ES2449665B2

ES2449665B2 - Procedimiento para el diagnóstico clínico de una enfermedad infecciosa basada en el empleo de la PCR cuantitativa, oligonucleótidos marcados de 8 a 9 nucleótidos de longitud y la UNG del Bacalao del Atlántico (Gadus morhua).

Info

Publication number: ES2449665B2
Application number: ES201231456A
Authority: ES
Inventors: Germán BOU ARÉVALO; Ana FERNÁNDEZ GONZÁLEZ; Maria Del Mar TÓMAS CARMONA
Original assignee: Fundacion Do Complexo Hospitalario Universitario A Coruna; FUNDACION DO COMPLEXO HOSPITALARIO UNIVERSITARIO A CORU A; Servizo Galego de Saude SERGAS
Current assignee: Fundacion Do Complexo Hospitalario Universitario A Coruna; FUNDACION DO COMPLEXO HOSPITALARIO UNIVERSITARIO A CORU A; Servizo Galego de Saude SERGAS
Priority date: 2012-09-19
Filing date: 2012-09-19
Publication date: 2014-07-17
Anticipated expiration: 2032-09-19
Also published as: ES2449665R1; ES2449665A2

Abstract

La presente invención proporciona un procedimiento, útil para su uso en un laboratorio de microbiología clínica, que permite la determinación de la presencia o ausencia de un microorganismo en una muestra Biológica de un sujeto con un alto grado de fiabilidad utilizando la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) realizada de forma cuantitativa en tiempo real. Dicho procedimiento comprende los siguientes pasos:#a. Llevar a cabo un tratamiento de la mezcla de reacción que se utilizará para llevar a cabo la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) realizada de forma cuantitativa en tiempo real con la Uracil-ADN-Glicosilasa procedente del Bacalao del Atlántico (Gadus morhua) de SEQ ID No 3 o con una variante de la misma; y#b. Determinar la presencia o ausencia del microorganismo en la muestra biológica, tras tratamiento de la mezcla de reacción según el apartado a), a través de la determinación de la presencia o ausencia de amplicones procedentes de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) realizada de forma cuantitativa en tiempo real;#donde dicha reacción en cadena de la polimerasa (PCR) emplea ADN, ADN complementario (ADNc) ó ADN de hebra simple obtenido por retrotranscripción de ácido ribonucleico (ARN) de la muestra biológica, al menos un par de cebadores específicos, dNTPs, un tampón de reacción adecuado, una ADN polimerasa termoestable y una sonda marcada fluorescentemente, donde dicha sonda marcada fluorescentemente consiste en un oligonucleótido con una longitud de 8 a 9 nucleótidos marcado con un fluoroforo, preferiblemente dicha sonda presenta una longitud de 8 nucleótidos.

Description

Procedimiento para el diagnóstico clínico de una enfermedad infecciosa basada en el empleo de la P(R cuantitativa, oligonucleótidos marcados de 8 a 9 nucleótidos de longitud y la UNG del Bacalao del Atlántico (Gadus morhual.

Campo de la técnica

La presente invención se refiere al campo del diagnóstico clínico. Más concretamente al diagnóstico clínico mediante la utilización de la técnica de la PCR en tiempo real con sondas marcadas fluorescentemente constituidas por oligonucleótidos con una longitud entre 8 y 9 nucleótidos.

Antecedentes de la invención

La siguiente discusión de los antecedentes de la invención se proporciona simplemente para ayudar al lector a comprender la invención y no se reconoce que describa o constituya técnica anterior de la presente invención.

Hoy en día el diagnóstico mediante técnicas moleculares ha cambiado la práctica clínica en relación a las enfermedades infecciosas. En este sentido, la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es la técnica molecular más desarrollada actualmente y tiene un amplio abanico de posibilidades, entre las que se incluyen la detección de diversos patógenos, la individualización de nuevos agentes infecciosos o el seguimiento de la prevalencia de diversas enfermedades infecciosas en la población. Así, la PCR cuantitativa o en tiempo real se está aplicando hoy en día en tres grandes campos clínicos:

L En el diagnóstico clínico o etiológico, donde la PCR es muy útil sobre todo en ausencia de métodos de diagnóstico alternativos o cuando éstos son muy complejos, para mejorar la eficacia diagnóstica complementando métodos convencionales o si se requiere un diagnóstico rápido y precoz del agente etiológico que permita iniciar el tratamiento específico lo antes posible.

2.: En el control del tratamiento, donde la PCR se utiliza tanto para la selección de los pacientes que deben ser tratados como para, una vez iniciado el tratamiento, comprobar su eficacia, para lo cual es importante disponer de métodos cuantitativos.

3.: En la caracterización genética del microorganismo (genotipificación) e identificación de mutaciones determinantes de resistencias a fármacos o de virulencia.

Así, la utilización de la técnica de la PCR en tiempo real en los laboratorios de Microbiología Clínica supone un avance muy significativo en el campo del diagnóstico clínico, el control del tratamiento así como en la genotipificación. Adicionalmente, ésta técnica se vería notablemente mejorada con la utilización de sondas (en ingles "probes") cortas, es decir sondas marcadas fluorescentemente con una longitud de 8 a 9 nucleótidos (ntl. Esto es debido por un parte a su gran variabilidad y por otra al hecho en sí que la utilización de la PCR a tiempo real utilizando sondas cortas presenta la necesidad de utilizar un rango de tamaño específico de los transcritos (de aquí en adelante amplicones) amplificados.

Así, es importante matizar que dichos amplicones deben poseer un tamaño entre 60 y 120 nucleótidos para que de esta forma se incremente la eficiencia de la amplificación y se reduzca el tiempo de reacción. La razón para ello es porque los fragmentos pequeños se desnaturalizan más facilmente que aquellos fragmentos más grandes (> 120 nucleótidos) a una temperatura de 95D y exigen de un menor tiempo de reacción. De esta forma es conocido en el estado de la técnica que la eficiencia de amplificación es menor cuanto mayor sea el tamaño del amplicon. Por lo tanto, se recomienda la amplificación de transcritos que presenten un tamaño entre 50 y 150 nucleótidos, mas concretamente entre 60 y 120 nuc1eótidos, aún más concretamente entre 70 y 110 nucleótidos cuando se utilizan sondas cortas. De hecho, la utilización de sondas cortas (8-9 nucleótidos), amplifican en su mayoría

fragmentos comprendidos entre 70 y 110 nucleótidos siguiendo indicaciones del software Primer3

(http://primer3.sourceforge.netf) utilizando los ajustes optimizados de forma predeterminada,

presentando la temperatura de fusión de ambos cebadores ajustada a 59-61 o C y la longitud del cebador fijada en 18-27 nucleótidos. Además, la utilización de dicha longitud de amplicones (70-110 nucleótidos) permite una adecuada eficiencia de amplificación aumentando la sensibilidad del diagnóstico etiológico en muestras clínicas.

Sin embargo, el empleo de esta longitud de amplicon y sondas cortas presenta una importante limitación, los falsos positivos producidos como resultado de la contaminación resultante de las amplificaciones realizadas previamente en los laboratorios de Microbiología clínica (en inglés "carry overJ/). Así, se ha de tener en cuenta que más de un 90% de los amplicones que detectan las sondas cortas se encuentran en un rango entre 70-110 nucleótidos, y que su total eliminación como posibles contaminantes resulta imprescindible para garantizar la seguridad de trabajar con este sistema en los laboratorios de Microbiología Clínica. No obstante, la total eliminación de dichos amplicones en un rango entre 70-110 nucleótidos resulta sumamente complicado en un laboratorio de Microbiología Clínica.

Así, hay que tener en cuenta que la limitación del uso de material o la separación física de unidades de trabajo en los laboratorios de Microbiología Clínica no garantiza la total eliminación de los contaminantes (en ingles "carry over contamination"). Entre otras cosas, porque de hecho, dichos contaminantes se transmiten principalmente por el propio personal técnico del laboratorio y porque estos contaminantes pueden permanecer en muchas superficies largos períodos de tiempo cuando no son sistemáticamente identificados y descontaminados después de cada contacto potencial con los productos de PCR, lo cual en la clínica diaria resulta complicado de llevar a cabo.

