CN112481360A - 一种用于各类案件样本法庭科学dna分型检测的dna免提取直接扩增试剂 - Google Patents

一种用于各类案件样本法庭科学dna分型检测的dna免提取直接扩增试剂 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于各类案件样本法庭科学DNA分型检测的DNA免提取直接扩增试剂。该DNA免提取直接扩增试剂由Tris‑HCl缓冲液、MgCl2、KCl、dNTP、BSA、二硫苏糖醇、多羟基醇、两性表面活性剂、非离子表面活性剂、多聚糖和DNA聚合酶组成。实验证明，采用本发明提供的DNA免提取直接扩增试剂进行直接扩增所获得的STR分型图谱清晰完整、平衡性好、无非特异性人工产物出现、无条带丢失或明显的抑制现象出现；对各类案件样本均表现出出色的抗抑制能力和较高的检测灵敏度。本发明具有重要的应用价值。

Description

一种用于各类案件样本法庭科学DNA分型检测的DNA免提取直 接扩增试剂
技术领域
本发明属于法医学领域，具体涉及一种用于各类案件样本法庭科学DNA分型检测的DNA免提取直接扩增试剂。
背景技术
生物样本的快速准确STR检测是法庭科学DNA检验领域的核心任务。法庭科学领域常见的生物样本主要包括：血液、血斑、唾液、唾液斑、精液、精斑、毛发(带毛囊)、各种组织、接触性检材等，不同类型的生物样本常附着于不同载体上或存在于不同环境中。作为PCR扩增的模板DNA主要存在于上述各类不同类型生物样本中。当前法庭科学领域主流的DNA检验技术基于STR-PCR法，该方法对模板DNA的纯度及浓度的要求极为苛刻，因此在扩增前需要进行生物样本的DNA提取与纯化。当前主流的DNA提取方法(如Chelex提取法、硅珠DNA提取法、磁珠DNA提取法等)已经在很大程度上简化了DNA提取纯化流程，具有较高的DNA提取效率及检测灵敏度；但与免提取技术相比，仍存在以下缺陷：1)操作步骤较多；2)耗时长；3)耗费大量人力、物力和财力；4)涉及有毒有害化学试剂的使用等。以磁珠DNA提取法为例，该法能够有效提高DNA提取效率，最大化清除各类PCR抑制物，简化操作步骤，避免使用有毒溶剂，且能够免去离心操作因此可实现多种不同生物样本的自动化提取；但是，当面对超大规模生物样本高通量检验时，表现出诸多不足之处：1)可实现自动化，但必须依托于昂贵的自动化提取工作站，财政负担重；2)试剂成本高；3)耗材消耗大；4)效率低、耗时长，易导致实验室案件积压。
为了实现样本高通量检验，大幅度提高样本的检验效率，很多商业化试剂试图能够免去DNA提取步骤，直接针对适量生物样本进行PCR扩增操作，即所谓的直接扩增技术(Direct PCR)。直接PCR又称直接扩增技术或免提取扩增技术，它能够将原始粗制样本直接加入PCR反应体系并成功获得有效的扩增产物，实现DNA快速检测，减少检验步骤，降低检验成本，对于生物样本快速高效检验而言，这无疑将是一个巨大的革命性进步。
然而，当前在法庭科学DNA检验过程中，直接扩增技术仅适用于样本类型比较单一的数据库样本(如血卡和唾液卡样本)，因扩增成功率低、检材适应性差导致直接扩增难以在案件类型样本检测中实现。近年来随着法庭科学DNA检验技术的发展应用，检测人员将某些个别案件样本，甚至是接触类样本，直接加入复合扩增试剂体系中进行扩增，获得了比常规检验流程更为理想的检验结果，在某种程度上提高了个别检材的检验成功率，然而对于所有案件类型样本而言，基于常规扩增试剂进行直接扩增检测总体成功率较低，其主要原因如下：1、抗抑制性难以满足要求，案件类型样本通常伴随着大量的PCR抑制剂释放至PCR体系，使DNA聚合酶活性降低、失活或影响引物退火，从而严重降低PCR效率甚至导致阴性结果的产生；2、检材适应性难于满足要求，案件涉及生物样本类型较多，主要包括血液类型样本、唾液类型样本、精斑样本，带毛囊毛发样本、人体组织样本、接触性样本等，上述样本具有不同的细胞结构，DNA无法在PCR体系中得到有效释放使得扩增试剂仅对某类检材(如血液、唾液等简单样本)具有适应性；3、灵敏度难以满足微量样本检验要求，很多遗留在案件样本为脱落细胞等接触性样本，属于低拷贝DNA模板，常规的直接扩增试剂为了达到其抗抑制性，试剂灵敏度通常较低，无法突破兼顾抑制性与灵敏度的技术瓶颈。截至目前，国际国内可实现案件样本直接扩增的试剂盒还处于空白状态。
