CN111235290B - 一种厌氧菌液相芯片检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及检测技术领域，具体涉及一种厌氧菌液相芯片检测方法，该检测方法包括下列步骤：步骤A：设计引物和探针；步骤B：多重RT‑PCR反应体系的建立；步骤C：液相芯片检测体系的建立；步骤D：检测。本发明的检测方法基于16S rDNA分子分型的设计依据，通过结合多重PCR反应，以Luminex技术为平台建立起来的液相芯片法，同时检测临床常见的9种厌氧菌核酸，操作方便，无活菌要求，通量高、灵敏度高、速度快、特异性强、成本低廉，为临床提供及时、准确的信息，节约医疗资源，有效降低医疗费用，且厌氧菌的早期诊断利于临床的早期治疗，有效降低患者住院周期，减轻患者医疗费用，节约共同医疗资源。
Description
技术领域
本发明涉及检测技术领域，具体涉及一种厌氧菌液相芯片检测方法。
背景技术
厌氧菌是人体正常菌群的一部分，广泛分布于人体的各个部位，当人体全身或局部抵抗力降低时，寄存于机体的正常菌群定植位置或菌量发生改变时，将导致厌氧菌内源性感染，不仅可引起严重的炎症、脓肿和软组织坏死，还可引起感染的全身性因素多为复杂性疾病，如糖尿病、免疫抑制、肿瘤、肝硬化等。局部因素多为局限性，如体内粘膜损伤、局部组织缺血、缺氧、休克、水肿等，这些均有利于厌氧菌感染的发生发展。研究指出，血培养中厌氧菌的检出率为5-15%，腹部的感染检出率为50-90%，女性生殖道为50-75%，肺部为75%，糖尿病足溃疡为85-95%，口腔厌氧菌检出率甚至高达90-100%。在不同的感染部位中，能够分离出的厌氧菌存在差异。例如在血流感染中最常被分离到的厌氧菌是拟杆菌属细菌，中枢神经系统是普雷沃氏菌属、消化链球菌属、卟啉单胞菌属细菌，胸部为梭杆菌属、普雷沃氏菌属以及卟啉单胞菌属细菌，腹部为拟杆菌属、消化链球菌属以及梭杆菌属细菌，女性泌尿生殖道常为消化链球菌属细菌。厌氧菌感染的愈后从轻微症状到危及生命各不相同，有研究指出，厌氧菌菌血症的死亡率甚至高达63%。近年来由于抗菌药物不合理使用和侵入性操作的广泛应用，致使厌氧菌感染呈上升趋势，其病原菌的种类和耐药情况也在不断的变迁。
而厌氧菌的检测主要依据其表型特征、生化反应进行传统细菌培养与鉴定，但而厌氧菌对培养环境要求苛刻而导致检出阳性率低下、菌种分离和鉴定耗时长，且厌氧菌生长缓慢，并常与其他病原体混合存在，整个检测周期长达3-7天，鉴定难度大导致准确率低、假阴性率高，而且整个过程需要特殊的厌氧环境和昂贵的厌氧菌培养设备，限制了国内很多实验室开展的同时，亦远远不能满足临床早期、敏感、特异的诊断需求。
发明内容
为了克服现有技术中存在的缺点和不足，本发明的目的在于提供一种厌氧菌液相芯片检测方法，该检测方法操作方便，运用液相芯片技术同时对临床常见9种厌氧菌进行检测，无活菌要求，通量高、灵敏度高、速度快、特异性强、成本低廉。
本发明的目的通过下述技术方案实现：一种厌氧菌液相芯片检测方法，包括下列步骤：
步骤A：设计引物和探针；
步骤B：多重RT-PCR反应体系的建立；
步骤C：液相芯片检测体系的建立；
步骤D：检测。
优选的，所述步骤A中，设计引物的具体步骤如下：选择九种厌氧菌的16S rDNA基因的特异性序列设计各种菌的上下游引物，下游引物5’端用生物素修饰，九种厌氧菌的引物序列如下所示：
