ES2386023T3

ES2386023T3 - Método mejorado para la prevención de la contaminación cruzada en tecnologías de amplificación de ácidos nucleicos

Info

Publication number: ES2386023T3
Application number: ES09008229T
Authority: ES
Inventors: Roy Bohenzky; Amar Gupta; Janine Montiel; Stephen Gordon Will
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG; Roche Diagnostics GmbH
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG; Roche Diagnostics GmbH
Priority date: 2008-06-26
Filing date: 2009-06-24
Publication date: 2012-08-07
Anticipated expiration: 2029-06-24
Also published as: CA2670300A1; CA2670300C; US8669061B2; US20100093041A1; EP2138590A1; CN101613730A; EP2138590B1; HK1138330A1; JP5596308B2; CN101613730B; JP2010004884A

Abstract

Método para disminuir la contaminación cruzada durante la amplificación mediante la reacción en cadenade la polimerasa (PCR) de un ácido nucleico, que comprende las etapas de:a. proporcionar una muestra de solución que contiene dicho ácido nucleico;b. amplificar dicho ácido nucleico en presencia de un enzima que posee actividad ADN glicosilasapara generar ADN con al menos un sitio abásico;c. proporcionar al menos un reactivo que facilite la degradación del ADN abásico, siendo dichoreactivo una poliamina;d. incubar dicha solución muestra en condiciones adecuadas para provocar la degradación de dichoADN con al menos un sitio abásico.

Description

Metodo mejorado para la prevencion de la contaminacion cruzada en tecnologias de amplificacion de acidos nucleicos SECTOR TECNICO DE LA INVENCION La presente invencion se refiere de forma general a metodos de amplificacion de acidos nucleicos y de forma mas especifica, al control de la contaminacion cruzada durante la amplificacion de acidos nucleicos. ANTECEDENTES DE LA INVENCION La reaccion en cadena de la polimerasa (PCR) permite la amplificacion especifica de una cantidad tan pequefa como una (nica copia de una secuencia de acido nucleico diana. La alta sensibilidad y especificidad de la PCR han demostrado ser muy valiosas en el sector del diagnostico, del analisis forense y en otras aplicaciones en las que debe detectarse una pequefa cantidad de un ac ido nucleico diana. Desafortunadamente, la misma elevada sensibilidad de los ensayos de PCR los hace vulnerables a la contaminacion y a resultados positivos falsos. En el sector forense y en el cribado de enfermedades (como por ejemplo la determinacion de VIH), los resultados positivos falsos pueden tener consecuencias devastadoras. El origen mas frecuente de resultados positivos falsos es la denominada "contaminacion cruzada", en la que un producto de PCR (amplicon) de un ensayo anterior contamina los ensayos de PCR siguientes. El contaminante puede ser transmitido por un tecnico, un instrumento o incluso por aerosoles. En una muestra "negativa", en la que el acido nucleico diana esta ausente, el contaminante genera un resultado positivo falso. En una muestra "positiva", en la que el acido nucleico diana esta presente, el contaminante es amplificado conjuntamente con la diana verdadera. Dicha amplificacion conjunta puede distorsionar el resultado de un ensayo cuantitativo, en el que debe determinarse la cantidad exacta de la diana verdadera. Una forma popular y efectiva de evitar la contaminacion cruzada supone la utilizacion de uracilo-ADN glicosilasas, especificamente UNG (EC 3.2.2.3). Estos enzimas reconocen los uracilos presentes en el ADN de cadena (nica o doble y escinden el enlace N-glicosidico entre la base uracilo y la desoxirribosa, dejando un sitio sin base (abasico). Ver, por ejemplo, la Patente n° 6.713.294. Ademas, las bases uracilo se escinden especificamente por uracilo-ADN glicosilasas generando sitios apirimidinicos susceptibles de la piperidina en la generacion de fragmentos de ADN escindidos (ver, por ejemplo, WO 02/090536 y WO 97/12061). Las uracilo-ADN glicosilasas, abreviadas como "UDG"

o "UNG" incluyen la UNG1 mitocondrial, la UNG2 nuclear, la SMUG1 (uracilo-ADN glicosilasa selectiva de cadena (nica), TDG (desajuste de timina ADN glicosilasa), MBD4 (uracilo-ADN glicosilasa con un dominio de union de metilo) y otros enzimas eucariotas y procariotas (ver Krokan H.E. y otros "Uracil in DNA - occurrence, consequences and repair" ("Uracilo en el ADN - presencia, consecuencias y reparacion"), Oncogene (2002) 21:8935-9232). Las uracilo-ADN glicosilasas son enzimas de reparacion del ADN que evitan, entre otras cosas, las mutaciones de transicion de G a A provocadas por la desaminacion de la citosina en uracilo. Si la citosina (C) es desaminada en uracilo (U) y el ADN se somete a replicacion, se incorpora una A opuesta al U, mientras que previamente habia una G opuesta a la C. Si la base uracilo es eliminada por la glicosilasa antes de la replicacion, el sitio abasico es reparado mediante una via de r eparacion del ADN con parche corto o l argo, que incluye las actividades endonucleasa y ADN polimerasa. Ademas de la reparacion de los dafos producidos en el ADN, la actividad ADN glicosilasa juega un papel en las mutaciones somaticas, incluyendo el cambio de clase de inmunoglobulinas y la hipermutacion somatica durante la maduracion de la afinidad de los anticuerpos. Ver Bransteitter R. y otros "First AID (Activation-induced cytidine deaminase) is needed to produce high affinity isotype-switched antibodies" ("En primer lugar se necesita la AID ("citidin desaminasa inducida por activacion) para producir anticuerpos de alta afinidad con cambio de isotipo"), J. Bio. Chem. (2007) 281:16833-16836. La preparacion de uracilo-N-AND-glicosilasa (UNG) optimizada para el control de la contaminacion cruzada en las reacciones de amplificacion se ha dado a conocer, por ejemplo, en la Patente U.S. n° 6.187.575. Tambien se ha descrito la utilizacion de UNG para evitar la contaminacion cruzada, ver Longo y otros "Use of uracil DNA glycosylase to control carry-over contamination in polymerase chain reaction" ("Utilizacion de la uracilo ADN glicosilasa para controlar la contaminacion cruzada en l a reaccion en cadena de l a polimerasa") (1990) Gene, 93:125-128. El metodo del estado de la tecnica para controlar o disminuir el riesgo de contaminacion cruzada utilizando la UNG se describe en las patentes U.S. n° 6.287.823, 6.518.026 y la publicacion U.S. n° 2003/0077637, y en combinacion con la produccion de moleculas de acido nucleico sintetizadas in Vitro descrita en EP 1 041 159 y EP 1 038 974. En general, el metodo incluye dos etapas. En primer lugar, los ensayos de PCR deben incluir dUTP, de manera que los amplicones, que son potenciales contaminantes en la contaminacion cruzada, contienen uracilo. El metodo supone sustituir por dUTP algunos o todos los dTTP de la reaccion de amplificacion. Alternativamente (o adicionalmente), pueden incorporarse uno o mas uracilos en los cebadores de amplificacion. Debe tenerse en cuenta, sin embargo, que s i un uracilo del cebador esta demasiado cerca del extremo 5', el metodo es menos eficiente para evitar su amplificacion subsiguiente. La utilizacion de dUTP no interfiere con los ensayos de PCR. Tras la generacion de un amplicon que contiene uracilo, este puede detectarse y analizarse mediante metodos estandar a pesar de la presencia de uracilo en lugar de timina.