与常规扩增试剂盒相比，案件样本直接扩增试剂具有如下技术优势：1、大幅度缩减检测全流程所消耗的时间，提高检验效率，减少案件积压；直接扩增方法将免去所涉及到的大量样本提取纯化操作，可节约50％-70％的检验时间；2、极大简化检验流程，避免提取过程中人源及样本交叉污染等问题的发生；3、免去提取步骤和环节，节约大量提取试剂经费；4、避免大量提取环节所涉及的有毒有害试剂的使用；5、提高案件样本的检验成功率，特别是对于某些微量样本，直接扩增可最大化体系模板量，避免有限的样本在提取纯化过程中的损耗。鉴于此，迫切需要开展全新案件样本直接扩增检验试剂的研究开发工作，即在对现有DNA检验试剂进行深入研究的基础上，针对国内外相关领域的最新技术发展和法庭科学DNA领域对法医DNA检测试剂的最新需求，开展所涉及各项关键技术研究与开发，研发快速、高效、高通量的案件样本直接扩增检验试剂，将极大满足我国案件样本DNA检测对速度、效率和通量的需求，具有重要的经济价值和社会价值。
发明内容
本发明的目的是对案件样本的直接扩增，且DNA分型检测结果准确。
本发明首先保护一种DNA免提取直接扩增试剂，可包括Tris-HCl缓冲液、MgCl2、KCl、dNTP、BSA、二硫苏糖醇、多羟基醇、两性表面活性剂、非离子表面活性剂、多聚糖和DNA聚合酶。
所述DNA免提取直接扩增试剂具体可由Tris-HCl缓冲液、MgCl2、KCl、dNTP、BSA、二硫苏糖醇、多羟基醇、两性表面活性剂、非离子表面活性剂、多聚糖和DNA聚合酶组成。
所述DNA免提取直接扩增试剂进行直接扩增时，所述Tris-HCl缓冲液在直接扩增体系中的浓度可为10-30mmol/L Tris-HCl缓冲液(pH8.0)(如10-20mmol/L Tris-HCl缓冲液(pH8.0)、20-30mmol/L Tris-HCl缓冲液(pH8.0)、10mmol/L Tris-HCl缓冲液(pH8.0)、20mmol/L Tris-HCl缓冲液(pH8.0)或30mmol/L Tris-HCl缓冲液(pH8.0))。
所述DNA免提取直接扩增试剂进行直接扩增时，所述MgCl2在直接扩增体系中的浓度可为1.5-2.5mmol/L(如1.5-2.0mmol/L、2.0-2.5mmol/L、1.5mmol/L、2.0mmol/L或2.5mmol/L)。
所述DNA免提取直接扩增试剂进行直接扩增时，所述KCl在直接扩增体系中的浓度可为20-70mmol/L(如20-50mmol/L、50-70mmol/L、20mmol/L、50mmol/L或70mmol/L)。
所述DNA免提取直接扩增试剂进行直接扩增时，所述dNTP(dATP、dTTP、dGTP、dCTP)在直接扩增体系中的浓度可为180-220μmol/L(如180-200μmol/L、200-220μmol/L、180μmol/L、200μmol/L或220μmol/L)。
所述DNA免提取直接扩增试剂进行直接扩增时，所述BSA在直接扩增体系中的浓度可为400-1200μg/ml(如400-800μg/ml、800-1200μg/ml、400μg/ml、800μg/ml或1200μg/ml)。
所述DNA免提取直接扩增试剂进行直接扩增时，所述二硫苏糖醇在直接扩增体系中的浓度可为1-2mmol/L(如1-1.5mmol/L、1.5-2mmol/L、1mmol/L、1.5mmol/L或2mmol/L)。
所述DNA免提取直接扩增试剂进行直接扩增时，所述多羟基醇在直接扩增体系中的浓度可为2-10％(v/v)(如2-3％、3-6％、6-10％、2％、3％、6％或10％)。
所述DNA免提取直接扩增试剂进行直接扩增时，所述两性表面活性剂在直接扩增体系中的浓度可为1-2％(m/v)(如1-1.5％、1.5-2％、1％、1.5％或2％)。
