CN105648057B - 一种筛选人类egfr基因多态性的引物组、试剂盒及其检测方法 - Google Patents

一种筛选人类egfr基因多态性的引物组、试剂盒及其检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物技术领域，具体组合运用了等位基因特异性扩增、重组酶聚合酶扩增、肽核酸结合DNA和SYBR GreenⅠ显色四种分子生物学方法。以肺癌EGFR基因多态性为筛选对象，进行基因多态性筛选方法的研究。获得了一种筛选人类EGFR基因多态性的引物组、试剂盒及其检测方法；引物序列如SEQ ID NO.1～5。可用于对EGFR多态性的筛选和对适合于靶向治疗的患者的鉴别。本发明所述方法不需要任何大型设备，或侧流筛选试纸的精密试剂、在特异性、敏感性、简便性和即时筛选等方面都具有很大优势，预计这种方法将是未来筛选基因多态性、与基因筛查发展愿望相一致的可靠的且具有低成本效益的快速筛选方法。

Description

一种筛选人类EGFR基因多态性的引物组、试剂盒及其检测 方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及由等位基因特异性扩增(ASA)、重组酶聚合酶扩增(RPA)、肽核酸(PNA)结合DNA技术以及SYBR GreenⅠ显色组合而成的一种快速且准确筛选人类EGFR基因多态性(单个核苷酸多态性和基因缺失)的新方法。
背景技术
快速、准确并且简便的基因多态性筛查方法一直受到广泛的重视。人类基因组是一个十分稳定的体系，不同的民族、群体和个体都有46条染色体，有相同数目的基因和基因分布，也有基本相同的核苷酸序列。正是基因组结构的这种稳定性保证了人类作为一个物种的共同性和稳定性，也决定了目前基因组测定是有意义的，即有代表性的。
然而人类基因组又是一个变异的体系。在长期进化的过程中，基因组的DNA序列不断地发生变异。这些变异可能是有害的、有益的或中性的，它们其中的一些被保存下来，导致了不同种族、群体和个体间基因组的差异或多态性。除了同卵双生子外，没有两个个体的基因组是完全相同的。
表皮生长因子受体(EGFR)的基因多态性通常是发生在19号染色体缺失(E746-A750)和21号染色体L858R点突变(最普遍的单个核苷酸多态性)，到目前为止，基于聚合酶链反应(PCR)扩增DNA的测序技术已成为一个标准技术，然而，由于该标准技术需要大型的设备和复杂的实验步骤，包括热循环设备和DNA测序设备等，目前的分子筛选方法仍然大大阻碍该基因多态性检测的效果。
目前，等温酶扩增DNA系统包括基于核酸序列的扩增，环介导等温扩增(LAMP)，滚环扩增和解旋酶依赖性扩增。最近，智能扩增方法(SMAP)被开发用于筛选EGFR多态性，但其复杂的引物设计，大型设备和对操作人员的专业性高要求是其操作缺点。与此相反，重组酶聚合酶扩增(RPA)是一种较为先进的DNA扩增方法，反应温度为37℃，引物设计简便，并具有更快的扩增速度，能得到大量产物。此外，通过ATP水解作用来促进链置换扩增使基因扩增方法变得更为有趣和实用。RPA可以适用于扩增不同的DNA和RNA，随着等温扩增核酸新技术的逐渐产生，重组酶聚合酶扩增以其极快的扩增速度备受瞩目。
重组酶聚合酶扩增(RPA)最突出的特点是利用重组酶与引物寡DNA的结合，寻找到目的序列，在单链结合等蛋白作用下低温(36-40℃)打开双链DNA，具有高特异性、高敏感性，能够快速产出目的DNA片段。遗憾的是，RPA扩增方法还没有被用于快速筛选人类基因多态性。并且，在单个核苷酸多态性的筛选中更是需要大型、精密的仪器或者高端科学及人才。目前基因多态性的筛选都还停留在以实时定量PCR为基础的方法中，而且并不能普及。
发明内容
本发明的目的是克服上述不足问题，提供一种实用可靠的筛选基因多态性的引物组、其试剂盒及其检测方法，本发明在特异性、敏感性、简便性和即时筛选等方面都具有很大优势。本发明是基于等位基因特异性扩增(ASA)，重组酶聚合酶扩增(RPA)，肽核酸(PNA)，和SYBR Green I染料，即AS-RPA-PNA-SYBR(ARPS)系统的基因筛选新方法，目的是识别EGFR基因多态性，这可用于对EGFR多态性的筛选。该系统中的ASA/AS理论，RPA扩增，PNA和SYBRGreen的结合，不需要任何大型设备，或侧流筛选试纸等的精密试剂。只需要用本试剂盒中已设计好的引物组和扩增缓冲液，即可进行筛选检测。预计这种方法将是未来筛选基因多态性，与基因筛查发展愿望相一致的可靠的且具有低成本效益的快速筛选方法。