Adicionalmente, hay que tener en cuenta que los contaminantes de ADN localizados en los equipos y pipetas son de difícil descontaminación con UV (radiación ultravioleta) presumiblemente debido a que es menos eficaz con el ADN seco y que esta técnica no es ni siquiera eficaz en aquellos amplicones de pequeño tamaño, por ejemplo de 73 nucleótidos. Además, no es posible establecer un protocolo de eliminación de amplificaciones de ADN contaminantes de pequeño tamaño (73 nucleótidos) para PCR cuantitativas o en tiempo real, ya que requiere aplicación de luz UV durante 10 min a corta distancia solo del Buffer que forma parte de la mez.cla de reacción, no siendo aplicable ni a oligonucleótidos, ni a la Taq polimerasa, ni a los cebadores.

Por todo ello, encontrar una solución rápida y sencilla que perm ita la adecuada eliminación de estos amplicones de pequeño tamaño (que como anteriormente hemos comentado son los que permiten una mayor eficiencia de amplificación, y por tanto sensibilidad diagnóstica) permitiría el diagnóstico con gran sensibilidad y especificidad de numerosas enfermedades infecciosas, trabajando con la técnica de PCR a tiempo real con sondas cortas en los laboratorios de Microbiología Clínica.

Breve description de la invención

Por lo tanto, la presente invención resuelve las limitaciones existentes a la hora de trabajar con la técnica de la PCR a tiempo real con sondas cortas y amplicones de pequeño tamaño en el campo del diagnóstico clínico. Para ello, en un primer aspecto de la presente invención proponemos un procedimiento, útil para

su uso en un laboratorio de Microbiología Clínica, que permite la determinación de la presencia o

ausencia de un microorganismo en una muestra Biológica de un sujeto con un alto grado de fiabilidad

utilizando la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) realizada de forma cuantitativa en tiempo real.

Dicho procedimiento comprende los siguientes pasos:

a.: llevar a cabo un tratamiento de la mezcla de reacción que se utilizará para llevar a cabo

la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) realizada de forma cuantitativa en tiempo

real con la Uracil-ADN-Glicosilasa procedente del Bacalao del Atlántico (Gadus morhua)

de SEQ ID No 3 o con una variante de la misma; y

b.: Determinar la presencia o ausencia del microorganismo en la muestra Biológica, t ras

tratamiento de la mezcla de reacción según el apartado a), a través de la determinación

de la presencia o ausencia de amplicones procedentes de la reacción en cadena de la

polimerasa (PCR) realizada de forma cuantitativa en tiempo real;

donde dicha reacción en cadena de la polimerasa (PCR) emplea ADN, ADN complementario (ADNc) ó

ADN de hebra simple obtenido por retrotranscripción de ácido ribonucleico (ARN) de la muestra Biológica, al menos un par de cebadores específicos, dNTPs, un tampón de reacción adecuado, una ADN polimerasa termoestable y una sonda marcada fluorescentemente, donde dicha sonda marcada fluorescentemente consiste en un oligonucleótido con una longitud de 8 a 9 nucleótidos marcado con un fluoroforo, preferiblemente dicha sonda presenta una longitud de 8 nucleótidos.

En una realización preferida de la invención, dicha reacción en cadena de la polimerasa (PCR) amplifica amplicones con una longitud entre 60 y 120 nucleótidos, más preferentemente amplicones que presenten una longitud entre 70 y 110 nucleótidos, más preferentemente amplicones que presenten una longitud entre 75 y 110 nucleótidos.

En otra realización preferida de la invención, la sonda marcada fluorescentemente es una sonda Taqman.

En otra realización de la presente invención, el sujeto es un humano.

En aún otra realización de la presente invención, el microorganismo es un microorganismo que provoca patología infecciosa (patógeno). Preferentemente, dicho microorganismo infeccioso se selecciona de la lista que consiste en Neisseria meningitidis, Streptococcus agalactiae, Listeria monocytogenes, Virus de la Varicela Zoster, Bordetella pertussis, Bordetella ho/mensii, el complejo Mycobacterium tuberculosis, Haemophilus influenzae o Streptococcus pneumoniae.

Un segundo aspecto de la presente invención, se refiere a un procedimiento para diagnosticar una patología causada por un microorganismo en base a la presencia o ausencia de dicho microorganismo en una muestra biológica de un sujeto, que comprende:

a. Toma de muestra biológica de un sujeto;

b. Preparar una mezcla de reacción que permita determinar la presencia o ausencia del microorganismo en la muestra biológica a través de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) realizada de forma cuantitativa en tiempo real;

c. llevar a cabo un tratamiento de la mezcla de reacción que se uti lizará para llevar a cabo la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) realizada de forma cuantitativa en tiempo real

con Uracil-ADN-Glicosilasa procedente del Bacalao del Atlántico (Gadus morhua) o con una variante de la misma; y

d. Determinar la presencia o ausencia del microorganismo en la muestra biológica, tras tratamiento de la mezcla de reacción según el apartado c), a través de la determinación de la presencia o ausencia de amplicones procedentes de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) realizada de forma cuantitativa en tiempo real;

donde dicha reacción en cadena de la polimerasa (PCR) emplea ADN, ADN complementario (ADNc) ó ADN de hebra simple obtenido por retrotranscripción de ácido ribonucleico (ARN), de la muestra biológica, al menos un par de cebadores específicos, dNTPs, un tampón de reacción adecuado, una AON polimerasa termoestable y una sonda marcada fluorescentemente, donde dicha sonda marcada fluorescentemente consiste en un oligonucleótido con una longitud de 8 a 9 nucleótidos marcado con un fluoroforo, preferiblemente 8 nucleótidos; y

En una realización preferida de este segundo aspecto de la invención, dicha reacción en cadena de la polimerasa (PCR) amplifica amplicones con una longitud entre 50 y 120 nucleótidos, más preferentemente amplicones que presenten una longitud entre 70 y 110 nucleótidos, más preferentemente amplicones que presenten una longitud entre 75 y 110 nucleótidos.

En otra realización preferida de este segundo aspecto de la invención, la sonda marcada fluorescentemente es una sonda Taqman.

En otra realización de este segundo aspecto, el sujeto es un humano.

En aún otra realización del segundo aspecto, el m icroorganismo es un microorganismo que provoca patología infecciosa (patógeno). Preferentemente, dicho microorganismo infeccioso se selecciona de la lista que consiste en Neisseria meningitidis, 5treptococcus agalactiae, Listeria monocytogenes, Virus de fa Varicela Zoster, Bordetelfa pertussis, Bordetelfa holmensii, el complejo Mycobacterium tuberculosis, Haemophifus influenzae o 5treptococcus pneumoniae.

En aún otra realización del segundo aspecto, el procedimiento de la invención se puede utilizar para diagnósticar enfermedades tales como la tosférina o la meningitis bacteriana.

Un tercer aspecto de la presente invención, se refiere a un kit adecuado para la determinación de la presencia o ausencia de un microorganismo de acuerdo con cualquiera de los aspectos precedentes, que comprende al menos los siguientes elementos:

a.: l a Uracil-ADN-Glicosilasa procedente del Bacalao del Atlántico (Gadus morhua) de SEQ

ID No 3 o una variante de la misma; y

b.: Sonda/s marcada/s fluorescentemente con una longitud de 8 a 9 nucleótidos,

preferiblemente de 8 nucleótidos.

En una realización preferida del tercer aspecto de la invención, el microorganismo a identificar y la sonda se seleccionan de cualquiera de la siguiente lista:

a.: Bordetella pertussis y la sonda marcada con un {Iuoró/oro de SEQ ID No 4;

b.: Bordetefla holmensii y la sonda marcada con un fluoróforo de SEQ ID No 5;

c.: Complejo Mycobacterium tuberculosis y la sonda marcada con un fluoróforo de SEQ ID No 6;

d.: Streptococcus pneumoniae y la sonda marcada con un fluoróforo de ID No 7;

e.: Neisseria meningitidis y la sonda marcada con un fluoróforo de ID No 8;

f.: Usteria manocytogenes y la sonda marcada con un fluorófaro de ID No 9; a

g.: Streptococcus agalactiae y la sonda marcada con un fluoróforo de ID No 10.

Un cuarto aspecto de la invención, se refiere a un kit adecuado para el diagnóstico de la tosferina, que comprende al menos los siguientes elementos:

a.: la Uracil-ADN-Glicosilasa procedente del Bacalao del Atlántico (Gadus morhua) de SEO ID No 3 o una variante de la misma; y

b.: las sondas marcadas con un fluoroforo de SEO ID No 4 y SEO ID No 5.

Un quinto aspecto de la presente invención, se refiere a un kit adecuado para el diagnóstico de la meningitis bacteriana, que comprende al menos los siguientes elementos:

b.: l as son das marcadas con un fluoroforo de SEO ID No 8, SEO ID No 9, SEO ID No 7 V SEO ID No 10.