所述DNA免提取直接扩增试剂进行直接扩增时，所述非离子型表面活性剂在直接扩增体系中的浓度可为0.1-1.0％(m/v)(如0.1-0.2％、0.2-1.0％、0.1％、0.2％或1.0％)。
所述DNA免提取直接扩增试剂进行直接扩增时，所述多聚糖在直接扩增体系中的浓度可为1-10％(m/v)(如1-4％、4-6％、6-10％、1％、4％、6％或10％)。
所述DNA免提取直接扩增试剂进行直接扩增时，所述DNA聚合酶在直接扩增体系中的浓度可为0.05-0.2U/μL(如0.05-0.1U/μL、0.1-0.2U/μL、0.05U/μL、0.1U/μL或0.2U/μL)。
上述任一所述多羟基醇可为丙三醇、乙二醇、丙二醇或己二醇。
上述任一所述两性表面活性剂可为N，N-二甲基-N-十二烷基甘氨酸甜菜碱。
上述任一所述非离子型表面活性剂可为Tween 20、TritonX-100、Tween 21、Tween40、Tween60、Tween65、Tween80、Tween85、TritonX-100、NP40、Brij 30、Span 20、辛基苯基-聚乙烯二醇、聚氧乙烯10油醚或N-辛酰基-N-甲基葡糖胺。
上述任一所述多聚糖可为多聚蔗糖。所述多聚蔗糖可为多聚蔗糖400。
上述任一所述DNA聚合酶可为Taq DNA聚合酶。所述Taq DNA聚合酶可为热启动TaqDNA聚合酶。
本发明还保护上述任一所述的DNA免提取直接扩增试剂的应用，可为A1)-A4)中的至少一种：
A1)对样本进行DNA分型检测；
A2)对样本进行直接扩增；
A3)制备用于对样本进行DNA分型检测的试剂盒；
A4)制备用于对样本进行直接扩增的试剂盒。
上述应用中，所述样本可为案件样本。所述案件样本可为血液类型样本、唾液类型样本、精斑类型样本、毛发(带毛囊)类型样本、肌肉组织样本或接触性样本。所述血液类型样本可为生锈菜刀转移血迹样本或石灰墙面转移血迹样本。所述唾液类型样本可为烟蒂样本。所述接触性样本可为棉线手套虎口处纱线。
上述应用中，所述DNA分型检测可为：将上述任一所述的DNA免提取直接扩增试剂直接扩增的产物进行毛细管电泳检测，分析获得检测图谱。
上述应用中，所述直接扩增可为STR荧光复合扩增或PCR扩增。
本发明还保护一种对样本进行DNA分型检测的方法，包括如下步骤：向上述任一所述的DNA免提取直接扩增试剂中加入样本，进行直接扩增，之后进行DNA分型检测。
上述方法中，所述样本可为案件样本。所述案件样本可为血液类型样本、唾液类型样本、精斑类型样本、毛发(带毛囊)类型样本、肌肉组织样本或接触性样本。所述血液类型样本可为生锈菜刀转移血迹样本或石灰墙面转移血迹样本。所述唾液类型样本可为烟蒂样本。所述接触性样本可为棉线手套虎口处纱线。
上述方法中，所述DNA分型检测可为：将上述任一所述的DNA免提取直接扩增试剂直接扩增的产物进行毛细管电泳检测，分析获得检测图谱。
上述方法中，所述直接扩增可为STR荧光复合扩增或PCR扩增。
上述任一所述样本可为案件样本。
上述任一所述DNA分型检测可为法庭科学DNA分型检测。
实验证明，采用现有商业试剂盒(如Identifiler plus试剂盒)对不同类型案件样本进行直接扩增所获得的STR分型图谱均有不同程度的位点丢失，甚至扩增失败现象出现；而采用本发明制备的DNA免提取直接扩增试剂对不同类型案件样本进行直接扩增所获得的STR分型图谱清晰完整、平衡性好、无非特异性人工产物出现、无条带丢失或明显的抑制现象出现，表现出出色的抗抑制能力和较高的检测灵敏度。由此可见，本发明制备的DNA免提取直接扩增试剂检测成本低且检出率较高，可用于各类案件样本法庭科学DNA分型检测。本发明具有重要的应用价值。
附图说明
图1为0.5ng 9947A阳性对照DNA分型结果(Identifiler plus试剂盒)。
图2为0.25ng 9947A阳性对照DNA分型结果(Identifiler plus试剂盒)。
图3为0.125ng 9947A阳性对照DNA分型结果(Identifiler plus试剂盒)。
图4为0.0625ng 9947A阳性对照DNA分型结果(Identifiler plus试剂盒)。
