JP2015507931A

JP2015507931A - ブロック型プライマーを用いた等温増幅法

Info

Publication number: JP2015507931A
Application number: JP2014557780A
Authority: JP
Inventors: ディー．ジェニソン，ロバート; ヒック，ブライアン; ウェスト，マデリン
Original assignee: グレートベイスンサイエンティフィック
Priority date: 2012-02-14
Filing date: 2013-02-14
Publication date: 2015-03-16
Anticipated expiration: 2033-02-14
Also published as: CA2881200A1; HK1205194A1; US8936921B2; EP2814975A4; EP2814975A1; US20140017730A1; US20150176068A1; JP6466173B2; WO2013123238A1; US9896723B2

Abstract

病原体の感染性ゲノム中の臨床的に重要な突然変異を迅速検出するための方法が開示される。該方法は、新規の標的、およびrpoB遺伝子中の配列などの標的配列の等温性ヘリカーゼ依存的増幅を開始するためのブロック型DNAプライマーの温度依存的RNase H媒介切断の使用を含む。【選択図】図１

Description

先行出願に対する参照
本出願は、合衆国法典第35巻第119条(e)項（35 U.S.C. §119(e)）のもとに、2012年2月14日出願の発明の名称「RAPID DETECTION OF RPOB GENE MUTATIONS CONFERRING RIFAMPIN RESISTANCE IN MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS」を有する米国特許仮出願第61/598,648号に対する優先権を主張し、該出願は、参照によりその全体で本明細書中に組み入れられる。

薬剤耐性TB（Mycobacterium tuberculosis；結核菌）、特に多剤耐性（MDR）および広範囲薬剤耐性（XDR）株の世界規模での発生は、主要な世界的問題である。MDR TBの割合は、推計980万件のTB感染の4.8％であると見積もられているが、過去に治療を受けた患者に対しては55％もの高率で観察されてきた。TBは、適正に同定されれば、効率よく治療することができる。しかしながら、MDR-TBが疑われる症例での適切な治療の開始の遅れは、余分な死亡率（morbidity）および院内感染に関連する。

治療が遅れる主な原因は、診断検査の感度の低さであることが突き止められており、喀痰顕微鏡検査の平均感度は免疫不全患者では60％未満であり、HIV感染症例ではより低い。頻度の高い塗抹検査陰性（smear-negative）疾患が、同様にHIV関連TBの検出に伴う困難性を増大させている。マイコバクテリウム培養ははるかに感度が高いが、2〜8週間という非常に遅い所要時間を有し、技術的に複雑である。核酸増幅ベースの検査は、検出感度および結果を得るまでの時間を改善しているが、効率よく実践するのはこれまで困難であった。近年発表されたリアルタイムPCRのアプローチは、使い勝手のよさをもたらすが、コストが高い。

一態様では、等温核酸配列増幅法が開示される。該方法は、(a)標的配列をブロック型プライマーと混合するステップであって、ブロック型プライマーは、その5’末端に単一のリボヌクレオチドを含み、その3’末端にブロック修飾を含むステップを含み、それによりDNAポリメラーゼによる伸長が起こらないフラップを含有する、上記ステップ；(b)ステップ(a)の混合物を、耐熱性RNase H酵素および耐熱性ヘリカーゼ依存的増幅試薬と接触させるステップ；(c)ステップ(b)の混合物を加熱するステップであって、RNase H酵素が、ブロック型プライマーからフラップを除去し、それにより、非ブロック型プライマーが生じ、ヘリカーゼ依存的増幅試薬が非ブロック型プライマーを伸長して、二本鎖アンプリコンを生成させ、これがブロック型プライマーにハイブリダイズすることができる一本鎖核酸アンプリコンへと変性されるステップを含む。

一部の実施形態では、RNase H酵素はRNase H1である。一部の実施形態では、RNase H酵素はRNase H2である。一部の実施形態では、RNase H酵素は1mU/μL以上の濃度で存在する。一部の実施形態では、RNase H2酵素は3mU/μL以上の濃度で存在する。

一部の実施形態では、ブロック型プライマーは以下の式のものである：5’-dNa-Nb-dNc-X-3’（式中、aは11以上の整数であり；bは1の整数であり；cは1以上の整数であり；dNはデオキシリボヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログであり；Nは非修飾リボヌクレオチドまたは修飾リボヌクレオチドであり；Xは、それによりDNAポリメラーゼによる伸長が起こらない、デオキシヌクレオチド、ヌクレオチド、ヌクレオチドアナログ、または非ヌクレオチド修飾である）。一部の実施形態では、プライマーフラップは、プライマーの融解温度を2℃超高める（contributes greater than 2°C to the melting temperature of the primer）。一部の実施形態では、プライマーフラップは、少なくとも3塩基対からなり、少なくとも1個のシトシンまたはグアノシン塩基を含有する。一部の実施形態では、プライマーフラップは、シトシンまたはグアノシン塩基を有さず、少なくとも4塩基対からなる。一部の実施形態では、プライマーフラップは、シトシンまたはグアノシンを有さず、修飾塩基および副溝結合剤から選択される少なくとも2個の塩基からなる。一部の実施形態では、プライマーフラップは、70℃でインキュベートされる約10mU/μLのRNase H2、約200nMの標的配列、および約400nMのブロック型プライマーを含有する切断アッセイを用いて、約15分以内に除去される。

一部の実施形態では、アンプリコンは、約60分間未満で検出可能である。一部の実施形態では、アンプリコンは、約30分間未満で検出可能である。一部の実施形態では、HDA増幅試薬は、バッファー、DNAポリメラーゼ、ヘリカーゼ、一本鎖結合性タンパク質およびデオキシヌクレオチド三リン酸からなる群のうちの1以上から選択される。一部の実施形態では、HDA増幅試薬は、バッファー、DNAポリメラーゼ、一本鎖結合性タンパク質およびデオキシヌクレオチド三リン酸からなる群のうちの1以上から選択される。

rpoB遺伝子の81塩基対コア配列を有するプローブのアライメントを示す図である。 (a)様々なアンプリコンのゲル分析、および(b)様々なアッセイのリアルタイム増幅分析を示す図である。本明細書中に記載されるTB ID/R技術を用いた結核菌のrpoB遺伝子内のSNP識別を示す図であり、具体的には、図3(a)は各プローブに影響を及ぼす突然変異の画像であり、図3(b)はアレイマップを示す図である。本明細書中に記載されるTB ID/R技術の性能および検出された各プローブに対するシグナルを示す図である。 TB ID/Rアッセイの検出限界（LOD）を示す図である。様々なスタフィロコッカス種内の2つの遺伝子の多重（マルチプレックス）増幅についてのbpHDAとHDAとの比較を示す図である。

本明細書中で用いられる用語は、当技術分野で標準的なものであり、以下の一部の用語の定義は、明確性を確保するために与えられる。

単位、接頭辞、および記号は、そのSIで認められる形態で表示することができる。特に断らない限り、核酸は、左から右へ5’〜3’の向きで記載される。本明細書中に列記される数値範囲は、該範囲を規定する数字について内包的であり、規定された範囲内のそれぞれの整数を含み、かつそれらを支持する。アミノ酸は、それらの通常知られる3文字記号によるか、またはIUPAC-IUBMB命名委員会により推奨される1文字記号により、本明細書中で参照される場合がある。ヌクレオチドは同様に、それらの通常認められている1文字コードにより参照される場合がある。特に明記しない限り、「a」または「an」との用語は、「少なくとも1つの」を意味するものと解釈されるべきである。本明細書中で用いられる節の表題は、組織化の目的のみのためのものであり、記載される対象を限定するものと解釈されるべきではない。限定するものではないが特許、特許出願、記事、書籍、および論文を含む、本出願で引用されるすべての文献、または文献の一部分は、いかなる目的のためにもその全体で参照により本明細書中に明示的に組み入れられる。本出願のうちでいずれかのアミノ酸または核酸配列の矛盾がある場合、図面が支配する。

