CN101812533A

CN101812533A - 乙肝病毒hbv荧光定量pcr检测引物与探针

Info

Publication number: CN101812533A
Application number: CN200910024424A
Authority: CN
Inventors: 符芳芳; 李杨霞; 于秀菊
Original assignee: JIANGSU MOLE BIOSCIENCE CO Ltd
Current assignee: JIANGSU MOLE BIOSCIENCE CO Ltd
Priority date: 2009-02-24
Filing date: 2009-02-24
Publication date: 2010-08-25

Abstract

一种用于检测HBV DNA的引物与探针，引物序列包括：上游引物HBVF：5′TAGGAGGCTGTAGGCATAAATTGG3′下游引物HBVR：5′GCACAGCTTGGAGGCTTGA3’探针序列HBVP：5′FAM-TCACCTCTGCCTAATC-MGB3’。

Description

乙肝病毒HBV荧光定量PCR检测引物与探针

技术领域

本发明是一种用于检测乙肝病毒HBV核苷酸序列的的引物和探针。

背景技术

乙型肝炎病毒(HBV)，嗜肝DNA病毒科。全世界有3.5亿人携带乙肝病毒，每年有近100万人死于乙肝相关并发症，包括肝硬化、肝细胞癌。我国是乙型肝炎高发区，约57.6％的人口过去或现在受到过乙型肝炎病毒的感染，他们中仍有约1.2亿人携带乙肝病毒，现症患者已超过2000万人。乙肝病毒携带者中，50％--75％的人有活动性病毒复制的慢性乙肝，估计5年中从慢性乙肝进展为肝硬化的发生率为2％-20％；从代偿性肝硬化到肝脏失代偿为20％-23％；从代偿肝硬化到肝癌为6％-15％。慢性乙肝是进展为肝硬化、肝衰竭和肝细胞癌的首要危险因素乙肝病毒携带者中，50％--75％的人有活动性病毒复制的慢性乙肝，估计5年中从慢性乙肝进展为肝硬化的发生率为2％-20％；从代偿性肝硬化到肝脏失代偿为20％-23％；从代偿肝硬化到肝癌为6％-15％。HBV的传染性很强，接种0.00004ml含病毒血液足以使人发生感染。而乙肝病毒又常常产生突变，这给乙肝的确诊和治疗带来极大的麻烦，所以迫切需要一种既准确又快速的实验室检验方法来检测乙肝病毒。

乙肝病毒的检测技术包括：免疫学检测方法，包括酶联免疫分析法，胶体金免疫层析测定法，免疫荧光法和固相放射免疫法；分子生物学检测方法，包括核酸探针法，PCR法和基因芯片法。其中，PCR检测法简便、快速，近年来，在临床检测中备受青睐，但是，普通PCR检测易产生污染。，实时荧光定量PCR法检测HBV-DNA较传统定性PCR技术操作简便，检测时不需打开反应管便可测出定量结果，从而减少污染机会，同时提高了检测灵敏度、特异性及整个操作的自动化程度。其特异、灵敏且准确等优点，在人类传染病和病原定量上的应用日益广泛。在实时荧光定量PCR检测方法中，引物和探针的设计尤为重要，决定了检测结果的有效性。

发明内容

本发明的目的在于提供一种检测HBV DNA的引物和探针。

基于上述目的，本发明采用以下技术方案：

用于检测HBV DNA的引物和探针序列包括：

上游引物HBVF的序列为：5′TAGGAGGCTGTAGGCATAAATTGG3′，

下游引物HBVR的序列为：5′GCACAGCTTGGAGGCTTGA3’，

探针HBVP的序列为：5′FAM-TCACCTCTGCCTAATC-MGB3’

本发明的原理为：在传统的PCR扩增体系中加入一个与靶序列特异互补的双荧光标记寡核苷酸探针，探针的5’端设计了一个报告荧光基团，3’端设计了一个淬灭荧光基团。在探针完整的情况下，报告荧光基团发出荧光被淬灭荧光基团吸收，此时检测不到荧光信号。当有特异PCR产物时，复性时，标记探针与靶序列结合互补，形成局部双链产生适合于5’-3’核酸外切酶外切活性的底物，激活Tag聚合酶的5’外切酶活性，将5’的荧光分子切除，这样，报告荧光基团与淬灭荧光基团分离，淬灭作用被解除，产生荧光信号，通过荧光定量PCR仪检测荧光度，即可测得最终的定量结果。

附图说明

利用引物对HBVF/HBVR和探针HBVP检测HBV DNA阳性样品的荧光定量PCR图。

见附图一。

具体实施方式

1，引物和探针的设计：通过分别对所有已知的乙肝病毒基因序列比较分析，选择高保守的区段，设计多对引物和探针，最优的引物和探针如下：

上游引物HBVF：5′TAGGAGGCTGTAGGCATAAATTGG3′

下游引物HBVR：5′GCACAGCTTGGAGGCTTGA3’

探针HBVP：5′FAM-TCACCTCTGCCTAATC-MGB3’

2，反应体系的优化：利用病人血清作为待检样品，分装后储存于-20℃

2.1引物浓度的优化：在反应体系中其他组分相同的情况下，将HBV引物浓度分别从0.1μM到2.0μM作倍比连续稀释，通过实验结果的分析比较，确定最优引物浓度为0.5μM。

2.2探针浓度的优化：在反应体系中其他组分相同的情况下，将HBV探针浓度分别从0.01μM到1.0MM作倍比连续稀释，通过实验结果的分析比较，去顶最优探针浓度为0.05μM。

利用上述引物和探针进行反应体系的建立，最后确定，HBV DNA荧光定量PCR的最优体系为40μL。

3.仪器检测通道的选择

选择的荧光检测通道应与探针所标记的报告荧光基团一致，具体按照仪器使用说明书进行设置。

4，PCR反应条件如下：

37℃5min，1个循环；95℃2min，1个循环；95℃10sec，59℃40sec，40个循环。在59℃40sec阶段收集荧光。

5，检测结果分析：

如果待检样品中HBV DNA，则显示阳性扩增曲线，检测灵敏度为100拷贝/mL。如果待检样品中没有HBV DNA，则没有信号。显示上述引物和探针有良好的特异性和检测灵敏度。

本发明的优点在于：

(1)由于我国乙肝病毒多为B和C型，故市场上同类产品基本只针对这两型。而本发明提供的引物和探针，是选取了乙肝病毒已知的所有亚型的高保守区域，可以达到所有亚型都能检出的效果。并能避免假阴性结果的出现。

(2)本发明提供的引物和探针的检测灵敏度达到300拷贝/mL，显示了其将具有很好的检出率。

(3)本发明提供的引物和探针检测阴性样品没有信号，显示了其很好的特异性。

Claims

1.一种用于检测乙肝病毒基因(HBV DNA)的引物，其特征在于所述的引物序列包括上游引物HBVF：5′TAGGAGGCTGTAGGCATAAATTGG3′，下游引物HBVR：

5′GCACAGCTTGGAGGCTTGA3’。

2.一种用于检测乙肝病毒基因(HBV DNA)的探针，其特征在于所述的探针HBVP序列为：5′FAM-TCACCTCTGCCTAATC-MGB3’。