JPH0731475A - 耐熱性酵素を用いる標的核酸配列の増幅法および検出法 - Google Patents
耐熱性酵素を用いる標的核酸配列の増幅法および検出法Info
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- JPH0731475A JPH0731475A JP18011593A JP18011593A JPH0731475A JP H0731475 A JPH0731475 A JP H0731475A JP 18011593 A JP18011593 A JP 18011593A JP 18011593 A JP18011593 A JP 18011593A JP H0731475 A JPH0731475 A JP H0731475A
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 特異性の高い増幅を可能とする。また保存時
の安定化を図る。 【構成】 ＤＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼのプロモータ
ー配列を有するプライマーを使用して標的核酸配列の多
数のＲＮＡコピーを増加させる複製ＲＮＡベースの増幅
系において、必要なＲＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ、Ｄ
ＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡ依存ＲＮＡポリメ
ラーゼをいずれも耐熱性酵素を使用する。 【効果】 従来の複製ＲＮＡベースの増幅法に比べ、安
定性の高い耐熱性酵素を用いるため、増幅効率が高く特
異性の高い核酸増幅法である。また加熱変性時にも酵素
群の失活がなく、酵素の逐次添加の必要がない。さらに
増幅の際に反応容器を密閉したままで実施できることか
ら、増幅法で大きな問題となるコンタミも低減できる。
の安定化を図る。 【構成】 ＤＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼのプロモータ
ー配列を有するプライマーを使用して標的核酸配列の多
数のＲＮＡコピーを増加させる複製ＲＮＡベースの増幅
系において、必要なＲＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ、Ｄ
ＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡ依存ＲＮＡポリメ
ラーゼをいずれも耐熱性酵素を使用する。 【効果】 従来の複製ＲＮＡベースの増幅法に比べ、安
定性の高い耐熱性酵素を用いるため、増幅効率が高く特
異性の高い核酸増幅法である。また加熱変性時にも酵素
群の失活がなく、酵素の逐次添加の必要がない。さらに
増幅の際に反応容器を密閉したままで実施できることか
ら、増幅法で大きな問題となるコンタミも低減できる。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は特定の核酸配列の増幅法
およびその増幅法により得られた特定核酸配列のＲＮＡ
コピーまたはＤＮＡコピーから目的とする核酸配列を検
出する方法およびそれらの試薬キットに関する。
およびその増幅法により得られた特定核酸配列のＲＮＡ
コピーまたはＤＮＡコピーから目的とする核酸配列を検
出する方法およびそれらの試薬キットに関する。
【０００２】
【従来の技術】ＤＮＡまたはＲＮＡ等の遺伝子の検出に
よる疾病の診断方法が、細菌やウイルス等の検出のため
に開発されている。ある種の検体では、直接検出するの
に充分量の核酸が存在するが、目的遺伝子が非常に少量
であったり、存在比が非常に小さい場合、直接目的遺伝
子を検出することは困難である。従来は細胞培養法や細
菌培養法により目的遺伝子を増やすことが行われてきた
が、これらの方法では長時間を要するという欠点があっ
た。
よる疾病の診断方法が、細菌やウイルス等の検出のため
に開発されている。ある種の検体では、直接検出するの
に充分量の核酸が存在するが、目的遺伝子が非常に少量
であったり、存在比が非常に小さい場合、直接目的遺伝
子を検出することは困難である。従来は細胞培養法や細
菌培養法により目的遺伝子を増やすことが行われてきた
が、これらの方法では長時間を要するという欠点があっ
た。
【０００３】また他の標的核酸増幅法としてポリメラー
ゼ連鎖反応（ＰＣＲ；特公平４−６７９５７公報）法が
知られている。この方法では、標的核酸の増幅の程度は
サイクル数によって調整される。増幅率は理論的には２
n （ｎはサイクル数）で求められる。実際に検出可能量
まで標的核酸を増幅するには２０〜３０サイクルが必要
であった。
ゼ連鎖反応（ＰＣＲ；特公平４−６７９５７公報）法が
知られている。この方法では、標的核酸の増幅の程度は
サイクル数によって調整される。増幅率は理論的には２
n （ｎはサイクル数）で求められる。実際に検出可能量
まで標的核酸を増幅するには２０〜３０サイクルが必要
であった。
【０００４】またさらに別の核酸増幅法として、複製Ｒ
ＮＡベースの増幅系が知られている（特開平２−５８６
４、特開平２−５００５６５、特開平２−５０１５３
２）。これらの方法は、標的核酸から二本鎖ＤＮＡを合
成する際に用いるプライマーに、ＤＮＡ依存ＲＮＡポリ
メラーゼのプロモーター配列を含有させることにより、
二本鎖ＤＮＡ合成に引き続き、合成された二本鎖ＤＮＡ
を鋳型とし、ＤＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼによって、
標的核酸に相当するＲＮＡが合成される。更に合成され
たＲＮＡからＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼによって
ＤＮＡ／ＲＮＡ鎖が合成され、ＤＮＡ鎖を分離し一本鎖
のＤＮＡを得る。ＤＮＡの分離の方法としては加熱変性
による方法（特開平２−５００５６５，特開平２−５０
１５３２）とリボヌクレアーゼＨを用いる方法（特開平
２−５８６４）が知られている。こうして得た一本鎖Ｄ
ＮＡとプライマーによって、ＤＮＡ依存ＲＮＡポリメラ
ーゼのプロモーター配列を含む二本鎖ＤＮＡ合成を行い
ＲＮＡ転写反応を行う。この方法によれば、ＤＮＡ依存
ＲＮＡポリメラーゼにより一分子の二本鎖核酸から数十
から数千分子のＲＮＡを転写増幅することができ、ＰＣ
Ｒ法に比べ１サイクル当たりの増幅効率が高い。またリ
ボヌクレアーゼＨを用いた場合、ＰＣＲ法の際必要であ
った温度サイクルが不要であり、より簡便に増幅が可能
である。
ＮＡベースの増幅系が知られている（特開平２−５８６
４、特開平２−５００５６５、特開平２−５０１５３
２）。これらの方法は、標的核酸から二本鎖ＤＮＡを合
成する際に用いるプライマーに、ＤＮＡ依存ＲＮＡポリ
メラーゼのプロモーター配列を含有させることにより、
二本鎖ＤＮＡ合成に引き続き、合成された二本鎖ＤＮＡ
を鋳型とし、ＤＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼによって、
標的核酸に相当するＲＮＡが合成される。更に合成され
たＲＮＡからＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼによって
ＤＮＡ／ＲＮＡ鎖が合成され、ＤＮＡ鎖を分離し一本鎖
のＤＮＡを得る。ＤＮＡの分離の方法としては加熱変性
による方法（特開平２−５００５６５，特開平２−５０
１５３２）とリボヌクレアーゼＨを用いる方法（特開平
２−５８６４）が知られている。こうして得た一本鎖Ｄ
ＮＡとプライマーによって、ＤＮＡ依存ＲＮＡポリメラ
ーゼのプロモーター配列を含む二本鎖ＤＮＡ合成を行い
ＲＮＡ転写反応を行う。この方法によれば、ＤＮＡ依存
ＲＮＡポリメラーゼにより一分子の二本鎖核酸から数十
から数千分子のＲＮＡを転写増幅することができ、ＰＣ
Ｒ法に比べ１サイクル当たりの増幅効率が高い。またリ
ボヌクレアーゼＨを用いた場合、ＰＣＲ法の際必要であ
った温度サイクルが不要であり、より簡便に増幅が可能
である。
【０００５】
【発明が解決しようする課題】複製ＲＮＡベースの増幅
系では増幅効率が高いが、反応系で使用する従来の酵
素、すなわちＲＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡ依
存ＲＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ
は熱安定性が低いため、増幅反応時の温度を高くするこ
とが出来ず、鋳型となる核酸とプライマー間での非特異
的ハイブリダイゼーションを避けることが出来ず、特異
性の低下が問題となる。また酵素の試薬としての供給
時、保存時に不安定性は大きな問題となり、冷凍保存や
冷蔵保存が必要となる。またリボヌクレアーゼＨを使用
しない増幅法では二本鎖核酸の変性に加熱変性を用いる
が、酵素が不安定であるため加熱の度に酵素群を逐次添
加する必要がある。本発明の目的は、非特異的ハイブリ
