JP2006500028A - 核酸のヘリカーゼ依存性増幅 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明のさらなる実施形態において、標的の核酸は、一本鎖核酸、より詳細には一本鎖DNAまたは一本鎖RNA、または二本鎖核酸、より詳細には二本鎖DNAのいずれであってもよい。核酸が二本鎖である場合には、熱または酵素によって変性させて、DNAポリメラーゼ依存性増幅のための一本鎖鋳型を作成してもよい。さらに、標的の核酸は、約50bp〜100kbの範囲の大きさを有していてもよい。
便宜上、本明細書、実施例および添付の請求項において用いる用語についてここにまとめる。
熱安定性ヘリカーゼをヘリカーゼ調製物中で利用する場合、一本鎖結合タンパク質を共存されるかどうかは随意である。
ヘリカーゼは、ヌクレオチド三リン酸(例えばATP)加水分解のエネルギーを利用して、二本鎖DNAおよびRNA内の鎖同士を保持している水素結合を破壊する(KornbergとBaker、DNA Replication、W.H.Freeman and Company(第2版、(1992))、特に第11章)。ヘリカーゼは、DNA複製、DNA修復および組み換え、転写、およびRNAプロセシングなどの細胞内での核酸代謝のあらゆる面で関与している。あらゆる生物において発見されている多数のヘリカーゼが、この広い利用性を反映しているのかもしれない。
ヘリカーゼは、いくつかの異なる特性に基づいて分類されてきた。例えば、異なるヘリカーゼの特徴は、単量体または多量体構造を有するヘリカーゼを含めた、それらのオリゴマー構造である。例えば、ヘリカーゼのあるファミリーは6量体構造を有する一方で、別のファミリーは単量体または2量体ヘリカーゼで構成される。
一般に、HDAにおいて使用するのに適したプライマー対は、例えば、10ヌクレオチドよりも長く50ヌクレオチド未満の長さを有する短い合成オリゴヌクレオチドである。オリゴヌクレオチドプライマー設計には、文字列に基づく(string−based)アライメントスコア、融点、プライマーの長さ、およびGC含量などの様々なパラメータが関与する(Kampkeら、Bioinformatics17:214〜225(2003))。プライマーを設計する際の重要な因子の1つは、増幅すべき核酸分子に特異的な標的断片内の配列を選択することである。他の重要な因子は、HDA反応のためにプライマーの融点を決定することである。プライマーの融点は、そのオリゴヌクレオチドの長さとGC含量によって決まる。好ましくは、プライマーの融点は、ハイブリダイゼーションと増幅を行う温度よりも約10〜30℃高ければよい。例えば、大腸菌UvrDヘリカーゼ調製物を用いる場合でハイブリダイゼーションと増幅の温度を37℃に設定するならば、この反応のために設計するプライマー対の融点は、約47℃〜67℃の範囲とする。ハイブリダイゼーションと増幅の温度が60℃であるならば、この反応のために設計するプライマー対の融点は、約65℃〜90℃の範囲とする。HDA反応のための最良のプライマーを選択するために、様々な融点をもつプライマーの組を平行アッセイにおいて調べることができる。プライマー設計に関するさらなる情報は、Kampkeら、Bioinformatics17:214〜225(2003)に記載されている。
ポリメラーゼは、プロセッシビティおよび鎖置換活性に基づいてHDA用に選択する。融解、およびプライマーとのハイブリダイゼーションに続き、核酸を重合工程に供する。増幅すべき核酸がDNAである場合には、DNAポリメラーゼを選択する。最初の標的がRNAである場合には、まず初めに逆転写酵素を用いてRNA標的をcDNA分子に複写し、このcDNAをさらに、選択したDNAポリメラーゼによるHDAにおいて増幅する(実施例VII)。DNAポリメラーゼは、4種のdNTPの存在下において、標的の核酸上で作用して、核酸鋳型にハイブリダイズしたプライマーを伸長して、核酸鋳型上のヌクレオチド配列に相補的なプライマー伸長産物を作成する(図1および図3)。
ヘリカーゼは、一本鎖結合タンパク質(SSB)の存在下で活性の向上を示す。こうした状況において、SSBの選択は一般に特異的タンパク質には限られない。一本鎖結合タンパク質としては、例えば、T4遺伝子32タンパク質、大腸菌SSB、T7 Gp2.5SSB、ファージφ29SSB(前掲のKornbergとBaker(1992))および上述の切断型が挙げられる。
塩およびpHに加えて、他の化学物質、例えば、尿素やジメチルスルホキシド(DMSO)などの変性剤をHDA反応に加えて、二本鎖DNAを部分的に変性または不安定化するようにしてもよい。HDA反応は、SSBタンパク質の存在下または非存在下にて、変性剤の濃度を変えて比較することができる。このようにして、HDA効率を高めるか、および/または一本鎖(ss)DNA安定化においてSSBの代わりとなる化学化合物を同定することができる。核酸やタンパク質などの生体マクロ分子の殆どが、生物細胞内ではin vitro実験条件よりもはるかに高い濃度で機能および/またはそれらの天然の構造を形成するように設計される。ポリエチレングリコール(PEG)は、水を排除し、溶質ポリカチオンと静電的相互作用を作り出すことにより、人工的な分子の込み合った状態を作り出すために用いられてきた(Miyoshiら、Biochemistry 41:15017−15024(2002))。PEG(7.5%)をDNAライゲーション反応に加えると、反応時間は5分間に短縮される(Quick Ligation Kit、New England Biolabs Inc.(マサチューセッツ州ベバリー))。またPEGは、反応の効率を高めるためにヘリカーゼ巻き戻しアッセイにも加えられてきた(Dongら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、93:14456〜14461(1996))。HDAへのPEGまたは他の分子込み合い剤は、HDA反応における酵素および核酸の有効濃度を高めることにより、反応時間および反応に必要なタンパク質の濃度を低減するかもしれない。