「核酸」との用語は、二本鎖または一本鎖DNA、RNA、またはDNA/RNAハイブリッドを意味する。二本鎖核酸である分子は、ニックが挿入されているか、または完全であり得る。二重鎖は、平滑末端であるか、または一本鎖尾部を有し得る。一本鎖分子は、ヘアピンまたはループ・ステムの形態で二次元構造を有することができる。核酸は、環境、食物、生物学的流体（血液、気管支洗浄液もしくは気道サンプル、喀痰、鼻分泌物、糞便、粘膜組織のスワブなど）または組織サンプルもしくは細胞をはじめとする様々な供給源から単離することができる。核酸は、細胞から取得することができ、そのような核酸としては、染色体DNA、プラスミドDNA、組換えDNA、DNA断片、メッセンジャーRNA、トランスファーRNA、リボソームRNA、および細胞中に存在するsiRNAなどの他のRNAが挙げられる。これらの核酸のいずれかを修飾に供すことができ、その場合、個々のヌクレオチドが化学的に変化させられる。修飾は、天然に由来するか、in vitro合成によるか、または化学的修飾によることができる。「二重鎖」（duplex）との用語は、全部または一部分が二本鎖である核酸を意味する。

「標的核酸」または「標的配列」との用語は、選択的に増幅される対象であり、3’および5’境界により規定される核酸の全部または一部を意味する。標的核酸はまた、増幅されることが意図される断片または配列と称することもできる。

「融解すること」、「巻き戻すこと」（unwinding）、または「変性すること」との用語は、核酸二重鎖の2本の相補鎖の全部または一部を分離することを意味する。

「ハイブリダイゼーション」との用語は、オリゴヌクレオチドプライマーまたはプローブが、該プライマーまたはプローブが鋳型鎖の1つのその相補的配列に結合する条件下で、一本鎖核酸鋳型の一領域に結合することを意味する。

「プライマー」との用語は、標的核酸の一本鎖領域に結合し、それにより標的核酸のポリメラーゼ依存的複製を促進することが可能な一本鎖核酸を意味する。「ブロック型プライマー」との用語は、DNAポリメラーゼによるプライマー伸長を妨げる修飾をその3’末端に有するプライマーを意味する。ブロック型プライマーに関して「フラップ」との用語は、プライマーの下流（3’方向）にあり、リボヌクレオチドを含むプライマーの一部分を意味する。例えば、式5’-dNa-Nb-dNc-X-3’（式中、aは11以上の整数であり；bは1の整数であり；cは1以上の整数であり；dNはデオキシリボヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログであり；Nは非修飾リボヌクレオチドまたは修飾リボヌクレオチドであり；Xは、それによりDNAポリメラーゼによる伸長が起こらない、デオキシヌクレオチド、ヌクレオチド、ヌクレオチドアナログ、または非ヌクレオチド修飾である）によりプライマーが規定されるならば、Nb-dNc-X部分がプライマーフラップを構成する。

「ヘリカーゼ」との用語は、酵素的に二本鎖核酸を巻き戻すことが可能ないずれかの酵素を意味する。ヘリカーゼは、すべての生物で、かつ組換え、複製、修復、転写、翻訳、およびRNAスプライシング（Kornberg and Baker. DNA Replication. W.H. Freeman and Company (2^nd ed. (1992))）などの核酸の関与があるすべてのプロセスで見出される酵素である。5’〜3’方向もしくは反対の3’〜5’方向でDNAまたはRNAに沿って移動するいずれかのヘリカーゼを用いることができ、それには、例えば、DnaB、PriA、PcrA、T4 Gp41ヘリカーゼ、T4 Ddaヘリカーゼ、T7 Gp4ヘリカーゼ、およびT.テングコンゲンシス（T. tengcongensis）およびT.サーモフィルス（T. thermophilus）由来の耐熱性UvrDヘリカーゼが含まれる。

「等温増幅」との用語は、単一の温度で起こる増幅を意味する。

「プライマー二量体」または「プライマーアーチファクト」との用語は、標的核酸非依存的増幅産物を意味する。これは、別のプライマーが鋳型として働く場合のプライマー伸長によって発生すると考えられる。

「耐熱性」または「好熱性」との用語は、高温での至適活性およびより低い温度での低い活性を有する酵素を意味する。高温とは、本明細書中の実施例で用いられるピロコッカス・アビシ（Pyrococcus abyssi）由来のRNase H2およびuvrDヘリカーゼの場合には、50℃超、理想的には約65℃を意味し、より低い温度とは、37℃未満を意味する。RNase H2酵素に関して、25℃および65℃での活性の違いは10倍以上であり、uvrDヘリカーゼの活性は55℃よりも40℃で30％低い。

「ホットスタート」との用語は、核酸増幅反応で用いられる酵素が、高温に到達するまで実質的に活性でない条件を説明する。これは、プライマー二量体、プライマーアーチファクト、および核酸の非標的領域へのプライマーミスアニーリングが、望ましくない増幅産物を生成する可能性がある比較的低い温度での活性を回避する。これらの増幅アーチファクトは、標的配列の増幅と競合し、増幅反応の感度および特異性を低下させる。

「ブロック基」との用語は、プライマーまたは他のオリゴヌクレオチドに連結されて、増幅が起こらないようにする化学基を意味する。例えば、プライマー伸長が起こらない。ブロック基がプライマーまたは他のオリゴヌクレオチドから除去されると、プライマーは、本明細書中に開示されるアッセイ（例えば、プライマー伸長）に参加することが可能になる。

リボヌクレアーゼ（RNase）は、より小さい構成要素へのRNAの加水分解を触媒する酵素である。RNase H酵素およびその酵素ファミリーは、RNAの切断を触媒するエンドヌクレアーゼであり、2つのクラス：RNase H1およびRNase H2がある。これらの酵素のすべてが、RNA：DNAヘテロ二重鎖の、または一方もしくは両方の鎖にRNA塩基を含有するDNA：DNA二重鎖内のRNA構成要素を切断することができるという特徴を共有している。切断産物は、両方のクラスのRNase Hに関して、遊離の3’-OHを生じる。RNase H1は、至適活性のためにRNA：DNA二重鎖内に2個以上のRNA塩基を必要とし、RNase H2は、RNA：DNA二重鎖中に1個のRNA塩基しか必要としない。

「多重（マルチプレックス）」との用語は、複数の標的核酸配列の同時増幅を意味する。これは、増幅反応中に一緒に存在する複数ペアのプライマーの使用を含む。

「HDA増幅試薬」との用語は、以下の試薬のうちの1種以上を意味する：バッファー、DNAポリメラーゼ、ヘリカーゼ、一本鎖結合性タンパク質、およびデオキシヌクレオチド三リン酸。一部の実施形態では、HDA増幅試薬は、バッファー、DNAポリメラーゼ、一本鎖結合性タンパク質、およびデオキシヌクレオチド三リン酸を含む。一部の実施形態では、HDA増幅試薬は、バッファー、DNAポリメラーゼ、ヘリカーゼ、およびデオキシヌクレオチド三リン酸を含む。

感度よく特異的な診断検査を、発展途上国の患者に身近なものにする必要性を解決するために、結核菌および第一選択薬剤であるリファンピンに対する耐性を付与するrpoB遺伝子内の突然変異の特異的検出のための単純で低コストなアプローチが記載され、ときにはTB ID/Rと称される。ブロック型プライマー/RNase H2媒介標的特異的「ホットスタート」と組み合わせた、標的DNA配列を指数関数的に増幅するための等温増幅法ヘリカーゼ依存的増幅を利用するbpHDAを用いて、rpoB遺伝子内の標的DNA配列を増幅する。分子間相互作用が発色強度の変化を引き起こし、アトモル量の核酸の視覚的検出を可能にする、rpoB遺伝子増幅領域中の突然変異を検出する変性シリコンチップ表面上に並べられたプローブセットに対するハイブリダイゼーションにより、得られたアンプリコンを検出する。