本发明组合运用了等位基因特异性扩增(ASA)、重组酶聚合酶扩增(RPA)、肽核酸(PNA)结合DNA和SYBR GreenⅠ显色四种分子生物学方法。以EGFR多态性为筛选对象，进行基因多态性筛选方法的研究。
在本发明的引物筛选方面，重组酶聚合酶扩增引物的设计要求是
(1)引物长度在30-40个碱基内
(2)扩增片段长度最好在150-300个碱基内
(3)引物的3’端避开第三位密码子(正向和反向引物最好都避免)
(4)PNA的设计以PNA与非靶序列结合的Tm值(熔解温度，主要由PNA的长度和碱基序列决定)和设计的PNA片段的特异性(不与其他序列结合)为标准。
根据上述筛选标准，本发明所述的筛选人类EGFR基因多态性的引物组，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1～2或者SEQ ID NO.3～5所示。
本发明还设计一种筛选人类EGFR基因多态性的试剂盒，其包括上文所述的引物组之外，还包括检测试剂，即：核苷酸序列为SEQ ID NO.1～2和/或者SEQ ID NO.3～5所示的引物，重泡胀缓冲液、醋酸镁溶液、SYBR GreenⅠ溶液及含有冻干扩增酶的EP管。
此外，在上文所述的试剂盒中，还可以包括记载检测待测样品方法的说明书。
同时，上文所述的试剂盒中，还可以包括阳性质控DNA：浓度为150ng/2μL的HCC-827细胞系DNA；阴性质控DNA：浓度为150ng/2μL的A549细胞系DNA。
在检测筛选15个碱基缺失的EGFR19Del(2)多态性中，不需要利用PNA-DNA抑制背景扩增，即只需要利用等位基因特异性重组酶扩增技术即可；在检测筛选单个核苷酸多态性如EGFRL858R多态性中，由于重组酶扩增速度非常快，需要预先利用PNA与样本DNA中非点多态性的片段结合，使其形成的PNA-DNA复合体在36-40℃RPA扩增中不会因为单链结合蛋白等因素而分开，使聚合酶不能识别并打开PNA-DNA复合物以抑制非特异性扩增。而SYBR也不能识别PNA，所以不必担心因为PNA而产生假阳性结果(应为阴性黄色结果而显绿色)。
利用上文所述的筛选人类EGFR基因(15个碱基缺失的EGFR19Del(2))多态性的引物组SEQ ID NO.1～2的检测方法，其操作步骤包括：
将12μL双蒸水、2μL的浓度为10μM的正向引物SEQ ID NO.1、2μL的浓度为10μM的反向引物SEQ ID NO.2、2μL的浓度为150ng/μL的样本DNA和29.5μL重泡胀缓冲液(rehydration buffer)加入到含有冻干扩增酶(TwistDX,Cambridge,UK)的EP管中，混匀后再向其中加入2.5μL浓度为280mM的醋酸镁溶液混匀、扩增至少5min，再按照每20μL产物应用1μL的比例，加入浓度为200X的SYBR GreenⅠ。优选的情况下，应用上述检测方法的时候，除了样本DNA外，还可以包括对阳性质控DNA和阴性质控DNA的检测，且更为优选的扩增时间为15min。
利用上文所述的筛选人类EGFR基因(EGFRL858R)多态性的引物组SEQ ID NO.3～5的检测方法，其操作步骤包括：
将10μL双蒸水、2μL的浓度为20μM的PNA SEQ ID NO.5、2μL浓度为150ng/μL的样本DNA，预先进行99℃解链2min，66℃结合2min，再加入2μL的浓度为10μM的正向引物SEQ IDNO.3、2μL的浓度为10μM的反向引物SEQ ID NO.4，和29.5μL重泡胀缓冲液加入到含有冻干扩增酶的EP管中，混匀后再向其中加入2.5μL浓度为280mM的醋酸镁溶液混匀、扩增至少10min后获得扩增产物，再按照每20μL扩增产物应用1μL的比例，加入浓度为200X的SYBRGreenⅠ。
优选的情况下，应用上述检测方法的时候，除了样本DNA外，还可以包括对阳性质控DNA和阴性质控DNA的检测，且更为优选的扩增时间为15min。