ダイゼーションによる特異性の低下、酵素試薬の供給、
保存時の不安定を解決する方法を提供するにある。
系では増幅効率が高いが、反応系で使用する従来の酵
素、すなわちＲＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡ依
存ＲＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ
は熱安定性が低いため、増幅反応時の温度を高くするこ
とが出来ず、鋳型となる核酸とプライマー間での非特異
的ハイブリダイゼーションを避けることが出来ず、特異
性の低下が問題となる。また酵素の試薬としての供給
時、保存時に不安定性は大きな問題となり、冷凍保存や
冷蔵保存が必要となる。またリボヌクレアーゼＨを使用
しない増幅法では二本鎖核酸の変性に加熱変性を用いる
が、酵素が不安定であるため加熱の度に酵素群を逐次添
加する必要がある。本発明の目的は、非特異的ハイブリ
ダイゼーションによる特異性の低下、酵素試薬の供給、
保存時の不安定を解決する方法を提供するにある。
【０００６】
【課題を解決するための手段】すなわち本発明は下記工
程を含むことを特徴とする耐熱性酵素を用いる標的核酸
配列の増幅法である。 工程１：標的核酸を必要により変性処理した一本鎖の第
一鋳型核酸に、第一鋳型の核酸配列に対して十分に相補
的な核酸配列を有する第一プライマーをハイブリダイズ
させ、耐熱性ＤＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼおよび／ま
たは耐熱性ＲＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼにより第一プ
ライマーを伸長させて、第一鋳型核酸に相補的な第二鋳
型である第一プライマー伸長物を得る； 工程２：第一鋳型核酸から第一プライマー伸長物を分離
して一本鎖の第二鋳型核酸を得る； 工程３：一本鎖の第二鋳型核酸に、第二鋳型の核酸配列
に対して相補的な核酸配列およびその５’末端側にプロ
モーター配列を有する第二プライマーをハイブリダイズ
させ、耐熱性ＤＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼにより伸長
し、第二鋳型核酸に相補的な第二プライマー伸長物を
得、このようにして機能可能なプロモーター配列に結合
した標的核酸配列を有する二本鎖ＤＮＡ中間体を生成さ
せる;（ここで第一プライマーは標的核酸配列に相補的
であり、第二プライマーは標的核酸配列に対して相同的
であり、第一プライマーの３’末端は相補的鎖上の第二
プライマーの３’末端に向けられる） 工程４：前記プロモーター配列を認識することができる
耐熱性ＤＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼを用いて、前記二
本鎖ＤＮＡ中間体から前記標的核酸配列の多数のＲＮＡ
コピーを増加させる:そして 工程５：必要により前記ＲＮＡコピーを第一鋳型核酸と
して用いて前記工程１から工程４を必要な回数繰り返
す。
程を含むことを特徴とする耐熱性酵素を用いる標的核酸
配列の増幅法である。 工程１：標的核酸を必要により変性処理した一本鎖の第
一鋳型核酸に、第一鋳型の核酸配列に対して十分に相補
的な核酸配列を有する第一プライマーをハイブリダイズ
させ、耐熱性ＤＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼおよび／ま
たは耐熱性ＲＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼにより第一プ
ライマーを伸長させて、第一鋳型核酸に相補的な第二鋳
型である第一プライマー伸長物を得る； 工程２：第一鋳型核酸から第一プライマー伸長物を分離
して一本鎖の第二鋳型核酸を得る； 工程３：一本鎖の第二鋳型核酸に、第二鋳型の核酸配列
に対して相補的な核酸配列およびその５’末端側にプロ
モーター配列を有する第二プライマーをハイブリダイズ
させ、耐熱性ＤＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼにより伸長
し、第二鋳型核酸に相補的な第二プライマー伸長物を
得、このようにして機能可能なプロモーター配列に結合
した標的核酸配列を有する二本鎖ＤＮＡ中間体を生成さ
せる;（ここで第一プライマーは標的核酸配列に相補的
であり、第二プライマーは標的核酸配列に対して相同的
であり、第一プライマーの３’末端は相補的鎖上の第二
プライマーの３’末端に向けられる） 工程４：前記プロモーター配列を認識することができる
耐熱性ＤＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼを用いて、前記二
本鎖ＤＮＡ中間体から前記標的核酸配列の多数のＲＮＡ
コピーを増加させる:そして 工程５：必要により前記ＲＮＡコピーを第一鋳型核酸と
して用いて前記工程１から工程４を必要な回数繰り返
す。
【０００７】また本発明は上記増幅法により標的核酸の
増幅産物である一本鎖ＲＮＡ、二重鎖ＤＮＡまたはＤＮ
Ａ／ＲＮＡハイブリッドに、必要により変性処理を行っ
た後標識プローブをハイブリダイズさせ、ハイブリダイ
ズした標識プローブの標識またはハイブリダイズしない
標識プローブの標識を検出することを特徴とする標的核
酸配列の検出法である。
増幅産物である一本鎖ＲＮＡ、二重鎖ＤＮＡまたはＤＮ
Ａ／ＲＮＡハイブリッドに、必要により変性処理を行っ
た後標識プローブをハイブリダイズさせ、ハイブリダイ
ズした標識プローブの標識またはハイブリダイズしない
標識プローブの標識を検出することを特徴とする標的核
酸配列の検出法である。
【０００８】さらに本発明は標的核酸配列を増幅するた
めの試薬キットであって、(a) 第一鋳型の核酸配列に対
して十分に相補的な核酸配列を有する第一プライマー、
(b) 第二鋳型の核酸配列に対して相補的な核酸配列およ
びその５’末端側にプロモーター配列を有する第二プラ
イマー、(c) 耐熱性ＲＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ、
(d) 耐熱性ＤＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼ、(e) 耐熱性
ＤＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ、(f) リボヌクレオシド
トリホスフェートおよび(g) デオキシリボヌクレオシド
トリホスフェートとを含み、但し、第一プライマーは標
的核酸配列に相補的であり、第二プライマーは標的核酸
配列に対して相同的であり、第一プライマーの３’末端
は相補的鎖上の第二プライマーの３’末端に向けられる
ことを特徴とする耐熱性酵素を用いる標的核酸配列の増
幅用試薬キットである。
めの試薬キットであって、(a) 第一鋳型の核酸配列に対
して十分に相補的な核酸配列を有する第一プライマー、
(b) 第二鋳型の核酸配列に対して相補的な核酸配列およ
びその５’末端側にプロモーター配列を有する第二プラ
イマー、(c) 耐熱性ＲＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ、
(d) 耐熱性ＤＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼ、(e) 耐熱性
ＤＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ、(f) リボヌクレオシド
トリホスフェートおよび(g) デオキシリボヌクレオシド
トリホスフェートとを含み、但し、第一プライマーは標
的核酸配列に相補的であり、第二プライマーは標的核酸
配列に対して相同的であり、第一プライマーの３’末端
は相補的鎖上の第二プライマーの３’末端に向けられる
ことを特徴とする耐熱性酵素を用いる標的核酸配列の増
幅用試薬キットである。
【０００９】また本発明は標的核酸配列を増幅するため
の試薬キットであって、(a) 第一鋳型の核酸配列に対し
て十分に相補的な核酸配列およびその５’末端側にプロ
モーター配列を有する第一プライマー、(b) 第二鋳型の
核酸配列に対して相補的な核酸配列およびその５’末端
側にプロモーター配列を有する第二プライマー、(c) 耐
熱性ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、(d) 耐熱性ＤＮ
Ａ依存性ＲＮＡポリメラーゼ、(e) 耐熱性ＤＮＡ依存性
ＤＮＡポリメラーゼ、(f) リボヌクレオシドトリホスフ
ェートおよび(g) デオキシリボヌクレオシドトリホスフ
ェートとを含み、但し、第一プライマー標的核酸配列に
相補的であり、第二プライマーは標的核酸配列配列に対
して相同的であり、第一プライマーの３’末端は相補的
鎖上の第２プライマーの３’末端に向けられることを特
徴とする耐熱性酵素を用いる標的核酸配列の増幅用試薬
キットである。
の試薬キットであって、(a) 第一鋳型の核酸配列に対し
