上改进并发展起来的一项PCR技术。其基本原理与常规PCR相同，区别在于液相多重PCR在同一个反应体系中，使用多对引物，对多个基因同时进行扩增。由于该项技术具有能快速同时检测多个基因以及节约试剂及器材等优点，已成功的应用于多种病原微生物的检测，遗传病及癌基因的分型鉴定以及实验室的研究。虽然理论上只需适当优化PCR反应条件，就可以扩增多组目的片段，但是液相多重PCR远比常规PCR复杂，其反应体系的组成和反应条件往往受很多实验因素影响，如引物之间的相互作用，PCR缓冲液中各种盐离子的浓度，Mg²⁺浓度和核苷酸浓度之间的平衡等。因此要建立一个灵敏度高特异性强的液相多重PCR反应体系需要做大量的优化工作。

新开发的液相多重PCR方法如Tem-PCR(target enriched multiplex PCR)技术等，在一定程度上解决液相多重PCR技术的问题，但仍然存在一些不足之处，如扩增时间较传统PCR长，靶基因的扩增和检测尚未一体化等。

针对于液相多重PCR的不足，固相桥式多重PCR技术以其独特的优势逐渐发展起来。所谓固相桥式多重PCR，是将特定的核苷酸引物通过共价连接固定在固相支持物上来扩增目的DNA。该项技术的特点是将固相芯片上连接的引物根据模板延伸的核苷酸序列桥连起来作为另一引物的模板，再循环扩增。该技术能消除多对引物之间的相互影响，也可避免常规PCR扩增的一些干扰因素，如没有引物二聚体的形成。因此固相桥式多重PCR在快速基因分型、药学基因组学以及疾病的分子诊断有广泛的用途。而传统固相桥式多重PCR由于属于固液相反应的原因，其扩增效率要明显低于液相PCR，从而限制了其应用范围。

近年来随着生物物理技术在分子生物学上的大量应用，新的核酸扩增模式也不断涌现。如介导等温扩增法(loop-mediated isothermalamplification，LAMP)、链替代扩增(SDA)、连接酶链式反应(LCR)和依赖核酸序列的扩增(NASBA)等，这些方法都具有很高的灵敏度，但如何将这些方法应用到高通量的快速检测是迫切需要解决的问题。

中国专利申请CN200910026137.7公开了一种“编码微球的制备方法”，并指出该编码的微球可以广泛应用于DNA、RNA、蛋白质糖分子的检测。

发明内容

因此，本发明的目的是提供一种基于悬浮芯片的多重固相扩增检测方法。

根据本发明的基于悬浮芯片的多重固相扩增检测方法包括以下步骤：

1)制备带有不同编码的芯片，所述芯片在核酸扩增反应体系中呈悬浮或近悬浮状态；

2)芯片表面修饰氨基，将每对特异性引物通过戊二醛的方式固定在各自被编码的芯片连接上；

3)抽提制待检测样品的DNA或RNA，其中，各DNA或RNA样品包含特异性扩增的片段；

4)以待检测样品的DNA或RNA、和上述固定有特异性引物的编码芯片进行多重固相扩增反应，并标记扩增产物；

5)荧光检测扩增产物，通过在暗场下观察荧光的有无，判断是否扩增，然后通过在明场下观察芯片图形，判断各扩增产物所对应的特异性片段。

根据本发明的方法，带有特征编码芯片可在扩增反应体系中呈悬浮状态，增加连接在芯片上的引物与模板的结合机会，提高扩增效率。芯片材料包括：二氧化硅、磁珠、聚丙烯酰胺、聚苯乙烯，其大小在50nm～200μm，该芯片编码方式包括形状、大小、点阵、荧光比例混合等，目的是将不同的芯片区分开，这样可以在不同芯片上连接不同的探针。例如，选用微片作为固相芯片，半导体微加工工艺在其表面制作出若干的方块可作为编码，每种编码的方块排列不同，然后每种编码的微片连接一对特异性引物，进行多重固相扩增，扩增产物经标记后在荧光显微镜下观察，首先在暗场观察是否有阳性扩增结果，然后转到明场，根据图形或荧光编码判断各编码的微片所扩增到的靶标。

根据本发明的方法，优选以SiO₂微片作为固相多重扩增的芯片，本发明的发明人进一步研究发现，在以SiO₂微片作为固相多重扩增的芯片时，其表面优选以氨基修饰，使其既能有效的将核酸引物稳定的固定在芯片表面，也能保证固定的引物能够耐受部分核酸扩增反应中热循环的温度而不脱落，而羧基修饰效果却不佳。

