JP6644478B2 - チオプリン製剤による副作用の危険性の判定方法 - Google Patents
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Description
本発明は、チオプリン製剤による副作用の危険性の判定方法に関し、より詳細には、チオプリンによる脱毛の発症の危険性を判定する方法に関する。
6-メルカトプリン（6-MP）およびアザチオプリン（AZA)などのチオプリン製剤は、クローン病(CD)および潰瘍性大腸炎(UC)を含む炎症性腸疾患(IBD)をはじめとする種々の疾患に対する治療薬として広く用いられている。チオプリンの副作用として様々なものがあげられるが、特に白血球減少が臨床的には問題とされてきた。
白血球減少の他に、患者側が主に問題とするものとして、妊娠に関する不安や、脱毛などの日常生活に強い影響を及ぼす副作用が挙げられる。脱毛には、本人が自覚するが客観的には評価が難しい軽度の脱毛と、経験的に他者が見ても明らかな客観的に重度の脱毛とがあるが、前者は薬剤の中止後にさらに脱毛が進行して完全に脱毛することはない。一方で、後者の客観的に確認できる重度の脱毛は、薬剤を中止しても完全に脱毛するまで進行し、完全脱毛に至ることが多い。一般的にチオプリンの副作用のほとんどは薬剤の中止で速やかに改善するが、脱毛は、一度抜けてしまうと発毛までも数週間から数か月、さらに完全に回復するまでは数か月から半年、元の髪の長さによっては数年も必要であるために、他の副作用よりも患者への影響が大きい。
このようなチオプリンの副作用を事前に予測できないかという検討はかねてから行われていた。その中でも、臨床的に医師側が問題とする白血球減少についての研究が多く、欧米では6-メルカトプリンの不活性化に関与するチオプリンＳ−メチルトランスフェラーゼ（TPMT）の遺伝子多型によるチオプリン代謝の違いが、欧米人での白血球減少に関係しているという報告がされている（非特許文献１）。また、韓国人を対象とした研究で、NUDT15遺伝子多型（NUDT15-R139C、NUDT15遺伝子によりコードされるタンパク質の139番目がアルギニンからシステインに変異する多型）が白血球減少と強い相関をしているという報告がされている（非特許文献２）。さらに、NUDT15遺伝子の139番目の遺伝子多型が急性リンパ性白血病(ALL)の小児におけるメルカプトプリン不耐性の決定因子であるという報告もされている（非特許文献３）。
Gastroenterology 2000; 118(6): 1025-1030
Nature genetics 2014; 46(9): 1017-1020.
Journal of Clinical Oncology 33 2015, 10.1200/JCO.2014.59.4671
しかしながら、NUDT15-R139C多型と、チオプリンによる脱毛の副作用との関係はまだ報告されていない。
また、チオプリンによる脱毛および白血球減少の副作用を予防または軽減するための、被験者のNUDT15-R139Cの遺伝子型に基づく投薬形式についても報告されていない。
上記の先行技術は欧米人や韓国人を被験者としたものであるが、クローン病でのATG16L1の遺伝子多型が韓国人と日本人で相関が違うことが報告されており(Gut2015;64:687-688 doi:10.1136/gutjnl-2014-308242, Journal of human genetics. 2007;52(7):575-83.）、日本人においても上記の先行技術のNUDT15-R139C多型とチオプリンによる副作用の相関が当てはまるかどうかは不明である。
本発明の目的は、脱毛の発症の危険性と関連性のある遺伝子多型を利用して、チオプリンによる脱毛の発症の危険性を判定する方法を提供することにある。
本発明の別の目的は、副作用として脱毛を伴うチオプリンを投与する患者の選別方法およびチオプリンによる脱毛の発症の危険性を判定するためのキットを提供することである。
本発明の別の目的は、脱毛および／または白血球減少の副作用を起こさない炎症性腸疾患の治療のための医薬組成物を提供することにある。
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討した結果、チオプリンによる脱毛の発症の危険性のある遺伝子多型を同定し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は以下の通りである。
［１］被検体におけるチオプリンによる脱毛の発症の危険性を判定する方法であって、
被検体由来の生物学的試料から、NUDT15遺伝子の第３エクソンの５’末端から６０番目の塩基における多型、または
前記NUDT15遺伝子の第３エクソンの５’末端から６０番目の塩基における多型と連鎖不平衡係数r2が0.8以上の連鎖不平衡状態にある多型
を検出することを含む方法。
［２］前記NUDT15遺伝子の第３エクソンの５’末端から６０番目の塩基における多型がC/CまたはC/Tである場合に、脱毛の発症の危険性が低いと判定し、T/Tである場合に、脱毛の発症の危険性が高いと判定することをさらに含む、項１に記載の方法。
［３］項１または２に記載の方法により判定したチオプリンによる脱毛の発症の危険性に基づいてチオプリンを投与する患者を選別することを含む、チオプリンを投与する患者の選別方法。
［４］チオプリンがアザチオプリンまたは6-メルカプトプリンである項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
［５］下記の（ｉ）または（ｉｉ）の塩基を含む連続する少なくとも１０塩基の配列、またはその相補配列にハイブリダイズすることができ、項１または２に記載の方法においてプローブとして用いられるポリヌクレオチド。
［１］被検体におけるチオプリンによる脱毛の発症の危険性を判定する方法であって、
被検体由来の生物学的試料から、NUDT15遺伝子の第３エクソンの５’末端から６０番目の塩基における多型、または
前記NUDT15遺伝子の第３エクソンの５’末端から６０番目の塩基における多型と連鎖不平衡係数r2が0.8以上の連鎖不平衡状態にある多型
を検出することを含む方法。