图5为0.03125ng 9947A阳性对照DNA分型结果(Identifiler plus试剂盒)。
图6为0.5ng 9947A阳性对照DNA分型结果(直接扩增试剂2)。
图7为0.25ng 9947A阳性对照DNA分型结果(直接扩增试剂2)。
图8为0.125ng 9947A阳性对照DNA分型结果(直接扩增试剂2)。
图9为0.0625ng 9947A阳性对照DNA分型结果(直接扩增试剂2)。
图10为0.03125ng 9947A阳性对照DNA分型结果(直接扩增试剂2)。
图11为0.5mm FTA卡的直接扩增检测结果(Identifiler plus试剂盒)。
图12为0.5mm FTA卡的直接扩增检测结果(直接扩增试剂2)。
图13为1.2mm FTA卡的直接扩增检测结果(Identifiler plus试剂盒)。
图14为1.2mm FTA卡的直接扩增检测结果(直接扩增试剂2)。
图15为血液类型(生锈菜刀转移血迹)样本的直接扩增结果(直接扩增试剂2)。
图16为血液类型(生锈菜刀转移血迹)样本的直接扩增结果(Identifiler plus试剂盒)。
图17为血液类型(石灰墙面转移血迹)样本的直接扩增结果(直接扩增试剂2)。
图18为血液类型(石灰墙面转移血迹)样本的直接扩增结果(Identifiler plus试剂盒)。
图19为唾液类型(烟蒂1.0mm孔径)样本的直接扩增结果(直接扩增试剂2)。
图20为唾液类型(烟蒂1.0mm孔径)样本的直接扩增结果(Identifiler plus试剂盒)。
图21为精斑类型样本的直接扩增结果(直接扩增试剂2)。
图22为精斑类型样本的直接扩增结果(Identifiler plus试剂盒)。
图23为毛发(带毛囊)类型样本的直接扩增结果(直接扩增试剂2)。
图24为毛发(带毛囊)类型样本的直接扩增结果(Identifiler plus试剂盒)。
图25为肌肉组织的直接扩增结果(直接扩增试剂2)。
图26为肌肉组织的直接扩增结果(Identifiler plus试剂盒)。
图27为接触性样本(棉线手套虎口处纱线2mm)的直接扩增结果(直接扩增试剂2)。
图28为接触性样本(棉线手套虎口处纱线2mm)的直接扩增结果(Identifilerplus试剂盒)。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中的浓度如无特殊说明，均为体系终浓度。
下述实施例中，10mmol/L Tris-HCl缓冲液(pH8.0)为将1mol Tris-HCl缓冲液(pH8.0)稀释获得。1M Tris-HCl缓冲液(pH8.0)为美国LifeTechnologies公司的产品，产品货号为15568025。
AmpFLSTRTM IdentifilerTM plus PCR Amplification Kit为美国LifeTechnologies公司的产品，货号为A26364。牛血清白蛋白(BSA)为澳大利亚Bovogen公司的产品，产品编号为BSAS-NZ。N，N-二甲基-N-十二烷基甘氨酸甜菜碱为美国MERCK公司的产品，产品目录号为30326。Taq DNA聚合酶为热启动Taq DNA聚合酶，可为化学修饰或抗体修饰，本实施例中采用kapa公司的产品，产品目录号为kk5525。氯化钾、氯化镁和多聚蔗糖400均为MERCK公司的产品，产品目录号依次为60128-250G-F、M4880-100G和F8636-25G。二硫苏糖醇(DTT)为Amresco公司的产品，产品目录号为0281。
实施例1、DNA免提取直接扩增试剂(简称直接扩增试剂)的制备
本发明的发明人经过大量实验，制备了表1所示的4种直接扩增试剂。
表1
Figure BDA0002841387540000051
注：表中各浓度为在PCR体系中的终浓度。
实施例2、灵敏度测试
本实施例中，采用AmpFLSTRTM IdentifilerTM plus PCR Amplification Kit(简称Identifiler plus试剂盒)与实施例1制备的直接扩增试剂2进行灵敏度平行比较测试。