本開示を用いて考慮される等温性技術は、等温増幅のための一般的な手段を含む。既述の通り、等温増幅のためのこの手段は、ヘリカーゼ依存的増幅および好熱性ヘリカーゼ依存的（tHDA）増幅を含む。また、この等温増幅としては、DNAのループ媒介等温増幅（LAMP）、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（RT-PCR）、リガーゼ連鎖反応（LCR）、転写に基づく増幅システム（TAS）（核酸配列に基づく増幅（NASBA）を含む）、「ローリングサークル」、「RACE」および「片側PCR」が挙げられる。本明細書中に開示される実施形態は、一般的なクラスの等温増幅の代表例および例示であるとみなされるべきである。

捕捉プローブ設計
リファンピン耐性を付与する突然変異のうちの大多数が生じるrpoB遺伝子のコア領域をカバーする重複プローブのセットを設計した（図1）。結核菌のrpoB遺伝子（27、GenBank登録番号L27989）は、81塩基対のコア配列（コドン508〜534を含む）を有し、この配列は報告された薬剤耐性結核症例に関して臨床的に重要な突然変異のうちの大多数を載せる。このコア領域を含有する128塩基対の断片を、本明細書中に記載された革新技術を用いて増幅した。プローブは、図1に示されたアンプリコンの指示する領域にハイブリダイズする。

本発明者らは、結核菌の野生型rpoB遺伝子配列に適合するように、プローブセットを設計した。DNA捕捉プローブを、MeltCalc^TMを用いて設計し、これは、すべての考えられる突然変異の識別を最適化するために最近傍演算を用いる。825mM一価カチオンのアッセイ条件下で58〜60℃のTmに対して基準を設定した。アンプリコン中の競合的二次元構造の存在により、アンプリコンの3’末端をカバーするプローブ（プローブ5.7および7.5）に対しては、より高い融解温度のプローブ（68℃）が必要とされた。それぞれのプローブを、そのプローブが検出するように設計された主要なリファンピン耐性突然変異の識別（ΔT_m）を最大化するようにスクリーニングした。

チップ作製
結晶シリコンウエハーを、ポリマーアミノ官能性T構造ポリジメチルシロキサン（TSPS、United Chemical Technologies, Bristol, PA）を用いてコーティングし、150℃にて24時間硬化させた。TSPSコーティングしたウエハーを、慣用の手段によりさらに調製して（Zhong, X.B., R. Reynolds, J. R. Kidd, K. K. Kidd, R. Jenison, R. A. Marlar, and D. C. Ward. 2003. Single-nucleotide polymorphism genotyping on optical thin-film biosensor chips. Proc. Natl. Acad. Sci. 100: 11559-11564を参照されたい）、アルデヒド官能化表面を作製し、室温で保存した。

プローブは、Integrated DNA Technologies社（Coralville, Iowa）により合成された。プローブの5’末端は、シリコンウエハーのアルデヒド官能化表面と相互作用し、これに付着するように設計された反応性ヒドラジン基を用いて修飾した。スポットバッファー（0.1Mリン酸バッファーpH7.8、10％グリセロール）中のプローブを、BioDotディスペンサー（AD5000型）を用いてSFBコーティングシリコンウエハー上に印刷（75ナノリットル）した。検出対照（DC）は、抗ビオチン抗体/HRPコンジュゲートの活性およびTMB性能について検査（control）するためのスポットされたビオチン標識プローブである。ハイブリダイゼーションバッファー（antiC）中に存在するビオチン標識相補的プローブと反応させることにより、ハイブリダイゼーションステップのストリンジェンシーを検査（control）するハイブリダイゼーション対照（HC）もまたスポットされた。2時間インキュベートした後、ウエハーを0.1％SDS溶液（ドデシル硫酸ナトリウム、滅菌脱イオン水中）で洗浄し、乾燥させて、スクライバーで処理して6.5mm²チップ（DynaTek）にして、使用まで窒素充填バッグ中に保存した。

DNA鋳型およびゲノムDNAサンプル
rpoB遺伝子の領域をカバーする一本鎖128塩基合成DNA鋳型を、TB ID/Rアッセイを用いて増幅した。野生型および28種類の突然変異型配列が設計され、Integrated DNA Technologies社により合成された。プローブ内の突然変異塩基を大文字で表し、野生型塩基を小文字で表す。参照野生型TB H37RaゲノムDNA鋳型、同種でないマイコバクテリウム（NTM）種の他の株ならびに特異性試験のための他の細菌属が、アメリカンタイプカルチャーコレクション（ATCC、表1）から提供された。すべての他のゲノムDNA鋳型（10種類の野生型および26種類の突然変異型臨床単離体）はZeptoMetrix（Buffalo, NY）から提供され、それらの単離体についての詳細な遺伝子型情報を、表2に列記する。

プライマーおよびブロック型プライマーヘリカーゼ依存的増幅（bpHDA）
Primer 3ソフトウェアにて、HDA設計に関して以前に公表されたパラメータを用いて、結核菌の野生型配列rpoB遺伝子配列に対してプライマーを設計した（An, L., W. Tang, T. A. Ranalli, H. J. Kim, J. Wytiaz, and H. Kong. 2005. Characterization of a thermostable UvrD helicase and its participation in helicase-dependent amplification. J. Biol. Chem. 280:28952-28958を参照されたい）。結核菌ゲノムの高いGC含量により、プライマーGC含量、生成物Tm、および生成物の長さについては規制を緩めた。ブロック型プライマーの配列は、rpoB1502F63（配列番号1：5’-CGA TCA AGG AGT TCT TCG GCrA CCA G/iSpC3-3’）およびrpoB1629F52（配列番号2：5’-/5BioTEG/GGC ACG CTC ACG TGA CAG ArCC GCC /iSpC3-3’）であり、iSpC3はプライマー配列の3’末端のC3ブロックを示す。用いた非ブロック型プライマー配列は、rpoB1502F1（配列番号3：5’-CGA TCA AGG AGT TCT TCG GC-3’）およびmtb-9R1（配列番号4：5’-GGC ACG CTC ACG TGA CAG A-3’）であった。すべてのプライマーは、Integrated DNA Technologies社により合成された。

増幅反応を、1×ABIIバッファー（3.85mMのMgSO₄、40mMのNaCl、0.4mMのIsoAmp dNTPs）、1×IsoAmp Enzyme混合液（BioHelix）、10mU/μLのRNase H2（IDT）、0.01％Tween-20、0.01％Triton X-100、200nM rpoB1502F63および400nM rpoB1629F52を用いて、65℃で行なった。リアルタイム増幅のために、Eva green色素（Biotium社）を、各反応に対して0.2×の最終量で添加し、LC480装置（Roche）を用いて蛍光をモニタリングした。増幅効率を測定するために、増幅反応への投入ゲノムDNA量を、横断時間（crossing time）（検出可能な蛍光シグナルを生成するのに必要な増幅時間）に対してプロットし、線形曲線フィットにフィッティングした。曲線の勾配を用いて、以下の通りに効率を算出する：
効率＝10^(-1/勾配)-1。

ゲノムDNAの量の自然対数を、横断時間の自然対数に対してプロットして、以下の通りに倍加速度（分）を決定した：
ln(gDNAコピー)＝kt＋ln(横断時間)（式中、k＝倍加時間）。

チップアッセイおよびイメージング
平型角型底面ウェルを有する96ウェルプレート（Whatman）に固定化したチップを用いて、アッセイを行なった。20μLのアンプリコンおよび80μLのハイブリダイゼーションバッファー（5×SSC、5mg/mLアルカリ処理カゼイン、0.05％Tween-20、および0.03％ProClin-300保存料、250pMのハイブリダイゼーション対照プローブに対するビオチン標識逆相補的配列（ C）を添加し、各チップに対するウェル中で軽く混合し、続いてプレートを95℃に設定したオーブン（Torrey Pines Scientific）中で6分間インキュベートして、アンプリコンを変性させた。変性後、プレートを10分間、53℃に設定した第2のハイブリダイゼーションオーブンにすぐに移した。ハイブリダイゼーション後、ウェルを、洗浄バッファーA（0.1×SSC、0.1％SDS）で3回（各200μL）軽く洗浄し、続いて洗浄バッファーB（0.1×SSC、0.01％Tween20）で3回（各200μL）軽く洗浄した。洗浄後、75mMクエン酸ナトリウム、500mM塩化ナトリウム、10％ウシ胎児血清、5mg/mLアルカリ処理カゼイン、0.5％ProClin300保存料の中の100μLのペルオキシダーゼコンジュゲート化抗ビオチンモノクローナルマウス抗体（Jackson ImmunoResearch Laboratory, Inc）をウェルに添加し、続いて室温で10分間インキュベートした。ウェルをさらに室温にて洗浄バッファーBで3回（各200μL）軽く洗浄した。次に、100μLのTMB基質（BioFX/SurModics）を添加し、室温にて5分間インキュベートした。最後に、それぞれ蒸留水およびメタノールでウェルを2回リンスした。圧縮空気を用いてチップを乾燥させ、μEye（IDS Imaging Development Systems GmbH Obersulm, Germany）により制御されたCCDカメラを用いて、画像を取得した。