A continuacion, se afade uracilo-N-ADN glicosilasa a la PCR subsiguiente. Convenientemente, UNG es activo en una mezcla de reaccion estandar que contiene todos los componentes de la PCR. Esto permite la adicion de UNG a reacciones de PCR ya montadas o incluso en la mezcla maestra de PCR. Previamente al inicio del ciclado termico, la mezcla de reaccion se incuba a una temperatura optima para la actividad UNG en el contexto de la mezcla maestra de PCR (aproximadamente 50°C) o dentro de un intervalo de temperaturas en el que la UNG es activa. Si existen contaminantes que contienen uracilo de una reaccion anterior, la UNG escindira el uracilo, dejando un sitio abasico. Se sabe que el ADN abasico es labil a temperaturas elevadas bajo condiciones de pH elevado. Cuando se inicia el ciclado termico, dicho ADN es degradado. La temperatura elevada tambien inhibe el enzima UNG, permitiendo la generacion de nuevos amplicones de ADN que contienen uracilo.

Tras el tratamiento con la UNG, el ADN abasico deber ser escindido eficientemente en los sitios abasicos. Si no se escinde, el ADN abasico act(a como molde para la polimerasa en la amplificacion subsiguiente. Por ejemplo, se sabe que la Taq ADN polimerasa omite los sitios abasicos incorporando una adenosina en el sitio opuesto a la base ausente. Una sola omision por parte de la polimerasa genera un moldeperfecto para la amplificacionsubsiguiente (ver Sikorsky, J.A. y otros, "DNA damage reduces Taq polymerase fidelityand PCR amplification efficiency" ("Los desperfectos en el ADN reducenla fidelidad y eficiencia en la amplificacion de la PCR de la polimerasa Taq"), Biochem. Biophys. Res. Commun. (2007) 355:431-437 o Kobayashi, A. y otros "Novel PCR-mediated mutagenesis employing DNA containing a natural abasic site as a template and translesional Taq DNA polymerase" ("Mutagenesis mediante PCR novedosa utilizando como molde ADN que contiene sitios naturales abasicos y Taq ADN polimerasa trans-lesional"), J. Biotech. (2005) 116:227-232). Por lo tanto, la capacidad de escindir eficientemente el ADN en los sitios abasicos es esencial para el exito global del metodo basado en UNG para evitar la contaminacion cruzada.

RESUMEN DE LA INVENCION

La pr esente i nvencion incluye un m etodo de co ntrol m ejorado de l a co ntaminacion cr uzada ut ilizando A DN glicosilasa. Los inventores han determinado que el factor limitante en la eliminacion exitosa del contaminante de la contaminacion cruzada es la degradacion eficiente del ADN abasico. La opinion aceptada es que la etapa limitante es la digestion enzimatica para generar ADN abasico. Se consideraba que la etapa subsiguiente de degradacion no enzimatica del ADN abasico era sencilla, eficiente y sin necesidad de mejoras. Los esfuerzos previos para mejorar los metodos de co ntrol de l a c ontaminacion s e h an c entrado e n l a adi cion d e mas enzima glicosilasa para incrementar los tiempos de incubacion. Los inventores han descubierto que al contrario de la opinion aceptada, la etapa e nzimatica es e xtremadamente ef iciente. A l m ismo t iempo, la etapa d e degradacion no e nzimatica e s ineficiente y, por lo tanto, el origen probable de la persistencia de contaminacion. Si un contaminante se escapa de la degradacion durante los ciclos iniciales de la PCR, este es copiado por la polimerasa y ya no puede ser eliminado.

Los inventores han descubierto que el control de la contaminacion puede mejorarse de forma dramatica afadiendo agentes que degradan o facilitan la degradacion del ADN abasico en la muestra. De dichos agentes los mas (tiles son aquellos compatibles con la amplificacion subsiguiente como una poliamina. Por consiguiente, la muestra se pone en contacto con poliaminas. En algunas realizaciones, la poliamina es espermidina, espermina o una amina intercaladora. A temperaturas elevadas y pH alto, las poliaminas mejoran de forma significativa la degradacion del ADN abasico sin inhibir la PCR. Ademas, la muestra se pone en contacto con un enzima, que cataliza la escision del esqueleto del ADN abasico. Se dan a conocer las composiciones y metodos que utilizan estos agentes y similares.

DESCRIPCION DE LOS DIBUJOS

Las Figuras 1A y B muestran los cromatogramas de HPLC de los productos de degradacion de un oligonucleotido que tiene sitios abasicos, en la ausencia o presencia de concentraciones crecientes de espermina. La Figura 1A muestra la degradacion a 50°C. La Figura 1B muestra la degradacion a 50°C seguida de un picotermico de 2 minutos a 95°C.

Las Figuras 2A y B muestran los resultados de la amplificacion de diversas cantidades de dianas de ADN y ARN en ausencia o presencia de espermina. La Figura 2A muestra la amplificacion de diversas cantidades de copias de entrada de ADN de VHC con o sin 100 !M de espermina. La Figura 2B muestra la amplificacion de diversas cantidades de copias de entrada de ARN de VHC en presencia de 50 !M de espermina.