En una realización preferida del tercer, cuarto V quinto aspecto de la invención, el kit además comprende al menos uno de los siguientes elementos: un par de cebadores específicos, dNTPs, un tampón de reacción adecuado vio una ADN polimerasa termoestable.

En otra realización preferida del tercer, cuarto y quinto aspecto de la invención, el kit además comprende un control positivo, preferiblemente ~~globina.

Descripción detallada de la invención

Definiciones

En el contexto de la presente invención se entiende por "PCR cuantitativa en tiempo real" una variante de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) utilizada para amplificar y simultáneamente cuantificar de forma absoluta el producto de la amplificación de ácido desoxirribonucleico (ADN). Para ello emplea, del mismo modo que la PCR convencional, un molde de ADN, al menos un par de cebadores específicos, dNTPs, un tampón de reacción adecuado, y una AON polimerasa termoestable; a dicha mezcla se le adiciona una sustancia marcada con un fluoróforo que, en un termociclador que albergue sensores para medir fluorescencia tras excitar el fluoróforo a la longitud de onda apropiada, permita medir la tasa de generación de uno o más productos específicos. Dicha medición, se realiza luego de cada ciclo de amplificación V es por esto que también se le denomina PCR en tiempo real (es decir, PCR inmediata, simultánea). En muchos casos el molde que se emplea para la PCR cuantitativa no es desde el principio ADN, sino que puede ser ADN complementario (ADNc), de heBra simple, obtenido por retrotranscripción de ácido ribonucleico (ARN); en este caso, la técnica es una RT-PCR cuantitativa o en tiempo real, o RT-QPCR.

En el contexto de la presente invención se entiende por "sonda/s" aquellos oligonucleótidos marcados fluorescentemente utilizados en la PCR cuantitativa para detectar la aparición del producto deseado. El fundamento de esta técnica se Basa en el empleo del FRET o transmisión de energía de resonancia, que es un mecanismo de transferencia de energía entre cromóforos. El FRET se fundamenta en que la excitación de un cromóforo puede transferirse a otro cercano, generalmente cuando ambos se sitúan en la misma molécula, mediante un mecanismo acoplador dipolo-dipolo. En el caso de que los cromóforos sean fluorescentes (esto es, fluorocromos), el mecanismo subyacente continúa siendo el mismo: la energía se transfiere, lo que desemboca en la aparición de fluorescencia.

En el contexto de la presente invención se entiende por "sonda/s Taqman" aquellas sondas empleadas en PCR a tiempo real que permiten medir la producción de productos de PCR mediante un sistema de sondas marcadas mediante dos fluorocromos. Su utilidad radica en que poseen un fluoróforo en su extremo 3' V una molécula en el 5' que Bloquea su emisión de fluorescencia (denominada en inglés «quencher»); esta sonda marcada híbrida específicamente en la parte central del producto de PCR a obtener. De este modo, cuando se efectúa la PCR (con la sonda más el par de ceBadores específicos), la sonda híbrida en el amplicon, pero, debido a la cercanía del fluoróforo al quencher, no se emite fluorescencia; cuando la polimerasa se topa con la sonda la hidroliza mediante su actividad exonucleasa 5'·3', lo cual provoca la separación del quencher del fluorocromo V, por tanto, la emisión de fluorescencia. Fluorescencia que está relacionada con la cantidad de amplicon producido.

En el contexto de la presente ínvención se entiende por "sonda corta" aquellos oligonucleótidos marcados fluorescentemente utilizados en la PCR cuantitativa para detectar la aparición del producto deseado que presenten una longitud de 8 o 9 nucleótidos, preferiblemente de 8 nucleótidos.

3D

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En el contexto de la presente invención se entiende por "amplican/es" un fragmento de ADN (ácido desoxirribonucleico) amplificado y detectado por PCR a tiempo real. También son conocidos como productos de peRo

En el contexto de la presente invención se entiende por "eficiencia de amplificación" la capacidad de la

reacción de duplicar el número de copias de las cadenas de ADN en cada ciclo. (Bustin,S.A. & Nolan,T. 2004. Analysis of mRNA Expression by Real-Time peRo In:Real-Time PCR; An Essential Guide. K.J.Edwards et al., editors.Horizon Bioscience.Wymondham, p. 125-184). Las eficiencias de la PCR en tiempo real se calculan a partir de las pendientes de la curva estándar (incluidas en el software) obtenidas después de realizar diluciones seriadas con las reacciones de la PCR en tiempo real (Pfaffl, 2004) de acuerdo a la siguiente fórmula: E::10[-1/slope]-1.

En el contexto de la presente invención se entiende por Cp (Punto de cruce/Umbral del Ciclo o "crossing point" en inglés) para cada muestra, el número de ciclos necesarios para interceptar el valor umbral (la señal alcanza un determinado nivel de fluorescencia) se llama "ciclo umbral" o "threshold cycle" (Ct). El Ct es inversamente proporcional al número de copias iniciales del ADN muestra.

En el contexto de la presente invención se entiende por UNG procedente de Thermotoga maritima MSB8, la Uracil-ADN-Glicosilasa con NCBI Reference Sequence: NP_228321.1, cuya secuencia aminoacídica es SEQ ID No 1:

MYTREELMEIVSERVKKCTACPLHLNRTNVVVGEGNLDTRIVFVGEGPGEEEDKTGRPFVGRAGMLLTELLRESGIRRED VYICNWKCRPPNNRTPTPEEQAACGHFLLAQIEIINPDVIVALGATALSFFVDGKKVSITKVRGNPIDWLGGKKVIPTFHP SYLLRNRSNELRRIVLEDIEKAKSFIKKEG

En el contexto de la presente invención se entiende por UNG procedente de la cepa K12 de la bacteria f.coli, la Uracil-ADN-Glicosilasa con la secuencia aminoacídica SEQ ID No 2:

MAN ELTWHDVLAE EKQQPYFLNTLQTVASERQSGVTIYPPQKDVFNAFRFTELGDVKVVILGQDPYHGPGQAHGLAFS VRPGIAI PPSLLN MYKELENTlPGFTRPNHGYLESWARQGVLLLNTVLTVRAGQAHSHASLGWETFTDKVISLI NQHREG VVFLLWGSHAQKKGAIIDKQRHHVLKAPHPSPLSAHRGFFGCNHFVLANQWLEQRGETPIDWMPVLPAESE

En el contexto de la presente invención se entiende por UNG procedente del Bacalao del Atlántico (Gadus morhua), la Uracil-ADN-Glicosilasa con la secuencia aminoacidica SEQ ID No 3:

MEFFGESWKKHLSGEFGKPYFIKLMGFVAEERKHYTVYPPPHQVFTWTQMCDIKDVKVVILGQDPYHGPNQAHGLCF SVQRPVPPPPSLVN IYKELSTDIEDFVHPGHGDLSGWAKQGVLLLNAVLTVRAHQANSHKERGWEQFTDAVVSWLNQ NSNGLVFLLWGSYAQKKGSAIDRKRHHVlQTAHPSPLSVYRGFFGCRHFSKTNELLQKSGKKPIDWKEL

Se hace notar que en el contexto de la presente invención se entiende por variantes de la UNG procedente del Bacalao del Atlántico (Gadus morhua) aquellas UNGs con una identidad de secuencia del

~o~el_o~~~o~el_o~~_o~ronla~ID~3.

Descripción de la invención Los inventores de la presente invención, analizaron 20 muestras clínicas humanas de distinto origen con el fin de analizar la presencia o ausencia del microorganismo Bordetella pertussis en dichas muestras.