为了进一步验证采用SYBR GreenⅠ显色结果是否准确，可以辅以琼脂糖凝胶电泳检测的方法进行验证，即：将利用上述方法扩增15min后获得的扩增产物中取出30μL加入100μL无水乙醇后12000rpm/min，离心5min，去除液体纯化RPA扩增产物(此步骤目的为去除扩增缓冲液，便于琼脂糖凝胶电泳的检测)后，再加入30μL双蒸水，最后进行琼脂糖凝胶电泳检测条带结果。
利用上文所述的试剂盒及试剂盒的使用方法筛选组织标本时。可以以阳性质控DNA和阴性质控DNA为对照品，白色背景为筛选环境，筛选冰冻组织样本中基因多态性情况。混匀SYBR显色剂之后，结果显示阳性质控DNA产生肉眼可见的绿色荧光并且阴性质控DNA显示黄色，表明本实验结果可靠，样品DNA的阳性结果为肉眼可见的绿色荧光，阴性结果为不变的黄色(不变色)。
本发明另一目的在于，利用上文所述的引物组在制备筛选人类EGFR基因多态性的检测试剂中的应用。
有益效果
本发明方法利用RPA极为快速的扩增技术，并结合ASA特异性方法可在最短5min内(样本中无干扰组织的理想情况下)筛选出EGFR19Del多态性。
本发明方法将PNA预先与模板DNA结合，然后利用RPA极为快速的扩增技术，并结合ASA特异性扩增方法可在最短10min内(样本中无干扰组织的理想情况下)筛选出EGFRL858R点多态性。发现RPA主要扩增酶gp32和Bsu无法区别多态性与正常样本DNA(结果显色均为阳性)，但是扩增酶无法打开预先与非多态性DNA结合的PNA-DNA复合物，从而RPA扩增反应无法扩增阴性样本。
由于RPA扩增速度非常迅速，传统PNA利用方法(PNA直接加入到反应体系中，以抑制非特异性片段扩增)很难在RPA扩增中实现(如本发明实施例5所述方法的图5结果显示：即便加入PNA，但是如果没有预先使PNA与非靶序列结合，即预先使PNA与样本99℃解链2min，66℃结合2min，(即便再加上另外的错配碱基)，其结果还是阳性和阴性多态性细胞系均显示绿色荧光，电泳结果也显示假阳性，(即都有单条带产生)，本发明利用PNA-DNA结合温度高于DNA-DNA结合温度的特点(在此实验中，相同长度寡核酸引物DNA与模板DNA结合温度低于相同长度寡PNA与模板DNA结合温度约10℃左右)，将PNA成功用于检测筛选单个核苷酸多态性的方法中。
本发明(ARPS)总结出一套标准化流程和阴阳质控(以细胞株DNA为质控品)的筛选人类基因多态性的方法：浓度为20μM的PNA溶解液2μL，300ng样本DNA，浓度为10μM的引物溶解液各2μL，扩增时间为15min，再加入浓度为200X的SYBR GreenⅠ(Solarbio，北京，索莱宝科技有限公司，每20μL产物应用1μL)，以上考虑到敏感性和特异性的平衡。由于扩增体系已经确立，即只需要加入已知浓度的样本DNA即可在15min内筛选出其有无相应的基因多态性。筛选不同的目的靶基因只需要调整相应引物和PNA。
附图说明
图1表示筛选的具有很好的特异性的EGFR19号染色体的引物。从左至右依次显示了阳性对照组(细菌DNA，143bp目的片段)、阴性对照组(无样本DNA)、扩增时间为20min的19号染色体缺失阳性细胞系(HCC827细胞系，目的片段266bp)的DNA样本个和阴性细胞系(A549细胞系)DNA样本、15min的19号染色体缺失阳性细胞系(HCC827细胞系，266bp)DNA和阴性细胞系(A549细胞系)DNA、10min的19号染色体缺失阳性细胞系(HCC827细胞系，266bp)DNA和阴性细胞系(A549细胞系)DNA和5min的19号染色体缺失阳性细胞系(HCC827细胞系，266bp)DNA和阴性细胞系(A549细胞系)DNA。EP管上面标记了结果的颜色，各个时间段都产出了特异性的目的片段。
图2表示筛选EGFRL858R多态性中设计的引物的特异性。从左至右依次显示了阳性对照组(细菌DNA，143bp目的片段)、阴性对照组(无样本DNA)、扩增时间为10min的L858R阳性细胞系(H1975细胞系，目的片段201bp)DNA和阴性细胞系(A549细胞系)DNA、15min的L858R阳性细胞系(H1975细胞系，201bp)DNA和阴性细胞系(A549细胞系)DNA、20min的L858R阳性细胞系(H1975细胞系，201bp)DNA和阴性细胞系(A549细胞系)DNA和5min的L858R阳性细胞系(H1975细胞系，201bp)DNA和阴性细胞系(A549细胞系)DNA。EP管上面标记了结果的颜色，10min-20min都特异性的扩增了目的片段。5min时间不适用于此筛选。