取1ng/μL 9947A阳性对照DNA(ORIGEN，货号FD200001)，用ddH2O稀释，得到浓度为0.5ng/μL的样本1、0.25ng/μL的样本2、0.125ng/μL的样本3、0.0625ng/μL的样本4和0.03125ng/μL的的样本5。
待测样本分别为样本1—样本5。
一、Identifiler plus试剂盒的灵敏度测试
1、制备扩增体系。扩增体系为25μl，由10μLIdentifilerTM plus Mastermix、5μLIdentifilerTM plusPrimerset、1μL待测样本和9μL ddH2O组成。
IdentifilerTM plus Mastermix和IdentifilerTM plusPrimerset均为Identifiler plus试剂盒中的组件。
2、取所述扩增体系，进行扩增，得到扩增产物。扩增参数为：95℃11min；94℃20s，59℃3min，28个循环；60℃10min，4℃永久保存。3、将所述扩增产物采用ABI3500型遗传分析仪进行毛细管电泳检测，经
Figure BDA0002841387540000063
IDX软件分析获得检测图谱。
样本1的检测结果见图1。
样本2的检测结果见图2。
样本3的检测结果见图3。
样本4的检测结果见图4。
样本5的检测结果见图5。
二、实施例1制备的直接扩增试剂2的灵敏度测试
1、制备扩增体系。扩增体系为25μl，由12.5μL 2倍浓度的直接扩增试剂2、5μLIdentifilerTM plus Primerset、1μL待测样本和6.5μL ddH2O组成。
2、取所述扩增体系，进行STR荧光复合扩增，得到扩增产物。扩增参数为：95℃5min；95℃20s，59℃1min，72℃30s，28个循环；60℃20min，4℃永久保存。
3、将所述扩增产物采用ABI3500型遗传分析仪进行毛细管电泳检测，经
Figure BDA0002841387540000064
IDX软件分析获得检测图谱。
样本1的检测结果见图6。
样本2的检测结果见图7。
样本3的检测结果见图8。
样本4的检测结果见图9。
样本5的检测结果见图10。
结果表明，Identifiler plus试剂盒的最小检测限为为0.0625ng 9947A阳性对照DNA，直接扩增试剂2的最小检测限为0.03125ng 9947A阳性对照DNA。
按照上述步骤，将直接扩增试剂2分别替换为直接扩增试剂1、直接扩增试剂3和直接扩增试剂4，其它步骤均不变。结果表明，直接扩增试剂1、直接扩增试剂3和直接扩增试剂4的最小检测限也为0.03125ng 9947A阳性对照DNA，与直接扩增试剂2完全一致。
实施例3、抗抑制能力测试
本实施例中，采用Identifiler plus试剂盒与实施例1制备的直接扩增试剂2进行抗抑制能力平行比较测试。为了最大化测试不同PCR体系抗抑制能力，反应体系降至10μL。
样本为FTA(Flinders Technology Associates)血卡。FTA卡是一种特制的滤纸，它由多种特殊的化学物质浸渍而成，是行业内公认的对PCR体系干扰比较强的一类载体。本实施例中FTA血卡为孔径大小为0.5mm的FTA血卡(简称0.5mm FTA卡)和孔径大小为1.2mm的FTA血卡(简称1.2mm FTA卡)。
一、IdentifilerTM plus试剂盒的抗抑制能力测试
1、制备扩增体系。扩增体系为10μl，由4μLIdentifilerTM plus Mastermix、2μLIdentifilerTM plusPrimerset、FTA血卡和4μL ddH2O组成。
2、取所述扩增体系，进行扩增，得到扩增产物。扩增参数为：95℃11min；94℃20s，59℃3min，28个循环；60℃10min，4℃永久保存。
3、将所述扩增产物采用ABI3500型遗传分析仪进行毛细管电泳检测，经
Figure BDA0002841387540000074
IDX软件分析获得检测图谱。
0.5mm FTA卡的检测结果见图11。
1.2mm FTA卡的检测结果见图13。
二、实施例1制备的直接扩增试剂2的抗抑制能力测试