［２］前記NUDT15遺伝子の第３エクソンの５’末端から６０番目の塩基における多型がC/CまたはC/Tである場合に、脱毛の発症の危険性が低いと判定し、T/Tである場合に、脱毛の発症の危険性が高いと判定することをさらに含む、項１に記載の方法。
［３］項１または２に記載の方法により判定したチオプリンによる脱毛の発症の危険性に基づいてチオプリンを投与する患者を選別することを含む、チオプリンを投与する患者の選別方法。
［４］チオプリンがアザチオプリンまたは6-メルカプトプリンである項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
［５］下記の（ｉ）または（ｉｉ）の塩基を含む連続する少なくとも１０塩基の配列、またはその相補配列にハイブリダイズすることができ、項１または２に記載の方法においてプローブとして用いられるポリヌクレオチド。
（ｉ）NUDT15遺伝子の第３エクソンの５’末端から６０番目の塩基における多型、および
（ｉｉ）前記NUDT15遺伝子の第３エクソンの５’末端から６０番目の塩基における多型と連鎖不平衡係数r2が0.8以上の連鎖不平衡状態にある多型
［６］下記の（ｉ）または（ｉｉ）の塩基を含む連続する少なくとも１０塩基の配列、またはその相補配列を増幅することができ、項１または２に記載の方法においてプライマーとして用いられるポリヌクレオチド。
（ｉｉ）前記NUDT15遺伝子の第３エクソンの５’末端から６０番目の塩基における多型と連鎖不平衡係数r2が0.8以上の連鎖不平衡状態にある多型
［６］下記の（ｉ）または（ｉｉ）の塩基を含む連続する少なくとも１０塩基の配列、またはその相補配列を増幅することができ、項１または２に記載の方法においてプライマーとして用いられるポリヌクレオチド。
（ｉ）NUDT15遺伝子の第３エクソンの５’末端から６０番目の塩基における多型、および
（ｉｉ）前記NUDT15遺伝子の第３エクソンの５’末端から６０番目の塩基における多型と連鎖不平衡係数r2が0.8以上の連鎖不平衡状態にある多型
［７］（ａ）NUDT15遺伝子の第３エクソンの５’末端から６０番目の塩基における多型を含む１５〜３００塩基からなるポリヌクレオチド、
（ｂ）（ａ）のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド、または
（ｃ）（ａ）または（ｂ）にハイブリダイズすることができるポリヌクレオチド
からなるチオプリンによる脱毛の発症の危険性の判定用マーカー。
［８］項５〜７のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含む、被検体におけるチオプリンによる脱毛の発症の危険性を判定するためのキット。
［９］有効成分としてチオプリンを含有する炎症性腸疾患を治療するための医薬組成物であって、チオプリンが6-メルカプトプリンであり、
NUDT15遺伝子の第３エクソンの５’末端から６０番目の塩基における多型がT/Cである被検体に、投与開始から８週間までの間、6-メルカプトプリンが1日0.2-0.3mg/kgの量で投与されるように用いられる、医薬組成物。
［１０］前記被験者が日本人である項９に記載の医薬組成物。
（ｉｉ）前記NUDT15遺伝子の第３エクソンの５’末端から６０番目の塩基における多型と連鎖不平衡係数r2が0.8以上の連鎖不平衡状態にある多型
［７］（ａ）NUDT15遺伝子の第３エクソンの５’末端から６０番目の塩基における多型を含む１５〜３００塩基からなるポリヌクレオチド、
（ｂ）（ａ）のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド、または
（ｃ）（ａ）または（ｂ）にハイブリダイズすることができるポリヌクレオチド
からなるチオプリンによる脱毛の発症の危険性の判定用マーカー。
［８］項５〜７のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含む、被検体におけるチオプリンによる脱毛の発症の危険性を判定するためのキット。
［９］有効成分としてチオプリンを含有する炎症性腸疾患を治療するための医薬組成物であって、チオプリンが6-メルカプトプリンであり、
NUDT15遺伝子の第３エクソンの５’末端から６０番目の塩基における多型がT/Cである被検体に、投与開始から８週間までの間、6-メルカプトプリンが1日0.2-0.3mg/kgの量で投与されるように用いられる、医薬組成物。
［１０］前記被験者が日本人である項９に記載の医薬組成物。
本発明によれば、チオプリンによる被験者における脱毛の発症の危険性が高いかどうかを、チオプリン投与前に事前に判定できるため、チオプリンの投与により起こる副作用である脱毛を未然に防ぐことができる。このように、本発明により、チオプリン投与の際のコンパニオン診断法が提供される。
また、被験者のNUDT15の139番目の多型がヘテロ（C/T）型である場合も、投薬量を調整することにより、脱毛および／または白血球減少の副作用を起こさずにチオプリン投与による治療継続性を向上させることができる。
本発明は、被検体におけるチオプリンによる脱毛の発症の危険性を判定する方法であって、被検体由来の生物学的試料から、NUDT15遺伝子の第３エクソンの５’末端から６０番目の塩基における多型、またはNUDT15遺伝子の第３エクソンの５’末端から６０番目の塩基における多型と連鎖不平衡係数r2が0.8以上の連鎖不平衡状態にある多型を検出することを含む方法を包含する。
NUDT15遺伝子の塩基配列は公知であり、例えばNational Center for Biotechnology Information(NCBI)にGene ID: 55270で登録されている。
連鎖不平衡とは、２つの対立遺伝子がそれぞれ独立に遺伝する場合よりも大きな頻度で互いに連鎖して遺伝することをいう。このような連鎖不平衡を示す一群の対立遺伝子のことをハプロタイプと称する。所定の遺伝子座において複数のＳＮＰｓがある場合、その多型の組み合わせであるハプロタイプマーカーは個人によって異なる。ハプロタイプマーカーを利用して被験者の遺伝情報と、チオプリン投与による脱毛の発症とを関連付けることができる。