Para ello se llevó a cabo el procedimiento detallado en el ejemplo 1 utilizando PCR en tiempo real con una eficiencia de amplificación de 2. los resultados se muestran en la tabla I abajo:

Tabla I

Número: Resultado PCR Ciclo positivo Control Servicio Tipo de Muestra

de: a tiempo real Bordetella Negativo Clínico

muestra: Bordetella pertussis (Agua

pertussis: estéril)

1: Posit ivo 18,07 Negativo l actantes Aspirado nasofaríngeo

2: Posit ivo 12,63 Negativo UCO pediátrica Aspirado traqueal

3: Negativo Negativo l actantes Aspirado Bronquial

4: Negativo Negativo l actantes Aspirado nasofaríngeo

5: Positivo 25,37 Negativo UCO pediátrica l avado Bronquial

6: Positivo 21,79 Negativo lactantes Aspirado nasofaríngeo

7: Positivo 21,86 Negativo UCO pediátrica Aspirado nasofaríngeo

8: Negativo Negativo l actantes Aspirado nasofaríngeo

9: Negativo Negativo l actantes Aspirado nasofaríngeo

10: Negativo Negativo Pediatría Aspirado nasofaríngeo

11: Positivo 23,35 39,37 Pediatría Aspirado nasofaríngeo

12: Negativo 35,73 39,37 Pediatría Aspirado nasofaríngeo

13: Negativo 38,82 39,37 Pediatría Aspirado nasofaríngeo

14: Positivo déBil 31,67/36,2 36,2jNegativ o Pediatría Aspirado nasofaríngeo

15: Negativo 30,12 32,11 lactantes Aspirado nasofaríngeo

16: Negativo Centro Cerceda Aspirado nasofaríngeo

17: Positivo 23,17 40 l actantes Aspirado Bronquial

18: Positivo 23,98 37,38 Pediatría Aspirado Bronquial

19: Negativo 31 31 l actantes Aspirado nasofaríngeo

20: Positivo 19 33 uel pediátrica Aspirado nasofaríngeo

Se hace notar que el resultado se entiende positivo si la amplificación presenta un Cp (Punto de

cruce/Umbral del Ciclo o "crossing point" en inglés) inferior a 35. El resultado es dudoso si la

amplificación presenta un Cp ente el ciclo 35 y 40 Y el resultado es negativo si existe amplificación en un

10 ciclo posterior a 40.

Los resultados de la tabla I muestran como a partir de la muestra numero 11, el control negativo (agua

estéril utilizada en la mezcla de PCR a tiempo real) deja de ser negativo lo cual afecta claramente la

fiabilidad del diagnóstico ya que se trata claramente de muestras contaminadas con amplicones

pequeños. Es más, muestras negativas tal y como las muestras 15 y 19 resultan ser claramente falsos positivos.

Estos resultados demuestran lo ya comentado con anterioridad, es decir, que en el diagnóstico clínico o etiológico, la causa más frecuente de fa lsos positivos es la contaminación, cuya fuente más común son las amplificaciones resultantes de las PCR realizadas previamente en el laboratorio. Este problema se ve exacerbado en el diagnóstico clínico utilizando sondas cortas y amplicones de pequeño tamaño lo que

reduce significativamente la fiabilidad de este tipo de diagnóstico llegando a la conclusión que la

utilización de sondas cortas en este tipo de diagnóstico clínico presenta una fiabilidad reducida.

Con el propósito de eliminar esta problemática e incrementar la fiabilidad del diagnóstico clínico los inventores estudiaron la posibilidad de realizar una descontaminación previa a la amplificación de posibles amplicones presentes en la muestra, para ello, utilizaron UNGs.

la Uracil-ADN-Glicosilasa (UNG) es una enzima reparadora del DNA que se encuentra en una amplia variedad de especies. Existen UNGs humanas (lanes 0, leiros " Smalas AO, Willassen NP. Identification, cloning, and express ion of uracil-DNA glycosylase from Atlantic cod (Gadus morhua): characterization and homology modeling of the cold-active catalytic domain. Extremophiles. 2002 FeB;6(1):73-86.], animales y bacterianas. Entre las bacterianas destacamos además de la procedente del f.coli utilizada para esta invención, las UNGs de B.subtifis, M.futeus y 8. stearothermophilus. la función normal de esta enzima es eliminar los residuos de uracilo (desoxiuracilo). En 1990, se publicó un método que utilizaba la UNG para inactivar los productos de amplificación por peRo Durante la amplificación, los TIPs son sustituidos por dUTPs que sirven como substrato para la Taq polimerasa en lugar de los TTPs, por lo que los productos de amplificación contienen residuos de desoxiuracilo; esto sirve para distinguir químicamente los productos de PCR del template original, ya que sólo los productos sintetizados contendrán desoxiuracilo. Si en la mezcla de reacción existen productos de PCR con dUTP como contaminantes, la adición de UNG a la mezcla provocará la eliminación de los mismos del DNA y el producto de reacción es entonces susceptible de hidrólisis alcalina a elevadas temperaturas.

la UNG se añade a la mezcla de reacción antes de la amplificación; durante una corta incubación previa a la amplificación, los productos de PCR inespecíficos con dUTP que puedan haberse formado son rotos por la UNG, inactivándolos como templates, por lo que en los ciclos iniciales de PCR, la síntesis de DNA ocurre exclusivamente sobre el template original que se encuentra a salvo de la acción de la UNG.

los descubridores de la presente invención procedieron a analizar el efecto de una de las muchas variedades de UNG conocidas, en concreto la Uracil-ADN-Glicosilasa procedente del Gadus morhua, sobre muestras clínicas tal y como se muestra en el ejemplo 2. Dicha Uracil-DNA--Glicosilasa procedente del Bacalao del Atlántico (Gadus morhua) fue capaz de producir una descontaminación total de la muestra. Se hace notar que, en este caso, los contaminantes estaban constituidos por amplicones con un tamaño superior a 120 nucleótidos, concretamente 127 nucleótidos. Así, destacar que en este caso la eficiencia de amplificación de la PCR a tiempo real para este tamaño de amplicon y por tanto la sensibilidad para la detección del mismo en la muestra clínica disminuye.

Debido a esta disminución en la sensibilidad ya que las sondas cortas empleadas en la presente invención exigen de un tamaño de amplicon entre 50 y 120 nUcleótidos, más preferiblemente entre 70 y

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110 nucleótidos, para conseguir una eficiencia de amplificación de 2, se modificaron las condiciones de reacción. De esta forma, se procedieron a analizar 5 muestras clínicas humanas de distinto origen, contaminadas con amplicones de diferentes tamaños procedentes de PCR a tiempo real de ONA de diferentes microorganismos que producen diversas patologías infecciosas. Estos eran N. meningitidis (amplicon de 65 nucleótidos), 5. agalactiae (amplicon de 67 nucleótidos), Listeria monocytogenes

(amplicon de 76 nucleótidos), Virus de la Varicela Zoster-WZ (85 nucleótidos) y Bordetelfa pertussis (106

nucleótidos). Para ello se llevó a cabo el procedimiento detallado en el ejemplo 3 utilizando PCR en tiempo real con una eficiencia de amplificación de 2, con y sin un pre-tratamiento previo con 1U UracilADN-Glicosilasa procedente del Bacalao del Atlántico (Gadus morhua). Los resultados se muestran en la tabla II abajo.

Tabla 11

Tamaño del ampUcon (nucJeótidos): Patógeno (gen) Amplificación de contaminantes 1/10.000 Amplificación de contaminantes UNG Gadus morhua 1U

65: N. meningitidis (sod) 5 26,27

67: S. agafactiae (sip) 8,25 28,74

76: Listeria manocytogenes (hfy) 8,03 Negativo

85: WZ (glicoproteina G) 5 Aprox. 35

106: Bordeteffa pertussis (ptxA) 12,15 Negativo

A la luz de los resultados mostrados, se puede llegar a la conclusión que la Uracil-AON-Glicosilasa procedente del Bacalao del Atlántico es altamente eficaz en la descontaminación de amplicones pequeños, especialmente en aquellos que presenten un tamaño entre 70 y 110 nucleótidos. Teniendo en cuenta, como ya hemos comentado anteriormente, que la utilización de la técnica de la PCR en tiempo real con sondas constituidas por oligonucleótidos con una longitud entre 8 y 9 nucleótidos exige de la utilización de amplicones de tamaño entre 60 y 120 nucleótidos, donde además aproximadamente un 90% de dichos amplicones presentan un tamaño entre 70 y 110 nucleótidos, se confirma que la utilización de la Uracil-ADN-Glicosilasa procedente del Bacalao del Atlántico como herramienta de descontaminación previa al diagnóstico clinico o etiológico utilizando la técnica de la PCR en tiempo real con sondas cortas resulta imprescindible.

Con el objeto de comprobar si se producía el mismo efecto descontaminante con otras variedades de UNGs, los investigadores de la presente invención procedieron a analizar el efecto de la UNG procedente de Thermotoga maritima MSB8 sobre una muestra clínica, tal y como se detalla en el ejemplo 2. Dicha UNG fue capaz de producir una descontaminación total de la muestra. Tal y como sucedía en el caso previo, se hace notar que los contaminantes estaban constituidos por amplicones con un tamaño superior a 120 nucleótidos, concretamente los amplicones presentaban una longitud de 127 nucleótidos.