チップデータ定量分析
チップスポットシグナル強度を定量するために、ImageJ（National Institute of Health; http://imagej.nih.gov/ij/）を用いた。辺縁周囲のスポット中に円を配置し、平均シグナル画素強度を測定した。次に、同じ円を近接するスポット外領域にドラッグして外し、平均画素強度を測定して、バックグラウンド画素値を生成した。反応スポットシグナル強度からバックグラウンドを減算することにより、調整済み平均スポットシグナル強度を得た。100画素を超えるシグナル強度を有するそれぞれのプローブについて、結果を野生型であると決定した。それらの値を、次に平均して、平均野生型シグナルを決定した。50未満のプローブシグナルはいずれも、突然変異型アレルをカバーすると決定した。平均野生型シグナルを突然変異型シグナルによって除算して、各突然変異に対するシグナル対ノイズ比を決定した。結核菌複合体（TBC）の存在について有効な検査とみなされるべき結果に対しては、少なくとも3種類のプローブが、互いに2倍以内で100画素を超えるシグナルを有しなければならない。2を超える比率が、突然変異の存在を示した。

rpoB遺伝子再配列決定
rpoBアンプリコン領域を含むDNA配列決定鋳型（440bp）を、Roche LightCycler 480 SYBR Green Iマスターキットにて、500nMのプライマー（rpoB1375F、配列番号5：5'-CTGATCCAAAACCAGATCCG-3'、およびrpoB1814R、配列番号6：5'-TACACGATCTCGTCGCTAAC-3'）を用いて100ナノグラムのゲノムDNAからPCR増幅し、続いてゲル精製した。DNA鋳型を、rpoB遺伝子特異的プライマー：rpoB1402F、配列番号7：5'-ATGTCGCGGATGGAGCGGGTG-3'、およびrpoB1721R、配列番号8：5'-GAGCCGATCAGACCGATGTTG-3’を用いて両方向に配列決定した（SeqWright, Inc.）。

bpHDA原理および特徴
結核菌ゲノムは高GC含量を有するので（65％；データはhttp://tuberculist.epfl.ch/から入手可能）、プライマーアーチファクトは標的増幅アプローチでの主に考え得る競合的副反応であり、アッセイ感度および多重化（マルチプレックス化）する能力に影響する。非修飾型HDAプライマーを用いた初期の設計は、50nMまでのプライマー濃度を用いてゲノムDNAをうまく増幅できたが、より高いプライマー濃度では、プライマーアーチファクトのみが増幅された（図2aを参照されたい）。図2aを参照すると、14レーンでのアンプリコンのゲル分析が示されている。レーン1および14は25塩基対DNAラダーに関し；レーン2〜4は50nM/50nM非ブロック型HDAプライマーに関し；レーン5〜7は50nM/50nM pbHDAに関し；レーン8〜10は200nM/400nM非ブロック型HDAプライマーに関し；レーン11〜13は200nM/400nM bpHDAに関し；レーン2、5、8、11は鋳型不含対照を有し；レーン3、6、9、および12は結核菌由来のH37aゲノムDNAの30コピーが投入され；レーン4、7、10、および13は30,000コピーのH37aゲノムDNAを有した。

これらの条件下では、増幅反応は緩慢であり、リアルタイム増幅実験にて30,000コピーのゲノムDNAについて検出可能なシグナルを得るために60.3分間を必要とした（図2bを参照されたい）。図2bを参照すると、リアルタイム増幅観察結果を記録した：黒丸は20nM/400nM bpHDAに関し；黒四角は50nM/50nM bpHDAに関し；黒菱形は50nM/50nM非ブロック型HDAプライマーに関し；白丸は200nM/400nM bpHDAに関し；白四角は50nM/50nM bpHDAに関し；白菱形は50nM/50nM非ブロック型HDAプライマーに関するものとした。図2bのグラフ中のすべての白色記号は鋳型不含対照を含有し、すべての黒色記号は30,000コピーのH37aゲノムDNAを含有する。これらの結果から、90分間の反応時間後でさえも、100コピーを下回るゲノムDNA量を増幅することができない場合には、感度が不良であることが明らかであった。気道結核症喀痰サンプル中の生物保持量は低い場合があるので、これらのプライマーは、臨床標本に対する使用には許容されないとみなされた。

これらの課題を克服するために、本発明者らは、プライマー伸長を妨げるための3’末端ブロックの4塩基上流に単一のリボヌクレオチド結合を有して構築された修飾型ブロック型プライマーを用いた。ブロック型プライマーが相補的標的配列にハイブリダイズすると、ピロコッカス・アビシ（Pyrococcus abyssi）由来の耐熱性RNase H2が活性化され、二重鎖DNA中に存在するプライマーのリボヌクレオチド結合を切断する。リボヌクレオチドの3’のプライマーの短いセグメントが解離し、増幅をブロックしているフラップを解放して、遊離の3’-ヒドロキシルをつくり出し、そのときにプライマー伸長することが可能である。ここで用いられるRNase H2は、40℃未満の温度では非常に低い活性を有し、65℃では高活性であり、この温度が、HDAが最適に標的配列を増幅するために必要とされる。プライマー/プライマーハイブリッドは高温では不安定であるので、プライマーアーチファクトは増幅されないと考えられる。

野生型結核菌ゲノムDNAを用いる実験では、非ブロック型プライマーと同じ濃度でブロック型プライマーを用いる増幅は、同様の動的挙動を示し；検出可能な増幅産物を得るために必要な時間は概ね同じであった（図2b）。しかしながら、ブロック型プライマーアプローチを用いると、より高い濃度を用いて標的DNAを増幅できる（図2a）。したがって、増幅反応はより迅速であり、より低いプライマー濃度での57.1分間に対して29.7分間の横断時間を有する。

また、少量のゲノムDNAを増幅する能力があり得、50分間以内のリアルタイム分析により1コピーの増幅が検出可能である。ブロック型プライマーアプローチの速度および効率を、リアルタイム検出装置で種々の既知量の野生型ゲノムDNAを増幅することにより測定した。ゲノムDNA量を横断時間に対してプロットすると、78秒間の速い倍加時間を有する、非常に効率のよい指数関数的増幅システム（95〜100％）が明らかになる。増幅反応を30分間室温に置いた後でさえ、ブロック型プライマーを用いてプライマーアーチファクトは生成されず、このことにより、RNase H2は活性になるために高温にしなければならないことがさらに確認された。

TB ID/R分析性能
ここで増幅されるrpoB遺伝子の領域内に存在する突然変異を検出するために、本発明者らは、野生型結核菌に完全に相補的な重複プローブのセットを作製し、変性シリコンチップに配置した。アンプリコン中に突然変異が存在する場合、突然変異した領域に相補的であるプローブに対して、ハイブリダイゼーションシグナルは劇的に減少するか、または消失するであろう。2種類の重複プローブにカバーされる突然変異に関しては、両方のプローブが影響を受け得る（図1を参照されたい）。

最終アレイの感度および特異性を確認するために、全長一本鎖鋳型のセットを設計し、これは結核菌のrpoBコア配列中のすべての既知の突然変異の95％超を示す。それぞれを、TB ID/Rアッセイを用いて試験し、それぞれのチップ画像を、CCDカメラを用いてキャプチャーした。

