CN113493782A - 热敏型udg酶储存液及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物试剂领域，具体而言，提供了一种热敏型UDG酶储存液及其应用。本发明提供了鱼明胶稳定热敏型UDG酶的新用途，添加有鱼明胶的储存液能够使热敏型UDG酶耐受反复冻融而不影响其活性，此外也不会对应用热敏型UDG酶参与的反应产生任何影响，极大地延长了热敏型UDG酶的有效期并且扩展了适用场景。
Description
技术领域
本发明涉及生物试剂领域，具体而言，涉及一种热敏型UDG酶储存液及其应用。
背景技术
热敏型尿嘧啶-DNA糖基化酶(UDG酶)是来源于嗜冷海洋细菌经大肠杆菌表达纯化的重组蛋白。该UDG酶能有效地水解单链或双链DNA上的尿嘧啶，产生的缺失尿嘧啶的核苷酸链在高温或高pH下，极易水解断裂。该酶对RNA无活性，主要用于PCR扩增产物的防污染。由于大肠杆菌来源的尿嘧啶-DNA糖基化酶较为耐热，经95℃10min处理仍会残留有少量的尿嘧啶-DNA糖基化酶活性，导致含有dU碱基的PCR产物的降解，进而干扰接下来的PCR反应。而来源于嗜冷海洋细菌的热敏型UDG酶在50℃5min即完全失活，在进行PCR扩增前，在PCR混合液中添加热敏型尿嘧啶-DNA糖基化酶，25℃10min即可消除PCR产物的残留污染，由于热敏型尿嘧啶-DNA糖基化酶在PCR循环的94℃变性一步便可被灭活，因此不会影响新的含dU的PCR产物。
由于热敏型UDG酶对热不稳定，在常温下储存时间长容易失活，所以目前市面上的产品均显示在-20℃下有效期仅为一年且避免反复冻融，说明热敏型UDG酶在储存过程中容易失活，且冻融稳定性比较差。2012年Felleret al.在review中提到一般的Cold-activeenzymes对温度比较敏感，只需要较低的温度即可发挥活性，因为其结构比较柔软和灵活，但是这类酶共有的特点就是蛋白结构稳定性差，这也揭示了大多数热敏感的酶比活很高，只需要升高一点温度即可获得大量的能量用于酶活的释放。2002年D’Amico,S et al.致力于研究热敏感酶的activity–flexibility–stability之间的关系，为了寻求这三种活性之间的平衡，大多数研究选择了对热敏感酶进行改造，使用点突变的方式来提高其稳定性并取得了一定的成效，理想状态是在保持热敏感酶的稳定性的前提下保证酶的activity–flexibility，因为酶的比活高且不需要很高的温度即能发挥很高的活性可以节约很多能源，从成本和能源上面考虑，获得稳定的高活性的热敏感酶是非常有意义的。然而，如果对酶进行点突变改造，无疑是增加了成本，且研发周期会很长，对酶进行改造，也有可能会影响其活性。
此外，热敏型UDG酶一般在-20℃下进行保存，所以其储存液的配方对热敏型UDG酶的稳定性影响也尤为重要，然而现有技术中并没有以其储存液作为改进方向的相关技术。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的第一目的在于提供鱼明胶在制备热敏型UDG酶储存液中的用途。
本发明的第二目的在于提供一种热敏型UDG酶储存液。
本发明的第三目的在于提供上述热敏型UDG酶储存液的应用。
本发明的第四目的在于提供一种含有UDG产品。
为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
鱼明胶在制备热敏型UDG酶储存液的用途；
可选地，鱼明胶在热敏型UDG酶储存液中的浓度为1-25mg/ml，优选为1-10mg/ml，进一步优选为2.5-10mg/ml。
一种热敏型UDG酶储存液，包括鱼明胶、缓冲试剂、还原剂、表面活性剂、甘油、任选的螯合剂和任选的金属盐离子。