Por esta razón y debido a que las sondas cortas empleadas en la presente invención exigen de un tamaño de amplicon entre 60 y 120 nucleótidos para conseguir una eficiencia de amplificación de 2, más preferiblemente entre 70 y 110 nucleótidos, se modificaron las condiciones de reacción. De esta forma, como en el experimento anterior, se procedieron a analizar 5 muestras clínicas humanas de distinto origen para analizar la presencia o ausencia de cinco tipos distintos de microorganismos infecciosos. Estos eran N. meningitidis, S. agalactiae, Usteria monocytogenes, Virus de Varicela laster y Bordetella pertussis. Para ello se llevó a cabo el procedimiento detallado en el ejemplo 3 utilizando PCR en tiempo real con una eficiencia de amplificación de 2 con y sin una descontaminación previa con la UNG procedente de Thermotoga maritima MSB8. los resultados se muestran en la tabla 111.

Tabla 111

Tamaño del amplicon (nucleótidos): Patógeno (gen) Amplificación de contaminantes 1/10.000 Amplificación de contaminantes UNG MSB81U

65: N. meningitidis (sod) 8,94 25,18

67: 5. agalactiae (sip) 8,03 30,36

76: Listeria monocytogenes (hly) 8,86 33,14

85: WZ (glicoproteina G) <5 (sin diluir) 18,01

106: Bordetella pertussiss (ptxA) 12,70 32,92

Sorprendentemente la utilización de la UNG procedente de Thermotogo moritima MSB8 no eliminaba de forma suficiente los contaminantes cuando éstos estaban constituidos por amplicones de un tamaño que 10 oscilaba entre 60 y 120 nucleótidos. De hecho, todos los valores mencionados en dicha tabla son interpretables como falsos positivos.

A la vista de los anteriores resultados, los investigadores de la presente invención repitieron los anteriores experimentos con otra UNG procedente de la cepa K12 de la Bacteria E.coli 1U. En este sentido, los investigadores procedieron a analizar el efecto de la UNG procedente de la Bacteria f.coli

15 1U sobre una muestra clínica tal y como se muestra en el ejemplo 2. Dicha UNG fue capaz de producir una descontaminación total de la muestra. Se hace notar que, como en los anteriores casos, los contaminantes estaban constituidos por amplicones con un tamaño superior a 120 nucleótidos, concretamente los amplicones presentaban una longitud de 127 nucleótidos.

Tal y como sucedió en el resto de los casos, debido a la necesidad de reducir el tamaño del amplicon se

20 procedieron a analizar 5 muestras clínicas humanas de distinto origen para analizar la presencia o ausencia de cinco tipos distintos de microorganismos infecciosos. Estos eran N. meningitidis, S. agalactiae, Usteria monocytogenes, Virus de la Varicela Zoster y Bordeteffa pertussis. Para ello se llevó a cabo el procedimiento detallado en el ejemplo 3 utilizando PCR en tiempo real con una eficiencia de amplificación superior a 2 con y sin una descontaminación previa de amplicones con un tamaño que

25 oscila entre 60 y 110 nucleótidos con la UNG procedente de la bacteria f.coli 1U. Los resultados se muestran en la tabla IV.

Tabla IV

Tamaño del ampUcon: Patógeno (gen) Amplificación de contaminantes 1/10.000 Amplificación de contaminantes UNG E.coli lU

65: N. meningitidis (sod) 5 24,71

67: 5. agalactiae (sip) 8,25 25,59

76: Listeria monocytogenes (hly) 8,03 Negativo

85: VVZ (glicoproteina G) 5 30,12

106: Bordetella pertussiss (ptxA) 12,15 29,38

De nuevo, sorprendentemente la utilización de la UNG procedente de la bacteria f.cofi lU no eliminaba de forma suficiente los contaminantes cuando éstos estaban constituidos por amplicones de un tamaño 5 que oscilaba entre 60 y 120 nucleótidos. De hecho, todos los valores facilitados, a excepción de uno, son interpretables como falsos positivos.

Así, si comparamos los resultados producidos entre la Uracil-AON-Glicosilasa procedente de la bacteria f.coli y la UNG procedente del Bacalao del Atlántico (Gadus morhua) podemos comprobar como la UNG procedente del Bacalao del Atlántico (Gadus morhua) produce un nivel de descontaminación 10 significativamente mas elevado, tal y como se ilustra en el tabla V abajo.

Tabla V

Tamaño del amphcon (nucleotldos): Patógeno (gen) AmplificaCión de contaminantes 1/10.000 Amplificación de contaminantes UNG Gadus morhua 1 U AmplificaCión de contaminantes UNG E.co1i1U Diferencias de ciclos

65: N.meningitidis(sod) 5 26.27 24.71 1.56

67: S.agalactiae(sip) 8.25 28.74 25.59 3.15

76: Listeria m onocytogenes(hly} 8.03 Ne. Ne. -

8S: VVZ(g fycoprotein G) S Aprox.35 30.12 4.88

106: Bordetella pertussis(ptxA) 12.15 Ne. 29.38 15.62

Además con el objeto de verificar que la UNG procedente del Bacalao del Atlántico (Gadus morhua) produce un nivel de descontaminación muy significativo de aquellos amplicones procedentes de

15 reacciones previas de PCR que presenten un tamaño entre 60 y 120 nucleótidos, mas preferentemente entre 70 y 110 nucleót idos, se ampliaron el número de experimentos utilizando un mayor numero de amplicones, sondas cortas y muestras estudiadas. En este sentido, ver tabla VI abajo.

Tabla VI

De nuevo sorprendentemente, se volvió a concluir que el nivel de descontaminación era suficientemente significativo para que no se produjesen falsos positivos en el rango de amplicones entre 70 y 110

nucleótidos .

De esta forma, se concluye que la utilización de la UNG procedente del Bacalao del Atlántico (Gadus

25 morhua) previamente al diagnóstico clínico o etiológico utilizando la técnica de la PCR en tiempo real con sondas cortas, resuelve el problema de la baja fiabilidad de ésta. Esto es así porque esta UNG es la única enzima capaz de eliminar suficientemente aquellos amplicones procedentes de reacciones previas de PCR que presenten un tamaño entre 60 y 120 nucleótidos, mas preferentemente entre 70 y 110 nucleótidos, aún más preferentemente entre 75 y 110 nucleótidos.

Tamaño Patógeno (gen) del amplicon

Cebadores(S' -3') Sonda corta

D-CCTTTGGTTCTAAAATGACTATGTGA

TTCCTCTG

R-GCTTGTTGACTAATCAAACTATAGCAG

D-GGACTCATCGATGTTCTTCCA

GACGGCGA R-GCCGACACATTTCCTTGG

0-TGGTTTCCACATCCATGAAA

CTGTGAGC R-CGCCTAAACCAGCTGTCAA 0-TCTGCATTCAAT AAAGAAAA TTCAA

ACCACCAG R-TTGGCGTCTTAGGACTTGC D-ACGCAACTGACGAGTGTGAC

CTGGGACT R-AATCGGTATTCTGACTTGACTTGA D-AATATGGCAGCAAATAACATTTCA

TGGCAACA R-TCCAAGT A TTAGCAGGTCCATAAA

ES 2 449 665 A2

Por lo tanto, la presente invención resuelve las limitaciones existentes a la hora de trabajar con la técnica de la PCR a tiempo real con sondas cortas y amplicones de pequeño tamaño en el campo del diagnóstico clínico. Para ello, en un primer aspect o de la presente invención proponemos un procedimiento, útil para su uso en un laboratorio de Microbiología clínica, que permite la determinación de la presencia o ausencia de un microorganismo en una muestra biológica de un sujeto con un alto grado de fiabilidad utilizando la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) realizada de forma cuantitativa en tiempo real. Dicho procedimiento comprende los siguientes pasos:

a.: llevar a cabo un tratamiento de la mezcla de reacción que se utilizará para llevar a cabo la

reacción en cadena de la polimerasa (PCR) realizada de forma cuantitativa en tiempo real

con Uradl-ADN-Glicosilasa procedente del Bacalao del Atlántico (Gadus morhua) de SEQ ID

No 3 o con una variante de la misma; y

b.: Determinar la presencia o ausencia del microorganismo en la muestra biológica, tras

tratamiento de la mezcla de reacción según el apartado a), a través de la determinación de la

presencia o ausencia de amplicones procedentes de la reacción en cadena de la polimerasa

(PCR) realizada de forma cuantitativa en t iempo real;

donde dicha reacción en cadena de la polimerasa (PCR) emplea ADN, ADN complementario (ADNc) ó ADN de hebra simple obtenido por retrotranscripción de ácido ribonucleico (ARN) de la muestra biológica, al menos un par de cebadores específicos, dNTPs, un tampón de reacción adecuado, una ADN polimerasa termoestable y una sonda marcada fluorescentemente, donde dicha sonda marcada fluorescentemente consiste en un oligonucleótido con una longitud de 8 a 9 nucleótidos marcado con un fluoroforo, preferiblemente de 8 nucleótidos.