本発明では、好ましくは、連鎖不平衡係数r2が0.8以上、より好ましくは0.95以上、最も好ましくは１である多型を用いることができる。
一実施形態において、被検体は、炎症性腸疾患(IBD)に罹患している被験者である。炎症性腸疾患には、クローン病(CD)、潰瘍性大腸炎(UC)およびその他の分類不能型腸炎(IBDU)が含まれる。好ましくは、被験者は日本人である。
被検体由来の「生物学的試料」は任意の生物学的試料であってよく、例えば血液、骨髄液、精液、腹腔液、唾液、尿等の体液；肝臓などの組織細胞；爪；毛髪等が挙げられる。
本明細書において「チオプリン」は、チオプリン系薬剤を指し、6-メルカプトプリン（6-MP）、アザチオプリン(AZA)、6-チオグアニン(6-TG)、もしくはこれらの組み合わせを含み、好ましくは6-メルカプトプリンまたはアザチオプリンである。
脱毛の発症の危険性の「判定」は、脱毛の発症の有無の判断、脱毛の発症の可能性の判断、脱毛の遺伝的要因の解明などを指す。
本明細書において、「チオプリンによる脱毛」とは、本人が主観的に自覚するが医師等による客観的評価が難しい脱毛は含まず、チオプリン投与により発症する、医師等により客観的に評価される脱毛を指す。
本発明において「多型を検出する」とは、（１）遺伝子側の多型を直接検出すること、および（２）遺伝子の相補配列側に存在する多型を検出し、その検出結果から遺伝子側多型を推定することの両方を指す。ただし、遺伝子側の多型を直接検出することが好ましい。
検出対象となるNUDT15(nucleside diphosphate linked moiety X-type motif 15)R139C多型は、NUDT15タンパク質の139番目のアルギニンがシステインへ変異する遺伝子多型である。
これは、第１３番染色体における位置が48045719番目の塩基、すなわちNUDT15遺伝子の第３エクソンの５’末端から６０番目の塩基が、シトシン(C)からチミン(T)に変異する一塩基多型）であり、NCBIにrs116855232で登録されている。rs116855232の多型を配列番号１に示す。配列中、ｙはcまたはtである。
cctggaccag cttttctggg gactgygttg tttaaaagaa caaggctatg a (配列番号１)
対立遺伝子の多型がC/Cの場合、脱毛の発症の危険性がないノンリスクホモ接合であり、C/Tの場合はヘテロ接合であり、T/Tの場合は脱毛の発症の危険性が高いホモ接合である。
これは、第１３番染色体における位置が48045719番目の塩基、すなわちNUDT15遺伝子の第３エクソンの５’末端から６０番目の塩基が、シトシン(C)からチミン(T)に変異する一塩基多型）であり、NCBIにrs116855232で登録されている。rs116855232の多型を配列番号１に示す。配列中、ｙはcまたはtである。
cctggaccag cttttctggg gactgygttg tttaaaagaa caaggctatg a (配列番号１)
対立遺伝子の多型がC/Cの場合、脱毛の発症の危険性がないノンリスクホモ接合であり、C/Tの場合はヘテロ接合であり、T/Tの場合は脱毛の発症の危険性が高いホモ接合である。
一実施形態において、本発明の上記の方法は、本発明の上記の方法は、多型がC/CまたはC/Tである場合に、脱毛の発症の危険性が低く、多型がT/Tである場合に、脱毛の発症の危険性が高いと判定することをさらに含む。ここで「脱毛の発症の危険性が低い」とは、多型がT/Tである場合に比べて相対的に低いことを指し、「脱毛の発症の危険性が無い場合も含む。これらの判定により、脱毛の発症の危険性が高い、T/T多型の被験者へのチオプリンの投与を未然に防ぐことができる。
遺伝子多型の検出の対象は、ゲノムＤＮＡが好ましいが、場合によっては（つまり多型部位およびその隣接領域の配列がゲノムと同一または完全相補的になっている場合）ｃＤＮＡ、またはｍＲＮＡを使用することもできる。
遺伝子多型を検出するにあたっては、まず遺伝子多型を含む部分を増幅する。増幅は例えばＰＣＲ法によって行われるが、他の公知の増幅方法、例えばＮＡＳＢＡ法、ＬＣＲ法、ＳＤＡ法、ＬＡＭＰ法等で行ってもよい。
プライマーの選択は、例えば、上記の一塩基多型を含む連続する、少なくとも１０塩基、好ましくは１０〜１００塩基の配列、より好ましくは１０〜５０塩基の配列、および／またはその相補配列を増幅するように行う。一つの実施形態において、プライマーの長さの下限値は、少なくとも１２塩基、少なくとも１５塩基、または少なくとも１８塩基である。プライマーは、上記の一塩基多型部位を含む所定塩基数の配列を増幅するためのプライマーとして機能し得る限り、その配列に１またはそれ以上の置換、欠失、付加を含んでもよい。
増幅のために用いるプライマーは、試料が一の対立遺伝子型の場合にのみ増幅されるように、フォワードプライマーまたはリバースプライマーの一方が一塩基多型にハイブリダイズするように選択してもよい。
遺伝子多型の検出は、一の対立遺伝子型に特異的なプローブとのハイブリダイゼーションにより行うことができる。プローブは、上記の一塩基多型を含み、試料とハイブリダイズし、所与の検出条件下で検出可能な程度の特異性を与えるものである限り、限定されない。プローブとしては、上記の一塩基多型を含む連続する少なくとも１０塩基、好ましくは１０〜１００塩基の配列、より好ましくは１０〜５０塩基の配列、またはそれらの相補配列にハイブリダイズすることのできるポリヌクレオチドを用いることができる。一つの実施形態において、プローブの長さの下限値は、少なくとも１２塩基、少なくとも１５塩基、または少なくとも１８塩基である。また、一塩基多型がプローブのほぼ中心部に存在するようにポリヌクレオチドを選択するのが好ましい。該ポリヌクレオチドは、プローブとして機能し得る限り、即ち、目的の対立遺伝子型の配列とハイブリダイズするが、他の対立遺伝子型の配列とはハイブリダイズしない条件下でハイブリダイズする限り、その配列に１またはそれ以上の置換、欠失、付加を含んでいてもよい。なお本明細書において、ヌクレオチドが複数連なったものをポリヌクレオチドと称し、ポリヌクレオチドの中でも塩基数が１００以下のものを特にオリゴヌクレオチドと称する。