进一步地，鱼明胶的浓度为1-25mg/ml，优选为1-10mg/ml，进一步优选为2.5-10mg/ml。
进一步地，热敏型UDG酶储存液的pH为7.4-8.5，优选为7.4-8.1；
可选地，缓冲试剂的浓度为10-100mmol/L，进一步优选为10-50mmol/L；
可选地，缓冲试剂包括Tris(三羟甲基氨基甲烷)、HEPES(N-2-羟乙基哌嗪-N'-2-乙磺酸)、TAPS(三羟甲基甲胺基丙磺酸)、Bicine(N,N-双(2-羟乙基)甘氨酸)、Tricine(N-三-(羟甲基)甲基氨基乙酸)、TES(N-三(羟甲基)甲基-2-氨基乙磺酸)、DIPSO(3-[N-N-双(2-羟乙基)氨基]-2-羟基丙磺酸)、TAPSO(N-3-(羟甲基)甲氨基-2-羟基丙烷磺酸)、HEPPSO(4-(2-羟乙基)哌嗪-1-2-羟基丙磺酸)、POPSO(哌嗪-1,4-二羟基丙磺酸)、EPPS(4-羟乙基哌嗪丙磺酸)或TEA(三乙醇胺)。
进一步地，还原剂包括DTT、TECP或巯基乙醇；
可选地，还原剂的浓度为0.5-5mmol/L，进一步优选为0.8-2mmol/L。
进一步地，表面活性剂为非离子表面活性剂，优选为TritonX-100、NP-40、吐温20或吐温80；
可选地，表面活性剂的浓度为0.01-1v/v％，优选为0.1-0.5v/v％。
进一步地，甘油的浓度为40-60v/v％，优选为50v/v％。
进一步地，螯合剂包括EDTA、NTA或DTPA；
可选地，螯合剂的浓度为0-0.5mmol/L，优选0.05-0.2mmol/L；
可选地，金属盐离子包括钠离子或钾离子；
可选地，金属盐离子的浓度为0-300mmol/L，优选0-150mmol/L。
上述热敏型UDG酶储存液在制备含有热敏型UDG酶产品中的应用。
一种含有热敏型UDG酶产品，包括上述热敏型UDG酶储存液。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
发明人意外发现在热敏型UDG酶储存液中添加鱼明胶后，在不影响热敏型UDG酶性能的同时，热敏型UDG酶的稳定性可以得到显著提高，该发现为含有热敏型UDG酶的产品的制备提供了更多的可能，不仅极大地降低了产品的成本，同时还能够缩短研发周期。本发明提供的热敏型UDG酶储存液包括鱼明胶、缓冲试剂、还原剂、表面活性剂、甘油、任选的螯合剂和任选的金属盐离子。该热敏型UDG酶储存液可以实现热敏型UDG酶的反复冻融而不影响其活性，此外也不会对应用热敏型UDG酶参与的反应产生任何影响，极大地延长了热敏型UDG酶的有效期并且扩展了适用场景。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例1中鱼明胶对PCR反应的影响结果图；
图2为本发明实施例1中BSA对PCR反应的影响结果图；
图3为本发明实施例1中海藻糖对PCR反应的影响结果图。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。
除非另有说明，本文中所用的专业与科学术语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法或材料也可应用于本发明中。
鱼明胶在制备热敏型UDG酶储存液中的用途。
热敏型UDG酶的保存目前没有有效地手段，一般在-20℃下保存，有效期仅为一年且不能反复冻融，对此，发明人以热敏型UDG酶储存液为改进方向，意外发现在热敏型UDG酶储存液中添加鱼明胶后，在不影响热敏型UDG酶性能的同时，热敏型UDG酶的稳定性可以得到显著提高，该发现为含有热敏型UDG酶的产品的制备提供了更多的可能，不仅极大地降低了产品的成本，同时还能够缩短研发周期。
