CN113846190A

CN113846190A - 一种单纯疱疹病毒1型、2型和伪狂犬病毒三重荧光定量pcr检测组合物、方法及试剂盒

Info

Publication number: CN113846190A
Application number: CN202111341777.0A
Authority: CN
Inventors: 宋佳; 马明明; 郭振华; 李刚; 庞咪
Original assignee: Henan Provincial Peoples Hospital
Current assignee: Henan Provincial Peoples Hospital
Priority date: 2021-11-12
Filing date: 2021-11-12
Publication date: 2021-12-28
Anticipated expiration: 2041-11-12
Also published as: CN113846190B

Abstract

本发明提供一种单纯疱疹病毒1型、2型和伪狂犬病毒三重荧光定量PCR检测组合物、方法及试剂盒。该检测组合物由HSV‑1‑UL49基因上游引物HSV‑1‑UL49F、下游引物HSV‑1‑UL49R和探针HSV‑1‑UL49P，HSV‑2‑gG基因上游引物HSV‑2‑gGF、下游引物HSV‑2‑gGR和探针HSV‑2‑gGP，PRV‑UL24基因上游引物PRV‑UL24F、下游引物PRV‑UL24R和探针PRV‑UL24P组成。该检测方法具有良好的特异性、敏感性和重复性，可有效区分HSV‑1、HSV‑2和PRV的核酸，为病毒性脑炎的临床鉴别诊断提供了很好技术支撑，具有良好的社会应用前景和价值。

Description

一种单纯疱疹病毒1型、2型和伪狂犬病毒三重荧光定量PCR检测组合物、方法及试剂盒

技术领域

本发明涉及一种单纯疱疹病毒1型、2型和伪狂犬病毒三重荧光定量PCR检测组合物、方法及试剂盒，属于分子检测技术领域。

背景技术

单纯疱疹病毒是α疱疹病毒亚科成员，包括单纯疱疹病毒1型(herpes simplexvirus type 1，HSV-1)和单纯疱疹病毒2型(herpes simplex virus type 2，HSV-2)两个血清型。人类是单纯疱疹病毒的储存宿主，HSV-1和HSV-2在世界范围内均具有很高的感染率。HSV是一种典型的嗜神经病毒，原发感染后可沿周围感觉神经纤维进入感觉神经或自主神经节潜伏下来，并建立终身感染。受人体免疫状况和外界环境的刺激，会周期性的临床或亚临床再激活，具有多种临床表现，包括无症状感染和各种黏膜病症(眼、口腔及嘴角黏膜处)，生殖器疱疹以及中枢神经系统并发症等。HSV-1也是引起成人严重散发性脑炎的主要病原之一，HSV-2是全世界性生殖器溃疡最常见的病因，特别是对患有免疫抑制病的人群，HSV感染是一个特别的威胁。

伪狂犬病毒(pseudorabies virus，PRV)，也称为猪疱疹病毒1型(suidherpesvirus 1，SuHV-1)，同样属于α疱疹病毒亚科，PRV可以感染除人之外的多种动物，如狗、猫、羊、牛、狐狸、貂和鼠等，致死率几乎为100％。但2018年以来，我国陆续报道了23例伪狂犬病毒感染人的案例。在感染早期(通常为1周以内)，主要表现为类似流感的症状，包括发热、头痛和不同程度的呼吸道症状；然后会快速进展到神经系统，包括癫痫和意识障碍，甚至昏迷等；此外，60％(12/20)的病例会出现严重的视力障碍，77.3％(17/22)的病例会伴发肺炎；患者虽然都接受了系统的抗病毒治疗，但是预后均非常差。因此，PRV在特定条件下，具有潜在感染人的能力，并引起严重的临床症状，有必要将其列入病毒性脑炎需要排查的病原；且PRV感染人后在早期与流感症状相似，临床症状不典型，中后期病程又进展很快，因此快速的鉴别诊断对于该病的早发现和早治疗具有重要意义。

传统的病毒性脑炎病原体检测技术包括脑脊液的病毒分离、ELISA、脑电图和影像学检查等，上述检测方法均具有一定的局限性，如病毒分离较难、特异性抗体检测时间相对滞后、病原无法确诊等。荧光定量PCR检测技术具有高敏感性、高特异性、检测通量高、耗时短、和成本低等诸多优势，已被广泛应用于临床病原微生物感染的精准诊断并辅助疾病治疗。鉴于病毒性脑炎的严重危害，急需开发出一种快速、特异和敏感的针对单纯疱疹病毒1型、单纯疱疹病毒2型和伪狂犬病毒的荧光定量检测方法，从而为病毒性脑炎的临床鉴别检测提供技术支撑。