本発明に用いるハイブリダイゼーション条件は、対立遺伝子型を区別するのに十分な条件である。例えば、試料が一の対立遺伝子型の場合にはハイブリダイズするが、他の対立遺伝子型の場合にはハイブリダイズしないような条件、例えばストリンジェントな条件である。ここで、「ストリンジェントな条件」としては、例えば、例えば、モレキュラークローニング・ア・ラボラトリーマニュアル第２版（Sambrook et al., 1989)に記載の条件などが挙げられる。具体的には、例えば、６×ＳＳＣ（１×ＳＳＣの組成：０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．０１５Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）、０．５％ＳＤＳ、５×デンハート及び１００ｍｇ／ｍｌニシン精子ＤＮＡを含む溶液中プローブとともに６５℃で一晩保温するという条件などが挙げられる。
遺伝子多型の検出は、制限酵素断片長多型分析法（ＲＦＬＰ：Restriction fragment length polymorphism）、ジデオキシ法およびMaxam-Gilbert法などの公知の直接配列決定法、マイクロアレイによる配列決定法、、GBA(genetic bit analysis)、ジェノタイプインピュテーション（疑似シーケンス技術）等、TaqMan PCR、インベーダーアッセイ、変性勾配ゲル電気泳動法（ＤＧＧＥ：denaturing gradient gel electrophoresis）、一本鎖コンフォメーション多型解析(ＳＳＣＰ：single strand conformation polymorphism）、対立遺伝子特異的ＰＣＲ(allele- specific PCR）、ＡＳＯ（allele-specific oligonucleotide）によるハイブリダイゼーション法、ミスマッチ部位の化学的切断（ＣＣＭ：chemical cleavage of mismatches）、ＨＥＴ（heteroduplex method)法、ＰＥＸ(primer extension)法、ＲＣＡ（rolling circle amplification)法、マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析法(MALDI-TOF/MS)等を用いて行ってもよい。
本発明はさらに、NUDT15遺伝子の第３エクソンの５’末端から６０番目の塩基における多型を含む、チオプリンによる脱毛の発症の危険性の判定用マーカーを包含する。好ましくは、かかるマーカーは、（ａ）NUDT15遺伝子の第３エクソンの５’末端から６０番目の塩基における多型を含む１５〜３００塩基からなるポリヌクレオチド、（ｂ）（ａ）のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド、または（ｃ）（ａ）または（ｂ）にハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドからなるチオプリンによる脱毛の発症の危険性の判定用マーカーを包含する。好ましくは、（ａ）のポリヌクレオチドは、配列番号１に示された塩基配列のうちの１５〜３００塩基を含むポリヌクレオチドである。
一つ実施形態では、そのようなポリヌクレオチドの塩基配列の長さは、好ましくは１５〜１００塩基の配列、より好ましくは１５〜５０塩基の配列である。別の実施形態では、そのようなポリヌクレオチドの塩基配列の長さは、好ましくは１８〜１００塩基の配列、より好ましくは１８〜５０塩基の配列である。
本発明はさらに、本発明の上記の方法により判定したチオプリンによる脱毛の発症の危険性に基づいてチオプリンを投与する患者を選別することを含む、チオプリンを投与する患者の選別方法を包含する。
一実施形態において、多型がT/Tである場合に、その患者をチオプリンを投与する対象外とする。
別の実施形態において、多型がC/CまたはC/Tである場合に、その患者をチオプリンを投与する対象とし、多型がT/Tである場合に、その患者をチオプリンを投与する対象外とする。
本発明はさらに、下記の（ｉ）または（ｉｉ）の塩基を含む連続する少なくとも１０塩基の配列、またはその相補配列にハイブリダイズすることができ、上記の判定方法においてプローブとして用いられるポリヌクレオチドを包含する。
（ｉ）NUDT15遺伝子の第３エクソンの５’末端から６０番目の塩基における多型、および
（ｉｉ）NUDT15遺伝子の第３エクソンの５’末端から６０番目の塩基における多型と連鎖不平衡係数r2が0.8以上の連鎖不平衡状態にある多型
本発明はさらに、下記の（ｉ）または（ｉｉ）の塩基を含む連続する少なくとも１０塩基の配列、またはその相補配列を増幅することができ、上記判定方法においてプライマーとして用いられるポリヌクレオチドを包含する。
（ｉｉ）NUDT15遺伝子の第３エクソンの５’末端から６０番目の塩基における多型と連鎖不平衡係数r2が0.8以上の連鎖不平衡状態にある多型
本発明はさらに、下記の（ｉ）または（ｉｉ）の塩基を含む連続する少なくとも１０塩基の配列、またはその相補配列を増幅することができ、上記判定方法においてプライマーとして用いられるポリヌクレオチドを包含する。
（ｉ）NUDT15遺伝子の第３エクソンの５’末端から６０番目の塩基における多型、および
（ｉｉ）NUDT15遺伝子の第３エクソンの５’末端から６０番目の塩基における多型と連鎖不平衡係数r2が0.8以上の連鎖不平衡状態にある多型
本発明はさらに、上記のプローブまたはプライマーとして用いられるポリヌクレオチドを含む、被検体におけるチオプリンによる脱毛の発症の危険性を判定するためのキットを包含する。
（ｉｉ）NUDT15遺伝子の第３エクソンの５’末端から６０番目の塩基における多型と連鎖不平衡係数r2が0.8以上の連鎖不平衡状態にある多型
本発明はさらに、上記のプローブまたはプライマーとして用いられるポリヌクレオチドを含む、被検体におけるチオプリンによる脱毛の発症の危険性を判定するためのキットを包含する。