て十分に相補的な核酸配列およびその５’末端側にプロ
モーター配列を有する第一プライマー、(b) 第二鋳型の
核酸配列に対して相補的な核酸配列およびその５’末端
側にプロモーター配列を有する第二プライマー、(c) 耐
熱性ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、(d) 耐熱性ＤＮ
Ａ依存性ＲＮＡポリメラーゼ、(e) 耐熱性ＤＮＡ依存性
ＤＮＡポリメラーゼ、(f) リボヌクレオシドトリホスフ
ェートおよび(g) デオキシリボヌクレオシドトリホスフ
ェートとを含み、但し、第一プライマー標的核酸配列に
相補的であり、第二プライマーは標的核酸配列配列に対
して相同的であり、第一プライマーの３’末端は相補的
鎖上の第２プライマーの３’末端に向けられることを特
徴とする耐熱性酵素を用いる標的核酸配列の増幅用試薬
キットである。
【００１０】本発明の標的核酸はＤＮＡであってもＲＮ
Ａであってもよい。二本鎖の場合や一本鎖であっても高
次構造をとっているような場合は予め加熱、酸、アルカ
リ等の変性処理により一本鎖として増幅反応に供する。
Ａであってもよい。二本鎖の場合や一本鎖であっても高
次構造をとっているような場合は予め加熱、酸、アルカ
リ等の変性処理により一本鎖として増幅反応に供する。
【００１１】本発明において使用する第一プライマー
は、標的核酸配列である第一鋳型の核酸配列に対して十
分に相補的な核酸配列を有する。第一プライマーの３’
末端は相補的鎖上の第二プライマーの３’末端に向けら
れる。また本発明における第二プライマーは第二鋳型の
核酸配列に対して相補的な核酸配列およびその５’末端
側にプロモーター配列を有し、標的核酸配列に対して十
分に相同である。第一プライマーは第一鋳型の核酸配列
に対して相補的な核酸配列に加えて必要によりその５’
末端側にプロモーター配列を有していてもよい。第一プ
ライマーにプロモーター配列を有している場合、この第
一プライマー、第二のプライマーのプロモーターはそれ
ぞれ異なっていても同一であってもよい。異なる場合は
それぞれのプロモーターに作用する耐熱性ＤＮＡ依存Ｒ
ＮＡポリメラーゼを必要により複数種用いる。プロモー
ターの種類によっては一種の耐熱性ＤＮＡ依存ＲＮＡポ
リメラーゼにより２種のプロモーターともに機能するよ
うに選択することも可能である。第一プライマー、第二
プライマー共にプロモーター機能を持たせることで増幅
効率をより高めることが可能である。
は、標的核酸配列である第一鋳型の核酸配列に対して十
分に相補的な核酸配列を有する。第一プライマーの３’
末端は相補的鎖上の第二プライマーの３’末端に向けら
れる。また本発明における第二プライマーは第二鋳型の
核酸配列に対して相補的な核酸配列およびその５’末端
側にプロモーター配列を有し、標的核酸配列に対して十
分に相同である。第一プライマーは第一鋳型の核酸配列
に対して相補的な核酸配列に加えて必要によりその５’
末端側にプロモーター配列を有していてもよい。第一プ
ライマーにプロモーター配列を有している場合、この第
一プライマー、第二のプライマーのプロモーターはそれ
ぞれ異なっていても同一であってもよい。異なる場合は
それぞれのプロモーターに作用する耐熱性ＤＮＡ依存Ｒ
ＮＡポリメラーゼを必要により複数種用いる。プロモー
ターの種類によっては一種の耐熱性ＤＮＡ依存ＲＮＡポ
リメラーゼにより２種のプロモーターともに機能するよ
うに選択することも可能である。第一プライマー、第二
プライマー共にプロモーター機能を持たせることで増幅
効率をより高めることが可能である。
【００１２】本発明に用いるプロモーター配列は特に制
限はないが、耐熱性ＤＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼが作
用するように機能する配列である必要がある。このよう
なプロモーター配列としては、例えばサーマス サーモ
フィルス(Thermus thermphilus) のＤＮＡ依存ＲＮＡポ
リメラーゼならば、 5'-TTCGCGCCCATCGTACACCGAGGCGGTATCCTC-3' 5'-CTTGACGGAGGCGGACGGCGCTGGTACACT-3' 5'-CTGGACAGGGCCCCCGTGTCCCGCTATCCT-3' 5'-CTAGCCTCAGGGCTTCCATGGGTGCTATACT-3' 5'-CTTGACCCCGCAGGCCTCGAGGGCTTACCT-3' が知られている。
限はないが、耐熱性ＤＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼが作
用するように機能する配列である必要がある。このよう
なプロモーター配列としては、例えばサーマス サーモ
フィルス(Thermus thermphilus) のＤＮＡ依存ＲＮＡポ
リメラーゼならば、 5'-TTCGCGCCCATCGTACACCGAGGCGGTATCCTC-3' 5'-CTTGACGGAGGCGGACGGCGCTGGTACACT-3' 5'-CTGGACAGGGCCCCCGTGTCCCGCTATCCT-3' 5'-CTAGCCTCAGGGCTTCCATGGGTGCTATACT-3' 5'-CTTGACCCCGCAGGCCTCGAGGGCTTACCT-3' が知られている。
【００１３】その外以下のものがある。 5'-CTTGACGCCGCCCAGGGCGGGCCTCTACCCT-3' 5'-TTTGAGGGCCTGGGGCAGTACCTCTTCT-3' 5'-TTTGTAAAGTGCTTTATTTCACAAAACT-3' 5'-TTTCACAAAACTGTCCCTCCCCCCGGGTTAGACT-3' 5'-TTGACACTCTCGGGCGGGTGTGCTAGCCT-3' 5'-CTTGAGGATCTCGGGGAGGCGGGCTTCCAT-3' 5'-TTGGGGTGGAGGAGCTTCTGCCGTAGAAT-3' 5'-CTTGACAAAAAGGAGGGGGATTGATAGCAT-3' 5'-CGTGAGGGCCACGGCGAGCGCGCCTAGGGGT-3' 5'-CTAGTCCAAGGGAAAGTATAGCCCAAGGTACACT-3' 5'-CTTGACGTGAAACTTGAAGACCACCATCTCAA-3'
【００１４】一般にファージのプロモーターは特異性が
高いが、その他の生物のプロモーターは必ずしも特異性
が高いとは言えない場合がある。ここで言う特異性の高
さとは、プロモーターに依存するＤＮＡ依存ＲＮＡポリ
メラーゼが作用できるプロモーター配列が、そのＤＮＡ
依存ＲＮＡポリメラーゼには一種または複数あっても非
常に少ないこと、またプロモーターとしての活性が非常
に低いことを言う。従って検出しようとする試料核酸中
に各種プロモーターが存在していても実質上問題なく特
異的にプロモーターに依存性するＤＮＡ依存性ＲＮＡポ
リメラーゼが作用できることを示す。
高いが、その他の生物のプロモーターは必ずしも特異性
が高いとは言えない場合がある。ここで言う特異性の高
さとは、プロモーターに依存するＤＮＡ依存ＲＮＡポリ
メラーゼが作用できるプロモーター配列が、そのＤＮＡ
依存ＲＮＡポリメラーゼには一種または複数あっても非
常に少ないこと、またプロモーターとしての活性が非常
に低いことを言う。従って検出しようとする試料核酸中
に各種プロモーターが存在していても実質上問題なく特
異的にプロモーターに依存性するＤＮＡ依存性ＲＮＡポ
リメラーゼが作用できることを示す。
【００１５】一方、細菌その他の生物ではＤＮＡ依存Ｒ
ＮＡポリメラーゼが作用するプロモーター配列は必ずし
も一種類ではなく、複数種のプロモーター配列が存在す
ることが知られている。細菌や真菌類では共通性の高い
ものも存在する。従って検出しようとする試料核酸中に
も用いるＤＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼが作用するプロ
モーター配列が存在する可能性も考えられる。
ＮＡポリメラーゼが作用するプロモーター配列は必ずし
も一種類ではなく、複数種のプロモーター配列が存在す
ることが知られている。細菌や真菌類では共通性の高い
ものも存在する。従って検出しようとする試料核酸中に
も用いるＤＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼが作用するプロ
モーター配列が存在する可能性も考えられる。
【００１６】本発明ではこのような点も考慮して検討を
進めた結果、耐熱性ＤＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼの作
用可能な５０〜７０℃で反応することにより、非特異的
なプロモーター機能が発現されないため特異性の高い増
幅および検出が可能である。
進めた結果、耐熱性ＤＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼの作
用可能な５０〜７０℃で反応することにより、非特異的