发明内容

针对现有技术的不足和临床疫病诊断检测的需求，本发明的目的是提供一种单纯疱疹病毒1型、2型和伪狂犬病毒三重荧光定量PCR检测组合物、方法及试剂盒。

为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：

一种单纯疱疹病毒1型、2型和伪狂犬病毒三重荧光定量PCR检测组合物，由单纯疱疹病毒1型UL49基因的上游引物HSV-1-UL49F、下游引物HSV-1-UL49R和探针HSV-1-UL49P，单纯疱疹病毒2型gG基因的上游引物HSV-2-gGF、下游引物HSV-2-gGR和探针HSV-2-gGP，伪狂犬病毒UL24基因的上游引物PRV-UL24F、下游引物PRV-UL24R和探针PRV-UL24P组成；

所述引物和探针的序列如下：

上游引物HSV-1-UL49F：GGTTCCGCGCGATGAG；

下游引物HSV-1-UL49R：GGGACTCGCCATACATGAAGA；

探针HSV-1-UL49P：VIC-ACGAGGATCTGTACTACAC-MGB；

上游引物HSV-2-gGF：CTACCACGCGTCGCTTTTG；

下游引物HSV-2-gGR：ATAAACGTGCGGCCCGTAA；

探针HSV-2-gGP：FAM-TCCCCAGAGCCTGCT-MGB；

上游引物PRV-UL24F：CTTCCCCGAGAGACGCTTAA；

下游引物PRV-UL24R：CCCGAGGTTGACTTCAAAGG；

探针PRV-UL24P：CY5-AAGGCGTCCTTGACC-MGB。

一种包含所述的检测组合物的三重荧光定量PCR检测试剂盒。

由试剂A、试剂B和试剂C组成；试剂A为荧光定量PCR反应预混液，包含探针法FastFire快速定量PCR试剂、内参染料ROX Reference Dye、所述的HSV-1-UL49、HSV-2-gG和PRV-UL24基因的三组引物、探针和无菌无酶水；试剂B为阳性对照，包含标准质粒对照品pUC57-UL49、pUC57-gG和pUC57-UL24；试剂C为阴性对照，为Tris-EDTA缓冲液。

所述标准质粒对照品pUC57-UL49，浓度为5.0×10⁴拷贝/微升；标准质粒对照品pUC57-gG，浓度为4.3×10⁴拷贝/微升；标准质粒对照品pUC57-UL24，浓度为4.3×10⁴拷贝/微升。

一种用于非诊断目的的三重荧光定量PCR检测方法，包括以下步骤：

(1)提取待测样品的DNA模板；

(2)采用所述的检测组合物建立三重荧光定量PCR反应体系；

(3)进行荧光定量PCR检测；

(4)待测样品的结果分析。

所述三重荧光定量PCR反应体系为25μL，包含20μL的试剂A和5μL的模板；所述模板为待测样品的DNA、阳性对照标准品或阴性对照标准品。

所述20μL的试剂A包括探针法FastFire快速定量PCR试剂12.5μL、内参染料ROXReference Dye 0.25μL、所述的HSV-1-UL49、HSV-2-gG和PRV-UL24基因的6种引物的反应终浓度均为0.2μM、3种探针的反应终浓度均为0.15μM，余量为无菌无酶水。

所述反应体系的反应条件为98℃预变性60s，98℃变性5s，60℃退火15s，40个循环。

本发明有益效果：

1、本发明针对单纯疱疹病毒1型、单纯疱疹病毒2型和伪狂犬病毒核酸的荧光定量PCR检测组合物的引物和探针，具有良好的兼容性；建立的三重荧光定量PCR检测方法，可同时检测HSV-1的UL49基因、HSV-2的gG基因和PRV的UL24基因，可用于HSV-1、HSV-2和PRV感染的临床鉴别诊断。

2、本发明建立了用于鉴别检测HSV-1、HSV-2和PRV的三重荧光定量PCR试剂盒，检测便捷。本发明的试剂盒由3种试剂构成，试剂A为荧光定量PCR反应液，其中已经预混好探针法FastFire快速定量PCR试剂(FastFire qPCR Premix)、内参染料ROX Reference Dye及UL49、gG和UL24基因的三组引物和探针；试剂B为阳性对照；试剂C为阴性对照。实际操作过程中，只需取20μL的试剂A与5μL的模板(样品核酸、阳性对照或阴性对照)混合，即可进行后续的荧光定量PCR检测，结果可在40分钟内进行解读。