在优选的实施方式中，鱼明胶在热敏型UDG酶储存液中的浓度为1-25mg/ml，鱼明胶的浓度典型但非限制性的为1mg/ml、2mg/ml、2.5mg/ml、3mg/ml、3.5mg/ml、4mg/ml、4.5mg/ml、5mg/ml、5.5mg/ml、6mg/ml、6.5mg/ml、7mg/ml、7.5mg/ml、8mg/ml、8.5mg/ml、9mg/ml、9.5mg/ml、10mg/ml、11mg/ml、12.5mg/ml、14mg/ml、15mg/ml、16mg/ml、17.5mg/ml、19mg/ml、20mg/ml、21mg/ml、22.5mg/ml、24mg/ml或25mg/ml，优选为1-10mg/ml，进一步优选为2.5-10mg/ml。
本发明保护一种热敏型UDG酶储存液，包括鱼明胶、缓冲试剂、还原剂、表面活性剂、甘油、任选的螯合剂和任选的金属盐离子。
本发明提供的热敏型UDG酶储存液，各组分之间相互配合影响，共同作用后可以实现热敏型UDG酶的反复冻融而不影响其活性，此外也不会对应用热敏型UDG酶参与的反应产生任何影响，极大地延长了热敏型UDG酶的有效期并且扩展了适用场景。
在优选的实施方式中，缓冲试剂用于调节和维持储存液的pH，使热敏型UDG酶处于适合的pH条件下。在本发明中，缓冲试剂使得热敏型UDG酶储存液的pH为7.4-8.5，优选为7.4-8.1。
缓冲试剂可以从下组中选择：Tris(三羟甲基氨基甲烷)、HEPES(N-2-羟乙基哌嗪-N'-2-乙磺酸)、TAPS(三羟甲基甲胺基丙磺酸)、Bicine(N,N-双(2-羟乙基)甘氨酸)、Tricine(N-三-(羟甲基)甲基氨基乙酸)、TES(N-三(羟甲基)甲基-2-氨基乙磺酸)、DIPSO(3-[N-N-双(2-羟乙基)氨基]-2-羟基丙磺酸)、TAPSO(N-3-(羟甲基)甲氨基-2-羟基丙烷磺酸)、HEPPSO(4-(2-羟乙基)哌嗪-1-2-羟基丙磺酸)、POPSO(哌嗪-1,4-二羟基丙磺酸)、EPPS(4-羟乙基哌嗪丙磺酸)或TEA(三乙醇胺)或者其他能够保持储存液pH在7.4-8.5之间的缓冲试剂。优选为Tris-HCl、Tris-醋酸、HEPES、TES或Bicine。
在优选的实施方式中，缓冲试剂的浓度为10-100mmol/L，浓度典型但非限制性的为10mmol/L、20mmol/L、30mmol/L、40mmol/L、50mmol/L、60mmol/L、70mmol/L、80mmol/L、90mmol/L或100mmol/L，进一步优选为10-50mmol/L。
在优选的实施方式中，还原剂具有一定的抗氧化作用，对稳定酶的活性起到一定作用，本发明中，还原剂可以为DTT(二硫苏糖醇)、TECP(三(2-羧乙基)膦)或巯基乙醇。还原剂的浓度可以为0.5-5mmol/L，典型但非限制性的为0.5mmol/L、0.6mmol/L、0.8mmol/L、1mmol/L、1.2mmol/L、1.4mmol/L、1.5mmol/L、1.6mmol/L、1.8mmol/L、2mmol/L、2.5mmol/L、3mmol/L、3.5mmol/L、4mmol/L、4.5mmol/L或5mmol/L，进一步优选为0.8-2mmol/L。
在优选的实施方式中，表面活性剂对热敏型UDG酶的活性起到稳定作用，表面活性剂优选非离子表面活性剂，进一步优选为TritonX-100、NP-40、吐温20或吐温80。此外，表面活性剂的浓度为0.01-1v/v％，典型但非限制性的为0.01v/v％、0.03v/v％、0.05v/v％、0.07v/v％、0.09v/v％、0.1v/v％、0.2v/v％、0.3v/v％、0.4v/v％、0.5v/v％、0.7v/v％、0.9v/v％或1v/v％，优选为0.1-0.5v/v％。可以理解是，本发明中“v/v％”是体积百分比。