优选的，所述步骤A中，设计探针的具体步骤如下：通过比对找出种内保守种间特异的序列作为筛选的特异性区域设计探针，合成时5’端进行氨基和C12修饰，并以阪崎肠杆菌作为阳性对照菌种，九种厌氧菌及阳性对照菌种的探针序列如下所示：
本发明以临床感染常见的9种厌氧菌为实验对象，包括脆弱类杆菌、厌氧消化链球菌、具核梭杆菌、产黑色素普雷沃菌、小韦荣球菌、衣氏放线菌、艰难梭菌、产气荚膜梭菌、牙龈卟啉单胞菌。并以阪崎肠杆菌作为阳性对照菌种，并结合多重PCR技术，建立一套完整的液相芯片检测体系。通过引物扩增优化和杂交优化，实现在Luminex平台同时精确检测9种常见厌氧菌，为临床提供及时、准确的信息；节约医疗资源，有效降低医疗费用。且厌氧菌的早期诊断利于临床的早期治疗，有效降低患者住院周期，减轻患者医疗费用，节约共同医疗资源。
根据菌种设计多对引物的序列和长度，保证各种菌靶序列的有效扩增；并以细菌的16S rRNA序列特异靶基因，设计特异性探针，保证液相芯片的质量和稳定性。
优选的，所述步骤B中，多重RT-PCR反应体系的建立具体步骤如下：
步骤B1、提取DNA：以天根DNA提取试剂盒进行DNA提取；
步骤B2、PCR 扩增靶序列：采用不对称 PCR进行扩增，生物素标记的引物浓度与普通的引物浓度比例4：1，双链靶基因的扩增完成后，剩余的生物素标记引物继续进行单链化标记，产生足够多的单链化PCR目标产物；RT-PCR的工作程序为：94℃ 3min，然后94℃30sec、55℃ 30sec、72℃ 60sec，共30个循环；最后72℃延伸5min，4℃保温；扩增产物用浓度为2%的琼脂糖凝胶电泳，在紫外凝胶图像分析系统上观察、分析扩增产物。
本发明通过优化PCR条件、偶联条件和杂交条件，能保证液相芯片的质量和高准确的检测度，其中，PCR条件主要为引物的退火温度、整个反应的循环数；偶联条件主要为一定体积中探针和其他试剂的加样比例；杂交条件的优化主要为杂交温度和杂交时间。其中，利用天根DNA提取试剂盒并采用离心柱法来对DNA进行提取，该技术为现有技术。
优选的，所述步骤C中，液相芯片检测体系的建立包括依次进行的：步骤C1寡核苷酸探针与微球共价偶联、步骤C2杂交、步骤C3染色。
优选的，所述步骤C1寡核苷酸探针与微球共价偶联的具体步骤如下：
步骤C1-1：对应九种厌氧菌及阳性对照菌种，对微球进行编号，并分别取1.25×106个微球置于离心管，转速为12000 rpm条件下离心3-5min，去上清；
其中，所述微球选购于Luminex公司，且每一条探针对应一个微球编号，9种厌氧菌及1种阳性对照（阪崎肠杆菌）的共10条探针需要10个不同的微球编号，各菌对应的微球编号如下：
步骤C1-2：加入10μL 浓度为0.1M的2-（n-吗啉代）乙磺酸溶液，充分震荡混匀，离心；
步骤C1-3：用蒸馏水将合成的寡核苷酸探针稀释至0.1mmol/L，然后加入4μL稀释探针于相应微球悬浮液中，振荡混匀，制得微球与探针混合液；
步骤C1-4：加入2.5μL新鲜配制的10mg/mL的EDC溶液至步骤C1-3的微球与探针混合液中，振荡，室温避光孵育30min；
步骤C1-5：用1mL 浓度为0.02%的吐温20洗涤一次，在转速为12000rpm的条件下离心3-5min；
步骤C1-6：去上清，微球重悬于1mL 浓度为0.1%的SDS中，振荡混匀；
步骤C1-7：在转速为12000rpm的条件下离心3-5min，去上清，微球重悬于30μL pH为8.0的TE中，振荡悬起混匀，即得到已偶联探针的十种检测微球。