图3显示ARPS筛选的灵敏度：
A：筛选19号染色体缺失(2)的特定引物与经过稀释的HCC-827细胞系的基因组DNA反应。HCC-827细胞系DNA的稀释液，30％以上的阳性细胞系(HCC-827细胞系)
DNA用ARPS或电泳均可检测出结果(肉眼可见的绿色荧光和单一目的条带)；
B：筛选L858R点多态性特异性引物与经过稀释的H-1975细胞系的基因组DNA反应。H-1975细胞系DNA的稀释液，40％以上的阳性细胞系(H-1975细胞系)DNA用ARPS或电泳均可检测出结果(肉眼可见的绿色荧光和单一目的条带)。
图4筛选冰冻组织样本中的基因多态性：
A:显示筛选的冰冻组织样本中EGFR19Del(2)型基因多态性的情况。从上至下依次阳性质控(HCC827细胞系DNA，经实施例1确定为有此基因多态性的DNA)、阴性质控(A549细胞系DNA，经验证无此基因多态性的DNA)、一个经过直接测序法筛选验证过的冰冻组织多态性样本、两个经过直接测序筛选过的冰冻组织非多态性样本。(左边为本发明筛选结果，右边为直接测序验证结果)左边结果(本发明肉眼可见检测结果)从上至下依次为多态性阳性(质控，绿色)、多态性阴性(质控，黄色)、多态性阳性(样本，绿色)、多态性阴性(样本，黄色)、多态性阴性(样本，黄色)；右边(直接测序)结果从上至下依次为阳性对照；阴性对照；样本1测序结果:TCGCTATCAAG(此处缺失15个碱基)ACATCTCCG；样本5测序结果：TCAAGGAATTAAGAGAAGCAACATCTCCG；样本6测序结果：TCAAGGAATTAAGAGAAGCAACATCTCCG。(划线字母为未缺失的15个碱基序列)。
图4B:显示筛选的冰冻组织样本中EGFRL858R基因多态性的情况。从上至下依次为阳性质控(H1975细胞系DNA经实施例2确定为有此基因多态性的DNA)、阴性质控(A549细胞系DNA，经验证无此基因多态性的DNA)和三个先经过直接测序法筛选验证的冰冻组织样本。(左边为本发明筛选结果，右边为直接测序验证结果)左边结果(本发明肉眼可见的检测结果)从上至下依次为多态性阳性(质控，绿色)、多态性阴性(质控，黄色)、多态性阳性(样本，绿色)、多态性阳性(样本，绿色)、多态性阳性(样本，绿色)、多态性阴性(样本，黄色)、多态性阴性(样本，黄色)；直接测序结果从上至下依次为阳性对照；阴性对照；样本2测序结果:TGGCCCGCCCA；样本3测序结果：TGCCCGCCCA；样本4测序结果：TGGCCCGCCCA；样本5测序结果：TGGCCAGCCCA；样本6测序结果：TGGCCAGCCCA(划线字母为多态性的碱基序列，此为杂合多态性)。
图5.筛选EGFRL858R引物时无预先使PNA与样本DNA结合情况下，显示的引物序列、ARPS结果和琼脂糖凝胶电泳数据。A：以筛选EGFR L858R的另一个错配碱基在反向引物中的位置(淡色字母并且下有黑框标记)。B，琼脂糖凝胶电泳和ARPS的结果。目的片段长度为201bp的“+”表示从RPA反应试剂盒(143bp)的阳性对照。所使用的DNA量为300ng。图中显示无论再多加任何的错配碱基T、A、G，都会产生假阳性结果，即阳性细胞系和阴性细胞系均为绿色，而阴性质控品(无DNA)为黄色，则结果可靠。
附图说明
图1：EGFR19号染色体引物的特异性。
图2：筛选EGFRL858R点多态性中设计的引物的特异性。
图3A：19号染色体缺失多态性的灵敏度
图3B：检测L858R多态性的灵敏度
图4A：显示检测筛选的临床样本中EGFR19Del(2)型多态性的情况。
图4B：显示筛选的临床样本中EGFRL858R多态性的情况。
图5：显示引物序列和琼脂糖凝胶电泳数据。A：筛选EGFR L858R的另一个错配碱基在反向引物中的位置(绿色字母)。B：琼脂糖凝胶电泳和ARPS的结果。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明进行详细说明，但本发明并不局限于具体实施例。