図3は、TB ID/Rを用いるrpoB遺伝子の識別を示す。合成128塩基対鋳型を、記載した通りにbpHDAを用いて増幅し、次に、チップにハイブリダイズさせ、CCDカメラ画像をキャプチャーした。図3(a)に示される通り、プローブシグナルは、視覚的に明瞭であり；野生型アンプリコンは、すべてのプローブについて明瞭かつ均衡が取れたシグナルを示した。コドン509〜531に突然変異を有する標的配列について、シグナルの完全な喪失が、突然変異型アレルをカバーするプローブで観察された。著明であるが完全ではないシグナルの減少が、533コドンでの様々な突然変異について観察された。試験した点突然変異のすべてに関して、コドン516および518内の突然変異の場合（これらのアレルに重複する2種類のプローブに影響した）を除いて、単一のプローブがシグナルを失った。1種類の突然変異である508Gccは、このプローブセットを用いて識別できなかった。アレイマップを図3(b)に示し、ここではHCはハブリダイゼーション対照を表し；DCは検出対照を表し、F＋DCは検出対照と混合した基準マーカーを表す。

突然変異に対するプローブの実質的に二値的な（バイナリー）応答により、視覚的識別は単純である：スポットが失われているかまたは非常に薄い場合は、突然変異が存在する。しかしながら、アレイは依然として視覚的に複雑であるので、画像解析も研究して、自動化された判定を作成した。プローブ画素強度をCCD画像から測定し、バックグラウンドについて補正し、各被験サンプルについてプロットした（図4を参照されたい）。図4を参照すると、大文字により示される突然変異を有する合成鋳型を増幅し、TB ID/Rにより試験し、CCDイメージング、および記載しかつ示した通りに画像解析に供した。各チップ上のそれぞれのプローブに対するシグナルを、以下のようにプロットした：プローブWT1.3（黒菱形）；プローブWT2.2（白四角）；プローブ3.5（黒三角）；プローブWT4.6（白三角）；プローブWT5.7（黒四角）；プローブ7.5（白丸）。10画素未満のシグナルは、肉眼で検出するのは困難である。CCD画像解析は、アッセイ性能の視覚的解釈を確かなものにした。コドン533を除くすべての被験突然変異が、シグナル脱落（10画素未満）を有する。各突然変異体サンプルの分析は、脱落群について20超、533Gtgについて5.2および533cCgについて9.4のシグナル対ノイズ比を明らかにし、これは、明瞭な識別を可能にする。

検出限界を、TB ID/Rアッセイを用いて精製野生型MTBゲノムDNAの既知量を滴定することにより決定した。単一コピーのゲノムDNAを検出するために、40分間の増幅時間が必要であった（図5を参照されたい）。図5を参照すると、アッセイの検出限界（LOD）を、40分間の増幅時間にて野生型（H37Ra）ゲノム鋳型を用いて測定した。上の行は、アッセイ性能についてのハイブリダイゼーション対照を示す。下の行は、TB ID/RアッセイへのゲノムDNAの投入コピー数の関数としての1種類のプローブ（WT1.3）からのシグナルを示す。

また、本発明者らは、TB複合体に含まれる他のマイコバクテリウム属の種との反応性を測定した（表1）。ウシ型結核菌（M. bovis）、ネズミ型結核菌（M. microti）、およびアフリカ型結核菌（M. africanium）の2つの菌株を含む試験したTB複合体のすべてのメンバーが、すべてのプローブに対してシグナルを生成した。少なくとも3種類のプローブが100超かつ互いに2倍以内のシグナルを有しなければならないとの基準を用いると、5種類のNTM菌種のいずれも検出されなかった。しかしながら、M.ゲナベンス（M. genavense）は2種類のプローブで強いシグナルを生じ、別のプローブに対しては非常に弱いシグナルを生じた。ヒトDNAをはじめとする数種類の非マイコバクテリウムゲノムDNAサンプルの試験により、シグナルは示されなかった（表1を参照されたい）。

臨床単離体試験
本アッセイをさらに確認するために、本発明者らは、10種類の野生型および26種類のRIF耐性標本についての臨床単離体由来のゲノムDNAを試験した（表2を参照されたい）。TB ID/Rアッセイは、rpoB遺伝子配列決定と比較して、10/10種類の野生型サンプル（100％特異的、95％CI 65.6〜100％）および24/26種類のRIF耐性サンプル（92.3％、95％CI 73.4〜98.7％）を正しく分類した。野生型アンプリコンは、10種類の固有の単離体にわたって2倍未満のばらつきで、各プローブに対して強いシグナルを示した（データ示さず）。単一の突然変異を含む臨床サンプルのそれぞれについて、合成鋳型を用いて得られた結果と比較して同様のレベルの識別が観察された。シグナル脱落は、コドン511〜526での突然変異に関して観察された。S531L突然変異に対するゲノムDNAに由来するアンプリコンについては、合成鋳型ほどは識別が良好ではなかったが、3種類の固有の菌株に対する平均として19のシグナル対ノイズ比を有して、容易に識別できた。L533P突然変異は、5.3のシグナル対ノイズ比を有して、合成鋳型と同様に機能した。TB ID/Rにより突然変異体として正しく分類された2つのサンプルは、rpoB遺伝子配列決定により単一の突然変異型アレルを保有することが明らかになったが、しかしながら、それぞれが、TB ID/Rにより2種類以上の突然変異の存在の兆候を有した。単一のD516G突然変異であることが当初報告されたサンプル#8094は、プローブ1.3、2.2、および3.4でのシグナル喪失を有し、このことは、上流コドンでのさらなる突然変異を示した。rpoB遺伝子の再配列決定により、511cCgでの突然変異が明らかになり、これは、プローブ1.3でのシグナルの喪失を説明する。サンプル#11230は、H526Nでの単一の突然変異を有するサンプルであると報告された。TB ID/Rは、1箇所の突然変異を含有するとしてこのサンプルを検出したが、非常に低い比である2.6を有した。このサンプルの再配列決定は、突然変異の位置での混合した塩基を明らかにし、このことは、2種類の固有のアレルの存在を示し、この突然変異に対する低い比を説明した。TB ID/Rアッセイはさらに、rpoBコア領域に複数の突然変異を有する6種類のサンプルを用いて試された。TB ID/Rは、5/6サンプルを突然変異体として正しく分類したが、一部のケースでは予期しないプローブ応答を伴った。3箇所の突然変異（S512R/Q513P/D516A）を有するサンプル#18740（プローブ1.3、2.2、および3.4でのシグナル喪失により検出されていたはずである）は、TB ID/Rにより、プローブ1.3および7.5でのシグナル喪失により検出された。rpoB遺伝子の再配列決定により、S512R突然変異の存在が確認され、531tGg突然変異が追加で検出されたが、しかしながら、Q513PおよびD516A突然変異の両方が検出されず、このことは、TB ID/Rの結果と一致した。H526N/L533V（#15606）を有するサンプルのケースでは、プローブ5.7および7.5の両方がシグナルを喪失していたはずである場合で、プローブ7.5でのみシグナルが失われた。

TB ID/Rアッセイと当初のrpoB遺伝子配列決定との間で不一致であった2種類のサンプルを、rpoB遺伝子の繰り返しの配列決定に供した。サンプル#16866は、TB ID/Rにより野生型と誤って特定された。再配列決定は、混合されたWT/H526Yの結果であるとの該サンプルについての当初の配列決定による判定を確認した。配列決定によりQ513P突然変異を含むと報告された別のサンプル（#8545）は、TB ID/Rアッセイでは野生型であると決定された。該サンプルの再配列決定により、513コドンには突然変異がないことが明らかになり、これはTB ID/Rアッセイと一致した。