根据本发明的方法，设计多对特异性检测引物，特异性引物5’端基为氨基、巯基、羧基等修饰。对于特定靶标(如已知的病原微生物)，本领域普通技术人员可以通过公知常识、并结合现有技术设计其特异性引物。PCR反应结果可通过以下多种常规方法检测：(1)Sybergreen I检测双链DNA产物；(2)通过在PCR反应的过程中加入带有地高辛、生物素和放射性同位素标记的dNTP反应，并采用显色法或化学发光法来检测标记地高辛的扩增产物，采用偶联了酶或荧光物质的亲和素(或链霉亲和素)来检测标记生物素的扩增产物，使其显色或产生荧光，以及采用放射自显影来检测放射性同位素标记的扩增产物；(3)通过标有生物素或荧光分子如FITC、CY5、CY3、HEX、ROX、ALEXA FLUOR等探针杂交检测，终产物可选择通过使用碱性磷酸酶(AP)耦联的抗体，或通过检测生物素或荧光信号检测杂交结果。

此外，本发明的发明人研究发现采用以下优化反应条件，可达到更好的检测效果，1、在固相扩增反应中，需将核酸等纯化，这样可以提高扩增效率；2在设计引物时，在每条引物增加一段8～15个Poly T，使得引物拥有合适的空间取向和运动灵活度；3采用生物素来标记产物可起到放大信号的作用，而若采用荧光FITC标记则容易被淬灭。

根据本发明的方法，可检测多条目标DNA片段，或可将总RNA片段逆转录成DNA片段，再进行多通量检测。扩增方法包括：PCR(聚合酶链式反应)、RT-PCR(反转录聚合酶链式反应)、LCR(连接酶链式反应)、RCA(滚环扩增)、LAMP(环介导的核酸等温扩增技术)、NASBA(自主序列复制与依赖于核酸序列的扩增)、SPIA(单引物等温扩增)、HAD(依赖解旋酶的等温扩增技术)、SDA(链替代扩增)、RIDA(快速等温检测放大技术)、NEMA(切刻内切酶核酸恒温扩增)。

根据本发明的方法，制备编码的微球或微片的方法可参考CN200910026137.7。

本发明将编码的微球或微片技术应用于多重固相核酸扩增检测方法，通过优化检测方法中的步骤实现了两种技术的组合。编码的微小芯片在溶液中呈悬浮的状态，可以大大的提高芯片表面引物与溶液中分子的反应效率，解决固相扩增效率低的问题，达到高效检测的目的。同时，通过芯片的编码，可确定扩增产物的类型，达到高通量检测的目的。该方法可适用于临床检测、公共卫生防疫及流行病学调查、转基因水稻的检测、动物疫病诊断、SNP分型等多个研究方向。

本发明能同时高效检测多个目的片段，根据本发明的方法只需要标记一种标记物就可以实现多种扩增结果的判读，且有效避免引物之间的干扰，防止二聚体的产生；重复性、灵敏度和特异性高；整个方法操作简单，不需要专业人员，在实际使用中有广泛的应用前景。

附图说明

图1新型固相多重PCR扩增原理；

图2氨基修饰芯片PCR扩增荧光显影图，图2a为明场观察结果，图2b为暗场观察结果，图2c为明暗场叠加结果。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本方法进行进一步的阐述，应理解，这些实例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲述的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

以中国专利申请CN200910026137.7公开的方法制备SiO₂微片。

实施例1核酸固定方法的比较

采用两种方法固定核酸

(一)采用3-氨丙基三甲氧基硅烷对微片表面进行氨基硅烷化，并通过戊二醛做为“手臂分子”将氨基化的微片与5’氨基修饰核酸引物连接，固定核酸引物，并通过硼氢化钠等来封闭未反应的醛基。

具体实验步骤如下：

1、微球或微片震荡充分，10000r/min离心1min，弃上清，只到微球悬浮液呈中性，置纯水中保存。

2、加入6％APTES(溶剂：95％乙醇)250μl，震荡充分后超声30s，震荡30min，10000r/min，离心1min，弃上清，复加无水乙醇至1ml。震荡30s后，10000r/min，离心1min，弃上清，重复一次，再用PBS清洗2次。

3、加入500μL的3％戊二醛(溶剂：PBS)，超声30s，室温反应2hour，结束反应后，用PBST(含0.02％吐温20)洗涤至无戊二醛。

4、洗掉戊二醛后，离心管中加入100μM的探针2-3μl，涡旋混匀10min直接加核酸反应2hour。

5、封闭醛基，(将多余的醛基封闭掉，减低背景)，50ml system(H₂O 27.5ml；20×SSC 12.5ml；乙醇10ml；NaBH40.65g)。

6、将连有引物的球用于PCR检测，模板为绿色荧光蛋白质粒DNA。PCR反应程序为：100℃热盖；94℃变性5min；循环步骤为94℃变性30s，54℃退火30s，72℃延伸30s，进行35个循环；最后72℃延伸5min，冷却到16℃。

primers	Sequences(5’-3’)
		P1-T10-NH2	TTTTTTTTTTGTGGATAGCGGTTTGACTC
p2-T10-NH2	TTTTTTTTTTCCTTGATGCCGTTCTTCT

7荧光显微镜观察，有扩增产物的芯片，由于扩增产物中标记的biotin能与荧光标记的strepavidin反应，因此可清晰的检测(如图2所示)，而无扩增产物的芯片则无荧光，通过明场和暗场的叠加，可清晰的判断扩增产物的类别以及扩增量。