优选的，所述步骤C1-7制得已偶联探针的十种检测微球后，还包括：
步骤C1-8：利用血球计数器计算每种微球的数量，换算出每种微球的单位浓度；
步骤C1-9：把已偶联探针的检测微球于4℃避光保存，且每种已偶联探针的检测微球单独保存，使用时，根据检测项目选择要混合的微球种类。
优选的，所述步骤C2杂交的具体步骤如下：
步骤C2-1：将已偶联探针的十种检测微球进行悬摇，并在20kHz、40W的超声条件下超声处理20s，再分别重悬20s；
步骤C2-2：用1.5×TMAC杂交液将各组微球稀释至150个/μL，制得混合微球工作液；
步骤C2-3：将步骤C2-2制得的混合微球工作液进行悬摇，并在20kHz、40W的超声条件下超声处理20s，混合均匀；
步骤C2-4：取一PCR反应板，向每个样品孔及空白对照孔中加入33μL混合微球工作液；
步骤C2-5：向每个空白对照孔中加入17μL pH为8.0的TE，向每个样品孔中分别加入17μL步骤B2扩增的生物素标记的单链化PCR目标产物；
步骤C2-6：利用移液枪分别吹吸步骤C2-5中空白对照孔和样品孔内的混合物，将各反应孔内的混合液混匀，然后盖上反应盖板，并放置于温度为95-100℃的环境中5min，促使PCR产物双链变性；
步骤C2-7：最后将PCR反应板放置于温度为52℃的环境中20min。
优选的，所述步骤C3染色的具体步骤如下：用1×TMAC杂交液将链霉亲和素-藻红蛋白配成2-4μg/mL的显色液，并往每个反应孔中加入75μL配制得到的显色液，再将反应板放置于温度为52℃的环境中孵育15min。
优选的，所述步骤D中，将反应板于温度为52℃的条件下利用Luminex 200进行检测。
本发明中Luminex 200的检测，通过红、绿两束激光检测，红色激光激发微球基质的染料从而对微球编号进行识别，绿色激光对微球表面结合的荧光染料进行识别，实现捕获探针捕获的PCR产物的定量分析。
关于分析的结果判读：以空白对照为基准，当样品的荧光信号值大于空白对照的荧光信号值6倍以上，样品检测结果为阳性；当样品的荧光信号值小于空白对照的荧光信号值3倍以下，样品检测结果为阴性；当样品的荧光信号值为空白对照的荧光信号值的3到6倍，样品检测结果为疑似阳性。实验过程中的空白对照从PCR扩增开始做起，其他反应条件均相同。本发明实验中的阳性对照以阪崎肠杆菌的探针为质控，设计了它的互补标记序列，在杂交的时候加入互补标记序列，和检测样本一起进行后续检测。
本发明的有益效果在于：本发明基于16S rDNA分子分型的设计依据，通过结合多重PCR反应，以Luminex技术为平台建立起来的液相芯片法，同时检测临床常见的9种厌氧菌核酸，操作方便，无活菌要求，通量高、灵敏度高、速度快、特异性强、成本低廉，为临床提供及时、准确的信息，节约医疗资源，有效降低医疗费用，且厌氧菌的早期诊断利于临床的早期治疗，有效降低患者住院周期，减轻患者医疗费用，节约共同医疗资源。
具体实施方式
为了便于本领域技术人员的理解，下面结合实施例对本发明作进一步的说明，实施方式提及的内容并非对本发明的限定。
实施例1
一种厌氧菌液相芯片检测方法，包括下列步骤：
步骤A：设计引物和探针；
步骤B：多重RT-PCR反应体系的建立；
步骤C：液相芯片检测体系的建立；
步骤D：检测。