一態様では、増幅法は、等温増幅法であるHDAにホットスタート成分を含み、これがより迅速な増幅および多重化（マルチプレックス化）を可能にする。このブロック型プライマーアプローチを用いることにより、DNA増幅の開始がDNA標的依存的となり、このことは、競合的プライマーアーチファクト増幅の軽減により感度および特異性を改善する。分析により、迅速な倍加時間を有する高効率の指数関数的増幅システムが明らかとなり、これは、ブロック型プライマーのRNase H2媒介切断によるHDAの開始が迅速であり、律速的でないことを示唆する。表面結合DNAハイブリッドが肉眼で視認できるチップ表面上の色強度の恒久的変化を変換できるようにする光学特性を有する表面をつくり出すためにポリマーコーティングで改質されたシリコンチップを用いて、増幅された産物を検出した。さらに、表面は、分子として平坦でありかつ化学的に不活性であり、それにより、非特異的相互作用を低減させ、非常に感度よく特異的な検出を可能にする。このことは、本明細書中で実証された通りの、ピコモル濃度の検出限界を有するSNPの識別を可能にする。検出可能な表面結合ハイブリッドを作製するために、bpHDA増幅される標的配列では、短いハイブリダイゼーション反応のみが必要とされる。突然変異に対するシグナル応答は事実上二値的であるので、結果は、装置を用いない視覚的アプローチまたは安価なCCDもしくはCMOSカメラに基づくイメージングシステムを用いて決定することができる。

TB ID/Rの分析性能は、RIF耐性に関連するrpoB遺伝子中の突然変異を有するものをはじめとする結核菌複合体菌株の検出のための近年報じられた他の分子的方法と同様である。突然変異体鋳型の包括的なセットを構築し、本明細書中で試験されたすべての突然変異が、1種類（508Gcc）を除いて識別された。最近傍解析により、このプローブセットがこの突然変異を識別できないことが明らかになった（ΔT_m＝0℃）。これは非常に稀な突然変異であり、TBでの報告されているリファンピン耐性症例の0.1％未満を占める。臨床標本から単離されたゲノムDNAの試験は、RIF耐性菌株の検出に対する優良な感度およびRIF感受性菌株に対する特異性を示した。2種類の矛盾するサンプルの再配列決定により、TB ID/Rを支持して1つの結果が解決され、これにより、感度が96.2％に向上した。rpoB遺伝子のコア領域での突然変異の特定はMDR TB（リファンピンおよびイソニアジド（INH）の両方に対して耐性）を診断するのに一般的に十分であると報告されてきたが、XDR TB（RIF、INH、フルオロキノロン（FQ）およびカナマイシン、アミカシン、またはカプレオマイシンなどのいずれかの1種の第二世代アミノグリコシド薬に対して耐性）の迅速診断のための追加の薬剤耐性情報は、さらに感染している患者でさえ、適切な管理および治療を助け、感染リスクをさらに低下させるであろう。限定された多重（マルチプレックス）検出能力を有するリアルタイムPCRおよびLAMPなどの近年報じられた他の分子的診断法とは異なり、TB ID/Rアッセイには、FQ耐性についてgyrAおよびgyrB遺伝子、ならびにアミノグリコシドへの耐性についてrrs遺伝子中の突然変異を検出するための耐性情報が容易に追加できる。これらのマーカーは、別の測定可能な検査プラットホームであるリバースラインブロット・ハイブリダイゼーションアッセイ（reverse line blot hybridization assay；RLBH）を用いて高感度で薬剤耐性を検出することが示されている。しかしながら、RLBH検査は、時間がかかりかつ技術的に複雑であり、そのことが、治療現場（POC）でのその有用性を制限している。

おそらくは2種以上のTB菌株を含有する感染に由来するか、または複数の突然変異を有する個々の菌株由来の、サンプル内での複数の突然変異は、遺伝子型検出アプローチに対する潜在的な挑戦を提示する。2種以上の突然変異が単一のTB単離体に存在する場合、それらは検出するのに容易であるが、複数の固有のRIF耐性株の混合物またはRIF耐性集団とRIF感受性集団の両方の混合物がある場合、耐性検出は複雑であり得る。この点を説明するために、本発明者らは野生型と突然変異型ゲノム鋳型の混合物を有する2種類の単離体（H526R/WTおよびH526Y/WT）を検査し、非常に難しい結果を得た。H526RとH526Yの両方の突然変異は、単一の突然変異を有する単離体でのプローブ#5.7についてのシグナル脱落をもたらし、つまり、強く識別される。本発明者らは、H526R/WTサンプルを明瞭に検出し、このことは、アッセイが一定量の競合する野生型アレルの存在に耐えることを示した。しかしながら、TB ID/Rによる野生型サンプルとしてのH526Y/WTの検出は、野生型アレルの比率が比較的高い場合に、突然変異の存在を見逃す可能性が存在することを示唆する。同様に、サンプル#15606は突然変異体サンプルとして正しく特定されたが、突然変異のうちのすべてが検出されたのではなく、このことにより、突然変異の発生源が2種類以上の感染性生物に由来することが示唆された。D516G/L533P突然変異体を含む2種類のサンプルの場合には、本発明者らは、それらが1箇所で突然変異している単離体であるかのごとくに、同様の識別レベルでそれぞれの突然変異を検出することができ、このことにより、それらの両方が同じ生物に存在したことが示唆された。所与の突然変異の識別の強度は、混合されたサンプル中の突然変異を検出する能力に強い影響を有することが、類似のプローブ設計を用いるアッセイで以前に観察されている。この事実は、存在する各アレルの存在割合と組み合わせて、2種類以上の感染性生物を含有するRIF耐性サンプルでの正しい検出に重要である。

結核菌での薬物耐性に関する改善された治療現場（POC）検査に対する必要性は、緊急のものである。35％（HIV陽性患者についての顕微鏡感度）〜95％（分子的診断アプローチ）の最初の検査の感度を増大させると、診断での平均所要時間を約25日減少させ、脱落率（治療を探索するのを中止する感染個体）を約30％低下させる。最初の診断検査の間に薬剤耐性情報を提供することにより、治療の妥当性の遅延（感染性疾患についての寄与死亡率の低下での決定的要因）が、さらに低減されるであろう。結核菌同定および薬剤感受性情報の使用し易く感度の高い診断検査に対する必要性を解決するために、TB ID/R検査は、小型で、安価、電気機械的に簡潔であり、かつバッテリー電源となる可能性がある装置で実行される使い捨てカートリッジを用いて行なうことができる。この検査の自動化も、達成することができる。等温増幅と、チップに基づく肉眼的検出との組み合わせは、低コストの加温器およびイメージング装置の使用を可能にする。また、これまでのところ活性低下なく37℃にて9ヵ月の測定された安定性を有する（データ示さず）、低コストで非常に安定かつ堅牢な試薬が達成可能である。これらの試薬は、迅速かつ正確な結果が必要とされるウイルスおよび呼吸器病原体などのテスト・アンド・トリート（test-and-treat）適応のために、治療現場（POC）で行なわれる商業的に成功したアッセイで用いられてきた。さらに、チップは、よく確立された半導体プロセスを用いて、安価に、非常に大規模に製造することができる。

本明細書中に記載された技術はまた、ブドウ球菌種の同定および入院患者由来のクラスター陽性血液培養中のグラム陽性球菌でのmecA遺伝子の存在に対しても用いることができる。RIF耐性を検出することができる低コストで使用し易いデバイスは、より早期に適切な治療を提供することにより、疾患の地域感染の低減に多大な影響を有し、ならびに、感染患者についての転帰を改善することができる。

bpHDA性能に対するRNase H2濃度の影響
方法：200nMの以下のそれぞれのブロック型プライマー：mecA898-ribo、mec990r-bio-ribo、tuf430l-bio-ribo、tuf527r-bio-ribo、nuc555f-bio-ribo、およびnuc661r-riboを含有する、最終濃度1×のABIIバッファー、3.85mM MgSO₄、40mM NaCl、0.4mM dNTP混合物、0.01％Tween-20、0.01％Triton X-100、5ng/μL uvrDヘリカーゼ、2ng/μL一本鎖結合性タンパク質、および0.8ng/μL GST DNAポリメラーゼ（BioHelix, Beverly, MA）を用いて、三重bpHDAをセットアップした。RNase H2（IdT Technologies）を、最終濃度100、31.6、10、3.16、1および0mU/μLで添加した。2×酵素ミックスを作製し、マイクロタイタープレートの個々のウェルに加えた。メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ATCC 33592）混入（spiked）陽性血液Cx（BACTEC、BD）を、アクロモペプチダーゼ（achromopeptidase）ベースの抽出バッファーを用いて抽出し、抽出された細胞にプライマーを添加して、2×鋳型/プライマーミックスを作製し、これを次に2×酵素ミックスに加えて、65℃にてインキュベートした。反応を、増幅中に形成される二本鎖DNAへのEvaGreen 色素の結合によりモニタリングした（LC480、Roche）。