La Figura 3 muestra los resultados de la amplificacion de una secuencia diana utilizando solamente dUTP o una combinacion de dUTP y dTTP.

La Figura 4 muestra los resultados de la amplificacion tras pretratamiento con cantidades crecientes de UNG.

La F igura 5 muestra l os resultados de la am plificacion de se cuencias que co ntienen dU y dU/dT co n o si n pretratamiento con UNG.

La Figura 6 muestra los resultados de la amplificacion tras pretratamiento con UNG en presencia de espermina.

La Figura 7 muestra los resultados de la amplificacion tras pretratamiento con UNG a varias temperaturas.

DEFINICIONES

Para facilitar la comprension de la presente invencion, pueden ser (tiles las siguientes definiciones.

Tal como se utiliza en la presente invencion, el termino "poliamina" significa un compuesto organico que posee mas de un grupo amino o una sal d e dicho compuesto. L as poliaminas i ncluyen, si n ca racter limitante, d iaminas, triaminas, tetraminas y especificamente, espermidina, espermina, putrescina, guanidina y dietilen triamina.

Tal como se utiliza en la presente invencion, el termino "amplicon" significa una poblacion de moleculas de ADN que ha sido producida mediante la amplificacion de un molde mediante, por ejemplo, PCR.

Tal como se utiliza en la presente invencion, el termino "secuencia diana" significa una secuencia de acido nucleico de especial interes, posiblemente presente en una muestra.

Tal como se utiliza en la presente invencion, el termino "ADN abasico" o "ADN con un sitio abasico" se refiere a una moleculas de ADN, ya sea de cadena (nica o doble, que contiene al menos un nucleotido abasico, en ocasiones denominado "sitio abasico". Un "nucleotido abasico" es un nucleotido que carece de base en la posicion 1' de la desoxirribosa.

Tal como se utiliza en la presente invencion, el termino "endonucleasa AP" o "liasa AP" significa un enzima capaz de romper el esqueleto fosfodiester de un acido nucleico. El termino incluye enzimas capaces de romper el esqueleto tanto en direccion 5' como 3' del sitio abasico.

DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION

La presente invencion se refiere a un metodo mejorado para controlar o disminuir la contaminacion cruzada de las reacciones de amplificacion de acido nucleico utilizando un enzima que posee actividad ADN glicosilasa y un reactivo que facilita la degradacion del ADN abasico como una poliamina. A modo de ejemplo, la presente invencion utiliza ADN glicosilasa o uracilo ADN glicosilasa. De forma general, el metodo se inicia con la generacion de amplicones que contienen una base no habitual. A modo de ejemplo, la presente invencion utiliza uracilo. Ello puede conseguirse realizando una amplificacion de acidos nucleicos en presencia de dUTP, incorporando desoxiuridina en los cebadores de amplificacion o desaminando las citosinas presentes en el ADN. Despues de que la primera reaccion de amplificacion genere amplicones con uracilo, cualquier reaccion de amplificacion subsiguiente se trata previamentecon un enzima que posee actividad uracilo-ADN glicosilasa, por ejemplo, el enzima UNG. Si se halla presente un amplicon contaminante de una amplificacion anterior, UNG escindira el uracilo de dicho amplicon y generara un sitio abasico.

Aunque el uracilo y UNG son los mas habitualmente utilizados para controlar la contaminacion, debe tenerse en cuenta que existen sistemas enzima/substrato alternativos que act(an del mismo modo. Es conocido en la tecnica que enzimas de reparacion del ADN especifico reconocen y escinden del ADN diversas bases no naturales, dando lugar a un sitio abasico. Puede utilizarse una combinacion de dicha base no natural y enzima especifico para controlar la contaminacion cruzada siempre y cuando la polimerasa sea capaz de incorporar la base no natural dentro del amplicon potencialmente contaminante o, alternativamente, que el amplicon potencialmente contaminante pueda ser tratado de modo que se de lugar a la presencia de la base no natural. Como ejemplos de dichos pares enzima/substrato se incluyen MutY o MutM y 8-oxoguanosina, hOGG1 y 8-oxoguanosina, MBD4 humana y uridina, Endo VIII de E. coli yglicol timina u otras pirimidinas oxidadas yuna serie de otros pares similares descritos, por ejemplo, en Hitomi y otros (2007) DNA Repair 6:410-428.

Seg(n los metodos tradicionales, tras la incubacion con UNG, la etapa siguiente es someter la mezcla de reaccion a ciclos termicos. Las reacciones de amplificacion, tales como la reaccion en cadena de la polimerasa (PCR) o la reaccion en cadena de l a l igasa (LCR), incluyen un calentamiento inicial o " etapa de d esnaturalizacion". S e consideraba que esta etapa de calentamiento inicial era suficiente para conseguir la desnaturalizacion del ADN abasico, dado que se sabe que este es labil a temperaturas elevadas bajo condiciones de pH alto. Si el metodo no conseguia la esterilizacion, los profesionales sospecharian el fracaso de la etapa enzimatica con UNG. Es conocido, de modo general, que los enzimas son sensibles a las condiciones de reaccion. Con una minima desviacion de las condiciones optimas, u n e nzima p uede perder gran p arte o t oda s u act ividad. P or l o t anto l os enzi mas son habitualmente l os primeros so spechosos ant e el f racaso de u n m etodo. P or ot ro l ado, se c onsidera qu e l as reacciones quimicas no enzimaticas son mas robustas. Por ejemplo Kleiboeker ("Quantitative detection of the effect of ur acil-DNA glycosylase on am plicon D NA de gradation an d R NA amplification in r everse t ranscription P CR" ("Deteccion cuantitativa del efecto de la uracilo-AND glicosilasa en la degradacion de amplicones de ADN y de ARN en la P CR d e t ranscripcion i nversa"), V irology Jo urnal ( 2005) 2: 29)) i nforma de los pobres resultados en la eliminacion de diversos moldes. Para mejorar la eficiencia, Kleiboeker expone el incremento de la cantidad de UNG, del tiempo de incubacion y el incremento de la temperatura de incubacion. Se conoce, sin embargo, que la presencia de cantidades excesivas de UNG es perjudicial para la PCR. Aunque la UNG es eventualmente inactivada por el calor, r etiene una act ividad su stancial d urante u n tiempo pr olongado dur ante l os ciclos termicos. C omo l a temperatura se acerca periodicamente a la optima de 50°C (durante la etapa de hibridacion de la PCR), la UNG se vuelve parcialmente activa einicia la digestion de los nuevos amplicones generados que contienen uracilo. Por lo tanto, no deben continuarse afadiendo cantidades cada vez mayores de UNG.