ATPまたはTTPは、高いプロセッシビティをもつ(highly processive)ヘリカーゼのための、広く好まれているエネルギー源である。平均的な1つのATP分子は、1〜4塩基対を巻き戻すためにDNAヘリカーゼによって消費される(前掲のKornbergとBaker(1992))。本発明の一実施形態において、UvrDに基づくHDA系は、3mMの最適初期ATP濃度を有していた。より長い標的を増幅するためには、短い標的の場合よりもより多くのATPが消費されるかもしれない。こうした状況において、ヘリカーゼとともに用いるための、ピルビン酸キナーゼに基づくATP再生産系を含めることが好ましいかもしれない(HarmonとKowalczykowski、Journal of Bioiogical Chemistry、276:232〜243(2001))。
トポイソメラーゼは、長いHDA反応において、HDAが長い標的アンプリコンを増幅する能力を高めるために用いることができる。非常に長い線形DNA二本鎖をヘリカーゼによって分離する場合には、トポイソメラーゼの旋回(弛緩)機能がよじれを除去し、巻きすぎ(over−winding)を防ぐ(前掲のKornbergとBaker(1992))。例えば、大腸菌トポイソメラーゼI(Fermentas、ビルニウス、リトアニア)を用いて、一方のDNA鎖にニックを入れることにより、負の超らせん状DNAを弛緩させることができる。これに対し、大腸菌DNAジャイレース(トポイソメラーゼII)は、DNA中に一時的な二本鎖破断をもたらし、DNA鎖同士が互いに通り越すようにする(前掲のKornbergとBaker(1992))。
増幅された核酸産物は、臭化エチジウム染色、および、放射性標識、蛍光標識および酵素からなる群より選択される標識によって、増幅された核酸を検出することを含む、様々な方法で検出することができる。例えば、HDA増幅産物は、ヘアピン構造内の3’末端の近くに蛍光団を有するように設計されたオリゴヌクレオチドである蛍光標識LUX(登録商標)プライマー(Invitrogen Corporation、Carlsbad、CA)で検出することができる。この構成は、別個の消光部分を必要とせずに、それ自体で本質的に蛍光消光能を与える。プライマーが二本鎖増幅産物に組み込まれると、蛍光団は脱消光されて、蛍光シグナルが著しく増大する。実施例XIVは、蛍光標識せれたプライマーを用いた標的配列のリアルタイム検出と、HDA方法を実証するものである。
ヘリカーゼを標的の核酸を増幅するためにHDAにおいて使用できるかどうかを調べるために、HDA反応を以下のように構成することができる。
鎖置換増幅などの他の等温的核酸増幅方法でも、サーモサイクリングを用いない定温度での標的増幅を行うことができるものの、これらの方法には一本鎖鋳型を生成するための初期変性工程を必要とする。本方法の実施形態の利点は、ヘリカーゼによる巻き戻しと増幅の両方を、実施例IXにおいて実証するように一貫して単一の温度において効率的に行うことができることにある。あるいは、ヘリカーゼによる標的の核酸の初期巻き戻しを助けるために温度を上げ、その後増幅を単一の温度で進行させる。
UvrDヘリカーゼとそのアクセサリタンパク質MutLのクローニングと精製
1.UvrDヘリカーゼとMutLタンパク質をコードする遺伝子のクローニング
大腸菌ヘリカーゼIIまたはUvrDヘリカーゼ(Swissprotアクセス番号:P03018)、およびそのアクセサリタンパク質である大腸菌MutLタンパク質(Swissprotアクセス番号:P23367)をコードする遺伝子を、Impact(登録商標)系を用いてクローニングした。このImpact系は、S.cerevisiae VMAインテインとキチン結合ドメインからなる2官能性タグのC末端翻訳融合体をもたらす(New England Biolabs Inc.(マサチューセッツ州ベバリー))。タンパク質精製系では、標的タンパク質を親和性タグ(キチン結合ドメイン)から分離するために、タンパク質スプライシング要素(インテインと呼ばれる)のDTT誘導性自己開裂活性を利用する。大腸菌K12ゲノムDNAから、プライマー5A(5’GGTGGTACCATGGACGTTTCTTACCTGCTC3’(配列番号:1))およびプライマー3A(5’GGTGGTGCTCTTCCGCACACCGACTCCAGCCGGGC3’(配列番号:2))を用いてuvrD遺伝子を増幅するために、Vent(登録商標)DNAポリメラーゼを用いた。mutL遺伝子は、プライマー5B(5’GGTGGTCATATGCCAATTCAGGTCTTACCG3’(配列番号:3))およびプライマー3B(5’GGTGGTTGCTCTTCCGCACTCATCTTTCAGGGCTTTTATC3’(配列番号:4))を用いて、大腸菌K12ゲノムDNAから増幅させた。大腸菌K−12はNew England Biolabs Inc.(マサチューセッツ州ベバリー)から得た。ゲノムDNAは、QiagenゲノムDNAキット(Qiagen、ヒルデン、ドイツ)を用いて単離した。プライマーには、mutL遺伝子をpTYB1(New England Biolabs Inc.(マサチューセッツ州ベバリー))のNdeIおよびSapI部位に、またuvrD遺伝子をpTYB3(New England Biolabs Inc.(マサチューセッツ州ベバリー))のNcoIおよびSapI部位にクローニングできるようにする制限酵素部位を含めた。ライゲーション産物をER2502細胞に形質転換した。陽性の形質転換体を、100μg/mLのアンピシリンを含むLB平板上で選択的に培養した後、コロニーPCRおよびインサートの配列決定によりスクリーニングした。配列決定結果を分析した後、妥当な構築物を大腸菌ER2566細胞に形質転換した。pTYBl−MutLまたはpTYB3−UvrDを含んだER2566細胞を、100μg/mLのアンピシリンを加えたLB培地中、37℃で培養した。OD550が〜0.5に達したところで、0.5mMイソプロピル−β−D−チオガラクトピラノシド(IPTG)によってタンパク質発現を誘導した。15℃で一晩インキュベートした後、遠心分離により細胞を回収した。