En una realización preferida de este primer aspecto de la invención, dicha reacción en cadena de la polimerasa (PCR) amplifica amplicones con una longitud entre 60 y 120 nucleótidos, más preferentemente amplicones que presenten una longitud entre 70 y 110 nucleótidos, más preferentemente amplicones que presenten una longitud entre 75 y 110 nucleótidos.

En el contexto de la presente invención, ejemplos ilustrativos del término "muestra Biológica" incluyen, pero no se limitan a, diferentes tipos de muestras de tejidos, así como de fluidos biológicos, tales como sangre, suero, plasma, líquido cefalorraquídeo, líquido peritoneal, muestras respiratorias (Lavado bronquioalveolar, Aspirado nasofaríngeo) y heces.

En el contexto de la presente invención, el término "microorganismo" representa cualquier ser vivo que solo puede visualizarse con el microscopio y que sea susceptible de determinarse su ausencia o presencia en una muestra biológica a través de la utilización de la técnica de la PCR cuantitativa o en tiempo real. En su mayoría son unicelulares, aunque en algunos casos se trate de organismos cenóticos compuestos por células multinucleadas, o incluso multicelulares.

En el contexto de la presente invención, el término "fluoróforo" son moléculas que tienen la propiedad de emitir fluorescencia. Al ser iluminadas por una radiación luminosa de una determinada longitud de onda, son excitadas y liberan energía a través de la emisión de luz de una longitud de onda mayor..

En el contexto de la presente invención, el término sujeto se refiere preferiblemente a un sujeto humano.

En el contexto de la presente invención, el término "Tratamiento de la mezcla de reacción" es la incubación de las Uracil-ADN-glicosllasas (UNGs) con el ADN total o el AON complementario (ADNc) ó el ADN de hebra simple obtenido por retrotranscripción de ácido ribonucleico (ARN) de la muestra biológica y los reactivos que constituyen la reacción. En dicha incubación se produce la activación de dichas enzimas.

Es importante matizar que el procedimiento descrito en el primer aspecto de la presente invención no está especialmente limitado y su implementación será evidente para el experto en la materia. La selección del rango de tamaño de los amplicones se puede realizar siguiendo indicaciones del software Primer3 (http://primer3.sourceforge.netf) utilizando los ajustes optimizados para una adecuada eficiencia de amplificación, presentando la temperatura de fusión de ambos cebadores ajustada a 59-61

o C y la longitud del cebador fijada en 18-27 nucleótidos.

En una realización preferida de la invención, la sonda marcada fluorescentemente es una sonda Taqman.

En aún otra realización de la presente invención, el microorganismo es un patógeno. Preferentemente, dicho microorganismo infeccioso se selecciona de la lista que consiste en Neisseria meningitidis, 5treptococcus ogo/octioe, Listerio monocytogenes, Virus de la Varicela Zoster, Bordetello pertussis, Bordetefla holmensii, el complejo Mycobacterium tuberculosis, Haemophilus influenzoe o 5treptococcus pneumoniae.

a.: Toma de una muestra biológica de un sujeto;

b.: Preparar una mezcla de reacción que permita determinar la presencia o ausencia del microorganismo en la muestra biológica a través de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) realizada de forma cuantitativa en tiempo real;

c.: llevar a cabo un tratamiento de la mezcla de reacción que se utilizará para llevar a cabo la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) realizada de forma cuantitativa en tiempo real con Uracil-AON-Glicosilasa procedente del Bacalao del Atlántico (Gadus morhua) de SEQ ID No 3 o con una variante de la misma; y

d.: Determinar la presencia o ausencia del microorganismo en la muestra biológica, tras tratamiento de la mezcla de reacción según el apartado e), a través de la determinación de la presencia o ausencia de amplicones procedentes de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) realizada de forma cuantitativa en tiempo real;

donde dicha reacción en cadena de la polimerasa (PCR) emplea AON, AON complementario (AONc) ó AON de hebra simple obtenido por retrotranscripción de ácido ribonucleico (ARN), de la muestra Biológica, al menos un par de cebadores específicos, dNTPs, un tampón de reacción adecuado, una AON polimerasa termoestable y una sonda marcada fluorescentemente, donde dicha sonda marcada fluorescentemente consiste en un oligonucleótido con una longitud de 8 a 9 nucleótidos marcado con un fluoroforo, preferiblemente 8 nucleótidos.

En una realización preferida de este segundo aspecto de la invención, dicha reacción en cadena de la

polimerasa (PCR) amplifica amplicones con una longitud entre 60 y 120 nucleótidos, más 5 preferentemente amplicones que presenten una longitud entre 70 y 110 nucleótidos, más preferentemente amplicones que presenten una longitud entre 75 y 110 nucleótidos.

La presencia o ausencia del microorganismo en la muestra biológica facultará a la persona encargada de

realizar el diagnóstico de la enfermedad con la posibi lidad de realizar dicho diagnóstico.

En una realización preferida de este segundo aspecto de la invención, la sonda marcada 10 fluorescentemente es una sonda Taqman.

En otra realización de este segundo aspecto, el sujeto es un humano.

En aún otra realización de este segundo aspecto, el microorganismo es aquel tanto responsable de patología infecciosa (patógeno), como saprofita (forma parte de la flora normal. Preferentemente, dicho microorganismo infeccioso se selecciona de la lista que consiste en Neisseria meningitidis, Streptococcus

15 agalactiae, Listeria monocytogenes, Virus de la Varicela Zoster, Bordetelfa pertussis, Bordetelfa holmensíí, el complejo Mycobacterium tuberculosis, Haemophifus in/fuenzae o Streptococcus pneumoniae.

Un tercer aspecto de la presente invención, se refiere a un kit adecuado para la determinación de la presencia o ausencia de un microorganismo de acuerdo con cualquiera de los aspectos precedent es, que 20 comprende al menos los siguientes elementos:

a.: la Uracil-ADN-Glicositasa procedente del Bacalao del Atlántico (Gadus morhua) de sEQ ID No 3 o una variante de la misma; y

b.: sonda/s marcada/s fluorescentemente con una longitud de 8 a 9 nucleótidos, preferiblemente de 8 nucleótidos.

25 En una realización preferida del tercer aspecto de la invención, el microorganismo a identificar y la sonda se seleccionan de cualquiera de la siguiente lista:

a. Bordetelfa pertussis y la sonda marcada con un fluor%ro de SEQ ID No 4. La SEQ ID No 4 se corresponde con la siguiente secuencia CGGGGTTC;

b. Bordetefla holmensii y la sonda marcada con un /fuaroforo de sEQ ID No s. la sEQ ID No 30 5 se corresponde con la siguiente secuencia GGCCCTGG

c.: Complejo Mycobacterium tuberculosis y fa sonda marcada con un fluor%ro de SEQ ID No 6. La SEQ ID No 6 se corresponde con fa siguiente secuencia GACGGCGA

d.: Streptococcus pneumoniae y fa sonda marcada con un fluor%ro de ID No 7. La SEQ ID No 7 se corresponde con la siguiente secuencia CTGGGACT

e. Neisseria meningitidis y fa sonda marcada con un fluoroforo de ID No 8. La SEQ ID No 8 se corresponde con la siguiente secuencia CTGTGAGC

f. Listeria monocytogenes y la sonda marcada con un fluoroforo de ID No 9. La SEQ ID No 9 se corresponde con fa siguiente secuencia ACCACCAG; o

5 g. Streptococcus aga/aetiae y la sonda marcada con un /fuar%ro de ID No 10. La SEQ ID No 10 se corresponde con fa siguiente secuencia TGGCAACA

Un cuarto aspecto de la invención, se refiere a un kit adecuado para el diagnóstico de la tosferi na, que comprende al menos los siguientes elementos:

a. la Uracil~ADN-Glicosi1asa procedente del Bacalao del Atlántico (Gadus morhua) de SEQ 10 ID No 3 o una variante de la misma; y

b. l as sondas marcadas con un /luoroloro de SEQ ID No 4 y SEQ ID No 5.

a. l a Uracil-ADN-Glicosilasa procedente del Bacalao del Atlántico (Gadus morhua) de SEQ 15 ID No 3 o una variante de la misma; y

b. l as sondas marcadas con un fluoroforo de SEO ID No 8, SEO ID No 9, SEO ID No 7 y SEO ID No 10.