De forma sorprendente, los inventores han descubierto que la UNG no es la causa de los fracasos del metodo de esterilizacion. C ontrariamente a l o esp erado, el f actor l imitante en el metodo de es terilizacion n o es la et apa enzimatica, si no la etapa subsiguiente de escision de la cadena. Habiendo analizado los productos intermedios del metodo de la UNG mediante HPLC, los inventores han determinado que la UNG convierte mas del 95% de los uracilos del ADN en sitios abasicos. Sin embargo solamente un 6% del ADN abasico resultante es escindido a 50°C y solamente aproximadamente el 10% es escindido a 95°C. Por lo tanto, los inventores han desarrollado una mejora (til del metodo de esterilizacion con UNG, que supone la adicion de agentes que facilitan la degradacion del ADN abasico. Es una mejora especialmente (til aquella que incluye tipos de dichos agentes que no interfieren con las reacciones de amplificacion subsiguientes.

Seg(n la presente invencion, dichos agentes facilitadores de la degradacion del ADN abasico son poliaminas. De modo general, las poliaminas son moleculas de hidrocarburo lineales que incluyen, como minimo, dos grupos amino, estando situados dichos grupos amino a ambos extremos. Algunas poliaminas lineales estan sustituidas por grupos no lineales o ciclicos, Ademas de los grupos amino terminales, algunas poliaminas poseen en la cadena uno o mas grupos amino internos. En algunas realizaciones, la poliamina posee una estructura en la que los grupos amino adyacentes estan separados entre si por tres carbonos. El analisis comparativo de un gran n(mero de poliaminas ha mostrado que esta estructura permite una escision optima de los sitios abasicos, ver Steullet y otros "Cleavage of abasic sites in DNA by intercalator amines," ("Escision de sitios abasicos del ADN mediante aminas intercaladoras") Bioorg. Medic. Chem. 1999 (7), 2531-2540. La escision de sitios abasicos en el ADN mediante la utilizacion de poliaminas tambien ha sido descrita por McHugh P.J. y Knowland J. "Novel reagents for chemical cleavage at abasic sites and U V ph otoproducts in D NA" ( "Reactivos novedosos para l a esc ision quimica d e si tios abasicos y fotoproductos UV del ADN"), (1995) Nucleic Acid Res., Oxford UniversityPress, Surrey/GB, 23/10: 1664-1670 y Bailly y otros "The multiple activities of E. coli endonuclease IV and the extreme lability of 5'-terminal base-free deoxyribose 5-phosphate" ("Las m(ltiples actividades de la endonucleasas IV de E. coli y la extrema labilidad de la desoxirribosa 5-fosfato sin base en el extremo 5") (1989) The Biochem. J., 259/3: 761-768. Esta norma se cumple independientemente del n(mero total de atomos y del n(mero total de grupos amino de la poliamina. Como ejemplos de poliaminas (tiles se incluyen:

Espermidina, (NH2)(CH2)3(NH)(CH2)4(NH2);

Espermina, (NH2)(CH2)3(NH)(CH2)4(NH2);

Trimetilendiamina, (NH2)(CH2)3(NH2).

Preferentemente, se g(n l a i nvencion, se afaden a l a reaccion u na o m as poliaminas, dando l ugar a una concentracion entre 0,01 mM y 1 mM.

En algunas realizaciones la poliamina es una amina intercaladora. Las poliaminas de este grupo poseen un grupo intercalador, capas de intercalarse entre los pares de bases o bases de un acido nucleico. Como ejemplos de grupos intercaladores en una poliamina se incluyen los arenos y los poliarenos, tales como el naftaleno y la antraquinona. En algunas realizaciones, el grupo intercalador tambien puede estar sustituido con una o mas cadenas laterales de poliamina. Las aminas intercaladoras son frecuentemente mas eficientes para degradar acidos nucleicos abasicos que l as aminas lineales. S in adscr ibirse a ni nguna t eoria en p articular, pued e su gerirse qu e est e ef ectos es probablemente debido al intercalado, que lleva la parte activa de la molecula de poliamina a una situacion cercana a sitio abasico diana.

Es conocido q ue l as poliaminas mejoran l a ef iciencia d e di versas reacciones enzimaticas que i ncluyen aci dos nucleicos. Por ejemplo, se ha descubierto que una o mas poliaminas (etilendiamina, trimetilendiamina, espermidina y espermina) mejoran en ocasiones la eficiencia de la amplificacion mediante PCR utilizando muestras impuras, tales como la sangre o tejidos de plantas oanimales (ver los res(menes en ingles de las publicaciones de solicitud de patente japonesa JP 11113573, JP 2001008680, JP 8009997 y JP 6277061). D e f orma ge neral, se obse rvo que diversas poliaminas poseian una capacidad muy similar de facilitar las reacciones enzimaticas. La Patente U.S. n°

6.413.747 " Enhancement of nucl eic acid am plification b y t he a ddition of a p olyamine" ( "Incremento de l a amplificacion de acidos nucleicos mediante la adicion de una poliamina") da a conocer la utilizacion de nueve poliaminas diferentes, todas ellas capaces de incrementar la eficiencia de la PCR. Otro grupo ha observado que las poliaminas incrementan la eficiencia a la vez que disminuyen la especificidad de la PCR utilizando ADN extraido de semillas de cebada congeladas, ver Ahokas H. y M. J. Erkkila "Interference of PCR amplification by the polyamines, spermine a nd sp ermidine" ( "Interferencia de l a amplificacion m ediante P CR p or l as poliaminas, esp ermina y espermidina"), (1993) PCR Methods Appl., 3:65-68. Este grupo observo que el incremento de la concentracion de poliaminas en la reaccion de 0,6 mM a 0,8 mM da lugar a cuatro productos adicionales de PCR a partir de la misma combinacion molde-cebador. Tambien, se conoce en latecnica que la actividad de la UNG es estimulada en presencia de poliaminas, ve r W illiams y o tros "A m ollicute ( mycoplasma) D NA r epair enz yme: p urification a nd characterization of uracil-DNA glycosylase" ("Enzima de reparacion de ADN de mollicute (micoplasma): purificacion y

5 caracterizacion de la uracilo-ADN glicosilasa"), (1990) J. Bacteriol., 172/6: 2979-2985.