3、本发明结合当前分子诊断中广泛使用的探针法荧光定量检测法，建立了针对HSV-1、HSV-2和PRV的三重荧光定量检测方法，该方法具有良好的特异性、敏感性和重复性，可有效区分HSV-1、HSV-2和PRV的核酸，为病毒性脑炎的临床鉴别诊断提供了很好技术支撑，具有良好的社会应用前景和价值。

附图说明

图1本发明三重荧光定量PCR检测方法的标准曲线；

A)pUC57-gG标准曲线，模板浓度为4.3×10⁷-4.3×10²拷贝·μL^-1；

B)pUC57-UL49标准曲线，模板浓度5.0×10⁷-5.0×10²拷贝·μL^-1；

C)pUC57-UL24标准曲线，模板浓度为4.3×10⁷-4.3×10²拷贝·μL^-1。

图2本发明三重荧光定量PCR检测方法的特异性扩增曲线；

图3本发明三重荧光定量PCR检测方法的敏感性扩增曲线；

A)pUC57-gG基因敏感性扩增曲线，1-8：4.3×10⁸-4.3×10¹拷贝·μL^-1。

B)pUC57-UL49基因敏感性扩增曲线，1-7：5.0×10⁷-5.0×10¹拷贝·μL^-1；

C)pUC57-UL24基因敏感性扩增曲线，1-8：4.3×10⁸-4.3×10¹拷贝·μL^-1。

图中曲线1-8分别对应的浓度按10⁸-10¹依次倍比递减。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。

本发明实施例中所用的实验材料：

(1)病毒核酸

伪狂犬病毒HeNLH/2017(MT775883)基因组由河南省农业科学院提供，HSV-1、HSV-2、人巨细胞病毒(human cytomegalovirus，HCMV)和水痘带状疱疹病毒(varicella-zostervirus，VZV)核酸由临床病例样品获得。乙脑弱毒疫苗(Japanese encephalitis virus，JEV)购自武汉科前生物股份有限公司。上述病毒作为临床上可能引起病毒性脑炎的病原，在此用于本发明所建立方法的特异性分析。

(2)主要试剂及仪器

病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒、探针法FastFire快速定量PCR试剂(FastFireqPCR Premix)和内参染料ROX ReferenceDye均购自天根生化科技(北京)有限公司，荧光定量PCR仪(ABI7500)，美国ABI公司产品；核酸浓度测定仪NanoDrop One，美国ThermoFisherScientific公司产品。

实施例1引物和探针的设计与合成

根据伪狂犬病毒株HeNLH/2017(GenBank登录号：MT775883)UL24的基因序列，单纯疱疹病毒HSV-2HG52株(GenBank登录号：Z86099)gG基因的序列，单纯疱疹病毒HSV-1ZW6株(GenBank登录号：KX424525)UL49的基因序列，通过Primer express 3.0.1软件进行引物和探针的设计。所有的引物和探针均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成(表1)，引物和探针用无菌水稀释到10μmol·L^-1，于-20℃保存。

表1 引物和探针序列

引物/探针	序列
		HSV-1-UL49F	GGTTCCGCGCGATGAG(SEQ ID NO.1)
HSV-1-UL49R	GGGACTCGCCATACATGAAGA(SEQ ID NO.2)
		HSV-1-UL49P	VIC-ACGAGGATCTGTACTACAC-MGB(SEQ ID NO.3)
HSV-2-gGF	CTACCACGCGTCGCTTTTG(SEQ ID NO.4)
		HSV-2-gGR	ATAAACGTGCGGCCCGTAA(SEQ ID NO.5)
HSV-2-gGP	FAM-TCCCCAGAGCCTGCT-MGB(SEQ ID NO.6)
		PRV-UL24F	CTTCCCCGAGAGACGCTTAA(SEQ ID NO.7)
PRV-UL24R	CCCGAGGTTGACTTCAAAGG(SEQ ID NO.8)
		PRV-UL24P	CY5-AAGGCGTCCTTGACC-MGB(SEQ ID NO.9)