En una realización preferida del tercer, cuarto y quinto aspecto de la invención, el kit además comprende al menos uno de los siguientes elementos: un par de cebadores específicos, dNTPs, un tampón de

20 reacción adecuado y/o una ADN polimerasa termoestable.

En otra realización preferida del tercer, cuarto y quinto aspecto de la invención, el kit además comprende un control positivo, preferiblemente B-globina.

El uso del kit no está particularmente limitado, aunque se prefiere el uso en el procedimiento de la invención en cualquiera de sus realizaciones.

25 l os siguientes ejemplos sirven para ilustrar la presente invención; no se pretende de ninguna forma que estos ejemplos limiten el alcance de la invención.

EJEMPLOS

Ejemplo 1: Análisis clínico de 20 muestras humanas de distinto origen para analizar la presencia o ausencia del microorganismo Bordeteffa pertussis utilizando la técnica de PCR en tiempo real utilizando

30 sondas marcadas fluorescentemente constituidas por oligonucleótidos de un tamaño entre 8 y 9 nucleótidos.

,.

ES 2 449 665 A2

Para llevar a cabo este ejemplo diseñamos una sonda corta marcada con fluorocromo cuya secuencia nuc1eótica fue (6FAM-GGCAGCAG-BBQ) y cebadores (Di recto S'-GACCATCTGACCGGACGTI-3' y Reverso S"-GCTGGTGGAGACGAAAGC-3') para la amplificación y detección de un amplicon de 63 nucleótidos del gen ptxA del microorganismo Bordeteffa pertu5sis en muestras respiratorias. (Njamkepo E, Bonacorsi S, Debruyne M, Gibaud SA, Guillot S, Guiso N. Significant finding cf Bordetefla ha/mesH ONA in

nasopharyngeal samples from French patients with suspected pertussis. J (Iin Microbio !. 2011

Dec;49(12):4347-8. EpuB 2011 Dct 19). Como control de extracción de DNA y amplificación utilizamos el

gen B-gfobina. (Fenollar F. Raoult D. Molecular technigues in Whipple's disease. Expert Rev Mol Diagn

2001; 1:299-309). Como control negativo, el agua estéril utilizada en la mezcla de la PCR a tiempo real. La PCR a tiempo real fué llevada a cabo a partir del lightCycler480 Probes Master kit (Rache). la mezcla que constituye la reacción de PCR (20 ~I de volumen total por reacción) está constituida por los siguientes componentes (Volumen/concentraciones): Master Probe x2 (5 J-II/ Fast Start Polymerase,

reaction Buffer, dNTPs y 6.4 mM MgCI2), cebador directo (0,75 J-II del stock inicial a 20 J-IM), cebador reverso (0,75 J-II del stock inicial a 20 J-IM), sonda corta (0,5 J-Il de un stock inicial de 10 J-Imol/l ), DNA de la muestra (5 J-II) yagua estéril (3 ~I) . Realizamos PCR a t iempo real sin t ratam iento previo con UNGs. El protocolo de PCR a tiempo real se rea lizó en un aparato de LightCycler480 11 y estuvo constituido por los siguientes pasos: 1) Activación de la enzima Fast Start (950 durante 10 minI. 2) Amplificación del fragmento (950 durante 10 segundos, 600 durante 20sgundos, 7r durante 1 segundo) y 3) Enfriamiento (40· durante 10m in). Los resultados (Cp) fueron analizados a partir del software del l ightCycler480 11

teniendo en cuenta una eficiencia de amplificación de 2 (en inglés "Second Derivative Maximum method").

Ejemplo 2: Descontaminación de muestras clínicas utilizando distintas UNGs. (amplicones de 127 nucleótidos)

Diseñamos sonda corta (6FAM-TCCAGCAG-BBQ) y cebadores (Directo 5' -CATCAAGGGAATGGAGTIGG-3' y Reverso 5'-TAGCGGGTCCTGCTICTC-3') para la amplificación y detección de un amplicon de 127 nucleótidos del gen devR del microorganismo Mycobocterium tuberculosis en muestras respiratorias (Dasgupta N, Kapur V, Singh KK, Das TK, Sachdeva S, Jyothisri K, Tyagi JS.Characterization of a twocomponent system, devR-devS, of Mycobacterium tuberculosis. Tuber l ung Dis. 2000;80(3):141-59) .Tras llevar a cabo la PCR a t iempo real siguiendo el protocolo comentado en el ejemplo 1, el producto de PCR obtenido (amplicones) fue utilizado para contaminar muestras en una dilución 1/10.000. A partir de estas muestras contaminadas se volvió a realizar PCR a tiempo real siguiendo el siguiente protocolo: 1) Activación de UNGs: 500 durante 10 min 2) Activación de la enzima Fast Start (950 durante 10 minI. 3)

Amplificación del fragmento (950 durante l Osegundos, 60· durante 20sgundos, 72D durante 1 segundo) y 4) Enfriamiento (40010min). Sorprendentemente, se obtuvieron excellentes resultados con la Uracil

ADN-Glicosilasa procedente del Bacalao del Atlántico (Gadus morhua).utilizando un programa a 50° 10 min en el Lightcycler480 11. Los resultados (Cp)fueron analizados a partir del software del LightCycler480 5 11 teniendo en cuenta una eficiencia de amplificación de 2 (en inglés "Second Derivative Maximum

method").

Ejemplo 3: Descontaminación de m uestras clínicas utilizando distintas UNGs. (amplicones 60 a 110 nucleótidos)

Diseñamos sondas cortas y cebadores para la detección de N.meningitidis, S.agalactiae,

10 L.monocytogenes, Virus de la Varicela Zoster y Bordetella pertussis (ver Tabla VII abajo). Tras llevar a cabo la PCR a t iempo real siguiendo el protocolo comentado en el ejemplo 1, el prod ucto de PCR obtenido (amplicones de 65nt, 67nt, 76 nt, 85 nt y 106 nt ) fueron utilizados para contaminar muestras en una dilución 1/10.000. A partir de estas muestras contaminadas se volvió a realizar PCR a tiempo real siguiendo el siguiente protocolo del ejemplo 2 (protocolo de PCR a tiempo real añadiendo

15 una incubación de 50G durante 10 min con las diferentes UNGs). l os resultados fueron analizados con el software del Lightcycler 48011, como en los ejemplos 1 y 2. Tabla VII

Tamaño del amplicon: Patogeno (gen) Cebadores(S -3 ) Sonda corta

65 nt: N. meningitidis(sod) D-GTAAATIGACAGCTGGTTIAGGC R-ACCATGITGTITIGCACCTTI CACTGGGA

67 nt: 5.agalactiae(sip) 0-TGCATCACCAGAGCATGTATC R-CTGTCTGTAGCTGITGAAGTCGT TCCAGCAG

76 nt: Listeria monocytogenes(hly) D-TCTGCATICAATAAAGAAAATICAA R-ITGGCGTCITAGGACITGC ACCACCAG

85 nt: VVZ(glycoprotein G) 0-TGITAATGAAATGITGGCACGT A R-TGGAAA T AGTCCGCTCCAAA TCCTCGTC

106 nt: Bordetella pertussis(ptxA) D-GGTCCATATACGGTCTCTATGACG R-CAGAAAGTITCGCGATAAATGA CGGGGTIC

Un experto en la materia apreciará fácilmente que la presente invención está bien adaptada para llevar a cabo los. objetivos y obtener los fines y ventajas mencionados, así como los inherentes a la misma. l os ejemplos proporcionados en el presente documento son representativos de realizaciones preferidas, son

5 ilustrativos, y no se pretende que sean limitaciones del alcance de la invención.

Será fácilmente evidente para un experto en la materia que se pueden hacer diferentes

sustituciones y modificaciones de la invención descrita en el presente documento sin salirse del alcance y

espíritu de la invención.