1、制备扩增体系。扩增体系为10μl，由5μL 2倍浓度的直接扩增试剂2、2μLIdentifilerTM plus Primerset、FTA血卡和3μL ddH2O组成。
2、取所述扩增体系，进行STR荧光复合扩增，得到扩增产物。扩增参数为：95℃5min；95℃20s，59℃1min，72℃30s，28个循环；60℃20min，4℃永久保存。
3、将所述扩增产物采用ABI3500型遗传分析仪进行毛细管电泳检测，经
Figure BDA0002841387540000075
IDX软件分析获得检测图谱。
0.5mm FTA卡的检测结果见图12。
1.2mm FTA卡的检测结果见图14。
结果表明，在10μL反应体系的条件下，IdentifilerTM plus试剂盒在扩增两种孔径FTA卡时，PCR体系都均受到不同程度严重抑制(0.5mm FTA血卡主要出现大片段逐渐降低抑制现象；1.2mm FTA血卡则出现无法拮抗的PCR抑制，扩增完全失败)；直接扩增试剂2在同样的引物组条件下，获得了高质量的STR分型结果，并未表现出显著的PCR抑制现象。
按照上述步骤，将直接扩增试剂2分别替换为直接扩增试剂1、直接扩增试剂3和直接扩增试剂4，其它步骤均不变。结果表明，直接扩增试剂1、直接扩增试剂3和直接扩增试剂4的抗抑制能力与直接扩增试剂2无显著差异。
实施例4、直接扩增试剂在不同类型样本直接扩增中的应用
一、(生锈菜刀转移)血迹样本的直接扩增
用纱线擦拭并转移生锈菜刀表面血痕(由公安机关DNA实验室提供)，1-2mm带有转移血痕的纱线即为样本。
1、采用直接扩增试剂2进行直接扩增
(1)制备扩增体系。扩增体系为25μl，由12.5μL 2倍浓度的直接扩增试剂2、5μLIdentifilerTM plus Primerset、样本和7.5μL ddH2O组成。
(2)取所述扩增体系，进行STR荧光复合扩增，得到扩增产物。扩增参数为：95℃5min；95℃20s，59℃1min，72℃30s，28个循环；60℃20min，4℃永久保存。
(3)将所述扩增产物采用ABI3500型遗传分析仪进行毛细管电泳检测，经
Figure BDA0002841387540000076
IDX软件分析获得检测图谱。
检测结果见图15。
2、Identifiler plus试剂盒进行直接扩增
(1)制备扩增体系。扩增体系为25μl，由10μLIdentifilerTM plus Mastermix、5μLIdentifilerTM plusPrimerset、样本和10μL ddH2O组成。
2、取所述扩增体系，进行扩增，得到扩增产物。扩增参数为：95℃11min；94℃20s，59℃3min，28个循环；60℃10min，4℃永久保存。
3、将所述扩增产物采用ABI3500型遗传分析仪进行毛细管电泳检测，经
Figure BDA0002841387540000081
IDX软件分析获得检测图谱。
检测结果见图16。
结果表明，对于生锈菜刀转移血迹样本来说，直接扩增试剂2获得了完整的STR分型结果，且峰型尖锐、无位点丢失及大片段跑低现象出现；Identifiler plus试剂盒对样本直接扩增检测结果显示，体系受到了PCR抑制剂的影响，总体表现出大片段逐渐减低的现象，其中位点丢失现象严重，仅获得11个位点的STR分型信息。
二、(石灰墙面转移)血迹样本的直接扩增
用棉签转移墙体表面血痕(由公安机关DNA实验室提供)，采用医用眼科镊子撕取适量带有转移血痕的棉签即为样本。
1、采用直接扩增试剂2进行直接扩增
按照步骤一中1的方法，采用直接扩增试剂2检测上述样本。
检测结果见图17。
2、Identifiler plus试剂盒进行直接扩增
按照步骤一中2的方法，采用Identifiler plus试剂盒检测上述样本。
检测结果见图18。
混有石灰的转移血迹样本通常具有很强的PCR抑制作用。结果表明，对于石灰墙面转移血迹样本来说，Identifilerplus试剂盒的直接扩增结果仅获得5个STR位点信息；直接扩增试剂2主要表现出大片段逐渐降低以及PCR效率低下问题，但最终获得了完整的STR分型图谱，无位点丢失现象出现。