本発明のキットは、遺伝子多型によるチオプリンによる脱毛の発症の危険性の判定を実施するために必要な１種以上の以下の成分をさらに含んでもよい：酵素緩衝液、ｄＮＴＰ、コントロール用試薬（例えば、組織サンプル、ポジティブおよびネガティブコントロール用標的オリゴヌクレオチドなど）、標識用または検出用試薬、固相支持体、ならびに説明書。
本発明はさらに、有効成分としてチオプリンを含有する炎症性腸疾患を治療するための医薬組成物であって、NUDT15遺伝子の第３エクソンの５’末端から６０番目の塩基における多型がT/Cである被験者に対して、投与開始から８週間までの間、被検体のNUDT15遺伝子の第３エクソンの５’末端から６０番目の塩基における多型がC/Cである被験者に対する用量よりもチオプリンが低用量で投与されるように用いられる、医薬組成物を包含する。
このような医薬組成物の、被検体のNUDT15遺伝子の第３エクソンの５’末端から６０番目の塩基における多型がC/Cである被験者に対する投与間隔および用量は、患者の症状、体重、年齢、性別等によって異なり一概には決定できないが、投与間隔は、通常１日１回、通常１ヶ月以上、より好ましくは８週間以上、さらに好ましくは１、２、３、５、又は１０年以上の期間投与する。１日２〜４回に分けて投与してもよい。また、好ましくは投与は連続投与とするが、投与開始の初期は副作用を避けるため数日または数週間おきに投与してもよい。以下の投与量は炎症性腸疾患の種類を問わず適用されるものとする。
多型がC/Cである被験者の場合、チオプリンが6-メルカプトプリンである場合には、投与開始から８週間までの期間の投与量である初期投与量を通常１日0.1mg/kg〜3mg/kg、より好ましくは1日0.4mg/kg〜1mg/kg、さらに好ましくは１日0.5mg/kgとし、９週目以降は、通常１日0.2mg/kg〜5mg/kg、より好ましくは1日0.8mg/kg〜2mg/kg、１日1.0mg/kgを目標とし増量する。以下、初期投与量は投与開始から８週間までの期間の投与量を指すものとする。
多型がC/Cである被験者の場合、チオプリンがアザチオプリンである場合には、初期投与量を通常１日0.2mg/kg〜6mg/kg、より好ましくは1日0.8mg/kg〜2mg/kg、さらに好ましくは１日1mg/kgとし、９週目以降は、通常１日0.4mg/kg〜10mg/kg、より好ましくは1日1.6mg/kg〜4mg/kg、１日2.0mg/kgを目標とし増量する。
多型がC/Cである被験者の場合、チオプリンがチオグアニン(6-TG)である場合には、初期投与量を通常１日0.1mg/kg〜4mg/kg、より好ましくは1日0.5mg/kg〜1.2mg/kg、さらに好ましくは１日0.6mg/kgとし、９週目以降は、通常１日0.2mg/kg〜6mg/kg、より好ましくは1日0.9mg/kg〜2.4mg/kg、１日1.2mg/kgを目標とし増量する。
多型がC/Cである被験者であって、被験者が小児の場合、好ましくは、上記のチオプリンの初期投与量を半量にし、９週目以降は同じとする。つまり、6-メルカプトプリンの初期投与量を通常１日0.05mg/kg〜1.5mg/kg、より好ましくは1日0.2mg/kg〜0.5mg/kg、さらに好ましくは１日0.2〜0.3mg/kgとし、アザチオプリンの初期投与量を通常１日0.1mg/kg〜3mg/kg、より好ましくは1日0.4mg/kg〜1mg/kg、さらに好ましくは１日0.4〜0.6mg/kgとし、チオグアニン(6-TG)の初期投与量を通常１日0.05mg/kg〜2mg/kg、より好ましくは1日0.2mg/kg〜0.6mg/kg、さらに好ましくは１日0.2〜0.4mg/kgとする。
多型がC/Tである被験者の場合、チオプリンが6-メルカプトプリンである場合には、投与開始から８週間までの期間の投与量である初期投与量を通常１日0.05mg/kg〜1.0mg/kg、より好ましくは1日0.2mg/kg〜0.5mg/kg、さらに好ましくは１日0.2〜0.3mg/kgとし、９週目以降は、通常１日0.1mg/kg〜2.5mg/kg、より好ましくは1日0.4mg/kg〜1mg/kg、１日0.5mg/kgを目標とし増量する。
多型がC/Tである被験者の場合、チオプリンがアザチオプリンである場合には、初期投与量を通常１日0.1mg/kg〜2mg/kg、より好ましくは1日0.4mg/kg〜1mg/kg、さらに好ましくは１日0.4〜0.6mg/kgとし、９週目以降は、通常１日0.2mg/kg〜4mg/kg、より好ましくは1日0.8mg/kg〜2mg/kg、１日1.0mg/kgを目標とし増量する。
多型がC/Tである被験者の場合、チオプリンがチオグアニン(6-TG)である場合には、初期投与量を通常１日0.05mg/kg〜2mg/kg、より好ましくは1日0.2mg/kg〜0.6mg/kg、さらに好ましくは１日0.2〜0.4mg/kgとし、９週目以降は、通常１日0.1mg/kg〜3mg/kg、より好ましくは1日0.4mg/kg〜1.2mg/kg、１日0.5〜0.7mg/kgを目標とし増量する。
多型がC/Tである被験者であって、被験者が小児の場合、好ましくは、上記のチオプリンの初期投与量を半量にし、９週目以降は同じとする。つまり、6-メルカプトプリンの初期投与量を通常１日0.02mg/kg〜0.5mg/kg、より好ましくは1日0.1mg/kg〜0.3mg/kg、さらに好ましくは１日0.1〜0.2mg/kgとし、アザチオプリンの初期投与量を通常１日0.05mg/kg〜1mg/kg、より好ましくは1日0.2mg/kg〜0.5mg/kg、さらに好ましくは１日0.2〜0.3mg/kgとし、チオグアニン(6-TG)の初期投与量を通常１日0.02mg/kg〜1mg/kg、より好ましくは1日0.1mg/kg〜0.3mg/kg、さらに好ましくは１日0.1〜0.2mg/kgとする。
なお、アロプリノールを併用する場合は、多型C/C又はC/Tである被験者の上記のチオプリンの投与量を低減する場合があり、例えば以下の通りである。
多型がC/Cである被験者であって、チオプリンが6-メルカプトプリンである場合、初期投与量を１日0.03mg/kg〜1mg/kgとし、９週目以降は１日0.05mg/kg〜1.7mg/kgを目標とする。チオプリンがアザチオプリンである場合、初期投与量を１日0.05mg/kg〜2mg/kgとし、９週目以降は１日0.2mg/kg〜3.4mg/kgを目標とする。チオプリンがチオグアニン(6-TG)である場合、初期投与量を１日0.02mg/kg〜1.4mg/kgとし、９週目以降は１日0.05mg/kg〜2mg/kgを目標とする。