人类非小细胞肺癌细胞株NCI-H1975，HCC-827和A-549得自美国模式菌种收集中心(ATCC，Manassas，VA，USA)获得，并保持在RPMI-1640培养基(Gibco，美国)，并用10％胎牛血清(HyClone公司，美国)，100U/mL青霉素和100U/mL链霉素，在37℃在含有5％CO2和95％空气的潮湿培养箱中。其NCI-H1975细胞含有所述EGFR21号外显子L858R的单个核苷酸多态性，HCC-827细胞含有所述EGFR19号外显子15个碱基的缺失，和A-549细胞含有野生型EGFR目标DNA序列。
实施例1
筛选15个碱基缺失的EGFR19Del(2)多态性的具体过程为：
在筛选目的基因片段多态性之前，先根据缺失碱基位置寻找一对合适(考虑特异性和敏感性)的引物，即利用NCBI网站中的BLAST工具(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/ Blast.cgi)，检查引物的理论特异性。利用含有此多态性的细胞系HCC827和未含有此多态性的细胞系A549进行扩增筛选并且利用琼脂糖凝胶电泳再次确定筛选引物的特异性和敏感性。
此探究过程中试剂及样本加入量及顺序：将12μL双蒸水、2μL正向引物、2μL反向引物(引物浓度均为10μM)、2μL样本DNA(浓度为150ng/μL)和29.5μL重泡胀缓冲液(rehydration buffer)加入到含有冻干扩增酶(TwistDX,Cambridge,UK)的EP管中，混匀后再向其中加入2.5μL醋酸镁溶液(280mM)混匀、扩增。最合适的扩增时间为15min，再加入浓度为200X的SYBR GreenⅠ(Solarbio，北京，索莱宝科技有限公司)，每20μL产物应用1μL。以上均考虑到敏感性和特异性的平衡。
为了检测筛选EGFR19Del(2)多态性中设计的引物的特异性，按照上述方法，分别对下述样品进行检测：1.以TwistDX扩增试剂盒(TwistDX,Cambridge,UK)中的自带阳性细菌DNA片段，扩增后电泳条带长度为143bp为本实验阳性对照组、2.以无样本DNA为阴性对照组、19号染色体缺失阳性细胞系HCC827和阴性细胞系A549两两一组，分为扩增时间不同的4组，挑选出设计的8组引物中特异性最好的引物组(以没有二聚体的单一条目的带为引物筛选理由)检测结果如图1所示：
图1表示EGFR19号染色体引物的特异性。从左至右依次显示了阳性对照组(细菌DNA，143bp目的片段)、阴性对照组(无样本DNA)、20min19号染色体缺失阳性细胞系(HCC827细胞系，266bp)和阴性细胞系(A549细胞系)、15min19号染色体缺失阳性细胞系(HCC827细胞系，266bp)和阴性细胞系(A549细胞系)、10min19号染色体缺失阳性细胞系(HCC827细胞系，266bp)和阴性细胞系(A549细胞系)和5min19号染色体缺失阳性细胞系(HCC827细胞系，266bp)和阴性细胞系(A549细胞系)。5～20min都能够特异性的扩增到目的片段，即EGFR19号染色体引物的扩增时间至少为5min，而考虑到杂质等因素，最优的扩增时间为15min。
实施例2
本发明在筛选单个核苷酸多态性EGFRL858R的具体过程为：
在筛选目的基因片段多态性之前，先根据缺失碱基位置寻找一对合适(考虑特异性和敏感性)的引物，即利用NCBI网站中的BLAST工具(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/ Blast.cgi)，检查引物的理论特异性，还利用了网站http:// www6.appliedbiosystems.com/support/pnadesigner.cfm.筛选了PNA退火温度Tm值为66℃)。利用含有此多态性的细胞系H-1975和未含有此多态性的细胞系A549进行扩增筛选并且利用琼脂糖凝胶电泳再次筛选引物的特异性和敏感性。
此探究过程中试剂及样本加入量及顺序：将10μL双蒸水、2μLPNA、2μL样本DNA(浓度为150ng/μL)，预先进行99℃解链2min，66℃PNA-DNA结合2min，再加入2μL正向引物、2μL反向引物(引物浓度均为10μM)、和29.5μL重泡胀缓冲液(rehydration buffer)加入到含有冻干扩增酶(TwistDX,Cambridge,UK)的EP管中，混匀后再向其中加入2.5μL醋酸镁溶液(280mM)混匀、扩增，合适的扩增时间为15min。再加入浓度为200X的SYBR GreenⅠ(Solarbio，北京，索莱宝科技有限公司，每20μL产物应用1μL)，以上均考虑到敏感性和特异性的平衡。显示结果。