在优选的实施方式中，甘油可降低冰点，减少冰晶的形成，对热敏型UDG酶起到保护作用，甘油的浓度为40-60v/v％，典型但非限制的为40v/v％、45v/v％、50v/v％、55v/v％或60v/v％，优选为50v/v％。
在优选的实施方式中，储存液可以含有或不含有螯合剂，储存液中含有螯合剂可以起到抗氧化作用，对热敏型UDG酶起到保护作用。具体地，螯合剂可以为EDTA(乙二胺四乙酸)、NTA(氨基三乙酸)或DTPA(二亚乙基三胺五乙酸)等。优选地，螯合剂的浓度为0-0.5mmol/L，典型但非限制的为0mmol/L、0.02mmol/L、0.04mmol/L、0.05mmol/L、0.06mmol/L、0.08mmol/L、0.1mmol/L、0.12mmol/L、0.14mmol/L、0.16mmol/L、0.18mmol/L、0.2mmol/L、0.25mmol/L、0.3mmol/L、0.35mmol/L、0.4mmol/L、0.45mmol/L或0.5mmol/L，优选0.05-0.2mmol/L。
在优选的实施方式中，储存液可以含有或不含有金属盐离子，金属盐离子包括钠离子或钾离子，来源可以为钠盐或钾盐，例如氯化钠、氯化钾、醋酸钾、硫酸钾等等。此外，金属盐离子的浓度为0-300mmol/L，典型但非限制的为0mmol/L、10mmol/L、20mmol/L、30mmol/L、40mmol/L、50mmol/L、60mmol/L、70mmol/L、80mmol/L、90mmol/L、100mmol/L、120mmol/L、130mmol/L、150mmol/L、200mmol/L、250mmol/L或300mmol/L，优选0-150mmol/L。实验研究发现金属盐离子对热敏型UDG酶的活性影响非常大，在合适的范围内可以保证热敏型UDG酶的稳定性和活性。
本发明保护提供的热敏型UDG酶储存液在制备含有热敏型UDG酶产品中的应用。
本发明还保护一种含有热敏型UDG酶产品，包括本发明提供的热敏型UDG酶储存液。该产品可以为热敏型UDG酶，也可以为含有热敏型UDG酶的试剂盒，本发明提供的储存液主要用于热敏型UDG酶的保存。
下面通过具体的实施例进一步说明本发明，但是，应当理解为，这些实施例仅仅是用于更详细地说明之用，而不应理解为用于以任何形式限制本发明。
如下实施例中“mM”是指“mmol/L”。
实施例1
配置基础储存buffer：
基础储存buffer1:20mM Tris-HCl、150mM NaCl、0.1mM EDTA、1mMDTT、0.1％(V/V)Triton X-100、50％(V/V)甘油(储存液pH7.5@25℃)。
基础储存buffer2:20mM Tris-HCl、0.1mM EDTA、1mM DTT、0.1％(V/V)Triton X-100、50％(V/V)甘油(储存液pH7.5@25℃)。
基础储存buffer3:50mM Tris-醋酸、0.8mM TECP、0.5％(V/V)NP-40、50％(V/V)甘油(储存液pH7.8@25℃)。
基础储存buffer4:10mM HEPES、0.05mM NTA、2mM巯基乙醇、0.3％(V/V)吐温20、60％(V/V)甘油(储存液pH7.4@25℃)。
基础储存buffer5:70mM TES、0.2mM DTPA、0.5mM TECP、0.01％(V/V)吐温80、40％(V/V)甘油(储存液pH8.0@25℃)。
基础储存buffer6:100mM Bicine、0.5mM EDTA、5mM DTT、1％(V/V)NP-40、50％(V/V)甘油(储存液pH8.5@25℃)。
制备不同含量鱼明胶的储存液：
在基础储存buffer1的基础上，分别添加鱼明胶至终浓度为：0mg/ml、1mg/ml、2.5mg/ml、5mg/ml、7.5mg/ml、10mg/ml，由此得到的储存液分别命名为储存液A1\A2\A3\A4\A5\A6。