三、唾液样本的直接扩增
用孔径为1.0mm的打孔器取烟蒂(由公安机关DNA实验室提供)过滤嘴，即为样本。
1、采用直接扩增试剂2进行直接扩增
按照步骤一中1的方法，采用直接扩增试剂2检测上述样本。
检测结果见图19。
2、Identifiler plus试剂盒进行直接扩增
按照步骤一中2的方法，采用Identifiler plus试剂盒检测上述样本。
检测结果见图20。
结果表明，对于唾液类型烟蒂样本来说，对扩增体系表现出较弱抑制效果，直接扩增试剂2获得了完整的STR分型结果，且峰型尖锐、无位点丢失及大片段跑低现象出现，而Identifiler plus试剂盒的检测结果则表现为整体扩增效率低下，且FGA和D18S51位点丢失。
四、精斑样本的直接扩增
剪取1mm2精斑纱线(由公安机关DNA实验室提供，已确认为单一精斑样本)，即为样本。
1、采用直接扩增试剂2进行直接扩增
按照步骤一中1的方法，采用直接扩增试剂2检测上述样本。
检测结果见图21。
2、Identifiler plus试剂盒进行直接扩增
按照步骤一中2的方法，采用Identifiler plus试剂盒检测上述样本。
检测结果见图22。
结果表明，对于精斑样本来说，直接扩增试剂2获得了完整的STR分型结果，且峰型尖锐、无位点丢失及大片段跑低现象出现。而Identifiler plus试剂盒的检测结果为分型结果失败，其原因可能是精子细胞表面分布大量二硫键，常规扩增试剂中所含去污剂成分难以有效使精子细胞裂解，因此无法实现有效扩增而获得了阴性结果。
五、毛发(带毛囊)样本的直接扩增
剪取毛发(由公安机关DNA实验室提供)的毛囊部分，即为样本。
1、采用直接扩增试剂2进行直接扩增
按照步骤一中1的方法，采用直接扩增试剂2检测上述样本。
检测结果见图23。
2、Identifiler plus试剂盒进行直接扩增
按照步骤一中2的方法，采用Identifiler plus试剂盒检测上述样本。
检测结果见图24。
结果表明，对于毛发(带毛囊)样本来说，直接扩增试剂2获得了完整的STR分型结果，且峰型尖锐、无大片段跑低现象出现。而Identifiler plus试剂盒虽获得完整的STR分型结果，虽获得完整的STR分型结果，但在扩增效率及平衡性方面显示出明显不足，主要表现为整体RFU值低、大片段峰高值逐渐减低现象。
六、肌肉组织样本的直接扩增
取适量肌肉组织(由公安机关DNA实验室提供)，即为样本。
1、采用直接扩增试剂2进行直接扩增
按照步骤一中1的方法，采用直接扩增试剂2检测上述样本。
检测结果见图25。
2、Identifiler plus试剂盒进行直接扩增
按照步骤一中2的方法，采用Identifiler plus试剂盒检测上述样本。
检测结果见图26。
结果表明，对于肌肉组织样本来说，与毛发(带毛囊)样本相似，直接扩增试剂2获得了完整的STR分型结果，且峰型尖锐、无大片段跑低现象出现。而Identifiler plus试剂盒在获得完整的STR分型结果前提下，扩增效率及平衡性方面显示出明显不足，主要表现为整体RFU值低、大片段峰高值逐渐减低现象。
七、接触性样本的直接扩增
取棉线手套虎口处纱线2mm(由公安机关DNA实验室提供)，即为样本。
1、采用直接扩增试剂2进行直接扩增
按照步骤一中1的方法，采用直接扩增试剂2检测上述样本。
检测结果见图27。
2、Identifiler plus试剂盒进行直接扩增
按照步骤一中2的方法，采用Identifiler plus试剂盒检测上述样本。
检测结果见图28。
结果表明，对于接触性样本来说，直接扩增试剂2获得了完整的STR分型结果，且峰型尖锐、无位点丢失现象出现，完全满足个体识别和鉴定的需要；Identifiler plus试剂盒对样本直接扩增检测结果显示，体系受到了低样本量、PCR抑制剂的影响，STR位点丢失现象严重，7个STR位点信息丢失，仅获得9个位点的STR分型信息。
上述结果表明，采用Identifiler plus试剂盒进行直接扩增所获得的STR分型图谱均有不同程度的位点丢失，甚至扩增失败现象出现；可见，案件样本直接扩增，易出现PCR抑制，大片段丢失现象严重，表现为常见的PCR抑制现象；在灵敏度、扩增能力、抗抑制能力等方面均对直接扩增试剂具有较高要求。