实施例2试剂盒中阳性对照和阴性对照的选择

分别选择HSV-2HG52株gG基因的第500-1000位的碱基序列(500bp)，HSV-1ZW6株UL49的基因全长(906bp)和PRV HeNLH/2017株UL24基因的第1-300位碱基序列(300bp)，克隆构建到pUC57质粒载体上，从而获得质粒标准品pUC57-gG、pUC57-UL49和pUC57-UL24，该标准品由本实验室保存，标准质粒浓度利用核酸浓度测定仪NanoDrop One测定。基因拷贝数(Y)计算公式如下：

Y(copies/μL)＝[质粒DNA的浓度(ng/μL)×10^-9/(质粒DNA长度bp×660)]×6.02×10²³。

经测定，标准质粒的基因拷贝数分别为1.5×10⁹拷贝·μL^-1(pUC57-UL49)、1.3×10⁹拷贝·μL^-1(pUC57-gG)和1.3×10⁹拷贝·μL^-1(pUC57-UL24)；进一步将三种标准质粒混合在一起，作为阳性对照，并用无菌无酶水进行稀释，使各质粒的浓度分别为5.0×10⁴拷贝·μL^-1(pUC57-UL49)、4.3×10⁴拷贝·μL^-1(pUC57-gG)和4.3×10⁴拷贝·μL^-1(pUC57-UL24)；同时用TE缓冲液(Tris-EDTA buffer solution)作为阴性对照。

实施例3三重荧光定量PCR检测方法的建立

(1)三重荧光定量PCR检测试剂盒的组成

由试剂A、B和C组成。试剂A为荧光定量PCR反应预混液，包含了探针法FastFire快速定量PCR试剂(FastFire qPCR Premix)、内参染料ROX Reference Dye、针对UL49、gG和UL24基因的三组引物和探针(表1)；试剂B为阳性对照，包含标准质粒对照品pUC57-UL49、pUC57-gG和pUC57-UL24；试剂C为阴性对照，为TE缓冲液。

(2)标准曲线的建立

经过引物和探针浓度的摸索，确定三重荧光定量PCR的反应体系为25μL，包含20μL的试剂A和5μL的模板。试剂A中6种引物的终浓度均为0.2μM，3种探针的反应终浓度均为0.15μM；探针法FastFire快速定量PCR试剂(FastFire qPCR Premix)12.5μL；内参染料ROXReference Dye 0.25μL，余量为无菌无酶水。三种标准质粒按照1:1:1的体积进行混合，然后进行10倍倍比稀释，取5μL作为模板。

使用ABI 7500 Fast Real-Time PCR System进行荧光定量PCR检测，最佳反应程序为：98℃预变性60s，98℃变性5s，60℃退火15s，40个循环。

如图1所示，模板拷贝数在10²～10⁷范围内时，所建立的三重荧光定量PCR检测方法可以获得良好的扩增动力学曲线。HSV-2gG基因对应的标准曲线为Y＝-3.59x+45.19，相关系数R²＝0.996，扩增效率为90.0％(图1A)；HSV-1UL49基因对应的标准曲线为Y＝-3.44x+42.57，相关系数R²＝0.993，扩增效率为95.26％(图1B)；PRV UL24基因对应的标准曲线为Y＝-3.54x+41.05，相关系数R²＝0.994，扩增效率为91.59％(图1C)。

实施例4特异性分析实验

分别以PRV的基因组DNA、HSV-1的基因组DNA和3个标准质粒对照品(pUC57-UL49、pUC57-gG和pUC57-UL24)的混合物为阳性对照，以人巨细胞病毒(HCMV)、水痘带状疱疹病毒(VZV)和乙脑弱毒疫苗(JEV)的核酸以及无菌无酶水为阴性对照，用建立的三重荧光定量PCR检测方法进行检测，如图2所示，阳性对照组可以出现特异性的扩增曲线，而含有其它病原cDNA和DNA的样品检测均为阴性，表明本研究建立的检测方法具有良好的特异性。

实施例5敏感性扩增实验

对质粒标准品(pUC57-UL49、pUC57-gG和pUC57-UL24)分别做10倍倍比稀释，使标准品浓度在10⁸-10¹拷贝·μL^-1之间，用设计的引物和探针进行荧光定量PCR检测(检测方法同实施例3)。如图3所示，在浓度低至10¹拷贝·μL^-1时，建立的荧光定量检测方法均可以获得良好的扩增曲线。

实施例6重复性实验

将上述质粒标准品(pUC57-UL49、pUC57-gG和pUC57-UL24)分别做10倍倍比稀释，以不同浓度的质粒标准品为模板进行批次内和批次间的重复性检测，结果如表2所示，当模板浓度在10⁷-10²之间时，对应CT值约在15-32之间时，组内变异系数为0.09％～2.64％；组间变异系数为1.82％～6.21％，表明建立的三重荧光定量PCR检测方法具有良好的稳定性和重复性。