なプロモーター機能が発現されないため特異性の高い増
幅および検出が可能である。
【００１７】第一プライマーおよび第二プライマーとな
るオリゴヌクレオチドは、例えばＡＢＩ社（Applied Bi
osystems Inc. ）のＤＮＡシンセサイザー３９１型を用
いてホスホアミダイト法により合成できる。他の合成法
としてリン酸トリエステル法、Ｈ−ホスホネート法、チ
オホスファイト法等がある。また生物学的起源、例えば
制限エンドヌクレアーゼ消化物から単離してもかまわな
い。プライマーとして機能するように設定された核酸な
らば長さ、構造に特に制限はない。一般に第一プライマ
ーおよび第二プライマーの第一鋳型あるいは第二鋳型に
相補的な部分は、６〜５０ヌクレオチド、好ましくは１
０〜３０ヌクレオチドである。またプロモーター領域と
標的核酸とハイブリダイズするプライマー領域との間に
スペーサーを設けることも可能であるが、このスペーサ
ーは一般に０〜１００ヌクレオチド、好ましくは０〜２
０ヌクレオチドがよい。
るオリゴヌクレオチドは、例えばＡＢＩ社（Applied Bi
osystems Inc. ）のＤＮＡシンセサイザー３９１型を用
いてホスホアミダイト法により合成できる。他の合成法
としてリン酸トリエステル法、Ｈ−ホスホネート法、チ
オホスファイト法等がある。また生物学的起源、例えば
制限エンドヌクレアーゼ消化物から単離してもかまわな
い。プライマーとして機能するように設定された核酸な
らば長さ、構造に特に制限はない。一般に第一プライマ
ーおよび第二プライマーの第一鋳型あるいは第二鋳型に
相補的な部分は、６〜５０ヌクレオチド、好ましくは１
０〜３０ヌクレオチドである。またプロモーター領域と
標的核酸とハイブリダイズするプライマー領域との間に
スペーサーを設けることも可能であるが、このスペーサ
ーは一般に０〜１００ヌクレオチド、好ましくは０〜２
０ヌクレオチドがよい。
【００１８】本発明にいう耐熱性酵素とは、ハイブリダ
イゼーションを特異的に行うために５０〜７０℃で酵素
反応が実施可能であり、核酸の加熱変性を行う９０〜９
５℃、１０秒〜１０分程度でも失活の少ない酵素をい
う。またこのような酵素は一般的に冷蔵保存、室温保存
でも十分安定であり、冷凍保存の必要がない場合が多
く、供給時、保存時の安定性もよい。
イゼーションを特異的に行うために５０〜７０℃で酵素
反応が実施可能であり、核酸の加熱変性を行う９０〜９
５℃、１０秒〜１０分程度でも失活の少ない酵素をい
う。またこのような酵素は一般的に冷蔵保存、室温保存
でも十分安定であり、冷凍保存の必要がない場合が多
く、供給時、保存時の安定性もよい。
【００１９】耐熱性ＲＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ（耐
熱性逆転写酵素とも呼ぶ）としては、サーマス・サーモ
フィルス(Thermus thermophilus)、サーマス・アクアテ
ィカス(Thermus aquaticus) 由来のＤＮＡ依存ＤＮＡポ
リメラーゼに活性があることが知られている。耐熱性Ｄ
ＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼ（耐熱性ＲＮＡポリメラー
ゼとも呼ぶ）としては、サーマス・サーモフィルス(The
rmus thermophilus)由来などが挙げられる。該耐熱性Ｄ
ＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼはプロモーター配列を認識
することができる。耐熱性ＤＮＡ依存ＤＮＡポリメラー
ゼ（耐熱性ＤＮＡポリメラーゼとも呼ぶ）としては、サ
ーマス・サーモフィルス(Thermus thermophilus)、サー
マス・アクアティカス(Thermus aquaticus) 、ピロコッ
カス・フリオサス(Pyrococcus furiosus) 、サーモコッ
カス・リトラリス(Thermococcus kitorakis)、サーマス
・フラビス(Thermus flavus)由来などが挙げられる。
熱性逆転写酵素とも呼ぶ）としては、サーマス・サーモ
フィルス(Thermus thermophilus)、サーマス・アクアテ
ィカス(Thermus aquaticus) 由来のＤＮＡ依存ＤＮＡポ
リメラーゼに活性があることが知られている。耐熱性Ｄ
ＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼ（耐熱性ＲＮＡポリメラー
ゼとも呼ぶ）としては、サーマス・サーモフィルス(The
rmus thermophilus)由来などが挙げられる。該耐熱性Ｄ
ＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼはプロモーター配列を認識
することができる。耐熱性ＤＮＡ依存ＤＮＡポリメラー
ゼ（耐熱性ＤＮＡポリメラーゼとも呼ぶ）としては、サ
ーマス・サーモフィルス(Thermus thermophilus)、サー
マス・アクアティカス(Thermus aquaticus) 、ピロコッ
カス・フリオサス(Pyrococcus furiosus) 、サーモコッ
カス・リトラリス(Thermococcus kitorakis)、サーマス
・フラビス(Thermus flavus)由来などが挙げられる。
【００２０】本発明の工程１では必要により変性処理し
た単鎖の第一鋳型核酸に、第一プライマーをハイブリダ
イズさせ、デオキシリボヌクレオシドトリホスフェート
の存在下に、耐熱性ＤＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼおよ
び／または耐熱性ＲＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼにより
伸長させて、第一鋳型核酸に相補的な第二鋳型である第
一プライマー伸長物を得る。第一プライマー伸長物は、
第一鋳型がＲＮＡの場合には、耐熱性ＲＮＡ依存ＤＮＡ
ポリメラーゼ、第一プライマー伸長物は、第一鋳型がＤ
ＮＡの場合には、耐熱性ＤＮＡ依存ＤＮＡポリメラー
ゼ、標的核酸配列がＤＮＡおよびＲＮＡを含む場合は、
耐熱性ＤＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼおよび耐熱性ＲＮ
Ａ依存ＤＮＡポリメラーゼにより伸長させて、ＤＮＡ伸
長生成物を得る。
た単鎖の第一鋳型核酸に、第一プライマーをハイブリダ
イズさせ、デオキシリボヌクレオシドトリホスフェート
の存在下に、耐熱性ＤＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼおよ
び／または耐熱性ＲＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼにより
伸長させて、第一鋳型核酸に相補的な第二鋳型である第
一プライマー伸長物を得る。第一プライマー伸長物は、
第一鋳型がＲＮＡの場合には、耐熱性ＲＮＡ依存ＤＮＡ
ポリメラーゼ、第一プライマー伸長物は、第一鋳型がＤ
ＮＡの場合には、耐熱性ＤＮＡ依存ＤＮＡポリメラー
ゼ、標的核酸配列がＤＮＡおよびＲＮＡを含む場合は、
耐熱性ＤＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼおよび耐熱性ＲＮ
Ａ依存ＤＮＡポリメラーゼにより伸長させて、ＤＮＡ伸
長生成物を得る。
【００２１】一般にＲＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼには
ＤＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ活性が存在すること、ま
たサーマス・サーモフィルス由来、サーマス・アクアテ
ィカス由来のＤＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼにはＲＮＡ
依存ＤＮＡポリメラーゼ活性が存在することが知られて
おり、両活性をもつ一種のＤＮＡポリメラーゼを共通に
用いることも可能である。
ＤＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ活性が存在すること、ま
たサーマス・サーモフィルス由来、サーマス・アクアテ
ィカス由来のＤＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼにはＲＮＡ
依存ＤＮＡポリメラーゼ活性が存在することが知られて
おり、両活性をもつ一種のＤＮＡポリメラーゼを共通に
用いることも可能である。
【００２２】本発明の工程２では、第一鋳型からの伸長
生成物を第一鋳型核酸から分離して一本鎖の第二鋳型核
酸とする。分離法としては酸、アルアリ、加熱などの方
法による。特に第一鋳型核酸から第二鋳型核酸の分離を
加熱変性により行うことが好ましい。
生成物を第一鋳型核酸から分離して一本鎖の第二鋳型核
酸とする。分離法としては酸、アルアリ、加熱などの方
法による。特に第一鋳型核酸から第二鋳型核酸の分離を
加熱変性により行うことが好ましい。