试剂 浓度 加入量
双蒸水 10μL
正向引物(L858R：SEQ ID NO.3) 10μM 2μL
反向引物(L858R：SEQ ID NO.4) 10μM 2μL
PNA(L858R：SEQ ID NO.5) 20μM 2μL
样本DNA 150ng/μL 2μL
重泡胀缓冲液(rehydration buffer) 29.5μL
醋酸镁 280mM 2.5μL
为了检测筛选EGFRL858R点多态性中设计的引物的特异性，按照上述方法，分别对下述样品进行检测：1.以TwistDX扩增试剂盒(TwistDX,Cambridge,UK)中的阳性对照(细菌DNA，143bp)为本实验的阳性对照组、2.以无样本DNA为阴性对照组、L858R基因多态性阳性细胞系H1975细胞系为检测对象，未含有此点多态性的A549细胞系为阴性检测对象，两两一组，分为扩增时间不同的4组，设计的10组引物中特异性最好的引物组(以没有二聚体的单一目的条带为引物筛选理由)检测结果如图2所示：
图2表示筛选EGFRL858R点多态性中设计的引物的特异性。从左至右依次显示了阳性对照组(细菌DNA，143bp目的片段)、阴性对照组(无样本DNA)、10minL858R阳性细胞系(H1975细胞系，目的片段长201bp)和阴性细胞系(A549细胞系)、15minL858R阳性细胞系(H1975细胞系，201bp)和阴性细胞系(A549细胞系)、20minL858R阳性细胞系(H1975细胞系，201bp)和阴性细胞系(A549细胞系)和5minL858R阳性细胞系(H1975细胞系，201bp)和阴性细胞系(A549细胞系)。10min-20min都特异性的扩增了目的片段。5min时间不适用于此筛选。即EGFRL858R点多态性中设计的引物的扩增时间至少为10min，而考虑到杂质等因素，最优的扩增时间为15min。
实施例3
筛选本发明(ARPS)的敏感度的具体实施过程为：
1.将含有多态性的细胞系DNA和非多态性细胞系DNA混合，分别将多态性细胞系DNA(总DNA含量为300ng)分别稀释为浓度为100％、80％、60％、40％、30％、20％、10％和0％。(100％即300ng的DNA全部为多态性细胞系DNA，80％即300ng的DNA中有240ng为多态性细胞系DNA，60ng为非多态性细胞系DNA，以此类推)
2.按照实施例1所述方法，分别对下述样品进行检测：除了试剂盒中的阳性对照(+)和无DNA的阴性对照(-)，还将多态性细胞系DNA(HCC-827)和正常目的基因片段细胞系DNA(A-549细胞系)混合，多态性细胞系DNA(HCC-827)分别占100％、80％、60％、40％、30％、20％、10％和0％。图示3A显示HCC-827细胞系DNA占100％、80％、60％、40％和30％时，均可产生肉眼可见的绿色荧光，琼脂糖凝胶电泳结果也证实了这一点(单一目的条带的产生)。结果说明检测19号染色体缺失多态性的灵敏度为30％；
按照实施例2所述方法，分别对下述样品进行检测：除了试剂盒中的阳性对照(+)和无DNA的阴性对照(-)，还将多态性细胞系DNA(H-1975)和正常目的基因片段细胞系DNA(A-549)混合，多态性细胞系DNA(H-1975)分别占100％、80％、60％、40％、30％、20％、10％和0％。图示3B显示H-1975细胞系DNA占100％、80％、60％、和40％时，均可产生肉眼可见的绿色荧光，琼脂糖凝胶电泳结果也证实了这一点(单条带产生)。结果说明检测L858R多态性的灵敏度为40％；
分别反应后发现在EGFR19Del多态性中的敏感度为30％(多态性DNA含量，如图3A)，即，在EGFR19Del多态性中的敏感度为待检样本中目的DNA片段的量至少为90ng。EGFRL858R多态性中的敏感度为40％(多态性DNA含量，如图3B)。即，在EGFR L858R多态性中的敏感度为待检样本中目的DNA片段的量至少为120ng。
实施例4
筛选的冰冻组织样本中EGFR19Del(2)型多态性的情况