インテインタグのキチン結合ドメイン(CBD)によって、融合タンパク質をキチンビーズカラム(New England Biolabs Inc.(マサチューセッツ州ベバリー))上でアフィニティ精製することができるようになる。すべての手順は4℃で行った。6リットルの培地に含まれるUvrD発現細胞を210mLの超音波処理用バッファ(20mMトリスpH7.8、0.1mM EDTA、50mM NaCl、20μM PMSF、5%グリセロール)に再懸濁し、超音波破砕した。透明になった抽出物を、500mLのバッファA(20mMトリス−HCl(pH8)、1mM EDTA)と500mM NaClで平衡化した45mLキチンビーズカラムにロードした。カラムを500mLのバッファA+1M NaClと、500mLのバッファA+500mM NaClで洗浄した。自己開裂の誘導は、カラムに、カラムの3倍体積(135mL)の開裂バッファ(バッファA+500mM NaCl+50mMジチオトレイトール(DTT))を流すことにより行った。開裂反応は、開裂バッファ中、4℃で64時間行った。タンパク質を67mLのバッファB(20mMトリス−HCl(pH8)、1mM EDTA、1mM DTT)+50mM NaClで溶出した。陽性の画分をプールし、予めバッファB+50mM NaClで平衡化しておいた1mLのMonoQカラム(Pharmacia(ニュージャージー州ピスカタウェイ))にロードした。素通り画分と溶出画分をSDS−PAGEで分析した。陽性画分におけるヘリカーゼ活性については、ヘリカーゼが、30ヌクレオチド(nt)のオリゴヌクレオチドを相補的非標識70ntオリゴヌクレオチドにアニーリングすることによって調製した部分的二重鎖から、蛍光標識オリゴヌクレオチド(30nt)を置換する能力を測定することにより、さらに調べた。置換された30nt標識オリゴヌクレオチドは、別の非標識30nt相補的オリゴヌクレオチドによって捕捉された。オリゴヌクレオチドは、20%非変性ポリアクリルアミドゲル中での電気泳動により分離し、置換されたオリゴヌクレオチドはUV光によって可視化した。UvrDタンパク質およびヘリカーゼ活性は、素通りおよび洗浄画分中で見られた。これらの画分を混合し、1mLヘパリンTSKカラム(Pharmacia(ニュージャージー州ピスカタウェイ))上にロードした。この場合も、UvrDはカラムに結合しなかった。1mLのヒドロキシアパタイトカラム(TosoHaas(ペンシルヴェニア州フィラデルフィア))がUvrDを保持したが、これは直線勾配(50mM〜1M NaCl)における340mM NaCl付近で溶出した。精製画分をプールし、保存バッファ(20mMトリス−HCl(pH8.2)、200mM NaCl、1mM EDTA、1mM EGTA、15mM 2−メルカプトエタノール、50%グリコール)に対して一晩透析した。最終濃度は、Bradfordタンパク質アッセイ(Bradford、Anal.Biochem.72:248〜254(1976))およびSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS−PAGE)を用いて決定した。
Impact(登録商標)に加えて、ヘリカーゼおよびそれらのアクセサリタンパク質は、いくつかの代替の方法、例えば直接クローニング(付加的タグなしに遺伝子をベクターに直接クローニングする)、His−Tag(登録商標)(Novagen、Inc.(ウィスコンシン州マジソン))およびpMAL(登録商標)タンパク質融合体と精製系(New Engiand Biolabs Inc.(マサチューセッツ州ベバリー))を用いて精製してもよい。大腸菌UvrDヘリカーゼを、プラスミドpET15b(Novagen Inc.(ウィスコンシン州マジソン))およびpMAL−c2X(New England Biolabs Inc.(マサチューセッツ州ベバリー))中にクローニングした。Hisタグ融合体であるUvrD−Hisを、His.Bind(登録商標)カラムおよび製造業者(Novagen Inc.(ウィスコンシン州マジソン))によって提供されるプロトコールを用いて精製した。UvrD−Hisタンパク質は、ヒドロキシアパタイトカラムによってさらに精製した。MBP−UvrD融合タンパク質は、アミロースカラムおよび製造業者(New England Biolabs Inc.(マサチューセッツ州ベバリー))によって提供されるプロトコールを用いて精製した。UvrD−Hisタンパク質およびMBP−UvrD融合タンパク質のいずれも、機能的巻き戻し活性を示し、ヘリカーゼ−依存性増幅反応において使用しうることがわかった。
核酸二本鎖標的の増幅方法
ヘリカーゼ依存性増幅のモデル系として、合成DNA二本鎖をHDA反応における鋳型として用いた。この実施例では、UvrD HDA系を用いた上記DNA二本鎖の増幅について説明する。鋳型変性の方法、プライマーアニーリングおよび伸長について以下に示す。
HDAによるプラスミドDNAからの特定配列の増幅
DNA鋳型から特定の標的配列を増幅するためにHDAを用いることができるかどうかを調べるために、2つのpUC19/M13ユニバーサルプライマーであるプライマー1224およびプライマー1233を用いて、2647bpのDNAプラスミドであるpAH1(図15(配列番号:9))から110bpの配列をUvrD HDA系を用いて増幅した。プライマー1224およびプライマー1233は、市販されており、それらの配列は会社(New England Biolabs Inc.(マサチューセッツ州ベバリー))で入手可能である。増幅スキームを図3にまとめる。