【００２３】本発明の工程３では一本鎖の第二鋳型核酸
にその５’末端側にプロモーター配列を有する第二プラ
イマーをハイブリダイズさせ、耐熱性ＤＮＡ依存ＤＮＡ
ポリメラーゼにより伸長し、第二鋳型核酸に相補的な第
二プライマー伸長物を得る。第二プライマー伸長物は機
能可能なプロモーター配列に結合した標的核酸配列を有
する二本鎖ＤＮＡ中間体である。また工程１における第
一鋳型に相補的な第一プロモーターとして、５’末端側
にプロモーター配列を有するプライマーを用いてもよ
い。工程１で用いた耐熱性ＤＮＡポリメラーゼがＤＮＡ
依存ＤＮＡポリメラーゼ活性をもつ場合本工程３の耐熱
性ＤＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼと共用することができ
る。
にその５’末端側にプロモーター配列を有する第二プラ
イマーをハイブリダイズさせ、耐熱性ＤＮＡ依存ＤＮＡ
ポリメラーゼにより伸長し、第二鋳型核酸に相補的な第
二プライマー伸長物を得る。第二プライマー伸長物は機
能可能なプロモーター配列に結合した標的核酸配列を有
する二本鎖ＤＮＡ中間体である。また工程１における第
一鋳型に相補的な第一プロモーターとして、５’末端側
にプロモーター配列を有するプライマーを用いてもよ
い。工程１で用いた耐熱性ＤＮＡポリメラーゼがＤＮＡ
依存ＤＮＡポリメラーゼ活性をもつ場合本工程３の耐熱
性ＤＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼと共用することができ
る。
【００２４】本発明の工程４ではプロモーター配列を認
識することができる耐熱性ＤＮＡ依存ＲＮＡポリメラー
ゼを用いて、工程３で得られた二本鎖ＤＮＡ中間体から
標的配列の多数のＲＮＡコピーを増加させる。
識することができる耐熱性ＤＮＡ依存ＲＮＡポリメラー
ゼを用いて、工程３で得られた二本鎖ＤＮＡ中間体から
標的配列の多数のＲＮＡコピーを増加させる。
【００２５】本発明の工程５では必要により工程４で得
られたＲＮＡコピーを第一鋳型核酸として用いて、上記
工程１から工程４を必要な回数繰り返すことにより、標
的核酸配列を有するＤＮＡおよび／またはＲＮＡを増幅
することができる。
られたＲＮＡコピーを第一鋳型核酸として用いて、上記
工程１から工程４を必要な回数繰り返すことにより、標
的核酸配列を有するＤＮＡおよび／またはＲＮＡを増幅
することができる。
【００２６】本発明の増幅法では試薬の逐次添加を行わ
ず、上記工程１〜５を実施することが好ましい。本発明
のハイブリダイゼーション温度は、５０〜８０℃、好ま
しくは５０〜７０℃であり３種の耐熱性核酸ポリメラー
ゼが効率よく反応する温度が選択される。
ず、上記工程１〜５を実施することが好ましい。本発明
のハイブリダイゼーション温度は、５０〜８０℃、好ま
しくは５０〜７０℃であり３種の耐熱性核酸ポリメラー
ゼが効率よく反応する温度が選択される。
【００２７】すなわち本発明は複製ＲＮＡベースの増幅
系に必要なＲＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡ依存
ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼを
いずれも、耐熱性酵素とすることにより、標的核酸の増
幅反応を核酸鋳型とプライマー間の非特異ハイブリダイ
ゼーションを生じさせないのに充分な高温で実施するこ
とができる。その結果として非特異的増幅が生じず、特
異性の高い増幅が可能となる。また耐熱性酵素は低温で
は勿論のこと常温でも安定であり、供給時にも保存時に
も活性の低下が殆どなく、不安定性の解消が可能であ
る。またリボヌクレアーゼＨを用いず加熱により変性を
行う場合でも耐熱性酵素を用いることで酵素群の失活を
防止し酵素を逐次添加することなく増幅が可能となる。
系に必要なＲＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡ依存
ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼを
いずれも、耐熱性酵素とすることにより、標的核酸の増
幅反応を核酸鋳型とプライマー間の非特異ハイブリダイ
ゼーションを生じさせないのに充分な高温で実施するこ
とができる。その結果として非特異的増幅が生じず、特
異性の高い増幅が可能となる。また耐熱性酵素は低温で
は勿論のこと常温でも安定であり、供給時にも保存時に
も活性の低下が殆どなく、不安定性の解消が可能であ
る。またリボヌクレアーゼＨを用いず加熱により変性を
行う場合でも耐熱性酵素を用いることで酵素群の失活を
防止し酵素を逐次添加することなく増幅が可能となる。
【００２８】本発明では耐熱性のＤＮＡ依存性ＲＮＡポ
リメラーゼを用いることにより、反応温度を５０〜７０
℃に設定し、非特異的なプロモーター機能が発現されな
い条件で反応を行うことにより前記の問題点を克服でき
る。
リメラーゼを用いることにより、反応温度を５０〜７０
℃に設定し、非特異的なプロモーター機能が発現されな
い条件で反応を行うことにより前記の問題点を克服でき
る。
【００２９】本発明の増幅反応に使用する試薬として
は、複数の酵素を同時に反応させるように設定させるこ
とが好ましい。具体的にはそれぞれ適当量の(a)第一鋳
型の核酸配列に対して十分に相補的な配列および必要に
よりその５’末端側にプロモーター配列を有する第一プ
ライマーと、(b)第二鋳型の核酸配列に対して相補的な
核酸配列およびその５’末端側にプロモーター配列を有
する第二プライマーと、(c)耐熱性ＲＮＡ依存ＤＮＡポ
リメラーゼと、(d)耐熱性ＤＮＡ依存ＲＮＡポリメラー
ゼと、(e)耐熱性ＤＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼと、(f)
リボヌクレオシドトリホスフェートと、(g)デオキシリ
ボヌクレオシドトリホスフェートとを必須構成要素とす
る。
は、複数の酵素を同時に反応させるように設定させるこ
とが好ましい。具体的にはそれぞれ適当量の(a)第一鋳
型の核酸配列に対して十分に相補的な配列および必要に
よりその５’末端側にプロモーター配列を有する第一プ
ライマーと、(b)第二鋳型の核酸配列に対して相補的な
核酸配列およびその５’末端側にプロモーター配列を有
する第二プライマーと、(c)耐熱性ＲＮＡ依存ＤＮＡポ
リメラーゼと、(d)耐熱性ＤＮＡ依存ＲＮＡポリメラー
ゼと、(e)耐熱性ＤＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼと、(f)
リボヌクレオシドトリホスフェートと、(g)デオキシリ
ボヌクレオシドトリホスフェートとを必須構成要素とす
る。
【００３０】第一プライマーおよび第二プライマーの濃
度としてはそれぞれ一般に10〜5000nM 好ましくは100
〜500nM である。リボヌクレオシドトリホスフェート及
びデオキシリボヌクレオシドトリホスフェートの濃度と
しては、一般にdNTP 10 〜10000uM 、rNTP10〜10000uM
、好ましくはdNTP 100〜2000 uM 、rNTP 100〜4000 uM
である。またリボヌクレオシドトリホスフェート及び
デオキシリボヌクレオシドトリホスフェートの濃度比率
としては、一般に1/10〜2/1 好ましくは1/2 〜3/4 であ
る。
度としてはそれぞれ一般に10〜5000nM 好ましくは100
〜500nM である。リボヌクレオシドトリホスフェート及
びデオキシリボヌクレオシドトリホスフェートの濃度と
しては、一般にdNTP 10 〜10000uM 、rNTP10〜10000uM
、好ましくはdNTP 100〜2000 uM 、rNTP 100〜4000 uM
である。またリボヌクレオシドトリホスフェート及び
デオキシリボヌクレオシドトリホスフェートの濃度比率
としては、一般に1/10〜2/1 好ましくは1/2 〜3/4 であ
る。
【００３１】耐熱性ＲＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼとし
てはサーマス・サーモフィルス(Thermus thermophilu
s)、サーマス・アクアティカス(Thermus aquaticus) の
耐熱性ＤＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼにその活性がある
ことが知られており、２価金属イオンの種類、量を選択
することでＲＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ活性を発現す
ることが知られている。しかしＲＮＡ依存ＤＮＡポリメ
ラーゼとＤＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ活性を同時に発
現させるのは容易ではなく、本発明者らは二つの酵素活
性を最大限に発現させる条件を鋭意検討した結果、Mgイ
オンとMnイオンとの比率を 1:1〜4:1 、好ましくは、1.