所述步骤A中，设计引物的具体步骤如下：选择九种厌氧菌的16S rDNA基因的特异性序列设计各种菌的上下游引物，下游引物5’端用生物素修饰，九种厌氧菌的引物序列如下所示：
所述步骤A中，设计探针的具体步骤如下：通过比对找出种内保守种间特异的序列作为筛选的特异性区域设计探针，合成时5’端进行氨基和C12修饰，并以阪崎肠杆菌作为阳性对照菌种，九种厌氧菌及阳性对照菌种的探针序列如下所示：
所述步骤B中，多重RT-PCR反应体系的建立具体步骤如下：
步骤B1、提取DNA：以天根DNA提取试剂盒进行DNA提取；
步骤B2、PCR 扩增靶序列：采用不对称 PCR进行扩增，生物素标记的引物浓度与普通的引物浓度比例4：1，双链靶基因的扩增完成后，剩余的生物素标记引物继续进行单链化标记，产生足够多的单链化PCR目标产物；RT-PCR的工作程序为：94℃ 3min，然后94℃30sec、55℃ 30sec、72℃ 60sec，共30个循环；最后72℃延伸5min，4℃保温；扩增产物用浓度为2%的琼脂糖凝胶电泳，在紫外凝胶图像分析系统上观察、分析扩增产物。
所述步骤C中，液相芯片检测体系的建立包括依次进行的：步骤C1寡核苷酸探针与微球共价偶联、步骤C2杂交、步骤C3染色。
所述步骤C1寡核苷酸探针与微球共价偶联的具体步骤如下：
步骤C1-1：对应九种厌氧菌及阳性对照菌种，对微球进行编号，并分别取1.25×106个微球置于离心管，转速为12000 rpm条件下离心3-5min，去上清；
步骤C1-2：加入10μL 浓度为0.1M的2-（n-吗啉代）乙磺酸溶液，充分震荡混匀，离心；
步骤C1-3：用蒸馏水将合成的寡核苷酸探针稀释至0.1mmol/L，然后加入4μL稀释探针于相应微球悬浮液中，振荡混匀，制得微球与探针混合液；
步骤C1-4：加入2.5μL新鲜配制的10mg/mL的EDC溶液至步骤C1-3的微球与探针混合液中，振荡，室温避光孵育30min；
步骤C1-5：用1mL 浓度为0.02%的吐温20洗涤一次，在转速为12000rpm的条件下离心3-5min；
步骤C1-6：去上清，微球重悬于1mL 浓度为0.1%的SDS中，振荡混匀；
步骤C1-7：在转速为12000rpm的条件下离心3-5min，去上清，微球重悬于30μL pH为8.0的TE中，振荡悬起混匀，即得到已偶联探针的十种检测微球。
所述步骤C1-7制得已偶联探针的十种检测微球后，还包括：
步骤C1-8：利用血球计数器计算每种微球的数量，换算出每种微球的单位浓度；
步骤C1-9：把已偶联探针的检测微球于4℃避光保存，且每种已偶联探针的检测微球单独保存，使用时，根据检测项目选择要混合的微球种类。
其中，所述步骤C1-1中，微球选购于Luminex公司，且每一条探针对应一个微球编号，9种厌氧菌及1种阳性对照（阪崎肠杆菌）的共10条探针需要10个不同的微球编号，各菌对应的微球编号如下：
所述步骤C2杂交的具体步骤如下：
步骤C2-1：将已偶联探针的十种检测微球进行悬摇，并在20kHz、40W的超声条件下超声处理20s，再分别重悬20s；
步骤C2-2：用1.5×TMAC杂交液将各组微球稀释至150个/μL，制得混合微球工作液；
步骤C2-3：将步骤C2-2制得的混合微球工作液进行悬摇，并在20kHz、40W的超声条件下超声处理20s，混合均匀；
步骤C2-4：取一PCR反应板，向每个样品孔及空白对照孔中加入33μL混合微球工作液；