5μL 10×HDAバッファA
1.5μLの23nM AhdI開裂pAH1プラスミド
1μLの10μMプライマー1224
1μLの10μMプライマー1233
2μLの各dNTP(10mM)
1.5μLのATP(100mM)
8μLのdH2O
5μL 10×HDAバッファB
1μL exo-Klenow断片(5ユニット/μL)
0.5μL UvrDヘリカーゼ(200ng/μL)
1μL MutLタンパク質(400ng/μL)
0.9μL T4 Gp32(5μg/μL)
21.6μL dH2O
DNAプラスミドからの様々な標的配列の増幅方法
UvrDに基づくHDA系が様々な標的配列を増幅できるかどうかを調べるために、プライマー1224とプライマー1233の間に様々な配列および大きさのインサートを含んだpAHI誘導プラスミドを用いて、いくつかの平行反応を行った。
5μL 10×HDAバッファA
1μL pAH1プラスミドまたはpAH1誘導体(50ng/μL)
1μLの10μMプライマー1224
1μLの10μMプライマー1233
10μL 各dNTP(2mM)
1.5μL ATP(100mM)
15.5μL dH2O
5μL 10×HDAバッファB
1μL exo-Klenow断片(5ユニット/μL)
0.5μL UvrDヘリカーゼ(200ng/μL)
0.5μL MutL(800ng/μL)
0.9μL T4 Gp32(5μg/μL)
7.1μL dH2O
HDAによる細菌ゲノムDNAからの特定配列の増幅
HDAは、ウィルスゲノムDNAまたはRNA、細菌ゲノムDNAまたはヒトゲノムDNAなどのさらに複雑な核酸試料から、特定の標的配列を増幅するためにも用いることができる。本例においては、口腔病原体であるTreponema denticola ATCCNo.35405の細菌ゲノムから、大腸菌UvrDに基づくHDA系を用いて、特定の標的配列を増幅および検出する方法を開示する。制限エンドヌクレアーゼ遺伝子earIRを標的遺伝子(図16(配列番号:10))として選択し、earIRの配列にハイブリダイズするように1つの5’プライマーと2つの3’プライマーを設計した。反応バッファおよびプロトコールは、ゲノムDNA増幅用に改変した。10×HDAバッファAは、350mMトリス−酢酸(pH7.5)および100mM DTTを含む。10×HDAバッファBは、10mMトリス−酢酸(pH7,5)と、1mg/mL BSAと、100mM酢酸マグネシウムとを含む。
5μL 10×HDAバッファA
2μLのTreponema denticolaゲノムDNA(50ng/μL)
2μLの10μMプライマー58861(5’CCAAATGATGCTTATGTTGCTT3’(配列番号:11))
2μLの10μMプライマー58862(5’CATAAGCCTCTCTTGGATCT3’(配列番号:12))または2μLの10μMプライマー58863(5’TCCACATCTTTCACATTTCCAT3’(配列番号:13)
2μL 各dNTP(10mM)
7μL dH2O
5μL 10×HDAバッファB
4μL 100mM ATP
0.5μL UvrDヘリカーゼ(200ng/μL)
0.5μL MutL(800ng/μL)
0.9μL T4 Gp32(5μg/μL)
1μL exo-Klenow断片(5ユニット/μL)
18.1μL dH2O
5μL 10×HDAバッファA
2μLのTreponema denticolaゲノムDNA(50ng/μL)
2μLの10μMプライマー58861(5’CCAAATGATGCTTATGTTGCTT3’(配列番号:11))
2μLの10μMプライマー58863(5’TCCACATCTTTCACATTTCCAT3’(配列番号:13)
2μL 各dNTP(10mM)
7μL dH2O
5μL 10×HDAバッファB
4μL 100mM ATP
0.5μL UvrDヘリカーゼ(200ng/μL)
0.5μL MutL(800ng/μL)
0.9μL T4 Gp32(5μg/μL)
1μL T7 Sequenase(1.5ユニット/μL、または3.5ユニット/μL)
18.1μL dH2O
HDAによる、ヒトゲノムDNA試料からの標的配列の増幅
本例においては、ヒトゲノムDNA試料から、大腸菌UvrDに基づくHDA系を用いて標的配列を増幅する方法を開示する。乳癌細胞系列から調製したヒトゲノムDNA調製物をATCC No.45537より購入した。ヒトDNAメチルトランスフェラーゼ遺伝子(dnmt1)に特異的な2種のプライマーを合成した。50、75、100ng/μLの異なる濃度のゲノムDNAを用いた反応において、異なる開始量のヒトゲノムDNAについて調べた。
5μL 10×HDAバッファA
2μLのヒトゲノムDNA(50〜100ng/μL)
2μLの10μMプライマーdnmt5(5’GGAAGCTGCTAAGGACTAGTT3’(配列番号:14))
2μLの10μMプライマーdnmt3(5’CCATGTACCACACATGTGAAC3’(配列番号:15))
2μL 各dNTP(10mM)
7μL dH2O
5μL 10×HDAバッファB
3μL 100mM ATP
1μL exo-Klenow断片(5ユニット/μL)
0.5μL UvrDヘリカーゼ(200ng/μL)
0.5μL MutL(800ng/μL)
0.9μL T4 Gp32(5μg/μL)
19.1μL dH2O
本実施例においては、RNA試料から標的配列を増幅するための方法について開示する。ラット全RNAを核酸基質として使用し、最初にNew England Biolabs Inc.(マサチューセッツ州ベバリー)製のThe ProtoScriptキットを用いて一本鎖cDNA産物に変換した。
2μL ラット全RNA(0.5μg/μL)