本发明收集的手术切除样本来自大连医科大学附属第二医院(大连，中国)在2015年接受病理治疗的患者(均根据对肺癌的分期方案确诊的46例肺癌患者)。该研究通过了大连医科大学附属第二医院审核，每个参与这项研究的病人均签署过了书面知情同意书。这一组患者包括25名女性和21例男性，从42至87岁(中位数66岁)。手术切除后，所有的切除组织立刻快速冷冻并储存在-80℃直至使用。
为了进一步评估EGFR突变多态性的非小细胞肺癌组织标本，本发明收集的46例非小细胞肺癌患者手术切除组织样本，在我院采用突变多态性特异性扩增系统(ARMS)筛选出三例为表皮生长因子受体L858R多态性和一例EGFR19号染色体缺失的基因多态性样本，本发明利用测序法再次确认了这四个突变多态性样本和两个非突变多态性标本中的目标靶DNA序列，然后利用本发明进行筛查(图4A和图4B)。
本发明利用细胞系HCC-827和A549分别作为阳性和阴性对照(质控)，白色背景为筛选环境，筛选临床冰冻标本的基因多态性情况。然后，本发明使用ARPS新方法筛选了这六个组织样品中EGFR相关序列多态性(如实施例1)，并发现15min扩增后，混合预先滴加在EP管帽上的SYBR即出现可视化的结果(图4A)，并与DNA测序结果一致。
具体步骤为：将上述实施例1中验证成功的HCC-827细胞系DNA作为阳性对照，A-549细胞系DNA做为阴性对照，新鲜冰冻样本1、5、6(case1、case5、case6)为筛查对象，将12μL双蒸水、2μL正向引物、2μL反向引物(引物浓度均为10μM)、2μL样本DNA(浓度为150ng/μL)和29.5μL重泡胀缓冲液(rehydration buffer)加入到含有冻干扩增酶(TwistDX,Cambridge,UK)的EP管中，混匀后再向其中加入2.5μL醋酸镁溶液(280mM)混匀、扩增。扩增15min后，将预先滴在EP管盖内的2.5μL的SYBR混匀(每20μL产物加入1μLSYBR)，观察结果。
ARPS结果显示新鲜冰冻样本1(case1)产生肉眼可见的绿色荧光，并与PCR扩增后测序法结果相一致(多态性阳性)；样本5和6没有产生肉眼可见的绿色荧光；新鲜冰冻样本经PCR扩增后测序结果也为多态性阴性。
筛选的临床样本中EGFR L858R多态性的情况
本发明利用细胞系H-1975和A549分别作为阳性和阴性对照(质控)，白色背景为筛选环境，筛选临床冰冻标本的基因多态性情况。本发明(ARPS)筛选了这六个组织样品中EGFR相关序列多态性，并发现15min扩增后，混合预先滴加在EP管帽上的SYBR即出现可视化的结果(图4B)，并与DNA测序结果一致。
具体步骤为：将上述实施例2中验证成功的H-1975细胞系DNA作为阳性对照，A-549细胞系DNA做为阴性对照，新鲜冰冻样本2、3、4、5、6(case2、case 3、case 4、case5、case6)为筛查对象，将10μL双蒸水、2μLPNA、2μL样本DNA(浓度为150ng/μL)，预先进行99℃解链2min，66℃PNA-DNA结合2min，再加入2μL正向引物、2μL反向引物(引物浓度均为10μM)、和29.5μL重泡胀缓冲液(rehydration buffer)加入到含有冻干扩增酶(TwistDX,Cambridge,UK)的EP管中，混匀后再向其中加入2.5μL醋酸镁溶液(280mM)混匀、扩增，扩增15min后，将预先滴在EP管盖内的2.5μL的SYBR混匀(每20μL产物加入1μLSYBR)，观察结果。
ARPS结果显示新鲜冰冻样本2(case2)、3(case3)、4(case4)产生肉眼可见的绿色荧光，并与PCR扩增后测序法结果相一致(多态性阳性)；样本5和6没有产生肉眼可见的绿色荧光，新鲜冰冻样本经PCR扩增后测序结果也为多态性阴性。
图4A:显示检测筛选的临床样本中EGFR19Del(2)型多态性的情况。从上至下依次阳性质控(HCC827细胞系DNA)、阴性质控(A549细胞系DNA)、一个阳性临床样本中(经过直接测序法检测筛选验证过的19Del(2)多态性样本)、两个癌旁组织(经过测序法筛选了非19Del多态性)。(左边为本发明检测筛选结果，右边为直接测序验证结果)