步骤C2-5：向每个空白对照孔中加入17μL pH为8.0的TE，向每个样品孔中分别加入17μL步骤B2扩增的生物素标记的单链化PCR目标产物；
步骤C2-6：利用移液枪分别吹吸步骤C2-5中空白对照孔和样品孔内的混合物，将各反应孔内的混合液混匀，然后盖上反应盖板，并放置于温度为95-100℃的环境中5min，促使PCR产物双链变性；
步骤C2-7：最后将PCR反应板放置于温度为52℃的环境中20min。
所述步骤C3染色的具体步骤如下：用1×TMAC杂交液将链霉亲和素-藻红蛋白配成2-4μg/mL的显色液，并往每个反应孔中加入75μL配制得到的显色液，再将反应板放置于温度为52℃的环境中孵育15min。
所述步骤D中，将反应板于温度为52℃的条件下利用Luminex 200进行检测。
实施例2
本实施例为对上述实施例1的液态芯片的特异性、灵敏度和重复性进行分析验证：
1、特异性评价：检测9种厌氧菌确保种间不会互相交叉，对芯片上的每条探针进行特异性评价，特异性检测的荧光信号值如下表所示。
各菌株特异性检测荧光信号值(MFI)
2、灵敏度分析：紫外分光光度仪对各菌基因组浓度进行测定，并分别稀释为100ng/μL、10ng/μL、1 ng/μL、100 pg/μL、10 pg/μL、1 pg/μL、100 fg/μL、10 fg/μL、 1 fg/μL，对基因组进行PCR扩增，芯片杂交，上机检测。其中，脆弱类杆菌、具核梭杆菌、小韦荣球菌、衣氏放线菌、产气荚膜梭菌、牙龈卟啉单胞菌的检测灵敏度为100 fg/μL，厌氧消化链球菌、产黑色素普雷沃菌、艰难梭菌的检测灵敏度为10 fg/μL。
方法学灵敏度分析
3、重复性检测：对每个探针进行了3次独立地的实验。在实验中，选取每个样品100ng进行PCR扩增。测定3次实验中，每个样品对应的MFI值，所得结果如下表，离散系数CV均小于10%时，说明重复性良好。
重复性实验结果
通过上述检测，说明本发明的检测方法，通量高、灵敏度高、速度快、特异性强，能为临床提供及时、准确的信息。
上述实施例为本发明较佳的实现方案，除此之外，本发明还可以其它方式实现，在不脱离本发明构思的前提下任何显而易见的替换均在本发明的保护范围之内。
Claims (7)
1.一种厌氧菌液相芯片，其特征在于：所述厌氧菌液相芯片的制备包括下列步骤：
步骤A：设计引物和探针；
步骤B：多重RT-PCR反应体系的建立；
步骤C：液相芯片检测体系的建立；
所述步骤A中，设计探针的具体步骤如下：通过比对找出种内保守种间特异的序列作为筛选的特异性区域设计探针，合成时5’端进行氨基和C12修饰，并以阪崎肠杆菌作为阳性对照菌种，九种厌氧菌及阳性对照菌种的探针序列如下表所示：
所述步骤A中，设计引物的具体步骤如下：选择九种厌氧菌的16S rDNA基因的特异性序列设计各种菌的上下游引物，下游引物5’端用生物素修饰，九种厌氧菌的引物序列如下表所示：
。
2.根据权利要求1所述的一种厌氧菌液相芯片，其特征在于：所述步骤B中，多重RT-PCR反应体系的建立具体步骤如下：
步骤B1、提取DNA：利用DNA提取试剂盒进行DNA提取；
步骤B2、PCR 扩增靶序列：采用不对称 PCR进行扩增，生物素标记的引物浓度与普通的引物浓度比例4：1，双链靶基因的扩增完成后，剩余的生物素标记引物继续进行单链化标记，产生足够多的单链化PCR目标产物；工作程序为：94℃ 3min，然后94℃ 30sec、55℃30sec、72℃ 60sec，共30个循环；最后72℃延伸5min，4℃保温；扩增产物用浓度为2%的琼脂糖凝胶电泳，在紫外凝胶图像分析系统上观察、分析扩增产物。