多型がC/Tである被験者であって、チオプリンが6-メルカプトプリンである場合、初期投与量を１日0.01mg/kg〜0.3mg/kgとし、９週目以降は１日0.02mg/kg〜0.9mg/kgを目標とする。チオプリンがアザチオプリンである場合、初期投与量を１日0.02mg/kg〜0.7mg/kgとし、９週目以降は１日0.05mg/kg〜1.4mg/kgを目標とする。チオプリンがチオグアニン(6-TG)である場合、初期投与量を通常１日0.01mg/kg〜0.7mg/kgとし、９週目以降は１日0.02mg/kg〜1mg/kgを目標とする。
6-メルカプトプリンは散剤であるため、被験者が女性または小児を含む体重の少ない被験者である場合に好適に使用される。また、多型がC/Cである被験者の場合、投与開始から８週間までの間の用量を低くすることが好ましいため、6-メルカプトプリンが好適に使用される。
本発明はさらに、有効成分としてチオプリンを含有する炎症性腸疾患を治療するための医薬組成物であって、チオプリンが6-メルカプトプリンであり、NUDT15遺伝子の第３エクソンの５’末端から６０番目の塩基における多型がT/Cである被検体に、投与開始から８週間までの間、6-メルカプトプリンが1日0.2-0.3mg/kgの量で投与されるように用いられる、医薬組成物を包含する。
本発明の医薬組成物には、必要に応じて薬学的担体を配合し、予防または治療目的に応じて各種の投与形態を採用可能である。薬学的担体は、製剤素材として慣用の各種有機或いは無機担体物質が用いられ、固形製剤における賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、着色剤；液状製剤における溶剤、溶解補助剤、懸濁化剤、等張化剤、緩衝剤、無痛化剤等として配合される。また、必要に応じて防腐剤、抗酸化剤、着色剤、甘味剤、安定化剤等の製剤添加物を用いることもできる。
本明細書中に引用されているすべての特許出願および文献の開示は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれるものとする。
以下に実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されない。
１．対照
東北大学病院に通院中の潰瘍性大腸炎、クローン病、分類不能型腸炎に対してチオプリン治療歴がある日本人患者のうち、遺伝子研究に書面で同意した142例を対象とした。潰瘍性大腸炎およびクローン病の診断は厚生労働省の従来の診断基準に従って臨床症状、内視鏡所見、X線写真所見、及び組織学的所見に基づいて行った。患者のゲノムDNAは標準的なフェノール−クロロホルム抽出沈殿によるか、または自動核酸抽出装置（クラボウ、大阪）またはPAXgene DNAキット(BD, アメリカ合衆国ニュージャージー州)を使用して末梢血の白血球から得た。
２．チオプリン処理および有害事象
チオプリンの初期投与量（投与開始から８週間までの期間の投与量）、継続投与量、継続期間、性別、体重、抗TNFα抗体製剤の併用の有無、脱毛の有無、および他の副作用発症の有無（白血球減少症や膵炎など）を診療録から調査した。チオプリンの継続投与量は、1年を超えてチオプリン処理を継続できた患者の最終濃度として定義した。6MPの量は2倍してAZA相当量に調整した。脱毛は他覚的に確認できる完全な脱毛で回復に時間がかかるものとし、自覚症状のみで他覚的に進行しないものは除外した。白血球減少症は、NCI N, DHHS. National Cancer Institute, Common Terminology Criteria for Adverse Events v4. NIH publication 2009; # 09-7473.に記載されている一般的な毒性基準により以下のグレードに分けした：グレード２、白血球(WBC)数 2000-3000/mm3；グレード３、1000-2000/mm3；グレード４、<1000mm3。
３．ゲノムタイピング
検討する遺伝子多型は、これまでに白血球減少との相関が欧米で報告されているTPMT遺伝子多型（アレル３C, rs1142345）と、韓国人で報告されているNUDT15 R139C遺伝子多型(rs116855232)とした。タイピングにはCustom TaqMan SNP Genotyping Assay KitおよびSep-One Plus Real Time PCR システム(Life Technologies, アメリカ合衆国カリフォルニア州カールスバッド)を使用した。rs116855232に特異的なフォワードプライマーおよびリバースプライマーの配列と、蛍光レポーター染料（FAMまたはVIC）で標識した２つの対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプローブは、それぞれ
5′-CCCCTGGACCAGCTTTTCTG-3′（配列番号２）、
5′-CCACCAGATGGTTCAGATCTTCTTTAAA-3′（配列番号３）、
5′-AAACAACGCAGTCCC-3′ （配列番号４）、および
5′-TTTAAACAACACAGTCCC-3′（配列番号５）
とした。ポリメラーゼ連鎖反応のサーマルサイクラーの条件は変性に95℃で15秒間、アニーリングおよび伸長を60℃で60秒を40サイクルとした。
４．統計学的分析
アザチオプリン(AZA)または6-メルカプトプリンで(6-MP)最初に治療した患者の基準値はChi-square testまたはStudent's t-testで比較した。患者のアレル・遺伝子型頻度などの比較にはANOVAまたは単変量解析のChi-square testにより比較した。遺伝子型および他の因子と、白血球減少との相関の同定は多変量解析としてロジスティック回帰分析を行い、投与継続の解析にはカプランマイヤー法およびログランク検定を用い、計算にはR version 2.14.1を使用した。P値<0.05を統計学的に有意とした。
５．結果