采用本发明实施例1制备的直接扩增试剂2进行直接扩增所获得的STR分型图谱清晰完整、平衡性好、无非特异性人工产物出现、无条带丢失或明显的抑制现象出现；对各类案件样本均表现出出色的抗抑制能力和较高的检测灵敏度(在低至25μl的反应体系中，直接扩增试剂2仍能够针对包括脱落细胞在内的各类案件样本进行直接扩增，可以获得完整的、高质量STR分型图谱)。由此可见，本发明实施例1制备的直接扩增试剂2不仅检测成本低而且准确率较高。
按照上述步骤，将直接扩增试剂2分别替换为直接扩增试剂1、直接扩增试剂3和直接扩增试剂4，其它步骤均不变。结果表明，直接扩增试剂1、直接扩增试剂3和直接扩增试剂4的检测结果与直接扩增试剂2无显著差异。
综上所述，本发明实施例1制备的4个直接扩增试剂均可以对不同类型样本进行直接扩增，可用于各类案件样本法庭科学DNA分型检测。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

Claims (10)

1.一种DNA免提取直接扩增试剂，包括Tris-HCl缓冲液、MgCl2、KCl、dNTP、BSA、二硫苏糖醇、多羟基醇、两性表面活性剂、非离子表面活性剂、多聚糖和DNA聚合酶。
2.如权利要求1所述的DNA免提取直接扩增试剂，其特征在于：所述DNA免提取直接扩增试剂由Tris-HCl缓冲液、MgCl2、KCl、dNTP、BSA、二硫苏糖醇、多羟基醇、两性表面活性剂、非离子表面活性剂、多聚糖和DNA聚合酶组成。
3.如权利要求1或2所述的DNA免提取直接扩增试剂，其特征在于：采用所述DNA免提取直接扩增试剂进行直接扩增时，所述Tris-HCl缓冲液在直接扩增体系中的浓度为10-30mmol/L Tris-HCl缓冲液(pH8.0)；所述MgCl2在直接扩增体系中的浓度为1.5-2.5mmol/L；所述KCl在直接扩增体系中的浓度为20-70mmol/L；所述dNTP在直接扩增体系中的浓度为180-220μmol/L；所述BSA在直接扩增体系中的浓度为400-1200μg/ml；所述二硫苏糖醇在直接扩增体系中的浓度为1-2mmol/L；所述多羟基醇在直接扩增体系中的浓度为2-10％；所述两性表面活性剂在直接扩增体系中的浓度为1-2％；所述非离子型表面活性剂在直接扩增体系中的浓度为0.1-1.0％；所述多聚糖在直接扩增体系中的浓度为1-10％；所述DNA聚合酶在直接扩增体系中的浓度为0.05-0.2U/μL。
4.如权利要求1至3任一所述的DNA免提取直接扩增试剂，其特征在于：所述多羟基醇为丙三醇、乙二醇、丙二醇或己二醇。
5.如权利要求1至3任一所述的DNA免提取直接扩增试剂，其特征在于：所述两性表面活性剂为N，N-二甲基-N-十二烷基甘氨酸甜菜碱。
6.如权利要求1至3任一所述的DNA免提取直接扩增试剂，其特征在于：所述非离子型表面活性剂为Tween 20、TritonX-100、Tween 21、Tween 40、Tween60、Tween65、Tween80、Tween85、TritonX-100、NP40、Brij 30、Span 20、辛基苯基-聚乙烯二醇、聚氧乙烯10油醚或N-辛酰基-N-甲基葡糖胺。
7.如权利要求1至3任一所述的DNA免提取直接扩增试剂，其特征在于：所述多聚糖为多聚蔗糖。
8.如权利要求1至3任一所述的DNA免提取直接扩增试剂，其特征在于：所述DNA聚合酶为Taq DNA聚合酶。
9.权利要求1至8任一所述的DNA免提取直接扩增试剂的应用，为A1)-A4)中的至少一种：
A1)对样本进行DNA分型检测；
A2)对样本进行直接扩增；
A3)制备用于对样本进行DNA分型检测的试剂盒；
A4)制备用于对样本进行直接扩增的试剂盒。
10.一种对样本进行DNA分型检测的方法，包括如下步骤：向权利要求1至8任一所述的DNA免提取直接扩增试剂中加入样本，进行直接扩增，之后进行DNA分型检测。
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