制备不同含量BSA的储存液：
在基础储存buffer1的基础上，分别添加BSA至终浓度为：0、0.1mg/ml、0.25mg/ml、0.5mg/ml、0.75mg/ml、1mg/ml，由此得到的储存液分别命名为储存液B1\B2\B3\B4\B5\B6。
制备不同含量海藻糖的储存液：
在基础储存buffer1的基础上，分别添加海藻糖至终浓度为：0mg/ml、10mg/ml、25mg/ml、50mg/ml、75mg/ml、100mg/ml，由此得到的储存液分别命名为储存液C1\C2\C3\C4\C5\C6。
测试各个储存液是否影响PCR反应：
测试鱼明胶对PCR反应的影响：
对高浓度模板(2个重复)和低浓度模板(2个重复)进行扩增，将高浓度的热敏型UDG(500U/μl)酶分别使用A1\A2\A3\A4\A5\A6储存液进行稀释，稀释至活性单位为1U/μl后加入到TAQ防污染体系中进行反应，反应体系如下表1所示，反应条件为：50℃，2min；95℃，2min 30s；(94℃，15s，55℃，40s)*45Cycle(FAM)。结果如图1所示，结果表明无论是扩增高浓度模板还是低浓度模板，A1\A2\A3\A4\A5\A6组均对PCR反应无影响。
表1
| 体系组分名称 | 加入量 |
| 5×Reaction buffer | 10μl |
| dNTP mix(25mM each) | 0.4μl |
| Forward Primer(10μM) | 0.5μl |
| Reverse Primer(10μM) | 0.5μl |
| TAQ酶(5U/μl) | 0.5μl |
| 热敏型UDG酶(1U/μl) | 1μl |
| Template | 5μl |
| water | Up to 50μl |
| Total | 50μl |
测试BSA对PCR反应的影响：
对高浓度模板(2个重复)和低浓度模板(2个重复)进行扩增，将高浓度的热敏型UDG(500U/μl)酶分别使用B1\B2\B3\B4\B5\B6储存液进行稀释，稀释至活性单位为1U/μl后加入到TAQ防污染体系中进行反应，反应条件参上。结果如图2所示，结果表明无论是扩增高浓度模板还是低浓度模板，B1\B2\B3\B4\B5\B6组均对PCR反应无影响。
测试海藻糖对PCR反应的影响：
对高浓度模板(2个重复)和低浓度模板(2个重复)进行扩增，将高浓度的热敏型UDG(500U/μl)酶分别使用C1\C2\C3\C4\C5\C6储存液进行稀释，稀释至活性单位为1U/μl后加入到TAQ防污染体系中进行反应，反应条件参上。结果如图3所示，可以看出随着储存液中海藻糖浓度的提高，高浓度模板的CT出现逐渐靠后的趋势，而低浓度模板也出现了个别没检出的现象，可见海藻糖对PCR反应有抑制。
实施例2对含鱼明胶和BSA的储存液进行4℃稳定性考核
对含鱼明胶的储存液进行4℃考核：将分别使用A1\A2\A3\A4\A5\A6储存液稀释的热敏型UDG酶(0.25、0.5、0.75、1U/μl)加入到UDG酶活性测试的体系当中进行反应，测试其切割含U碱基的效率，UDG酶活性越高，其表现出来的CT值越靠后(说明底物模板能被有效切割)，相反，UDG酶活性越低，其表现出来的CT值越靠前(说明底物模板不能被有效切割)，结果如下表2，结果显示在4℃分别放置0天、7天、15天、30天后，A3/A4/A5/A6组稳定性几乎无明显下降，而A1/A2组的稳定性在30天后出现明显下降(备注：只显示4℃放置30天稳定性的结果)。
表2