3.根据权利要求1所述的一种厌氧菌液相芯片，其特征在于：所述步骤C中，液相芯片检测体系的建立包括依次进行的：步骤C1寡核苷酸探针与微球共价偶联、步骤C2杂交、步骤C3染色。
4.根据权利要求3所述的一种厌氧菌液相芯片，其特征在于：所述步骤C1寡核苷酸探针与微球共价偶联的具体步骤如下：
步骤C1-1：对应九种厌氧菌及阳性对照菌种，对微球进行编号，并分别取1.25×106个微球置于离心管，转速为12000 rpm条件下离心3-5min，去上清；
步骤C1-2：加入10μL 浓度为0.1M的2-（n-吗啉代）乙磺酸溶液，充分震荡混匀，离心；
步骤C1-3：用蒸馏水将合成的寡核苷酸探针稀释至0.1mmol/L，然后加入4μL稀释探针于相应微球悬浮液中，振荡混匀，制得微球与探针混合液；
步骤C1-4：加入2.5μL新鲜配制的10mg/mL的EDC溶液至步骤C1-3的微球与探针混合液中，振荡，室温避光孵育30min；
步骤C1-5：用1mL 浓度为0.02%的吐温20洗涤一次，在转速为12000rpm的条件下离心3-5min；
步骤C1-6：去上清，微球重悬于1mL 浓度为0.1%的SDS中，振荡混匀；
步骤C1-7：在转速为12000rpm的条件下离心3-5min，去上清，微球重悬于30μL pH为8.0的TE中，振荡悬起混匀，即得到已偶联探针的十种检测微球。
5.根据权利要求4所述的一种厌氧菌液相芯片，其特征在于：所述步骤C1-7制得已偶联探针的十种检测微球后，还包括：
步骤C1-8：利用血球计数器计算每种微球的数量，换算出每种微球的单位浓度；
步骤C1-9：把已偶联探针的检测微球于4℃避光保存，且每种已偶联探针的检测微球单独保存，使用时，根据检测项目选择要混合的微球种类。
6.根据权利要求4所述的一种厌氧菌液相芯片，其特征在于：所述步骤C2杂交的具体步骤如下：
步骤C2-1：将已偶联探针的十种检测微球进行悬摇，并在20kHz、40W的超声条件下超声处理20s，再分别重悬20s；
步骤C2-2：用1.5×TMAC杂交液将各组微球稀释至150个/μL，制得混合微球工作液；
步骤C2-3：将步骤C2-2制得的混合微球工作液进行悬摇，并在20kHz、40W的超声条件下超声处理20s，混合均匀；
步骤C2-4：取一PCR反应板，向每个样品孔及空白对照孔中加入33μL混合微球工作液；
步骤C2-5：向每个空白对照孔中加入17μL pH为8.0的TE，向每个样品孔中分别加入17μL步骤B2扩增的生物素标记的单链化PCR目标产物；
步骤C2-6：利用移液枪分别吹吸步骤C2-5中空白对照孔和样品孔内的混合物，将各反应孔内的混合液混匀，然后盖上反应盖板，并放置于温度为95-100℃的环境中5min，促使PCR产物双链变性；
步骤C2-7：最后将PCR反应板放置于温度为52℃的环境中20min。
7.根据权利要求6所述的一种厌氧菌液相芯片，其特征在于：所述步骤C3染色的具体步骤如下：用1×TMAC杂交液将链霉亲和素-藻红蛋白配成2-4μg/mL的显色液，并往每个反应孔中加入75μL配制得到的显色液，再将反应板放置于温度为52℃的环境中孵育15min。
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