Sin sustentarse en ninguna teoria en particular, puede sugerirse que tomados conjuntamente, los datos existentes muestran que las poliaminas mejoran la amplificacion del ADN dafado. Es posible que las poliaminas incrementen la capacidad de las polimerasas de sortear los sitios dafados del ADN, tales como los sitios abasicos. Siguiendo esta 10 logica, deberia esperarse que, del mismomodo, las poliaminas permitieran la amplificacion de los contaminantes digeridos con UNG antes de su degradacion durantela PCR. Por lo tanto, deberia concluirse que las poliaminas contrarrestarian el metodo basado en UNG para evitar la contaminacion cruzada y no deberian utilizarse conjuntamente con este metodo. Por el contrario, se ha descubierto que de hecho las poliaminas mejoran el control de la contaminacion basado en la UNG, incrementandola degradacion del ADN a nivel de s us sitios abasicos.

15 Seg(n la presente invencion, una solucion de muestra que comprende un reactivo facilitador de la degradaciondel ADN abasico, una poliamina, se incuba preferentemente a las condiciones adecuadas para provocar la degradacion del ADN correspondiente con, al menos, un sitio abasico, mas preferentemente a una temperatura entre 30°C y 95°C.

20 Debe entenderse que el exito en la eliminacion del contaminante cruzado se relaciona con la composicion de las bases del amplicon a eliminar. Un bajo contenido en desoxiadenosina de la cadena a copiar conlleva un bajo contenido en desoxiuridina del producto de la amplificacion realizada en presencia de dUTP. Por lo tanto, tras el tratamiento con UNG, dicho producto de amplificacion poseera una cantidad inferior de sitios abasicos y sufrira una rotura menor del esqueleto. Debe entenderse ademas que si las uridinas se distribuyen de forma asimetrica entre las

25 dos cadenas de un amplicon, la cadena pobre en uridina puede sobrevivir al proceso de esterilizacion y asegurar la supervivencia de todo el amplicon contaminante. En los ejemplos siguientes, se utilizaron dianas con cantidades y proporciones diferentes de timidinas. Tal como se muestra en la Tabla 1, el contenido en dT (dU) de las cadenas diana oscilaba entre un 15% y un 35%. Se describe la secuencia diana de la Diana 2 para los ejemplos descritos, a continuacion. Esta diana posee el n(mero absoluto mas bajo de timidinas (66) en una forma de doble cadena, asi

30 como el contenido absoluto y relativo mas bajos en una cadena (nica (la cadena directa).

Contenido en dT (dU) de diversas secuencias diana

Diana: Diana 1 Diana 2 Diana 3 Diana 4 Diana 5 Control interno

Tamafo, bp: 154 141 157 132 241 124

dTs totales: 79 (25%) 66 (23%) 79 (25%) 72 (27%) 95 (20%) 61 (25%)

dTs de la cadena directa: 32 (21%) 22 (%) 47 (30%) 46 (35%) 511 (21%) 32 (26%)

dTs de la cadena inversa: 47 (31%) 44 (31%) 32 (20%) 26 (20%) 44 (18%) 29 (23%)

Mientras que la sustitucion de todas las timidinas por uracilos garantiza la maxima actividad de UNG sobre un amplicon, puede ser deseable generar amplicones con una mezcla de timidinas y uracilos. Ello es debido a que 35 muchas de las ADN polimerasas conocidas en la tecnica poseen una baja preferencia por el dUTP como substrato. Tal como se muestra en los ejemplos siguientes, la amplificacion en presencia solamente de dUTP es, en general, menos eficiente que la amplificacion en presencia de dUTP u dTTP. Se entiende que la diferencia en la eficiencia puede variar entre secuencias diana diferentes y seg(n las cantidades de dTTP y dUTP en la mezcla de reaccion. Por lo tanto, para algunas secuencia diana, puede recomendarse la adicion de diversas cantidades de dTTP. En

40 algunas realizaciones, la relacion molar dTTP:dUTP en la mezcla de reaccion es 1:10. En algunas realizaciones, la concentracion de dUTP es superior a la de dATP, dCTP, y dGTP. En un ejemplo, las concentraciones de nucleotidos en la reaccion de amplificacion pueden ser de 0,3 mM de cada dATP, dCTP, y dGTP, 0,5 mM para dUTP y 0,05 mM para dTTP.

45 En ot ros ejemplos, l os agentes que f acilitan la d egradacion d el A DN ab asico s on enz imas, t ales como l a exonucleasas IV, la exonucleasa III o la AP liasa.

Kits

50 La presente invencion tambien da a conocer kits (tiles para utilizar el metodo de la invencion. Los kits comprenden uno o mas de los reactivos descritos en la presente invencion, un reactivo que posee actividad de ADN glicosilasa y un r eactivo c apaz de d egradar el A DN abasico c omo un a p oliamina. O pcionalmente, l os ki ts pueden incluir instrucciones en papel o en formato electronico.

55 Por lo tanto, los kits incluyen una poliamina adecuada para facilitar la degradacion no enzimatica del ADN abasico. En otros ejemplos, los kits incluyen, ademas, un enzima capaz de degradar el ADN abasico. Como otros reactivos del kit se incluyen reactivos (tiles para la amplificacion de los acidos nucleicos. Estos reactivos incluyen, sin caracter limitante, uno o mas oligonucleotidos cebadores, polimerasa de acidos nucleicos, tampones, sales y nucleosidos trifosfato y un enzima con actividad ADN glicosilasa, tal como la actividad uracilo-N-glicosilasa. Los nucleosidos trifosfato incluyen dATP, dCTP, dGTP yuno mas entre dUTP y dTTP. En lugar de dUTP, puede afadirse otro nucleosido t rifosfato n o c onvencional adecuado. S i s e utiliza ot ro n ucleosido t rifosfato n o c onvencional, p uede modificarse c onsiguientemente l a co mposicion en nuc leosidos trifosfato co nvencionales. P ueden s er r eactivos adicionales del kit aquellos reactivos (tiles para la deteccion de los acidos nucleicos amplificados. Estos reactivos incluyen, sin caracter limitante, una o mas sondas marcadas, como por ejemplo sondas marcadas radiactivamente o mediante fluorescencia, sondas TaqManT y otras sondas de PCR en tiempo real.