对含BSA的储存液进行4℃考核：将分别使用B1\B2\B3\B4\B5\B6储存液稀释的热敏型UDG酶(0.25、0.5、0.75、1U/μl)加入到UDG酶活性测试的体系当中进行反应，测试其切割含U碱基的效率，UDG酶活性越高，其表现出来的CT值越靠后(说明底物模板能被有效切割)，相反，UDG酶活性越低，其表现出来的CT值越靠前(说明底物模板不能被有效切割)，结果如下表3所示，结果显示在4℃分别放置0天、7天、15天、30天后，B2/B3/B4/B5/B6组稳定性几乎无明显下降，而B1组的稳定性在30天后出现明显下降，说明添加BSA后能提高热敏型UDG酶的稳定性(备注：只显示4℃放置30天稳定性的结果)。
表3
实施例3对含鱼明胶和BSA组的储存液进行冻融稳定性考核
对含鱼明胶的储存液进行冻融考核：将分别使用A1\A2\A3\A4\A5\A6储存液稀释的热敏型UDG酶(0.25、0.5、0.75、1U/μl)加入到UDG酶活性测试的体系当中进行反应，测试其切割含U碱基的效率，UDG酶活性越高，其表现出来的CT值越靠后(说明底物模板能被有效切割)，相反，UDG酶活性越低，其表现出来的CT值越靠前(说明底物模板不能被有效切割)，结果显示分别进行反复冻融0次、5次、10次、15次、20次以后，A3/A4/A5/A6组稳定性几乎无明显下降。
对含BSA的储存液进行冻融考核：将分别使用B1\B2\B3\B4\B5\B6储存液稀释的热敏型UDG酶(0.25、0.5、0.75、1U/μl)加入到UDG酶活性测试的体系当中进行反应，测试其切割含U碱基的效率，UDG酶活性越高，其表现出来的CT值越靠后(说明底物模板能被有效切割)，相反，UDG酶活性越低，其表现出来的CT值越靠前(说明底物模板不能被有效切割)，结果显示分别进行反复冻融0次、5次、10次、15次、20次、25次以后，B1/B2/B3/B4/B5/B6组的反复冻融稳定性均出现下降。
部分结果如下表4-8(备注：只展示不添加鱼明胶/BSA的储存液(A1/B1)，添加0.5％鱼明胶(A4)，1％鱼明胶(A6)、添加0.5mg/ml BSA(B4)，1mg/mlBSA(B6)):
表4不添加鱼明胶/BSA的储存液(例如A1/B1组)
可见对照组A1/B1冻融20次就出现活性明显下降，CT值靠前2个CT左右。
表5添加0.5％鱼明胶(A4组)
添加0.5％(5mg/ml)鱼明胶的储存液A4，反复冻融20次，活性无明显下降，反复冻融25次活性略有降低。
表6添加1％鱼明胶(A6组)
添加1％(10mg/ml)鱼明胶的储存液A4，反复冻融20次，活性无明显下降，反复冻融25次活性略有降低。
表7添加0.5mg/ml BSA(B4组)
添加0.5mg/mlBSA的储存液B4，反复冻融20次，活性开始下降，反复冻融25次，活性下降2-3个CT。
表8添加1mg/ml BSA(B6组)
添加1mg/mlBSA的储存液B4，反复冻融20次，活性开始下降，反复冻融25次，活性下降2-3个CT。
实施例4在已添加鱼明胶的基础上对盐离子浓度进行优化
1、在基础储存buffer2的基础上，添加0.5％鱼明胶，配置储存液中含有NaCl的梯度为：0、50mM、100mM、150mM、200mM、300mM，储存液分别命名为D1\D2\D3\D4\D5\D6。
2、将高浓度的热敏型UDG(500U/μl)酶分别使用D1\D2\D3\D4\D5\D6储存液进行稀释，稀释至活性单位为0.25、0.5、0.75、1U/μl后加入到UDG酶活性测试的体系当中进行反应，测试其切割含U碱基的效率，UDG酶活性越高，其表现出来的CT值越靠后(说明底物模板能被有效切割)，相反，UDG酶活性越低，其表现出来的CT值越靠前(说明底物模板不能被有效切割)，使用反复冻融来检盐离子对热敏型UDG酶的稳定性，分别进行反复冻融0次、20次、25次、30次以后，部分结果如下表9-10所示，结果显示随着盐离子浓度越高，热敏型UDG酶的活性出现下降，0mM和50mMNaCl条件下，活性最佳，而盐离子浓度达到100mM NaCl以上时，UDG酶的活性开始下降(备注：只显示0mM NaCl和100mM NaCl的结果)。