(二)采用羧基芯片通过EDC交联引物

1、羧基微球4μl重悬在1ml 0.1M MES(PH＝4.5)中，震荡充分，10000r/min，1min，吸上清，重复1次

2、弃上清，重悬于50μL 0.1M MES(PH＝4.5)，混匀；

3、想各个离心管中加入100μM的探针2-3μl，涡旋混匀10min；

4、加入20μL新鲜的EDC(50mg/mL in EDC 0.1M MES，PH＝4.5)；

5、涡旋30min后，再加入EDC repeat(EDC应该是可以过量的)重复四次，2hour；

6、沉淀珠子后，移走上层液体，加入1.0ml 0.02％Tween 20，清洗2次；

7、将连有引物的球用于PCR检测，PCR反应程序为：100℃热盖；94℃变性5min；循环步骤为94℃变性30s，54℃退火30s，72℃延伸30s，进行35个循环；最后72℃延伸5min，冷却到16℃

8、荧光显微镜观察，结果无荧光。

实验结果表明采用戊二醛连接氨基修饰小球与核酸引物是比较稳定的核酸连接方式，能够耐受PCR热循环反应。

实施例2金黄色葡萄球菌多重固相PCR检测

(1)检测菌株包括ATCC25923、TCC6538、CMCC26001、5H048、05I073、05K037、05N074、05L198、05B008、05B012、05B033、05B038、05B041、05B059、05I056；

(2)所有细菌菌株在37℃恒温LB肉汤培养基中培养20小时后提取DNA，DNA提取采用CTAB法；

(3)通过NCBI以及发表文献查找金黄色葡萄球菌的序列，并通过Primer Premier5.0设计检测的特异性引物，引物序列见表1，并将引物稀释到100μM；

表1 检测金黄色葡萄球菌的扩增引物

(4)以SiO₂微片作为固相多重PCR的芯片，并通过半导体微加工工艺在其表面制作出若干的方块可作为编码，每种编码的微片其表面上的方块的排列不同，如图2所示；

(5)将5～10μL(10,000～50,000个)微片悬浮于纯水中，加入6％APTES(溶剂：95％乙醇)250μL，震荡充分后超声30s，震荡30min，10000r/min，离心1min，弃上清，复加无水乙醇至1mL。震荡30s后，10000r/min，离心1min，弃上清，重复一次。再用PBS清洗2次。

(6)加入500μl的3％戊二醛(溶剂：PBS)。超声30s，室温反应2hour，结束反应后，用PBST(含0.02％吐温20)洗涤至无戊二醛；

(7)偶联引物，约在4,000～10,000个每种编码的微片中，分别加入一对引物各5～10μl(浓度为10μM)，常温下反应2小时，期间不断涡旋及超声；

(8)连接过后，通过NaBH4封闭多余的醛基，减低背景，50mL体系包括(H₂O27.5mL；20×SSC 12.5mL；乙醇10mL；NaBH40.65g)；

(9)采用25μL的PCR体系，包括1μL模板DNA；1U rTaq DNA聚合酶；1×TaqBuffer〔200mM Tris-HCl(pH 8.4)；200mM KCl；100mM(NH₄)₂SO₄〕；浓度1.0mM的MgCl₂；dNTP混合液包括0.25mM dATP，dCTP，dGTP，1mM biotin-11-dTTP，1.5mM dTTP；连好不同引物对的微片各1,000个；最后加入无菌水至25μl体系。

(10)PCR反应程序为：100℃热盖；94℃变性5min；循环步骤为94℃变性30s，54℃退火30s，72℃延伸30s，进行35个循环；最后72℃延伸5min，冷却到16℃。

(11)PCR产物通过与1μL0.5mg/mL的Alex标记的链霉亲和素反应，通过荧光显微镜检测PCR产物。

实施例3人副流感病毒的多重固相RT-PCR检测

(1)检测病毒HPIV-1、HPIV-2、HPIV-3和HPIV-4。病毒株在室温条件下复苏，取200μL病毒液接种在生长有70％的LLC-MK2(Rhesus monkey kidney cells)细胞的培养板中。每天观察细胞病变，直到CPE(cytopethic effect)出现，收获培养液及细胞-70℃备用；