Todas las publicaciones mencionadas en la memoria descriptiva son representativas de los 10 niveles de los expertos en la materia a la que pertenece la invención.

la invención descrita de forma ilustrativa en el presente documento se puede llevar a la práctica de forma adecuada en ausencia de cualquier elemento o elementos, limitación o limitaciones que no se describen especifica mente en el presente documento. Por 10 tanto, por ejemplo, en cada caso en el presente documento, cualquiera de los términos "comprende", "consiste esencialmente en" y "consiste

15 en" se puede sustituir por cualquiera de los otros dos términos. Los términos y expresiones que se han usado se usan como términos de descripción y no de limitación, y no se pretende que el uso de dichos términos y expresiones excluya cualquiera de los equivalentes de las características mostradas y descritas o partes de las mismas, pero se reconoce que son posibles diferentes modificaciones dentro del alcance de la invención reivindicada. Por lo tanto, debe entenderse que aunque la presente invención se

20 ha descrito específicamente por las realizaciones preferidas y características opcionales, los expertos en la materia pueden recurrir a la modificación y variación de los conceptos descritos en el presente documento, y dichas modificaciones y variaciones están dentro del alcance de esta invención como se define en las reivindicaciones adjuntas.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Procedimiento para la determinación de la presencia o ausencia de un microorganismo en una muestra biológica de un sujeto a través de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) realizada de forma cuantitativa en tiempo real, que comprende:

5 a. llevar a cabo un tratamiento de la mezcla de reacción que se utilizará para llevar a cabo

la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) realizada de forma cuantitativa en tiempo

real con la Uraci1+ADN-Glicosilasa procedente del Bacalao del Atlántico (Gadus morhua)

de SEQ ID No 3; y

b. Determinar la presencia o ausencia del microorganismo en la muestra biológica, tras el

10 tratamiento de la mezcla de reacción según el apartado al, a través de la determinación de la presencia o ausencia de amplicones procedentes de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) realizada de forma cuantitativa en tiempo real;

donde dicha reacción en cadena de la polimerasa (PCR) emplea ADN, ADN complementario (ADNc) ó ADN de hebra simple obtenido por retrotranscripción de ácido ribonucleico (ARN), de la muestra

15 biológica, al menos un par de cebadores específicos, dNTPs, un tampón de reacción adecuado, una ADN polimerasa termoestable y una sonda marcada fluorescentemente, donde dicha sonda marcada fluorescentemente consiste en un oligonucleótido con una longitud de 8 a 9 nucleótidos marcado con un fluoroforo.
2. El procedimiento de la reivindicación 1, donde la sonda marcada fluorescentemente consiste en 20 un oligonudeótido con una longitud de 8 nucleótidos.
3.

El procedimiento de la reivindicación 1 ó 2, donde dicha reacción en cadena de la polimerasa (PCR) amplifica amplicones con una longitud entre 60 y 120 nucleótidos.
4.

El procedimiento de la reivindicación 1 ó 2, donde dicha reacción en cadena de la polimerasa (PCR) amplifica amplicones con una longitud entre 70 y 110 nucleótidos.

25 5. El procedimiento segun cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde la sonda marcada fluorescentemente es una sonda Taqman.
6. El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde el sujeto es un humano.
7. El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde el microorganismo 30 es un patógeno.
8. El procedimiento según la reivindicación 7, donde el patógeno se selecciona de la lista que consiste en Neisseria meningitidis, Streptococcus agalactiae, Listeria monocytogenes, Virus de la Varicela Zoster, Bordeteffa pertussis, Bordetella holmensii, el complejo Mycobacterium

tuberculosis, Haemophilus influenzae o Streptococcus pneumoniae.
9. Procedimiento para diagnosticar una patología causada por un microorganismo en base a la presencia o ausencia de dicho microorganismo en una muestra biológica de un sujeto, que comprende:

a. Toma de muestra biológica de un sujeto;

5 b. Preparar una mezcla de reacción que permita determinar la presencia o ausencia del

microorganismo en la muestra biológica a través de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) realizada de forma cuantitativa en tiempo real;

c. Llevar a cabo un tratamiento de la mezcla de reacción que se utilizará para llevar a cabo la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) realizada de forma cuantitativa en tiempo

10 real con la Uracil~ADN-Glicosilasa procedente del Bacalao del Atlántico (Gadus morhua) de SEQ ID No 3; y

d. Determinar la presencia o ausencia del microorganismo en la muestra biológica, tras tratam iento de la mezcla de reacción según el apartado c), a través de la determinación de la presencia o ausencia de amplicones procedentes de la reacción en cadena de la

15 polimerasa (PCR) realizada de forma cuantitativa en tiempo real;

donde dicha reacción en cadena de la polimerasa (PCR) emplea ADN, ADN complementario (ADNc) ó ADN de hebra simple obtenido por retrotranscripción de ácido ribonucleico (ARN), de la muestra biológica, al menos un par de cebadores específicos, dNTPs, un tampón de reacción adecuado, una ADN polimerasa termoestable y una sonda marcada fluorescentemente, donde dicha sonda marcada

20 fluorescentemente consiste en un oligonucleótido con una longitud de 8 a 9 nucleótidos marcado con un fluoroforo.
10. El procedimiento de la reivindicación 9, donde la sonda marcada fluorescentemente consiste en un oligonucleót ido con una longitud de 8 nucleótidos.
11. El procedimiento de la reivindicación 9 ó I D, donde dicha reacción en cadena de la polimerasa 25 (PCR) amplifica amplicones con una longitud entre 60 y 120 nucleótidos.
12.

El procedimiento de la reivindicación 9 ó I D, donde dicha reacción en cadena de la polimerasa (PCR) amplifica amplicones con una longitud entre 70 y 110 nucleótidos.
13.

El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 12, donde la sonda marcada fluorescentemente es una sonda Taqman.

30 14. El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 13, donde el sujeto es un humano.
15. El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 14, donde el microorganismo es un patógeno.
16. El procedimiento según la reivindicación 15, donde el patógeno se selecciona de la lista que consiste en Neisseria meningitidis, Streptococcus agalactiae, Listeria monocytogenes, Virus de la

ES 2 449 665 A2

Varicela Zoster, Bordeteffa pertussis, Bordetelfa hofmensii, el complejo Mycobacterium

tuberculosis, Haemophilus influenzae o Streptococcus pneumoniae.
17. Un kit útil para la determinación de la de la presencia o ausencia de un microorganismo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que comprende al menos los siguientes e lementos:

a. la Uracil-ADN-Glicosilasa procedente del Bacalao del Atlántico (Gadus morhua) de SEQ IDNo3;y

b. Sonda marcada fluorescentemente con una longitud de 8 a 9 nucleótidos.
18. El kit según la reivindicación 17, que además comprende al menos uno de los siguientes

elementos: un par de cebadores específicos, dNTPs, un tampón de reacción adecuado, una ADN

polimerasa termoestable.
19. El kit según cualquiera de las reivindicaciones 17 Ó 18, donde el microorganismo a identificar y la sonda se seleccionan de una cualquiera de las opciones de la siguiente lista:

a.

Bordetefla pertussis y la sonda marcada con un fluoroforo de SEQ ID No 4;

b.

Bordetefla holmensii y la sonda marcada con un fluoroforo de SEQ ID No 5;

c.

Complejo Mycobacterium tuberculosis y la sonda marcada can un fluor%ro de SEQ /0 No 6;

d.

Streptococcus pneumoniae y la sonda marcada con un fluor%ro de /0 No 7;

e.

Neisseria meningitidis y la sonda marcada con un /fuoroforo de ID No 8;

f.

Listeria monocytogenes y /0 sonda marcada con un I/uor%ro de ID No 9;0

g.

Streptococcus agalactiae y la sonda marcada con un fluoroforo de ID No 10.
20. Un kit adecuado para el diagnóstico de la tosferina, que comprende al menos los siguientes elementos:

a.

l a Uracil-ADN-Glicosilasa procedente del Bacalao del Atlántico (Gadus morhua) de SEO IDN03; y

b.

l as sondas marcadas con un fluor%ro de SEO ID No 4 y SEO ID No S.
21. Un kit adecuado para el diagnóstico de la meningitis bacteriana, que comprende al menos los siguientes elementos:

a.

La Uracil-ADN-Glicosilasa procedente del Bacalao del Atlántico (Gadus morhua); y

b.

las sondas marcadas con un fluoroforo de SEO ID No 8, SEO ID No 9, SEO ID No 7 y SEO ID No 10.
22. El kit según cualquiera de las reivindicaciones 20 Ó 21, que además comprende al menos uno de los siguientes elementos: un par de cebadores especificos, dNTPs, un tampón de reacción adecuado, una ADN polimerasa termoestable.
23. El kit segú n cualquiera de las reivindicaciones 17 a 22, que además comprende un control 5 positivo, preferiblemente B-globina.