2μL プライマーdT23VN(50μM、New England Biolabs Inc.(マサチューセッツ州ベバリー))
4μL dNTP(2.5mM)
8μL H2O
2μL 10×RTバッファ(New England Biolabs Inc.(マサチューセッツ州ベバリー))
1μL RNase阻害剤(10U/μL)
1μL M−MulV逆転写酵素(25U/μL)
5μL 10×HDAバッファA
2μLの第1鎖cDNA産物
1μLの10μMプライマーsfo(5’ACCGCATCGAATGCATGTGGATCTCACCACCAACTGCTTAGC3’(配列番号:16))
1μLの10μMプライマーsre(5’CGATTCCGCTCCAGACTTGGATCTGATGGCATGGACTGTGGT3’(配列番号:17))
2μLの各dNTP(10mM)
9μLのdH2O
5μL 10×HDAバッファB
2μL 100mM ATP
1μL exo-Klenow断片(5ユニット/μL)
0.5μL UvrDヘリカーゼ(200ng/μL)
0.5μL MutL(800ng/μL)
0.9μL T4 Gp32(5μg/μL)
20.1μL dH2O
HDAは、細菌ゲノムDNAのわずか10コピーからでさえ標的配列を増幅および検出することができる。
熱変性を行わないHDAによる細菌ゲノムDNAからの標的配列の増幅
等温的標的増幅方法の大半は、配列特異的プライマーが標的配列にアニールできるようにするために熱変性工程から始める。熱変性工程を回避することにより、増幅手順が簡単になる。したがって、UvrDに基づくHDA反応は、最初の熱変性/アニーリング工程を行わずに37℃で行った。HDA反応成分Aは、以下の試薬を1つのチューブ内に組み合わせることにより構成した。
5μL 10×HDAバッファA
2μLのTreponema denticolaゲノムDNA(50ng/μL)
2μLの10μMプライマー58861(5’CCAAATGATGCTTATGTTGCTT3’(配列番号:11))
2μLの10μMプライマー58862(5’CATAAGCCTCTCTTGGATCT3’(配列番号:12))
2μL 各dNTP(10mM)
5μL 10×HDAバッファB
3μL 100mM ATP
0.9μL exo-Klenow断片(5ユニット/μL)
0.5μL UvrDヘリカーゼ(200ng/μL)
0.5μL MutL(800ng/μL)
0.9μL T4 Gp32(5μg/μL)
26.2μL dH2O
複製ヘリカーゼ(T7遺伝子4ヘリカーゼ)を用いたHDAによる長い標的配列の増幅方法
T7 Gp4Bなどの6量体複製ヘリカーゼを、さらに長い標的配列の増幅に用いることができるかを調べるために、また、異なるHDA系をHDA反応を行うために使用できるかどうかを調べるために、T7 Gp4Bヘリカーゼ調製物をT7 Sequenase(USB,(オハイオ州クリーブランド))とともに用いて、2.3kbの標的配列を増幅した。この標的配列は、プラスミドpCR2.1(Invitrogen Corporation)中にクローニングされた大腸菌Rep遺伝子(GenBank AccessionNo.U00096)であり、得られた組み換えプラスミドはPCR−Repと呼ぶ。挿入部位の両脇に位置するプライマー1224とプライマー1233を用いて、2.3kbの標的を増幅した。後述のように、2つの反応成分AおよびBを用い、これらを順に混合することにより、50μLのHDA反応系を構成した。2種類の酢酸をベースとする反応バッファをあらかじめ作成した。10×HDAバッファAは、350mMトリス−酢酸(pH7.5)および100mM DTTを含み、10×HDAバッファBは、10mMトリス−酢酸(pH7.5)、1mg/mL BSA、および100mM酢酸マグネシウムを含む。3本の平行チューブを、各チューブ内に以下の成分を混合することにより、それぞれ20μLの反応成分Aを含むように構成した。
5μL 10×HDAバッファA
1μLのプラスミドpCR−Rep(50ng/μL)
1μLの10μMプライマー1224
1μLの10μMプライマー1233
3μL 各dNTP(10mM)
9μL dH2O
5μL 10×HDAバッファB
9.3μL ヘリカーゼ調製物(*)
1μL T7 Sequenase(1U/μL、USB Corporation)
14.7μL dH2O
RecBCDを用いたHDAによるDNA断片の増幅方法
ヌクレアーゼ欠失変異体RecBD1067ACD(Wangら、J.Biol.Chem.275:507〜513(2000))を、HDA反応において使用し、400bpDNA断片を増幅した。この平滑末端を持つ二本鎖DNA鋳型は、プライマー1224とプライマー1233の間に400bpのインサートを含むpUC19誘導体を用いたPCR反応によって作成した(New Enngland Bioiabs、Inc.(マサチューセッツ州ベバリー))。RecBD1067ACDタンパク質のクローニングと精製については以前に記載されている(Wangら、J.Biol.Chem.275:507〜513(2000))。1本のチューブ中で以下の試料を組み合わせることにより、50μLの反応液を構成した。
1μLの400bp鋳型(2ng/μL)
1.5μLの10μMプライマー1224
1.5μLの10μMプライマー1233
2μL 各dNTP(10mM)
2μL 100mM ATP
1μL Sequenase Version 2.0(1.3ユニット/μL)
0.5μL RecBD1067ACDヘリカーゼ(130ng/μL)
1.3μL T4 Gp32(3.8μg/μL)
26.2μL dH2O
特定配列の熱安定性ヘリカーゼ依存性増幅方法