5:1 〜3:1 の条件が好ましいことを見出した。更にＤＮ
Ａ依存ＲＮＡポリメラーゼに対しても２価金属イオンの
種類、量は重要であり、これら三者の活性を最大限に発
現させるには、MgイオンとMnイオンとの比率を 1:1〜4:
1 、好ましくは 1.5:1〜3:1 且つ、dNTP : rNTP = 1:10
〜10:1好ましくは、1:2 〜2:1 の条件が好ましい。
てはサーマス・サーモフィルス(Thermus thermophilu
s)、サーマス・アクアティカス(Thermus aquaticus) の
耐熱性ＤＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼにその活性がある
ことが知られており、２価金属イオンの種類、量を選択
することでＲＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ活性を発現す
ることが知られている。しかしＲＮＡ依存ＤＮＡポリメ
ラーゼとＤＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ活性を同時に発
現させるのは容易ではなく、本発明者らは二つの酵素活
性を最大限に発現させる条件を鋭意検討した結果、Mgイ
オンとMnイオンとの比率を 1:1〜4:1 、好ましくは、1.
5:1 〜3:1 の条件が好ましいことを見出した。更にＤＮ
Ａ依存ＲＮＡポリメラーゼに対しても２価金属イオンの
種類、量は重要であり、これら三者の活性を最大限に発
現させるには、MgイオンとMnイオンとの比率を 1:1〜4:
1 、好ましくは 1.5:1〜3:1 且つ、dNTP : rNTP = 1:10
〜10:1好ましくは、1:2 〜2:1 の条件が好ましい。
【００３２】耐熱性酵素自体は従来から知られていた
が、本願発明のように耐熱性酵素を複数組み合わせて使
用することは公知ではなかった。また単に耐熱酵素を酵
素を組み合わせても核酸増幅反応は起こらないし、サイ
クル化することでより高い増幅効率を得ることは容易に
到達できるものではない。
が、本願発明のように耐熱性酵素を複数組み合わせて使
用することは公知ではなかった。また単に耐熱酵素を酵
素を組み合わせても核酸増幅反応は起こらないし、サイ
クル化することでより高い増幅効率を得ることは容易に
到達できるものではない。
【００３３】本発明では反応時間は増幅する核酸配列、
プライマーの配列やＴｍ、酵素量など諸条件により多様
であり、１サイクルの反応時間は約５〜３００分、好ま
しくは約２０〜６０分、サイクル数は０（繰り返しな
し）〜１００、好ましくは３〜１０回が適当である。こ
れらの条件は増幅効率や増幅量、反応所要時間も考慮し
て設定される。約５０〜７０℃で酵素反応を実施した
後、反応液を約９０〜９５℃に上昇させ、生成した核酸
の二重鎖を一本鎖に解離させ、温度を再び５０〜７０℃
に低下させて新たなプライマーを結合、伸長、増幅を行
う。これにより標的核酸配列を有する核酸コピーを多数
生成させることができる。更にこれを繰り返す（サイク
ル）ことでより大きな増幅を行うことが可能である。
プライマーの配列やＴｍ、酵素量など諸条件により多様
であり、１サイクルの反応時間は約５〜３００分、好ま
しくは約２０〜６０分、サイクル数は０（繰り返しな
し）〜１００、好ましくは３〜１０回が適当である。こ
れらの条件は増幅効率や増幅量、反応所要時間も考慮し
て設定される。約５０〜７０℃で酵素反応を実施した
後、反応液を約９０〜９５℃に上昇させ、生成した核酸
の二重鎖を一本鎖に解離させ、温度を再び５０〜７０℃
に低下させて新たなプライマーを結合、伸長、増幅を行
う。これにより標的核酸配列を有する核酸コピーを多数
生成させることができる。更にこれを繰り返す（サイク
ル）ことでより大きな増幅を行うことが可能である。
【００３４】本発明の増幅法により増幅した核酸を必要
により検出することが可能である。この増幅した核酸の
検出はＲＮＡコピーを測定することも、プロモーター配
列を有する二重鎖ＤＮＡを測定することも、またＤＮＡ
／ＲＮＡハイブリッドを測定することも可能である。こ
れらの検出は一般的な測定法で検出可能である。核酸ポ
リメラーゼによる伸長反応、転写反応の際、添加するリ
ボキシヌクレオシドトリホスフェートまたはデオキシリ
ボヌクレオシドトリホスフェートとして32Ｐ、ビオチン
化ヌクレオチドなどの標識物を用い、増幅産物中に標識
を取り込ませ、増幅産物中の標識を測定する。また標識
プライマーを用いて増幅産物中の標識を測定する方法、
標識プローブを用いて増幅された核酸を検出するなどの
方法がある。具体的な検出法として電気泳動による分
画、更にサザンブロット、ノーザンブロット、またドッ
トブロット、スロットブロット、サンドイッチハイブリ
ダイゼーションなどがある。定量的な測定をすることで
検査試料中の濃度を求めることも可能である。また内部
標準を用いる方法（特開62-205800 号公報）によって定
量性を向上させることも可能である。
により検出することが可能である。この増幅した核酸の
検出はＲＮＡコピーを測定することも、プロモーター配
列を有する二重鎖ＤＮＡを測定することも、またＤＮＡ
／ＲＮＡハイブリッドを測定することも可能である。こ
れらの検出は一般的な測定法で検出可能である。核酸ポ
リメラーゼによる伸長反応、転写反応の際、添加するリ
ボキシヌクレオシドトリホスフェートまたはデオキシリ
ボヌクレオシドトリホスフェートとして32Ｐ、ビオチン
化ヌクレオチドなどの標識物を用い、増幅産物中に標識
を取り込ませ、増幅産物中の標識を測定する。また標識
プライマーを用いて増幅産物中の標識を測定する方法、
標識プローブを用いて増幅された核酸を検出するなどの
方法がある。具体的な検出法として電気泳動による分
画、更にサザンブロット、ノーザンブロット、またドッ
トブロット、スロットブロット、サンドイッチハイブリ
ダイゼーションなどがある。定量的な測定をすることで
検査試料中の濃度を求めることも可能である。また内部
標準を用いる方法（特開62-205800 号公報）によって定
量性を向上させることも可能である。
【００３５】標識プライマー、標識プローブを用いる検
出方法では、標識物として放射性同位元素、酵素、蛍光
物質、発光物質など公知の標識物質を用いることができ
る。また本発明に用いる試薬をそれぞれ用意した試薬キ
ットにすることが可能である。
出方法では、標識物として放射性同位元素、酵素、蛍光
物質、発光物質など公知の標識物質を用いることができ
る。また本発明に用いる試薬をそれぞれ用意した試薬キ
ットにすることが可能である。
【００３６】
【実施例】次に実施例を用いて本発明を説明する。 参考例１ 各種オリゴヌクレオチドの合成 ABI社DNAシンセサイザー391型を用いて、ホスホアミダ
イト法にて下記配列のオリゴヌクレオチドを各種合成し
た。手法はＡＢＩ社マニュアルに従って０．２μＭスケ
ールで実施した。オリゴヌクレオチドの脱保護はアンモ
ニア水で５５℃、15〜18時間実施した。精製は日立製作
所社製ＦＰＬＣで逆相カラムにて実施した。 プロモーター領域を有するオリゴヌクレオチド(1):本オ
リゴヌクレオチドはリンカーで連結されたプロモーター
領域、腸炎ビブリオ耐熱性溶血毒素（VP-TDH）遺伝子の
313 番目から326 番目のヌクレオチド配列に相補的な領
域から成っている（配列表１）。 オリゴヌクレオチド(2):VP-TDH遺伝子の179 番目から20
2 番目に相同的なオリゴヌクレオチド（２４mer ）（配
列表２）。 オリドヌクレオチド(3):VP-TDH遺伝子の254 番目から27
7 番目に相補的なオリゴヌクレオチド（２４mer ）（配
列表３）。５’末端のリン酸基は32Ｐが標識されてい
る。
イト法にて下記配列のオリゴヌクレオチドを各種合成し
た。手法はＡＢＩ社マニュアルに従って０．２μＭスケ
ールで実施した。オリゴヌクレオチドの脱保護はアンモ
ニア水で５５℃、15〜18時間実施した。精製は日立製作
所社製ＦＰＬＣで逆相カラムにて実施した。 プロモーター領域を有するオリゴヌクレオチド(1):本オ
リゴヌクレオチドはリンカーで連結されたプロモーター
領域、腸炎ビブリオ耐熱性溶血毒素（VP-TDH）遺伝子の
313 番目から326 番目のヌクレオチド配列に相補的な領
域から成っている（配列表１）。 オリゴヌクレオチド(2):VP-TDH遺伝子の179 番目から20
2 番目に相同的なオリゴヌクレオチド（２４mer ）（配
列表２）。 オリドヌクレオチド(3):VP-TDH遺伝子の254 番目から27