表9
表10
实施例5用其他基础储存buffer配置的储存液，测试热敏型UDG的稳定性
分别在基础储存液buffer2-6中添加终浓度0.5％的鱼明胶，获得的储存液分别命名为E1/E2/E3/E4/E5，同时与未添加测试鱼明胶的基础储存液buffer2-6对比，主要对比4℃放置30天的稳定性和反复冻融25次的稳定性。将高浓度的热敏型UDG(500U/μl)酶分别使用不同组别的储存液进行稀释，稀释至活性单位为1U/μl后加入到UDG酶活性测试的体系当中进行反应，具体的实验数据如下表11-12所示：
表11热敏型UDG酶4℃放置30天稳定性
表12热敏型UDG酶反复冻融25次稳定性
尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，在不背离本发明的精神和范围的情况下可以作出许多其它的更改和修改。因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有这些变化和修改。
Claims (10)
1.鱼明胶在制备热敏型UDG酶储存液中的用途；
可选地，鱼明胶在热敏型UDG酶储存液中的浓度为1-25mg/ml，优选为1-10mg/ml，进一步优选为2.5-10mg/ml。
2.一种热敏型UDG酶储存液，其特征在于，包括鱼明胶、缓冲试剂、还原剂、表面活性剂、甘油、任选的螯合剂和任选的金属盐离子。
3.根据权利要求2所述的热敏型UDG酶储存液，其特征在于，鱼明胶的浓度为1-25mg/ml，优选为1-10mg/ml，进一步优选为2.5-10mg/ml。
4.根据权利要求2所述的热敏型UDG酶储存液，其特征在于，热敏型UDG酶储存液的pH为7.4-8.5，优选为7.4-8.1；
可选地，缓冲试剂的浓度为10-100mmol/L，进一步优选为10-50mmol/L；
可选地，缓冲试剂包括Tris、HEPES、TAPS、Bicine、Tricine、TES、DIPSO、TAPSO、HEPPSO、POPSO、EPPS或TEA。
5.根据权利要求2所述的热敏型UDG酶储存液，其特征在于，还原剂包括DTT、TECP或巯基乙醇；
可选地，还原剂的浓度为0.5-5mmol/L，进一步优选为0.8-2mmol/L。
6.根据权利要求2所述的热敏型UDG酶储存液，其特征在于，表面活性剂为非离子表面活性剂，优选为Triton X-100、NP-40、吐温20或吐温80；
可选地，表面活性剂的浓度为0.01-1v/v％，优选为0.1-0.5v/v％。
7.根据权利要求2所述的热敏型UDG酶储存液，其特征在于，甘油的浓度为40-60v/v％，优选为50v/v％。
8.根据权利要求2-7任一项所述的热敏型UDG酶储存液，其特征在于，螯合剂包括EDTA、NTA或DTPA；
可选地，螯合剂的浓度为0-0.5mmol/L，优选0.05-0.2mmol/L；
可选地，金属盐离子包括钠离子或钾离子；
可选地，金属盐离子的浓度为0-300mmol/L，优选0-150mmol/L。
9.权利要求2-8任一项所述的热敏型UDG酶储存液在制备含有热敏型UDG酶产品中的应用。
10.一种含有热敏型UDG酶产品，其特征在于，包括权利要求2-8任一项所述的热敏型UDG酶储存液。
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|---|---|
| CN113493782B (zh) | 2023-11-28 |
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