結果：表1で分かるように、1mU/μL RN2では45分間以内に増幅は起こらず、31.6mU/μL RN2まで著明な速度増加が観察された。この結果は、0.1mU/μL RNase H2を用いては、ブロック型プライマーと非ブロック型プライマーとについて、PCR反応が等しく効率的であるという知見と一致する（Dobosy et al）。bpHDAの場合、RN2切断は100mU/μLまで律速的であり、またはPCR条件で用いられた場合よりも380倍高いRN2濃度であることが実証された。

HDAとbpHDAについての増幅速度の比較
方法：以下（表2〜3）に示す種々の濃度のbpHDA増幅のためのブロック型（tcdB7011f-RIBO/tcdB7089r-RIBO）DNAプライマーまたはHDA増幅のための非ブロック型（tcdB7011f/tcdB7089r）DNAプライマーのいずれかを含有する、最終濃度1×のABIIバッファー、3.85mM MgSO₄、40mM NaCl、0.4mM dNTP混合物、0.01％Tween-20、0.01％Triton X-100、5ng/μL uvrDヘリカーゼ、2ng/μL一本鎖結合性タンパク質、および0.8ng/μL GST DNAポリメラーゼ（BioHelix, Beverly, MA）を用いて、反応をセットアップした。RNase H2（IdT Technologies）を、bpHDA反応のために30mU/μLの最終濃度まで添加した。2×酵素ミックスを作製し、マイクロタイタープレートの個々のウェルに加えた。各ウェルに、水（鋳型不含対照）または100コピーのクロストリジウム・ディフィシレ（Clostridium difficile）630株ゲノムDNA（ATCC #BAA-1382D-5）を添加し、65℃でインキュベートした。反応を、増幅中に形成される二本鎖DNAへのEvaGreen色素の結合によりモニタリングした（LC480、Roche）。

結果および結論：表3から観察される通り、試験したすべてのプライマー濃度で、bpHDAアプローチ（ブロック型）は、HDA（非ブロック型）アプローチよりも顕著に速く毒素産生性C.ディフィシレ由来のゲノムDNAを増幅した。また、100コピーの投入ゲノムDNAのbpHDA増幅は清浄なtcdBアンプリコン産物を得たが、HDA増幅反応のうちの数種類は、増幅されたプライマーアーチファクトも含有した。鋳型不含対照由来の増幅産物（プライマーアーチファクト）は、増加するプライマー濃度を用いると、bpHDAおよびHDAの両方に対して、より短い横断時間を示したが、HDAの場合は、プライマーアーチファクト増幅横断時間（Ct）は、300nMのプライマー濃度により、100コピーのゲノムDNAの増幅の横断時間に近づき、このことは、検出限界に悪影響を与えるであろう増幅中の競合についての強い可能性を示した。検出限界に対するこの影響は、さらに高いプライマー濃度ではより明らかであろう。

bpHDA増幅速度に対するフラップTmの影響
方法：bpHDA増幅のための種々の濃度のブロック型DNAプライマー（表1〜2）を含有する、最終濃度1×のABIIバッファー、3.85mM MgSO₄、40mM NaCl、0.4mM dNTP混合物、0.01％Tween-20、0.01％Triton X-100、5ng/μL uvrDヘリカーゼ、2ng/μL一本鎖結合性タンパク質、および0.8ng/μL GST DNAポリメラーゼ（BioHelix, Beverly, MA）を用いて、反応をセットアップした。RNase H2（IdT Technologies）を、3mU/μLまたは30mU/μLの最終濃度まで添加した。2×酵素ミックスを作製し、マイクロタイタープレートの個々のウェルに加えた。各ウェルに、水（鋳型不含対照）または10,000コピーのクロストリジウム・ディフィシレ（Clostridium difficile）630株ゲノムDNA（ATCC #BAA-1382D-5）を添加し、65℃でインキュベートした。反応を、増幅中に形成される二本鎖DNAへのEvaGreen色素の結合によりモニタリングした（LC480、Roche）。

結果および結論：表6から分かる通り、プライマーミックス3およびプライマーミックス6の両方が、30mU/μLのRNase H2では非常に似通った増幅速度を有する。3mU/μLのRNase H2では、プライマーミックス6を用いたbpHDA増幅が約10％だけ遅くなる一方、プライマーミックス3は約70％遅く増幅する。プライマーTmに対するフラップの寄与は、プライマーミックス6で用いられたtcdB7011f-RIBOプライマーに関してより高く、このことは、bpHDA性能に対するフラップ安定性の強い影響を確証している。

bpHDA性能に対するRNase H2切断速度およびフラップ安定性の影響
方法：種々のブロック型プライマーのRNase H2切断速度を測定するために、クエンチ済み/蛍光プライマーを合成DNA鋳型（400nMプライマーおよび200nM鋳型)と、RNaseミックス（1×アニーリングバッファーII、3.85mM MgSO₄、40mM NaCl、5％Ficoll 400（Sigma)、7.5％Ficoll 70（Sigma)、5％スクロース（Sigma)、0.01％Tween-20（Sigma)、2.5mg/mLウシ血清アルブミン（Probumin、Calbiochem)、0.01％Triton X-100（Sigma)および10mU/μLピロコッカス・アビシ（Pyrococcus abyssi）RNase H2（Integrated DNA Technologies)）中でアニーリングさせ、70℃でインキュベートした。切断についてのT1/2は、Roche LightCycler480を用いてフロオレセインまたはHEX色素についての蛍光変化をモニタリングした場合に切断の最大半値を達成するのに必要とされる時間であった。プライマーTmは、最近傍熱動態演算（Oligo Analayzer、www.idtdna.com）を用い、60mM NaClおよび4mM MgSO₄、ならびに0.25μMオリゴに設定して測定した。bpHDA反応は、最終濃度1×のABIIバッファー、3.85mM MgSO₄、40mM NaCl、0.4mM dNTP混合物、0.01％Tween-20、0.01％Triton X-100、5ng/μL uvrDヘリカーゼ、2ng/μL一本鎖結合性タンパク質、0.8ng/μL GST DNAポリメラーゼ（BioHelix, Beverly, MA)、100nMのフォワードmecAプライマー（表7)、200nMリバースプライマー（mec990-bio-r2、すべての増幅反応で用いた)を用いてセットアップし、10mU/μLのRNase H2を各増幅反応で用いた。

結果：RN2切断速度は、切断されたプライマーと未切断プライマーとの間のΔTmに比例し；プライマーTmに対するフラップの寄与が大きければ大きいほど、RNase H2による切断が速い。このことは、フラップ安定性がRN2切断速度の重要な構成要素であることを示す。同様に、HDA速度は、RN2切断速度に比例し；ブロック型プライマーの切断が速ければ速いほど、bpHDAによる増幅が速い。