Mezclas de reaccion

La presente invencion tambien da a conocer mezclas de reaccion. Unamezcla de reaccion tipicacomprende los componentes utilizados para la amplificacion de acidos nucleicos y uno o mas reactivos para facilitar la generacion y degradacion de ADN abasico. En algunas realizaciones, las mezclas de reaccion contendran los reactivos utilizados para la deteccion de acidos nucleicos. Las mezclas de reaccion contienen ademas reactivos utilizados para evitar la contaminacion cruzada. Una mezcla de reaccion ejemplar de la presente invencion comprende uno o mas oligonucleotidos cebadores, una polimerasa de acido nucleico, tampones, sales, nucleosidos trifosfato y un enzima con actividad ADN glicosilasa, tal como por ejemplo una actividad uracilo-N-glicosilasa, para generar ADN con al menos un sitio abasico. Las mezclas de reaccion comprenden ademas una poliamina para facilitar la degradacion del ADN abasico. En algunas realizaciones, las mezclas de reaccion contendran ademas un enzima capaz de escindir el ADN abasico. En algunas realizaciones, las mezclas de reaccion contendran ademas una o mas sondas marcadas.

Debe tenerse en cuenta, que el alcance de la presente invencion incluye cualquier metodo de amplificacion que sea susceptible a presentar contaminacion cruzada. Los metodos de amplificacion incluyen, sin caracter limitante, la reaccion en cadena de la polimerasa (PCR), la PCR en tiempo real, la PCR punto final, la PCR asimetrica y la reaccion en cadena de la ligado (LCR).

Ejemplos

Los ejemplos siguientes ejemplifican el metodo de la presente invencion.

Ejemplo 1

Efecto de la espermina en la degradacion de un oligonucleotido que posee sitios abasicos

El oligonucleotido de ADN con desoxiuracilo de identificador de secuencia n° 1:

5'-TTTGCATGGCTGCUTGATGTCCCCCCACT-3'

se incubo en una solucion preparada combinando una alicuota de 10 !l de una solucion 100 !M con 10 !l de una solucion maestra falsa de PCR-RT. La solucion maestra falsa contenia tricina 50-mM (pH 8,3), acetato potasico 90 mM, dATP, dCTP y dGTP de 200 !M cada uno de ellos, dUTP 400 !M, acetato de manganeso 4 mM, DMSO 5%, y glicerol 5%. Adicionalmente, la mezcla de reaccion contenia 2,5 !l de agua o d e solucion de espermina a la concentracion adecuada, y 2 !l de 4 unidades/!l de UNG. Las incubaciones fueron durante 30 minutos a 50°C, con o sin un pico de calor adicional a 95°C durante dos minutos. Las reacciones se analizaron mediante HPLC-MS utilizando el sistema de deteccion Agilent 1100 MSD con una fuente de ionizacion por electrospray. Los datos de la espectrometria de masas (MS) (no mostrados) mostraron claramente que bajo todas las condiciones, la eliminacion del uracilo fue completa (dentro de los limites del metodo de deteccion). Los resultados de la HPLC se muestran en las Figuras 1Ay 1B. La Figura 1A muestra la degradacion a 50°C en presencia de 100 !M, 1mMy 10 mM de espermina. A 10 !M, todavia es detectable el oligonucleotido completo. La Figura 1B muestra la degradacion tras una exposicion de 2 minutos a 95°C, tambien en presencia de 100 !M, 1mM y 10 mM de espermina. A 95°C, incluso a la concentracion de 100 !M, el oligonucleotido completo ya no es detectable. Los resultados muestran que con cantidades crecientes de espermina, el oligonucleotido completo se degrada mas eficientemente en fragmentos. A temperaturas mas altas, el efecto se consigue con una concentracion mas baja de espermina. Sin embargo, tal como m uestran l os resultados, l as temperaturas mas altas son i nsuficientes por si so las para pr ovocar l a degradacion del ADN abasico.

Ejemplo 2

Amplificación de AND y ARN en presencia de espermina

Para el ADN, se realizo una reaccion en cadena de la polimerasa para amplificar un molde de ADN de 241 bp (Diana 5, 20% dT en ADN de doble cadena). La mezcla de reaccion contenia 40 unidades de polimerasa ADN ZO5, Tricina 50 mM(pH 8,3), acetato potasico 90 mM, dATP, dCTP y dGTP de 200 !M de cadauno de ellos,dUTP 400 !M, cebadores cadena arriba y cadena abajo de 0,1 !M de cada uno, acetato de manganeso 4 mM, DMSO 5%, y glicerol 5%, tinte de intercalado SYTO-16 2 !M y, opcionalmente, 100 !M de espermina. La amplificacion se realizo en un instrumento Roche LightCycler 480 utilizando el perfil de temperatura siguiente 50°C durante 5 minutos (etapa UNG), dos ciclos de 94°C durante 15 segundos (desnaturalizacion) y 59°C durante 40 segundos (hibridacion y extension), 48 ciclos de 91°C (desnaturalizacion) y 59°C durante 40 segundos (hibridacion y extension). Se recogieron los datos de fluorescencia durante las etapas de hibridacion/extension de los (ltimos 48 ciclos utilizando una combinacion de

5 filtros de 483/533 nm para la excitacion y emision respectivamente. Los resultados se muestran en la Figura 2A, y en la Tabla 2A. Los grupos de lineas continuas representan las reacciones de amplificacion sin espermina, realizadas por t riplicado. Los grupos de l ineas de puntos representan l as reacciones de a mplificacion e n pr esencia de espermina realizadas por triplicado. Los resultados muestran que la amplificacion no es inhibida significativamente por la espermina.