熱安定性ヘリカーゼと熱安定性ポリメラーゼを用いて高温でHDAを行うことにより、プライマー結合の特異性が高まり、増幅の特異性が向上するかもしれない。本実施例においては、口腔病原体であるTreponema denticola ATCCNo.35405の細菌性ゲノムから、Tte−UvrDに基づく熱安定性ヘリカーゼ依存性増幅またはt−HDA系を用いて、特定の標的配列を増幅し検出する方法を開示する。
熱安定性UvrD様ヘリカーゼであるTte−UvrDは、完全に配列が決定されている熱安定細菌Thermoanaerobacter tengcongensis(Baoら、Genome Res.12:689〜700(2000))からクローニングおよび精製した。Tte−UvrDヘリカーゼをコードするT.tengcongensisのUvrD遺伝子のヌクレオチド配列は、T.tengcongensisゲノムの605,527と607,668の間に位置し、配列はGenBank(アクセス番号:NC 003869;Baoら、Genome Res.12:689〜700(2000))において参照することができる。PCRにより、T.tengcongensisゲノムDNA(100ng)+プライマーTUF(5’−ATACATATGATTGGAGTGAAAAAGATGAA−3’(配列番号:18))およびプライマーTUR(5’−AAATAAGCTCTTCAGCAAGAAATTGCCTTAATAGGAG−3’(配列番号:19))を用いて、Tte−UvrD遺伝子を増幅した。プライマーには、Tte−UvrD遺伝子を、pTYB1(New England Bioiabs Inc.(マサチューセッツ州ベバリー))のNdeIおよびSapI部位にクローニングできるようにする制限酵素部位を含めた。PCR産物をNdeIおよびSapIで消化し、消化したpTYBIにライゲーションした。ライゲーション産物をER2502細胞に形質転換した。陽性の形質転換体を100μg/mLのアンピシリンを含むLB平板上での選択培養によりスクリーニングし、インサートのコロニーPCRと配列決定を行った。配列決定結果の解析後、妥当な構築物を大腸菌ER2566細胞中に形質転換した。pTYB1−Tte−UvrDを含むER2566細胞を、100μg/mLのアンピシリンを加えたLB培地中、37℃で培養した。OD550が〜0.65に達したところで、0.4mM IPTGによってタンパク質発現を誘導した。15℃で一晩インキュベートした後、細胞を遠心分離により回収した。
精製した熱安定性Tte−UvrDヘリカーゼを、熱安定性BstDNAポリメラーゼラージフラグメント(New England Biolabs Inc.(マサチューセッツ州ベバリー))とともに用いて、ゲノムDNAから高温で選択的に標的配列を増幅した。制限エンドヌクレアーゼ遺伝子earIRを標的遺伝子として選択した(図16(配列番号:10))。標的断片の末端ごとに1種類ずつ、高温にて標的配列にハイブリダイズできるように高い融点(〜75℃)を有する2種類のプライマーを設計した。反応バッファとプロトコールは、ゲノムDNA増幅用に改変した。反応バッファは以下のとおりである。10×ThermoPol反応バッファ(New England Biolabs Inc.(マサチューセッツ州ベバリー)):200mMトリス−HCl(pH8.8)、100mM KCl、100mM (NH4)2SO4、20mM MgSO4、1%TritonX−100。
3.5μL 10×ThermoPolバッファ
2μLの0.83pM Treponema denticolaゲノムDNA
1μLの10μMプライマーp5−76(5’GGCCAGTTTGAATAAGACAATGAATTATT−3’(配列番号:20))
1μLの10μMプライマーp3−76(5’−ATTTTGAAACACAAGAATGGAAATGTGAAAG−3’(配列番号:21))
2μL 各dNTP(10mM)
1.5μL dATP(100mM)
24μLのdH2O
1.5μL 10×ThermoPolバッファ
2.6μL BstDNAポリメラーゼ、ラージフラグメント(8ユニット/μL)
1μL UvrD−tteヘリカーゼ(100 ng/μL)
0.9μL T4 Gp32(5μg/μL)
9μL dH2O
t−HDAによるNeisseria gonorrhoeaeからの特定配列の増幅および検出方法
本実施例においては、異なる細菌ゲノムNeisseria gonorrhoeaeからの特定の標的配列の増幅および検出方法を開示する。N.gonorrhoeaeは、最も一般的な性感染症の一つである淋病の原因となるヒトの病原体である。N.gonorrhoeaeゲノムDNAは、American Type Culture Collection(ATCC No.700825、(バージニア州マナサス))より購入した。標的配列(CATATGTAACAGCAGGTCAGGCCATATCCAATATTCCACAAAATGCCAGTAATAATGAATTACTGAAAATCAGCGATAAAACACGCCGTATGTTG(配列番号:22))の各末端に対して1つずつの2種類のプライマーを、〜78℃の融点を有するように合成した。反応バッファおよびプロトコールは、ゲノムDNA増幅用に改変した。反応バッファは、10×ThermoPol反応バッファ(New England Biolabs Inc.(マサチューセッツ州ベバリー))である。
3.5μL 10×ThermoPolバッファ
2μL N.gonorrhoeaeゲノムDNA(50ng/μL)
1μLの10μMプライマーH153(5’−CATATGTAACAGCAGGTCAGGCCATAT−3’(配列番号:23)
1μLの10μMプライマーH154(5’−CAACATACGGCGTGTTTTATCGCTGAT−3’(配列番号:24)
2μL 各dNTPs(10mM)
1.5μL dATP(100mM)
24μL dH2O
1.5μL 10×ThermoPolバッファ
2.6μL BstDNA ポリメラーゼ、ラージフラグメント(8ユニット/μL)
1μL UvrD−tteヘリカーゼ(100ng/μL)