7 番目に相補的なオリゴヌクレオチド（２４mer ）（配
列表３）。５’末端のリン酸基は32Ｐが標識されてい
る。
【００３７】実施例１ プロモーター領域を有するオリゴヌクレオチド(1) とオ
リゴヌクレオチド(2) を用いた増幅反応 参考例１のオリゴヌクレオチド(1) とオリゴヌクレオチ
ド(2) を用い、腸炎ビブリオゲノムの増幅反応を実施
し、多数のＲＮＡコピーを得た。反応条件を以下に示
す。 反応液 10mM Tris-HCl pH8.3 75mM KCl 6mM MgCl2 3mM MnCl2 0.6mM dNTP 0.4mM rNTP 20pmol オリゴヌクレオチド(1) 20pmol オリゴヌクレオチド(2) Tth-DNApolymerase ６０単位 Tth-RNApolymerase ２．５単位 腸炎ビブリオ(TDH毒素産生株) ゲノム １ｐｇ 反応: ９４℃、１分 ７０℃、１０分 その後 (1) ９４℃、１分 (2) ６０℃、３０分 (3) ７０℃、３０分 (1)、(2)、(3)をサイクル数 ５回繰り返す。
リゴヌクレオチド(2) を用いた増幅反応 参考例１のオリゴヌクレオチド(1) とオリゴヌクレオチ
ド(2) を用い、腸炎ビブリオゲノムの増幅反応を実施
し、多数のＲＮＡコピーを得た。反応条件を以下に示
す。 反応液 10mM Tris-HCl pH8.3 75mM KCl 6mM MgCl2 3mM MnCl2 0.6mM dNTP 0.4mM rNTP 20pmol オリゴヌクレオチド(1) 20pmol オリゴヌクレオチド(2) Tth-DNApolymerase ６０単位 Tth-RNApolymerase ２．５単位 腸炎ビブリオ(TDH毒素産生株) ゲノム １ｐｇ 反応: ９４℃、１分 ７０℃、１０分 その後 (1) ９４℃、１分 (2) ６０℃、３０分 (3) ７０℃、３０分 (1)、(2)、(3)をサイクル数 ５回繰り返す。
【００３８】実施例２ 増幅された核酸の測定 実施例１で増幅された核酸を希釈し、0.3N NaOHで核酸
を変性させた後、50μｌづつナイロン膜、Hybond N+ (A
mersham 製) にドットブロットした。また対照として腸
炎ビブリオ (VP) のゲノムを0.3N NaOHで核酸を変性さ
せた後、50μｌをドットブロットした。ナイロン膜を６
×ＳＳＣ（１×ＳＳＣとは、0.15M NaCl,0.015M クエン
酸ナトリウム(pH7.0)を意味する）、５×デーンハート
液（１×デンハート液とは0.02%フィコール、0.02%ポリ
ビニルピロリン、0.02%牛血清アルブミンを意味す
る）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１０μｇの煮沸したサケ精液
ＤＮＡ(平均５００塩基)を含む液１００μｌ中で６０
℃、１時間プレハイブリダイズした後、上記液に参考例
１で調製したオリゴマー(3)を加え、５５℃、１時間ハ
イブリダイズした。５５℃の６×ＳＳＣ中でナイロン膜
を充分洗浄した後、乾燥させた。Ｘ線フィルム（New AI
F RX 富士写真工業製）を密着させ、−８０℃で一昼夜
感光させた。フィルムの感光度から合成ＲＮＡを定量し
たところ、対照のVPのゲノム核酸に比べて約105 倍のＲ
ＮＡが合成されていた。この結果、本発明の増幅法が有
効であることが示された。更に本発明の増幅法では温度
サイクルのたびに新たな酵素の添加を必要とせず増幅反
応が進行することが証明された。
を変性させた後、50μｌづつナイロン膜、Hybond N+ (A
mersham 製) にドットブロットした。また対照として腸
炎ビブリオ (VP) のゲノムを0.3N NaOHで核酸を変性さ
せた後、50μｌをドットブロットした。ナイロン膜を６
×ＳＳＣ（１×ＳＳＣとは、0.15M NaCl,0.015M クエン
酸ナトリウム(pH7.0)を意味する）、５×デーンハート
液（１×デンハート液とは0.02%フィコール、0.02%ポリ
ビニルピロリン、0.02%牛血清アルブミンを意味す
る）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１０μｇの煮沸したサケ精液
ＤＮＡ(平均５００塩基)を含む液１００μｌ中で６０
℃、１時間プレハイブリダイズした後、上記液に参考例
１で調製したオリゴマー(3)を加え、５５℃、１時間ハ
イブリダイズした。５５℃の６×ＳＳＣ中でナイロン膜
を充分洗浄した後、乾燥させた。Ｘ線フィルム（New AI
F RX 富士写真工業製）を密着させ、−８０℃で一昼夜
感光させた。フィルムの感光度から合成ＲＮＡを定量し
たところ、対照のVPのゲノム核酸に比べて約105 倍のＲ
ＮＡが合成されていた。この結果、本発明の増幅法が有
効であることが示された。更に本発明の増幅法では温度
サイクルのたびに新たな酵素の添加を必要とせず増幅反
応が進行することが証明された。
【００３９】実施例３ 食中毒が疑われる患者便約0.5gからプロテイナーゼＫ処
理、フェノール・クロロホルム抽出、エタノール沈澱に
より精製した核酸１μｇを鋳型として、実施例１と同様
にして増幅した。実施例２と同様にハイブリダイゼーシ
ョンを行った。対照としてＴＣＢＳ分離培地で腸炎ビブ
リオを分離した。腸炎ビブリオが生育したものについて
はＥＬＩＳＡ法（日水製薬製）によるＴＤＨ毒素検出を
行った。結果を下表に示す。
理、フェノール・クロロホルム抽出、エタノール沈澱に
より精製した核酸１μｇを鋳型として、実施例１と同様
にして増幅した。実施例２と同様にハイブリダイゼーシ
ョンを行った。対照としてＴＣＢＳ分離培地で腸炎ビブ
リオを分離した。腸炎ビブリオが生育したものについて
はＥＬＩＳＡ法（日水製薬製）によるＴＤＨ毒素検出を
行った。結果を下表に示す。
【００４０】
【表１】 上表の如く従来法とよく一致する良好な結果を得た。
【００４１】
【発明の効果】本発明は、従来の複製ＲＮＡベースの増
幅法に比べ、安定性の高い耐熱性酵素を用いるため、増
幅効率が高く特異性の高い核酸増幅法である。本発明法
で耐熱性酵素群を用いるから、加熱変性時にも酵素群の
失活がなく、酵素の逐次添加の必要がない。従来の核酸
増幅法では常温では作用するが、第一の鋳型核酸から第
二の鋳型核酸を分離する際、加熱によって失活するため
再度増幅を行うために新たに酵素群を添加する必要があ
り、コスト高となる欠点があったが、本発明では耐熱性
酵素群を用いるため酵素の失活は見られず新たな添加を
必要としない。増幅の際に反応容器を密閉したままで実
施できることから、増幅法で大きな問題となるコンタミ
も低減できる。
幅法に比べ、安定性の高い耐熱性酵素を用いるため、増
幅効率が高く特異性の高い核酸増幅法である。本発明法
で耐熱性酵素群を用いるから、加熱変性時にも酵素群の
失活がなく、酵素の逐次添加の必要がない。従来の核酸
増幅法では常温では作用するが、第一の鋳型核酸から第
二の鋳型核酸を分離する際、加熱によって失活するため
再度増幅を行うために新たに酵素群を添加する必要があ
り、コスト高となる欠点があったが、本発明では耐熱性
酵素群を用いるため酵素の失活は見られず新たな添加を
必要としない。増幅の際に反応容器を密閉したままで実
施できることから、増幅法で大きな問題となるコンタミ
も低減できる。
【００４２】
配列番号：1 配列の長さ：24 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列の特徴 存在位置：1..24 他の特徴：腸炎ビブリオTDH 遺伝子の313 番目から326
番目の配列と相補的な配列を有する。 配列 GACACCGCTG CCATTGTATA GTCT 24
番目の配列と相補的な配列を有する。 配列 GACACCGCTG CCATTGTATA GTCT 24
【００４３】配列番号：2 配列の長さ：54 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列の特徴 特徴を表す記号：promoter 存在位置：1..30 特徴を決定した方法：S 他の特徴：プロモーター配列 存在位置：31..54 他の特徴：腸炎ビブリオTDH 遺伝子の179 番目から202
番目の配列と相同的な配列を有する。 配列 CTTGACAAAA AGGAGGGGGA TTGATAGCAT CTGACTTTTG GACAAACCGT AATG 54
番目の配列と相同的な配列を有する。 配列 CTTGACAAAA AGGAGGGGGA TTGATAGCAT CTGACTTTTG GACAAACCGT AATG 54