图4B:B:显示筛选的临床样本中EGFRL858R多态性的情况。从上至下依次为阳性质控(H1975细胞系DNA)、阴性质控(A549细胞系DNA)、三个阳性临床样本(经过直接测序法筛选验证过的L858R多态性)、两个癌旁组织(经过测序法筛选了非L858R多态性)样本。(左边为本发明筛选结果，右边为直接测序验证结果)
实施例5
筛选点多态性时，未预先经过PNA与非目的条带结合(即99℃2min和66℃2min)的筛选效果
为了验证是否有必要先使PNA与非目的序列结合，本发明在筛选EGFRL858R点多态性时也验证了同时将10μL双蒸水、2μL的PNA、2μL正向引物、2μL反向引物、2μL样本DNA和29.5μL重泡胀缓冲液(rehydration buffer)加入到含有冻干扩增酶(TwistDX,Cambridge,UK)的无核酸及核酸酶的EP管中，混匀后再向其中加入2.5μL醋酸镁溶液(280mM)混匀、扩增。扩增15min后，浓度为200X的SYBR GreenⅠ(Solarbio，北京，索莱宝科技有限公司)溶液每20μL产物应用1μL，样本DNA的量为300ng(以上考虑到敏感性和特异性的平衡)。虽然又加入了靶序列EGFR L858R的另一个错配碱基(图5，绿色字母)。琼脂糖凝胶电泳和ARPS的结果也不甚理想。(即筛选点多态性时，必须先利用PNA与非目的序列结合，去除假阳性，图5)。
图5.显示引物序列和琼脂糖凝胶电泳数据。A：筛选EGFR L858R的另一个错配碱基在反向引物中的位置(绿色字母)。B：琼脂糖凝胶电泳和ARPS的结果。目的片段长℃为201bp，“+”表示从RPA反应试剂盒(143bp)的阳性对照。所使用的DNA量为300ng。
以上内容是结合优选的技术方案对本发明所做的进一步详细说明，不能认定发明的具体实施仅限于这些说明。对本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的构思的前提下，还可以做出简单的推演及替换，都应当视为本发明的保护范围。

Claims (6)

1.一种筛选人类EGFR基因多态性的引物组，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1~2或者SEQID NO.3~5所示。
2.一种筛选人类EGFR基因多态性的试剂盒，其特征在于：包括权利要求1所述的引物组以及检测试剂：核苷酸序列为SEQ ID NO.1~2和/或者SEQ ID NO.3~5所示的引物，重泡胀缓冲液、醋酸镁溶液、SYBR GreenⅠ溶液及含有冻干扩增酶的EP管。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：还包括记载检测待测样品方法的说明书：
将12μL双蒸水、2μL的浓度为10μM的正向引物SEQ ID NO.1、2μL的浓度为10μM的反向引物SEQ ID NO.2、2μL的浓度为150ng/μL的样本DNA和29.5μL重泡胀缓冲液加入到含有冻干扩增酶的EP管中，混匀后再向其中加入2.5μL浓度为280mM的醋酸镁溶液混匀、扩增至少5min，再按照每20μL产物应用1μL的比例，加入浓度为200X的SYBR GreenⅠ。
4.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：还包括记载检测待测样品方法的说明书：
将10μL双蒸水、2μL的浓度为20μM的PNA SEQ ID NO.5、2μL浓度为150ng/μL的样本DNA，预先进行99℃解链2min，66℃结合2min，再加入2μL的浓度为10μM的正向引物SEQ ID NO.3、2μL的浓度为10μM的反向引物SEQ ID NO.4，和29.5μL重泡胀缓冲液加入到含有冻干扩增酶的EP管中，混匀后再向其中加入2.5μL浓度为280mM的醋酸镁溶液混匀、扩增至少10 min，再按照每20μL产物应用1μL的比例，加入浓度为200X的SYBR GreenⅠ。
5.根据权利要求3或4所述的试剂盒，其特征在于：所述说明书中还包括：取扩增产物30μL加入100μL无水乙醇后，12000rpm/min离心5min，去除液体后再加入30μL双蒸水，最后进行琼脂糖凝胶电泳检测。
6.权利要求1 所述的引物组在制备筛选人类EGFR基因多态性的检测试剂中的应用。
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