0.9μL T4 Gp32(5μg/μL)
9μL dH2O
試料中の病原体細菌の標的配列のリアルタイム検出
HDAは、他の技術と組み合わせて、一塩基変異多型(SNP)の決定などのゲノムの類別や、感染性物質の同定などのためにも用いることもできる。例えば、HDAは、蛍光標識したLUX(商標)プライマー(Invitrogen Corporation、カリフォルニア州カールスバッド)や、リアルタイム蛍光検出系(iCycler、Bio−Rad Laboratories Inc.カリフォルニア州ヘラクレス)などの他の核酸検出方法と組み合わせて、リアルタイムで標的配列を増幅および検出するために用いることもできる。本実施例では、細菌病原体Treponema denticola(ATCCNo.35405)における、HDA法およびUvrD HDA系を用いた、標的配列(図16(配列番号:10)のリアルタイム増幅および検出を開示する。蛍光標識したプライマー、プライマー175−LUX(5’cacatttTGAAACACAAGAATGGAAATGTG3’(配列番号:25))は、標的配列(図16(配列番号:10))に基づいて特注し、Invitrogen Corporationより入手した。反応バッファは予め調製しておいた。10×HDAバッファAは350mMトリス−酢酸(pH7.5)と100mM DTTを含む。10×HDAバッファBは、10mMトリス−酢酸(pH7.5)と、1mg/mL BSAと、100mM酢酸マグネシウムとを含む。
5μL 10×HDAバッファA
1μLのTreponema denticolaゲノムDNA(30ng/μL)
2μLの10μMプライマー175−LUX(5’cacatttTGAAACACAAGAATGGAAATGTG3’(配列番号:25))
2μLの10μMプライマー175−Rev(5’GGCCAGTTTGAATAAGACAATG3’(配列番号:26))
2μLの10mM各dNTP
8μL dH2O
5μL 10×HDAバッファB
1.5μL 100mM ATP
1μL exo-Klenow断片(5ユニット/μL)
0.5μL UvrDヘリカーゼ(200ng/μL)
0.8μL MutL(800ng/μL)
1.2μL T4 Gp32(5μg/μL)
20μL dH2O
Claims (50)
- 標的の核酸を指数的かつ選択的に増幅するための方法であって、
(a)増幅すべき標的の核酸の一本鎖鋳型を提供する工程と、
(b)工程(a)の鋳型にハイブリダイズさせるためのオリゴヌクレオチドプライマーを添加する工程と、
(c)二本鎖を形成するDNAポリメラーゼによって、鋳型に相補的なオリゴヌクレオチドプライマーの伸長産物を合成する工程と、
(d)二本鎖を巻き戻すために、工程(c)の二本鎖をヘリカーゼ調製物と接触させる工程と、
(e)工程(b)〜(d)を反復して標的の核酸を指数的かつ選択的に増幅する工程と
を含む方法。 - 増幅は等温的であることを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 工程(a)の核酸は、一本鎖核酸であることを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 一本鎖核酸は一本鎖DNAであることを特徴とする請求項3に記載の方法。
- 一本鎖核酸は一本鎖RNAであることを特徴とする請求項3に記載の方法。
- 標的の核酸は二本鎖核酸であり、該二本鎖核酸は工程(a)に先だって、熱によってまたは酵素的に変性されることを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 標的の核酸は、約50bp〜100kbの範囲の大きさを有することを特徴とする請求項1に記載の方法。
- オリゴヌクレオチドプライマーは、1つのプライマーが5’末端にハイブリダイズし、1つのプライマーが該核酸の3’末端にハイブリダイズし、標的の核酸を選択的に増幅させる一対のオリゴヌクレオチドプライマーであることを特徴とする請求項1に記載の方法。
- オリゴヌクレオチドプライマーは、オリゴヌクレオチドプライマーが増幅中のハイブリダイゼーションの反応温度よりも約10℃〜30℃高い融点を持つような、長さおよびGC含量を有することを特徴とする請求項1に記載の方法。
- DNAポリメラーゼは、大腸菌DNAポリメラーゼIのKlenow断片、T7 DNAポリメラーゼ(Sequenase)、およびBstポリメラーゼラージフラグメント(large fragment)から選択されることを特徴とする請求項9に記載の方法。
- DNAポリメラーゼは、5’→3’エキソヌクレアーゼ活性を欠如していることを特徴とする請求項10に記載の方法。
- DNAポリメラーゼは、鎖置換活性を有することを特徴とする請求項11に記載の方法。
- ヘリカーゼ調製物は、1つのヘリカーゼを含むことを特徴とする請求項1に記載の方法。
- ヘリカーゼ調製物は、複数のヘリカーゼを含むことを特徴とする請求項1に記載の方法。
- ヘリカーゼ調製物は、3’→5’ヘリカーゼを含むことを特徴とする請求項1に記載の方法。
- ヘリカーゼ調製物は、5’→3’ヘリカーゼを含むことを特徴とする請求項1に記載の方法。
- ヘリカーゼ調製物は、スーパーファミリー1ヘリカーゼを含むことを特徴とする請求項1に記載の方法。
- ヘリカーゼ調製物は、スーパーファミリー4ヘリカーゼを含むことを特徴とする請求項1に記載の方法。
- ヘリカーゼ調製物は、スーパーファミリー2ヘリカーゼ、スーパーファミリー3ヘリカーゼ、およびAAA+ヘリカーゼから選択されることを特徴とする請求項1に記載の方法。
- ヘリカーゼ調製物は、6量体ヘリカーゼを含むことを特徴とする請求項1に記載の方法。
- ヘリカーゼ調製物は、1量体または2量体ヘリカーゼを含むことを特徴とする請求項1に記載の方法。
- ヘリカーゼ調製物は、UvrDヘリカーゼまたはそのホモログを含むことを特徴とする請求項1に記載の方法。