Tabla 2A

Amplificación por PCR de ADN (valores Ct) en ausencia o presencia de espermina

N° de copias de molde: Sin espermina Espermina 100 !M Diferencia en Ct

10�: 18,8 19,0 �0,2

104: 25,7 25,9 �0,2

10: 36,6 36,1 -0,5

Para el ARN, se llevo a cabo una reaccion en cadena de la polimerasa con transcripcion inversa (RT-PCR) para amplificar 0-106 copias de un ARN equivalente a la Diana 5. La mezcla de reaccion y el perfil de temperatura fueron los mismos que en el caso del molde de ADN, excepto en que se afadio transcriptasa inversa y que tras la etapa

15 inicial UNG, la reaccion se incubo a 66°C durante 30 minutos (transcripcion inversa). Los resultados se muestran en la Figura 2B y la Tabla 2B. Como en la Figura 2A los grupos de lineas continuas representan las reacciones de amplificacion sin espermina, realizadas por triplicado. Los grupos de lineas de puntos representan las reacciones de amplificacion en presencia de espermina realizadas por triplicado. Los resultados muestran que la amplificacion no es inhibida significativamente por la espermina.

Tabla 2B

Amplificación (valores medios de Ct) de 10, 104 y 106 copias de ARN en ausencia o presencia de espermina

N° de copias: Sin espermina Espermina 100 !M Diferencia en Ct

10: 34,4 34,0 -0,3

104: 23,8 23,5 -0,3

106: 16,8 16,6 -0,2

Ejemplo 3

Eficiencia de la amplificación en presencia de dUTP solamente o una combinación de dUTP y dTTP

25 Se llevo a c abo una reaccion en cadena de l a polimerasa con transcripcion inversa (RT-PCR) para amplificar

100.000 copias de un molde de ARN de 141 nucleotidos (Diana 2 de la Tabla 1). Esta diana posee un contenido muy bajo en dU. El ADN de doble cadena correspondiente posee un 23% de dT (Tabla 1). Cuando se realiza la amplificacion en presencia de dTTP y dUTP, el contenido en dU del amplicon puede ser incluso inferior. La mezcla 30 de reaccion incluia betaina 0,5 M, pH6,3; acetato potasico 68 mM, pH 7,0; glicerol 2,8%, acetato demanganeso 3 mM, pH 6,1; azida sodica 0,07%; DMSO 5%, tricina 50 mM, pH 8,3; dATP, dCTP y dGTP 0,3 mM de cada uno de ellos; dUTP 0,5 mM; y donde se indique, dTTP 0,05 mM; 40 unidades de polimerasa ADN ZO5; aptamero 0,2 !M, cebador directo e inverso 0,2 !M de cada uno, 0,1!M de sonda. El perfil de temperatura fue: 94�C durante 30 segundos, 58�C durante 30 minutos (transcripcion inversa), cinco ciclosde 95�C durante 15 segundos y 59�C

35 durante 21 segundos, 52 ciclos adicionales de 91°C durante 15 segundos y 52°C durante 33 segundos, seguidos de 72°C durante 5 minutos y finalmente 40°C durante 2 minutos. Los resultados se muestran en la Figura 3 y la Tabla 3. En este experimento, la amplificacion en presencia de dUTP es aproximadamente tan eficiente como la amplificacion en presencia de dUTP y dTTP.

Tabla 3

Amplificación (valores medios de Ct) de 10.000 copias de la Diana 2 en presencia de dUTP o de una mezcla de dUTP y dTTP

dUTP: dUTP � dTTP

Ct promedio�: 26,2 25,9

Desviacion estandar: 0,05 0,2

� Promedio de cinco pruebas

Ejemplo 4

Efecto de concentraciones crecientes de UNG sobre un amplicón pobre de dT(dU)

En este ejemplo, se utilizo como diana para la amplificacion el amplicon de la Diana 2, generado utilizando una

5 mezcla de nucleotidos que contenia dUTP 0,5 mM y dTTP 0,05 mM, tal como se describe en elejemplo 3 (dU�T total 23%). El amplicon se purifico utilizando el kit de purificacion de PCR QIAQUICK� (Qiagen, Valencia, CA) y se cuantifico mediante espectrofotometria. Las amplificaciones se realizaron con 1.000, o 10.000 copias del amplicon afadidas a plasma humano de donantes sanos, se proceso con el instrumento COBAS AmpliPrep (Roche Molecular Systems, Pleasanton, CA). Las reacciones se llevaron a cabo en ausencia o en presencia de cantidades crecientes

10 de U NG. La RT-PCR se l levo a ca bo c on l as secuencias de ce badores y diana, l os reactivos y el p erfil d e temperaturas descritos en el Ejemplo 3, excepto en que se afadio la cantidad de UNG indicada. La amplificacion y deteccion se realizo en un instrumento COBAS TaqMan� utilizando el perfil de temperaturas siguiente: 50�C durante 2 minutos (etapa UNG), 94�C durante 30 segundos, 58�C durante 30 minutos (etapa RT), 5 ciclos de 95�C durante 15 segundos (desnaturalizacion) y 59�C durante 21 segundos (hibridacion y extension), 55 ciclos de 91�C durante 15

15 segundos (desnaturalizacion) y 52�C durante 33 segundos (hibridacion y extension). Los resultados se muestran en la Figura 4 y la Tabla 4. Como muestran los datos de laTabla 4, el ampliconpobre en dU sobrevivio incluso al tratamiento con 60 unidades/100!l de UNG (seis veces la cantidad recomendada).

Tabla 4

Amplificación de 10.000 copias de un amplicón pobre en dT(dU) tras el pretratamiento con cantidades crecientes de UNG

Sin UNG: 10u UNG 20u UNG 30u UNG 40u UNG 50uUNG 60u UNG

23,2�: 35,6 37,3 36,6 41,9 40,0 41,6

� Cada valor es el promedio de dos experimentos independientes

20 Ejemplo 5

Amplificación de secuencias que contienen dU y dT tras pretratamiento con UNG

En este ejemplo, se realizaron pretratamiento con UNG y RT-PCR en tiempo real tal como se describe en el Ejemplo

25 4. Los resultados se muestran en la Tabla 5. Los resultados demuestran que el amplicon que posee dT y dU es mas persistente, es decir, mas dificil de eliminar que el amplicon que contiene solamente dU.