HDA反応を多重化（マルチプレックス化）する能力に対するブロック型プライマーの影響を調べた。各200nMのbpHDAのためのブロック型プライマー（mecA898-ribo、mecA990r-bio-ribo、tuf430L-bio-ribo、およびtuf527r-bio-ribo）と各100nMの標準的HDAのための非ブロック型プライマー（mecA898f、mecA990r、tuf430L、およびtuf527r）を含有する、最終濃度1×のABIIバッファー、3.85mM MgSO₄、40mM NaCl、0.4mM dNTP混合物、0.01％Tween-20、0.01％Triton X-100、5ng/μL uvrDヘリカーゼ、2ng/μL一本鎖結合性タンパク質、および0.8ng/μL GST DNAポリメラーゼ（BioHelix, Beverly, MA）を用いて、二重（デュープレックス）増幅反応をセットアップした。RNase H2（IdT Technologies）を、bpHDA反応のために10mU/μLの最終濃度まで添加した。2×酵素ミックスを作製し、マイクロタイタープレートの個々のウェルに加えた。メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ATCC 33592）、メチシリン耐性表皮ブドウ球菌（ATCC 700562、MRSepi）、またはメチシリン耐性スタフィロコッカス・ワーネリ（ATCC 27836、S. warneri）混入（spiked）陽性血液Cx（BACTEC、BD）を、アクロモペプチダーゼ（achromopeptidase）ベースの抽出バッファーを用いて抽出し、抽出された細胞にプライマーを添加して、2×鋳型/プライマーミックスを作製し、これを次に2×酵素ミックスに加えて、65℃にてインキュベートした。反応生成物を、臭化エチジウムで染色した2％アガロースゲルにて泳動した。この結果は、標準的HDAと比較してのこのアプローチの特異性の増大により、複数の核酸標的配列の同時増幅に対するbpHDAの利益を実証する。以下の表9に特定されているプライマー配列を用いた。

図6を参照すると、7レーンを有するゲルが示されている。レーン2および3から分かる通り、bpHDAは、良好な産物バランスを伴って、MRSAおよびMRSepiに対するtuf遺伝子およびmecA遺伝子の両方を増幅する。S.ワーネリ（レーン4）の場合、予想通り、tuf遺伝子のみが増幅される。標準的HDAの場合、MRSAは良好な産物バランスを有して増幅されるが（レーン4）、MRSepiの場合、tuf遺伝子増幅に対しては乏しい産物量が観察される（レーン6）。S.ワーネリに関しては、tuf遺伝子は良好に増幅される（レーン7）。

一実施形態では、核酸配列を増幅する方法は、(a)標的配列をブロック型プライマーと混合するステップであって、該プライマーは3’末端で修飾されて伸長が起こらなくなっており、かつ該プライマーは単一のリボヌクレオチドを含有する、上記ステップ；(b)標的配列およびブロック型プライマーの混合物を耐熱性RNase H2酵素およびHDA増幅試薬と接触させるステップ；(c)ステップ(b)の生成物の混合物を加熱して、それによりプライマーを脱ブロックさせるステップを含む。一部の実施形態では、HDA増幅試薬は、耐熱性である。一部の実施形態では、ヘリカーゼ依存的増幅試薬が非ブロック型プライマーを伸長して、二本鎖アンプリコンを生成し、これが、ブロック型プライマーにハイブリダイズすることができる一本鎖核酸アンプリコンへと変性される。

一部の実施形態では、RNase H2酵素は、1mU/μL以上の濃度で存在する。一部の実施形態では、RNase H2酵素は、3mU/μL以上の濃度で存在する。

一部の実施形態では、ブロック型プライマーは、一般式：5’-dNa-Nb-dNc-X-3’（式中、aは11以上の整数であり；bは1の整数であり；cは1以上の整数であり；dNはデオキシリボヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログであり；Nは非修飾リボヌクレオチドおよび/または修飾リボヌクレオチドであり；Xは、それによりDNAポリメラーゼによる伸長が起こらない、デオキシヌクレオチド、ヌクレオチド、ヌクレオチドアナログ、または非ヌクレオチド修飾であり；Nb-dNc-X部分がプライマーフラップを構成する）により表される。一部の実施形態では、プライマーフラップは、プライマーの融解温度を2℃超高める。一部の実施形態では、プライマーフラップは、少なくとも3塩基対からなり、少なくとも1個のシトシンまたはグアノシン塩基を含有する。一部の実施形態では、プライマーフラップは、シトシンまたはグアノシン塩基を有さず、少なくとも4塩基対からなる。一部の実施形態では、プライマーフラップは、シトシンまたはグアノシンを有さず、修飾塩基および副溝結合剤から選択される少なくとも2個の塩基からなる。一部の実施形態では、プライマーは、70℃でインキュベートされる10mU/μLのRNase H2、200nMの標的配列および400nMのブロック型プライマーを含有する切断アッセイを用いて、約15分以内に脱ブロックされる。一部の実施形態では、本方法により生成される増幅されたDNAは、約60分間未満で検出可能である。一部の実施形態では、本方法により生成される増幅されたDNAは、約30分間未満で検出可能である。一部の実施形態では、HDA増幅試薬は、バッファー、DNAポリメラーゼ、ヘリカーゼ、任意により一本鎖結合性タンパク質およびデオキシヌクレオチド三リン酸、ならびにそれらの組み合わせからなる群より選択される。

別の態様では、(a)その5’末端に単一のリボヌクレオチドを含み、その3’末端にブロック修飾を含み、それによりDNAポリメラーゼによる伸長が起こらないフラップを有するブロック型プライマー；(b)耐熱性RNase H酵素；および(c)耐熱性ヘリカーゼ依存的増幅試薬を含有する組成物が開示される。

Claims

以下のステップ：
(a)標的配列をブロック型プライマーと混合するステップであって、該ブロック型プライマーは、その5’末端に単一のリボヌクレオチドおよびその3’末端にブロック修飾を含むフラップを含み、それによりDNAポリメラーゼによる伸長が起こらない、上記ステップ；
(b)ステップ(a)の混合物を耐熱性RNase H酵素および耐熱性ヘリカーゼ依存的増幅試薬と接触させるステップ；
(c)ステップ(b)の混合物を加熱するステップであって、ここで、RNase H酵素がブロック型プライマーからフラップを除去することにより非ブロック型プライマーを生じ、ヘリカーゼ依存的増幅試薬が非ブロック型プライマーを伸長して二本鎖アンプリコンを生成し、これが、ブロック型プライマーにハイブリダイズすることができる一本鎖核酸アンプリコンへと変性されるステップ
を含む、等温核酸配列増幅法。
RNase H酵素がRNase H1である、請求項1に記載の方法。
RNase H酵素がRNase H2である、請求項1に記載の方法。
RNase H酵素が1mU/μL以上の濃度で存在する、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
RNase H酵素が3mU/μL以上の濃度で存在する、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
ブロック型プライマーが、以下の式：5’-dNa-Nb-dNc-X-3’
[式中、
aは11以上の整数であり；
bは1の整数であり；
cは1以上の整数であり；
dNはデオキシリボヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログであり；
Nは非修飾リボヌクレオチドまたは修飾リボヌクレオチドであり；
Xは、それによりDNAポリメラーゼによる伸長が起こらない、デオキシヌクレオチド、ヌクレオチド、ヌクレオチドアナログ、または非ヌクレオチド修飾である]
のものである、請求項1〜5のいずれか1項に記載の方法。
プライマーフラップがプライマーの融解温度を2℃超高める、請求項6に記載の方法。
プライマーフラップが、少なくとも3塩基対からなり、少なくとも1個のシトシンまたはグアノシン塩基を含有する、請求項6または7に記載の方法。
プライマーフラップが、シトシンまたはグアノシン塩基を有さず、少なくとも4塩基対からなる、請求項6または7に記載の方法。
プライマーフラップが、シトシンまたはグアノシンを有さず、修飾塩基および副溝結合剤から選択される少なくとも2個の塩基からなる、請求項6または7に記載の方法。
プライマーフラップが、70℃でインキュベートされる約10mU/μLのRNase H2、約200nMの標的配列、および約400nMのブロック型プライマーを含有する切断アッセイを用いて、約15分以内に除去される、請求項1〜10のいずれか1項に記載の方法。
アンプリコンが約60分間未満で検出可能である、請求項1〜11のいずれか1項に記載の方法。
アンプリコンが約30分間未満で検出可能である、請求項1〜12のいずれか1項に記載の方法。
HDA増幅試薬が、バッファー、DNAポリメラーゼ、ヘリカーゼ、一本鎖結合性タンパク質およびデオキシヌクレオチド三リン酸からなる群のうちの1以上から選択される、請求項1〜13のいずれか1項に記載の方法。
HDA増幅試薬が、バッファー、DNAポリメラーゼ、一本鎖結合性タンパク質およびデオキシヌクレオチド三リン酸からなる群のうちの1以上から選択される、請求項1〜14のいずれか1項に記載の方法。