- UvrDヘリカーゼは、熱安定性ヘリカーゼまたはそのホモログを含むことを特徴とする請求項22に記載の方法。
- ヘリカーゼ調製物は、大腸菌UvrDヘリカーゼ、Tte−UvrDヘリカーゼ、T7 Gp4ヘリカーゼ、RecBCDヘリカーゼ、DnaBヘリカーゼ、MCMヘリカーゼ、Repヘリカーゼ、RecQヘリカーゼ、PcrAヘリカーゼ、SV40ラージT抗原ヘリカーゼ、ヘルペスウィルスヘリカーゼ、酵母Sgs1ヘリカーゼ、DEAH_ATP依存性ヘリカーゼおよびパピローマウィルスヘリカーゼE1タンパク質およびそのホモログからなる群より選択される1つ以上のヘリカーゼを含むことを特徴とする請求項1に記載の方法。
- UvrDヘリカーゼは、大腸菌UvrDヘリカーゼであることを特徴とする請求項22に記載の方法。
- 熱安定性ヘリカーゼはTte−UvrDヘリカーゼであることを特徴とする請求項23に記載の方法。
- ヘリカーゼ調製物は、RecBCDヘリカーゼを含むことを特徴とする請求項1に記載の方法。
- ヘリカーゼ調製物は、T7遺伝子4ヘリカーゼおよび大腸菌UvrDヘリカーゼを含むことを特徴とする請求項14に記載の方法。
- ヘリカーゼ調製物中のエネルギー源が、アデノシン三リン酸(ATP)、デオキシチミジン三リン酸(dTTP)またはデオキシアデノシン三リン酸(dATP)から選択されることを特徴とする請求項1に記載の方法。
- ATP、dATPまたはdTTPは、約0.1〜50mMの範囲の濃度であることを特徴とする請求項29に記載の方法。
- 熱安定性ヘリカーゼ調製物は、一本鎖結合タンパク質を含むことを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 一本鎖結合タンパク質(SSB)は、T4遺伝子32SSB、大腸菌SSB、T7遺伝子2.5SSB、ファージφ29SSBおよびそれらの誘導体より選択されることを特徴とする請求項1に記載の方法。
- ヘリカーゼ調製物は、アクセサリタンパク質を含むことを特徴とする請求項1に記載の方法。
- UvrDヘリカーゼのためにアクセサリタンパク質は、MutLであることを特徴とする請求項33に記載の方法。
- ヘリカーゼ調製物は、大腸菌UvrDヘリカーゼと、ATPと、大腸菌MutLタンパク質と、T4 Gp32とを含むことを特徴とする請求項1に記載の方法。
- ヘリカーゼ調製物は、大腸菌RecBCDと、ATPと、T4 Gp32SSBとを含むことを特徴とする請求項1に記載の方法。
- ヘリカーゼ調製物は、T7 Gp4Bヘリカーゼと、dTTPと、T7 Gp2.5SSBとを含むことを特徴とする請求項1に記載の方法。
- ヘリカーゼ調製物は、熱安定性Tte−UvrDヘリカーゼ、dATPまたはATPを含むことを特徴とする請求項1に記載の方法。
- ヘリカーゼ調製物は、熱安定性Tte−UvrDヘリカーゼ、dATPまたはATP、およびT4 Gp32SSBを含むことを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 工程(b)〜(e)は、約20℃〜75℃の範囲の実質的に1つの温度において実施することを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 工程(b)〜(e)は、約37℃で実施することを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 工程(b)〜(e)は、約60℃で実施することを特徴とする請求項23に記載の方法。
- 標的の核酸は生物試料中の病原体から得られ、工程(e)は、標的の核酸を増幅して病原体を検出する工程をさらに含むことを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 標的DNAは、染色体DNAであり、工程(e)は、染色体DNA内の配列の変化を検出する工程をさらに含むことを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 配列の変化は、一塩基変異多型であることを特徴とする請求項44に記載の方法。
- ヘリカーゼ調製物と、DNAポリメラーゼと、請求項1に記載のヘリカーゼ依存性増幅を実施するための説明書とを含む、核酸増幅キット。
- ヘリカーゼ調製物が、請求項1に記載の増幅を行うために、UvrDヘリカーゼと、一本鎖結合タンパク質と、アデノシン三リン酸とを含むことを特徴とする、請求項46に記載の核酸増幅キット。
- 約1000ヌクレオチドより大きい標的配列を増幅可能な等温増幅系。
- ヘリカーゼが、標的の核酸を指数的かつ選択的に増幅させるために適しているかどうかを判定する方法であって、
(a)ヘリカーゼと、NTPまたはdNTPと、トリス−酢酸またはトリス−HClを含み、約pH6.0〜9.0の範囲のpHを与え、0〜200mMの濃度範囲のNaClまたはKClの濃縮物を含む緩衝液と、任意に一本鎖結合タンパク質および/またはアクセサリタンパク質とを含むヘリカーゼ調製物を調製する工程と、
(b)標的の核酸と、オリゴヌクレオチドプライマーと、4種のdNTPと、DNAポリメラーゼとを、ヘリカーゼ調製物に添加する工程と、
(c)混合物を約20℃〜75℃の温度でインキュベートする工程と、
(d)DNAをアガロースゲル上で分析して、選択的および指数的増幅が起こったかどうかを判定する工程と
を含むことを特徴とする方法。 - ヘリカーゼ;一本鎖結合タンパク質;アクセサリタンパク質;NTPまたはdNTP;塩濃度;pHのいずれかまたはそれぞれの濃度を変えることにより、およびバッファの種類;温度;インキュベーション時間;および標的の核酸の長さを変えることにより、ヘリカーゼ依存性増幅の条件を最適化することをさらに含む請求項49に記載の方法。
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