(2)来自感染细胞的病毒总RNA用德国QIAGEN公司的QIAamp Kit抽提，抽提方法详见说明书。200μl细胞培养液被抽提，终产物RNA用50μl DEPC处理水洗脱，洗脱液放置-70℃备用；

(3)将总RNA反转录成cDNA是通过日本TAKARA公司的M-MLV RTasecDNASynthesis Kit完成，反转录方法具体见说明说。终产物20μl cDNATE Buffer溶解；放置在-20℃；

(4)通过文献资料来确定检测的片段见表2

表2人副流感病毒的多重RT-PCR的扩增引物

primers	Sequences(5’-3’)	Amplicon Size(bp)
			PI1+	TTTTTTTTTTCCGGTAATTTCTCATACCTATG	317
PI1-	TTTTTTTTTTCCTTGGAGCGGAGTTGTTAAG	317
			PI2+	TTTTTTTTTTAACAATCTGCTGCAGCATTT	570
PI2-	TTTTTTTTTTATGTCAGACAATGGGCAAAT	570
			PI3+	TTTTTTTTTTCTCGAGGTTGTCAGGATTAG	189
PI3-	TTTTTTTTTTCTTTGGGAGTTGAACACAGTT	189
			PI4+	TTTTTTTTTTCTGAACGGTTGCATTCAGGT	564
PI4-	TTTTTTTTTTTTGCATCAAGAATGAGTCCT	564

(5)以SiO₂微片作为固相多重PCR的芯片，并通过半导体微加工工艺在其表面制作出若干的方块可作为编码，每种编码的微片其表面上的方块的排列不同，如图2所示；

(6)将5-10μl(10,000～50,000个)微片悬浮于纯水中，加入6％APTES(溶剂：95％乙醇)250μl，震荡充分后超声30s，震荡30min，10000r/min，离心1min，弃上清，复加无水乙醇至1ml。震荡30s后，10000r/min，离心1min，弃上清，重复一次。再用PBS清洗2次。

(7)加入500μl的3％戊二醛(溶剂：PBS)。超声30s，室温反应2hour，结束反应后，用PBST(含0.02％吐温20)洗涤至无戊二醛；

(8)偶联引物，约在4,000～10,000个每种被编码的微片中，分别加入一对引物各5～10μL(浓度为10μM)，常温下反应2小时，期间不断涡旋及超声；

(9)连接过后，通过NaBH₄封闭多余的醛基，减低背景，50ml体系包括(H₂O 27.5ml；20×SSC 12.5ml；乙醇10ml；NaBH₄0.65g)；

(10)采用25μl的PCR体系，包括1μl模板DNA；1U rTaq DNA聚合酶；1×TaqBuffer〔200mM Tris-HCl(pH 8.4)；200mM KCl；100mM(NH₄)₂SO₄〕；浓度1.0mM的MgCl₂；dNTP混合液包括0.25mM dATP，dCTP，dGTP，1mM biotin-11-dTTP，1.5mMdTTP；连好不同引物对的微片各1,000个；最后加入无菌水至25μl体系。

(11)PCR反应程序为：100℃热盖；94℃变性5min；循环步骤为94℃变性30s，54℃退火30s，72℃延伸30s，进行35个循环；最后72℃延伸5min，冷却到16℃。

(12)PCR产物通过与1μl0.5mg/mL的Alex标记的链霉亲和素反应，通过荧光显微镜检测PCR产物。

Claims

1.一种基于悬浮芯片的多重固相扩增检测方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

3)分别制备多种待检测样品的DNA或RNA，其中，各DNA或RNA样品包含每对特异性引物特异性地扩增的片段；

4)以待检测样品的DNA或RNA、和上述固定有特异性引物的编码芯片进行多重固相扩增，并标记扩增产物；

5)荧光检测所得的扩增产物，通过在暗场下观察荧光的有无，判断是否扩增得到特异性产物，然后通过在明场下观察荧光的图形，判断各扩增产物所对应的待测样品，其中，每种编码芯片在明场在具有特征荧光或图形。

2.根据权利要求1所述的基于悬浮芯片的多重固相扩增检测方法，其特征在于，所述芯片的材料为二氧化硅、聚丙烯酰胺、聚苯乙烯、磁性材料。

3.根据权利要求1、2或3所述的基于悬浮芯片的多重固相扩增检测方法，其特征在于，所述芯片的大小为50nm～200μm。

4.根据权利要求1所述的基于悬浮芯片的多重固相扩增检测方法，其特征在于，芯片的编码方式包括形状、大小、点阵、荧光比例混合。

5.根据权利要求1所述的基于悬浮芯片的多重固相扩增检测方法，其特征在于，在每条特异性检测引物的3’末端增加一段8～15个Poly T。

6.根据权利要求1所述的基于悬浮芯片的多重固相扩增检测方法，其特征在于，扩增产物以生物素来标记。