１４２例中７例は、白血球のデータなどの欠損により除外した。今回対象とした患者背景や、２つのチオプリン製剤（AZA,6-MP）による背景の違いを検討したところ、6-MPが女性に使用されている頻度が高いものの、２つの群の年齢および体重あたりの投与量などに有意差はなかった（表１）。6-MPが女性に多い理由は、６MPは散剤で、アザチオプリンが５０ｍｇの錠剤であることから、体重が軽い女性のほうでは、散剤による用量調整が容易であるためと考えられた。残り１３５例について遺伝子多型ごとの副作用について検討した。
東北大学病院に通院中の潰瘍性大腸炎、クローン病、分類不能型腸炎に対してチオプリン治療歴がある日本人患者のうち、遺伝子研究に書面で同意した142例を対象とした。潰瘍性大腸炎およびクローン病の診断は厚生労働省の従来の診断基準に従って臨床症状、内視鏡所見、X線写真所見、及び組織学的所見に基づいて行った。患者のゲノムDNAは標準的なフェノール−クロロホルム抽出沈殿によるか、または自動核酸抽出装置（クラボウ、大阪）またはPAXgene DNAキット(BD, アメリカ合衆国ニュージャージー州)を使用して末梢血の白血球から得た。
２．チオプリン処理および有害事象
チオプリンの初期投与量（投与開始から８週間までの期間の投与量）、継続投与量、継続期間、性別、体重、抗TNFα抗体製剤の併用の有無、脱毛の有無、および他の副作用発症の有無（白血球減少症や膵炎など）を診療録から調査した。チオプリンの継続投与量は、1年を超えてチオプリン処理を継続できた患者の最終濃度として定義した。6MPの量は2倍してAZA相当量に調整した。脱毛は他覚的に確認できる完全な脱毛で回復に時間がかかるものとし、自覚症状のみで他覚的に進行しないものは除外した。白血球減少症は、NCI N, DHHS. National Cancer Institute, Common Terminology Criteria for Adverse Events v4. NIH publication 2009; # 09-7473.に記載されている一般的な毒性基準により以下のグレードに分けした：グレード２、白血球(WBC)数 2000-3000/mm3；グレード３、1000-2000/mm3；グレード４、<1000mm3。
３．ゲノムタイピング
検討する遺伝子多型は、これまでに白血球減少との相関が欧米で報告されているTPMT遺伝子多型（アレル３C, rs1142345）と、韓国人で報告されているNUDT15 R139C遺伝子多型(rs116855232)とした。タイピングにはCustom TaqMan SNP Genotyping Assay KitおよびSep-One Plus Real Time PCR システム(Life Technologies, アメリカ合衆国カリフォルニア州カールスバッド)を使用した。rs116855232に特異的なフォワードプライマーおよびリバースプライマーの配列と、蛍光レポーター染料（FAMまたはVIC）で標識した２つの対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプローブは、それぞれ
5′-CCCCTGGACCAGCTTTTCTG-3′（配列番号２）、
5′-CCACCAGATGGTTCAGATCTTCTTTAAA-3′（配列番号３）、
5′-AAACAACGCAGTCCC-3′ （配列番号４）、および
5′-TTTAAACAACACAGTCCC-3′（配列番号５）
とした。ポリメラーゼ連鎖反応のサーマルサイクラーの条件は変性に95℃で15秒間、アニーリングおよび伸長を60℃で60秒を40サイクルとした。
４．統計学的分析
アザチオプリン(AZA)または6-メルカプトプリンで(6-MP)最初に治療した患者の基準値はChi-square testまたはStudent's t-testで比較した。患者のアレル・遺伝子型頻度などの比較にはANOVAまたは単変量解析のChi-square testにより比較した。遺伝子型および他の因子と、白血球減少との相関の同定は多変量解析としてロジスティック回帰分析を行い、投与継続の解析にはカプランマイヤー法およびログランク検定を用い、計算にはR version 2.14.1を使用した。P値<0.05を統計学的に有意とした。
５．結果
１４２例中７例は、白血球のデータなどの欠損により除外した。今回対象とした患者背景や、２つのチオプリン製剤（AZA,6-MP）による背景の違いを検討したところ、6-MPが女性に使用されている頻度が高いものの、２つの群の年齢および体重あたりの投与量などに有意差はなかった（表１）。6-MPが女性に多い理由は、６MPは散剤で、アザチオプリンが５０ｍｇの錠剤であることから、体重が軽い女性のほうでは、散剤による用量調整が容易であるためと考えられた。残り１３５例について遺伝子多型ごとの副作用について検討した。
TPMT遺伝子多型については、*３Cアレル保有者が２人しか存在せず、一人は病状の悪化により他治療への変更を要し、もう一例は吐き気の訴えがありいずれも早期に（８週以内）チオプリン治療は中止していたが、いずれも脱毛はなく、相関は認めなかった。
NUDT15 R139C多型に関しての結果を表２にまとめた。完全脱毛は5例が発症し、全例がNUDT15 R139C多型のホモ接合(T/T)であり、T/T群以外には脱毛は認めなかった(p=3.82×10-16、オッズ比=212)。このことから、T/T群であるかどうかが、チオプリン関連の完全脱毛を規定しているという新たな知見が得られた。また、Tアレルと白血球減少との相関は、今回初めて日本人でも相関を認めることが確認された。
R139C遺伝子型は早発性白血球減少症（チオプリン薬剤投与後８週以内に発症する早発性白血球減少症）と有意に相関しており（表３）、T/T群のすべての患者は重度の早発性白血球減少症（グレード3または4）を発症した(p=3.82×10-16、オッズ比=212)。この相関は遅発性白血病減少症では観察されなかった（p=0.907）。性別、年齢、チオプリンの初期投与量、およびR139Cリスクアレル数についての論理回帰分析によると、R139Cのみが早発性白血球減少症と有意に相関していた（表４）。C/C表現型とC/T表現型を比較すると、C/T表現型の患者はC/C表現型の患者よりも高い頻度で早発性白血病減少症を発症していた(p=6.71×10-3,オッズ比=22.3)。