Tabla 5

Amplificación de secuencias que contienen dU y dT+dU con o sin pretratamiento con UNG

N° de c opias de amplicon afadidas: Amplicon solamente con dU Amplicon con dT y dU

� UNG: Sin UNG � UNG Sin UNG

100.000: 31,8� 20,3 28,0 19,9

10.000: 34,5 23,9 31,5 23,4

1.000: 37,2�� 27,3 43,7 27,0

100: ND�� 31,1 39,7�� 29,7

10: ND ND 49,7�� 35,9

� cada valor es el promedio de dos experimentos independientes �� representa un solo valor, los otros dos experimentos presentaron un valor ND �� ND: No detectado

Ejemplo 6

Amplificación tras pretratamiento con UNG y en presencia de espermina

En este ejemplo, se amplifico una diana que contenia dU y dT tras pretratamiento con UNG tal como se describe en el Ejemplo 4, excepto en que la mezcla de reaccion de amplificacion contenia tambien 100 !M de espermina. Los 35 resultados semuestranen la Figura 4 y en la Tabla 6.En comparacion con la Tabla 5, los datosmuestranuna mejoria de 1.000 veces o mas en el control de la contaminacion.

Tabla 6

Amplificación de secuencias que contienen dU y dT+dU tras pretratamiento con UNG y en presencia de 100 µM de espermina

N° de copias de amplicon afadidas: Sin UNG UNG 20 U

1.000.000: 16,1 � 38,7

100.000: 19,7 41,4��

10.000: 23,3 ND��

1.000: 26,7 ND

100: 30 ND

Ejemplo 7

5 Amplificación tras pretratamiento con UNG a diversas temperaturas en presencia de espermina

En este ejemplo, se realizo la amplificacion de la diana que contiene dT y dU tal como se describe en el Ejemplo 6, con la excepcion de que el tratamiento con UNG se realizo o a 45°C o a 50°C. La reaccion de control no contenia UNG ni espermina. La reaccion de ensayo contenia UNG y espermina. Los resultados se muestran en la Tabla 7. En

10 este experimento, el metodo funciona mejor a 50°C que a 45°C.

Tabla 7

Amplificación de secuencias que contienen dU y dT+dU con o sin pretratamiento con UNG a 50ºC y 45ºC

50°C: 45°C

N° de c opias de amplicon afadidas: Sin UNG n i espermina UNG 20U � espermina 100!M Sin U NG n i espermina UNG 2 0U � espermina 100!M

1.000.000: 16,4� 38,0 16,2 39,7

100.000: 20,0 ND�� 19,8 46,5

10.000: 23,4 ND 23,3 ND

1.000: 27,1 ND 27,1 ND

� cada valor es el promedio de dos experimentos independientes �� ND: No detectado

Mientras que la invencion se ha descrito en detalle haciendo referencia a ejemplos especificos. Sera evidente para los expertos en tecnica que pueden realizarse diversas modificaciones dentro del alcance de la presente invencion. 15 Por lo tanto, el alcance de la invencion no debe quedar limitado por ninguno de los ejemplos descritos en la misma, si no por las reivindicaciones presentadas mas adelante.

LISTADOS DE SECUENCIAS Identificador de secuencia n° 1: Secuencia artificial 5'-TTTGCATGGCTGCUTGATGTCCCCCCACT-3' LISTADO DE SECUENCIA �110� F. Hoffmann-La Roche AG

Roche Diagnostics GmbH

�120� METODO MEJORADO PARA LA PREVENCION DE LA CONTAMINACION CRUZADA EN TECNOLOG�AS

DE AMPLIFICACION DE �CIDOS NUCLEICOS

�130� 24623 EP-KOE

�160� 1

�170� PatentIn version 3.5

�210� 1

�211� 29

�212� ADN

�213� Secuencia artificial

�220�

�223� oligonucleotido de ADN que contiene desoxiuracilo

�400� 1

tttgcatggc tgcutgatgt ccccccact

Claims

REIVINDICACIONES

1. Metodo para disminuir la contaminacion cruzada durante la amplificacion mediante la reaccion en cadena de la polimerasa (PCR) de un acido nucleico, que comprende las etapas de:

a.

proporcionar una muestra de solucion que contiene dicho acido nucleico;

b.

amplificar dicho acido nucleico en presencia de un enzima que posee actividad ADN glicosilasa para generar ADN con al menos un sitio abasico;

c.

proporcionar al menos un reactivo que facilite la degradacion del ADN abasico, siendo dicho reactivo una poliamina;

d.

incubar dicha solucion muestra en condiciones adecuadas para provocar la degradacion de dicho ADN con al menos un sitio abasico
2.

Metodo, seg(n la reivindicacion 1, en el que dicha actividad glicosilasa es la actividad uracilo-N-ADN glicosilasa.
3.

Metodo, seg(n la reivindicacion 1, en el que dicha poliamina en una poliamina intercaladora.
4.

Metodo, seg(n la reivindicacion 1, en el que dicha poliamina se selecciona del grupo formado por espermidina, espermina, trietilentetramina y trimetilendiamina.
5.

Mezcla de reaccion para evitar la contaminacion cruzada durante la amplificacion mediante la reaccion en cadena de la polimerasa (PCR) de un acido nucleico, que comprende:

reactivos (tiles para la amplificacion de acidos nucleicos, incluyendo dichos reactivos uno o m as oligonucleotidos cebadores, una polimerasa de acidos nucleicos, tampones, sales y nucleosidos trifosfato incluyendo dATP, dCTP, dGTP y uno o mas entre dTTP y dUTP, un reactivo adecuado para generar ADN con al menos un sitio abasico y un reactivo que facilita la degradacion del ADN abasico, poseyendo dicho reactivo adecuado para generar ADN con al menos un sitio abasico actividad uracilo-N-ADN glicosilasa y dicho reactivo que facilita la degradacion del ADN abasico una poliamina.
6.

Mezcla de reaccion seg(n la reivindicacion 5, en la que dicho reactivo adecuado, para generar ADN con al menos un sitio abasico, es un enzima.
7.

Kit para llevar a cabo un metodo de prevencion de la contaminacion cruzada durante la amplificacion mediante la reaccion en cadena de la polimerasa (PCR) de un acido nucleico, que comprende:

a.

un reactivo que posee actividad ADN glicosilasa,

b.

un reactivo capaz de degradar el ADN abasico, siendo dicho reactivo una poliamina, y

c.

reactivo (tiles para amplificar acidos nucleicos, incluyendo dichos reactivos (tiles para amplificar acidos nucleicos uno o mas oligonucleotidos cebadores, una polimerasa de acidos nucleicos, tampones,sales, y nucleosidos trifosfato incluyendo dATP, dCTP, dGTP y uno o mas entre dTTP y dUTP.