表2 三重荧光定量PCR检测方法重复性试验结果

序列表

<110> 河南省人民医院

<120> 一种单纯疱疹病毒1型、2型和伪狂犬病毒三重荧光定量PCR检测组合物、方法及试剂盒

<130> 荧光定量PCR检测

<160> 9

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 1

ggttccgcgc gatgag 16

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 2

gggactcgcc atacatgaag a 21

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 3

acgaggatct gtactacac 19

<210> 4

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 4

ctaccacgcg tcgcttttg 19

<210> 5

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 5

ataaacgtgc ggcccgtaa 19

<210> 6

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 6

tccccagagc ctgct 15

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 7

cttccccgag agacgcttaa 20

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 8

cccgaggttg acttcaaagg 20

<210> 9

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 9

aaggcgtcct tgacc 15

Claims

1.一种单纯疱疹病毒1型、2型和伪狂犬病毒三重荧光定量PCR检测组合物，其特征在于，由单纯疱疹病毒1型UL49基因的上游引物HSV-1-UL49F、下游引物HSV-1-UL49R和探针HSV-1-UL49P，单纯疱疹病毒2型gG基因的上游引物HSV-2-gGF、下游引物HSV-2-gGR和探针HSV-2-gGP，伪狂犬病毒UL24基因的上游引物PRV-UL24F、下游引物PRV-UL24R和探针PRV-UL24P组成；

所述引物和探针的序列如下：

上游引物HSV-1-UL49F：GGTTCCGCGCGATGAG；

下游引物HSV-1-UL49R：GGGACTCGCCATACATGAAGA；

探针HSV-1-UL49P：VIC-ACGAGGATCTGTACTACAC-MGB；

上游引物HSV-2-gGF：CTACCACGCGTCGCTTTTG；

下游引物HSV-2-gGR：ATAAACGTGCGGCCCGTAA；

探针HSV-2-gGP：FAM-TCCCCAGAGCCTGCT-MGB；

上游引物PRV-UL24F：CTTCCCCGAGAGACGCTTAA；

下游引物PRV-UL24R：CCCGAGGTTGACTTCAAAGG；

探针PRV-UL24P：CY5-AAGGCGTCCTTGACC-MGB。

2.一种包含权利要求1所述的检测组合物的三重荧光定量PCR检测试剂盒。

3.如权利要求2所述的三重荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于，由试剂A、试剂B和试剂C组成；试剂A为荧光定量PCR反应预混液，包含探针法FastFire快速定量PCR试剂、内参染料ROX Reference Dye、权利要求1所述的HSV-1-UL49、HSV-2-gG和PRV-UL24基因的三组引物、探针和无菌无酶水；试剂B为阳性对照，包含标准质粒对照品pUC57-UL49、pUC57-gG和pUC57-UL24；试剂C为阴性对照，为Tris-EDTA缓冲液。

4.如权利要求3所述的三重荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于，所述标准质粒对照品pUC57-UL49，浓度为5.0×10⁴拷贝/微升；标准质粒对照品pUC57-gG，浓度为4.3×10⁴拷贝/微升；标准质粒对照品pUC57-UL24，浓度为4.3×10⁴拷贝/微升。

5.一种用于非诊断目的的三重荧光定量PCR检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)提取待测样品的DNA模板；

(2)采用权利要求1所述的检测组合物建立三重荧光定量PCR反应体系；

(3)进行荧光定量PCR检测；

(4)待测样品的结果分析。

6.如权利要求5所述的三重荧光定量PCR检测方法，其特征在于，所述三重荧光定量PCR反应体系为25μL，包含20μL的试剂A和5μL的模板；所述模板为待测样品的DNA、阳性对照标准品或阴性对照标准品。

7.如权利要求6所述的三重荧光定量PCR检测方法，其特征在于，所述20μL的试剂A包括探针法FastFire快速定量PCR试剂12.5μL、内参染料ROX Reference Dye 0.25μL、权利要求1所述的HSV-1-UL49、HSV-2-gG和PRV-UL24基因的6种引物的反应终浓度均为0.2μM、3种探针的反应终浓度均为0.15μM，余量为无菌无酶水。

8.如权利要求7所述的三重荧光定量PCR检测方法，其特征在于，所述反应体系的反应条件为98℃预变性60s，98℃变性5s，60℃退火15s，40个循环。