【００４４】配列番号：3 配列の長さ：24 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列の特徴 存在位置：1..24 他の特徴：腸炎ビブリオTDH 遺伝子の254 番目から277
番目の配列と相補的な配列を有する。 配列 CAGGTACTAA ATGGTTGACA TCCT 24
番目の配列と相補的な配列を有する。 配列 CAGGTACTAA ATGGTTGACA TCCT 24
【図１】本発明の反応を図式化する。
１：第一鋳型 ２：第一プライマー ３：第二鋳型 ４：第二プライマー ５：機能可能なプロモーター配列 ６：二本鎖ＤＮＡ中間体 ７：ＲＮＡコピー
Claims (10)
- 【請求項１】 下記工程を含むことを特徴とする耐熱性
酵素を用いる標的核酸配列の増幅法。 工程１：標的核酸を必要により変性処理した一本鎖の第
一鋳型核酸に、第一鋳型の核酸配列に対して十分に相補
的な核酸配列を有する第一プライマーをハイブリダイズ
させ、耐熱性ＤＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼおよび／ま
たは耐熱性ＲＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼにより第一プ
ライマーを伸長させて、第一鋳型核酸に相補的な第二鋳
型である第一プライマー伸長物を得る； 工程２：第一鋳型核酸から第一プライマー伸長物を分離
して一本鎖の第二鋳型核酸を得る； 工程３：一本鎖の第二鋳型核酸に、第二鋳型の核酸配列
に対して相補的な核酸配列およびその５’末端側にプロ
モーター配列を有する第二プライマーをハイブリダイズ
させ、耐熱性ＤＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼにより伸長
し、第二鋳型核酸に相補的な第二プライマー伸長物を
得、このようにして機能可能なプロモーター配列に結合
した標的核酸配列を有する二本鎖ＤＮＡ中間体を生成さ
せる;（ここで第一プライマーは標的核酸配列に相補的
であり、第二プライマーは標的核酸配列に対して相同的
であり、第一プライマーの３’末端は相補的鎖上の第二
プライマーの３’末端に向けられる） 工程４：前記プロモーター配列を認識することができる
耐熱性ＤＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼを用いて、前記二
本鎖ＤＮＡ中間体から前記標的核酸配列の多数のＲＮＡ
コピーを増加させる:そして 工程５：必要により前記ＲＮＡコピーを第一鋳型核酸と
して用いて前記工程１から工程４を必要な回数繰り返
す。 - 【請求項２】 試薬の逐次添加を行わず工程１〜５を実
施することを特徴とする請求項１に記載の耐熱性酵素を
用いる標的核酸配列の増幅法。 - 【請求項３】 第一鋳型核酸から第二鋳型核酸の分離を
加熱変性により行うことを特徴とする請求項１及び請求
項２に記載の耐熱性酵素を用いる標的核酸配列の増幅
法。 - 【請求項４】 第一鋳型の核酸配列に対して相補的な核
酸配列を有する第一プライマーが、５’末端側にプロモ
ーター配列を有することを特徴とする請求項１〜３に記
載の耐熱性酵素を用いる標的核酸配列の増幅法。 - 【請求項５】 耐熱性ＲＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼと
して、サーマス・サーモフィラス由来のＤＮＡ依存ＤＮ
ＡポリメラーゼのＲＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ活性を
用いることを特徴とする請求項１〜４記載の耐熱性酵素
を用いる標的核酸配列の増幅法。 - 【請求項６】 耐熱性ＤＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼが
サーマス・サーモフィラス由来であることを特徴とする
請求項１〜４記載の耐熱性酵素を用いる標的核酸配列の
増幅法。 - 【請求項７】 耐熱性ＤＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼが
サーマス・サーモフィラス由来であることを特徴とする
請求項１〜４記載の耐熱性酵素を用いる標的核酸配列の
増幅法。 - 【請求項８】請求項１〜４に記載される標的核酸配列の
増幅産物である一本鎖ＲＮＡ、二重鎖ＤＮＡまたはＤＮ
Ａ／ＲＮＡハイブリッドに、必要により変性処理を行っ
た後標識プローブをハイブリダイズさせ、ハイブリダイ
ズした標識プローブの標識またはハイブリダイズしない
標識プローブの標識を検出することを特徴とする標的核
酸配列の検出法。 - 【請求項９】 標的核酸配列を増幅するための試薬キッ
トであって、(a) 第一鋳型の核酸配列に対して十分に相
補的な核酸配列を有する第一プライマー、(b) 第二鋳型
の核酸配列に対して相補的な核酸配列およびその５’末
端側にプロモーター配列を有する第二プライマー、(c)
耐熱性ＲＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ、(d) 耐熱性ＤＮ
Ａ依存ＲＮＡポリメラーゼ、(e) 耐熱性ＤＮＡ依存ＤＮ
Ａポリメラーゼ、(f) リボヌクレオシドトリホスフェー
トおよび(g) デオキシリボヌクレオシドトリホスフェー
トとを含み、 但し、第一プライマーは標的核酸配列に相補的であり、
第二プライマーは標的核酸配列に対して相同的であり、
第一プライマーの３’末端は相補的鎖上の第二プライマ
ーの３’末端に向けられることを特徴とする耐熱性酵素
を用いる標的核酸配列の増幅用試薬キット。 - 【請求項１０】 標的核酸配列を増幅するための試薬キ
ットであって、(a) 第一鋳型の核酸配列に対して十分に
相補的な核酸配列およびその５’末端側にプロモーター
配列を有する第一プライマー、(b) 第二鋳型の核酸配列
に対して相補的な核酸配列およびその５’末端側にプロ
モーター配列を有する第二プライマー、(c) 耐熱性ＲＮ
Ａ依存ＤＮＡポリメラーゼ、(d) 耐熱性ＤＮＡ依存ＲＮ
Ａポリメラーゼ、(e) 耐熱性ＤＮＡ依存ＤＮＡポリメラ
ーゼ、(f) リボヌクレオシドトリホスフェートおよび
(g) デオキシリボヌクレオシドトリホスフェートとを含
み、 但し、第一プライマー標的核酸配列に相補的であり、第
二プライマーは標的核酸配列配列に対して相同的であ
り、第一プライマーの３’末端は相補的鎖上の第二プラ
イマーの３’末端に向けられることを特徴とする耐熱性
酵素を用いる標的核酸配列の増幅用試薬キット。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP18011593A JP3241496B2 (ja) | 1993-07-21 | 1993-07-21 | 耐熱性酵素を用いる標的核酸配列の増幅法および検出法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP18011593A JP3241496B2 (ja) | 1993-07-21 | 1993-07-21 | 耐熱性酵素を用いる標的核酸配列の増幅法および検出法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0731475A true JPH0731475A (ja) | 1995-02-03 |
| JP3241496B2 JP3241496B2 (ja) | 2001-12-25 |
Family
ID=16077685
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP18011593A Expired - Fee Related JP3241496B2 (ja) | 1993-07-21 | 1993-07-21 | 耐熱性酵素を用いる標的核酸配列の増幅法および検出法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3241496B2 (ja) |
-
1993
- 1993-07-21 JP JP18011593A patent/JP3241496B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP3241496B2 (ja) | 2001-12-25 |
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