薬剤の継続性もNUDT15 R139C遺伝子多型との相関が確認された。完全脱毛の危険性が高いホモ群（T/T）はすべての症例において８週以内に投与を白血球減少および全脱毛で治療を中止したが、ヘテロ接合の群(C/T)でも白血球減少により治療を中止した割合が、完全脱毛の危険性が無いホモ群(C/C)におけるよりも高い傾向があり（46% 対 23%、データ非図示）、完全脱毛の危険性が無いホモ群(C/C)と比較して、チオプリン開始後、早期にチオプリンの中止や、投与量の低減、チオプリン製剤のAZAから6MPへの変更を必要としていた(図１、p = 1.45×10-4)。しかし、投与量の低減やチオプリン製剤のAZAから6MPへの変更後はC/T群とC/C群の間で治療継続率に差を認めず（図２）、薬剤投与量や投与方法によってC/T群でも治療が継続できる可能性が示された。実際に、１年を超えて薬剤を継続できた人に関して、維持治療に使用していたチオプリン量を遺伝子型別に比較したところ、表５のように、C/T群はC/C群よりも使用量が有意に少なかった。１年を超えてチオプリン治療を継続できなかった４５％のC/T群の患者は、投与開始後８週以内で治療を中止していたが、治療を中止したC/T群の患者の初期投与量は、８週を超えてチオプリンを継続できたC/T群の患者のそれよりも有意に高かった(1.16mg/kg/day vs. 0.804mg/kg/day, p=0.0245) これより、C/T群では投与量を少なく設定することで薬剤の継続性を維持できるという新たな知見が得られた。
結論として、R139C多型は日本人においてチオプリン関連の完全脱毛と強い相関を認めた。T/T群はほぼ確実に完全脱毛と白血球減少を投与後早期に発症するため、チオプリン投与は避けるべきである。またC/T群は低用量（1日0.2-0.3mg/kg）の6MPでの治療開始が望ましいと考えられた。 以上より、R139C多型およびこれと連鎖不平衡にある多型の検査はチオプリン治療による脱毛を予測し継続性を上げることができるコンパニオン診断として有用であると考えられる。
Claims (12)
- 被検体におけるチオプリンによる脱毛の発症の危険性を判定する方法であって、
被検体由来の生物学的試料から、NUDT15遺伝子の第３エクソンの５’末端から６０番目の塩基における多型を検出すること、および
前記NUDT15遺伝子の第３エクソンの５’末端から６０番目の塩基における多型がT/Tである場合に、脱毛の発症の危険性が高いと判定すること
を含む方法。 - 被検体におけるチオプリンによる脱毛の発症の危険性を判定する方法であって、
被検体由来の生物学的試料から、NUDT15遺伝子の第３エクソンの５’末端から６０番目の塩基における多型を検出すること、および
前記NUDT15遺伝子の第３エクソンの５’末端から６０番目の塩基における多型がC/CまたはC/Tである場合に、脱毛の発症の危険性が低いと判定すること
を含む方法。 - 被検体におけるチオプリンによる脱毛の発症の危険性を判定する方法であって、
被検体由来の生物学的試料から、NUDT15遺伝子の第３エクソンの５’末端から６０番目の塩基における多型を検出すること、および
前記NUDT15遺伝子の第３エクソンの５’末端から６０番目の塩基における多型がC/CまたはC/Tである場合に、脱毛の発症の危険性が低いと判定し、T/Tである場合に、脱毛の発症の危険性が高いと判定すること
を含む方法。 - 請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法により判定したチオプリンによる脱毛の発症の危険性に基づいてチオプリンを投与する患者を選別することを含む、チオプリンを投与する患者の選別方法。
- チオプリンがアザチオプリンまたは6-メルカプトプリンである請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
- NUDT15遺伝子の第３エクソンの５’末端から６０番目の塩基における多型を含む連続する少なくとも１０塩基の配列、またはその相補配列を増幅することができるポリヌクレオチドをプライマーとして用いる、請求項１乃至５のいずれか一項に記載の方法。
- NUDT15遺伝子の第３エクソンの５’末端から６０番目の塩基における多型を含む連続する少なくとも１０塩基の配列、またはその相補配列を増幅することができるヌクレオチドからなる、チオプリンによる脱毛発症の危険性判定用プライマー。
- （ａ）NUDT15遺伝子の第３エクソンの５’末端から６０番目の塩基における多型を含む連続する少なくとも１０塩基からなるポリヌクレオチド、
（ｂ）（ａ）のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド、
（ｃ）NUDT15遺伝子の第３エクソンの５’末端から６０番目の塩基における多型を含み、（ｂ）にハイブリダイズすることができるポリヌクレオチド、または
（ｄ）NUDT15遺伝子の第３エクソンの５’末端から６０番目の塩基における多型に相補的な塩基配列を含み、（ａ）にハイブリダイズすることができるポリヌクレオチド
からなるチオプリンによる脱毛の発症の危険性の判定用プローブ。 - （ａ）NUDT15遺伝子の第３エクソンの５’末端から６０番目の塩基における多型を含む１５〜３００塩基からなるポリヌクレオチド、
（ｂ）（ａ）のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド、
（ｃ）NUDT15遺伝子の第３エクソンの５’末端から６０番目の塩基における多型を含み、（ｂ）にハイブリダイズすることができるポリヌクレオチド、または
（ｄ）NUDT15遺伝子の第３エクソンの５’末端から６０番目の塩基における多型に相補的な塩基配列を含み、（ａ）にハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドからなるチオプリンによる脱毛の発症の危険性の判定用プローブ。 - 請求項７に記載の判定用プライマー又は請求項８若しくは９に記載の判定用プローブを含む、被検体におけるチオプリンによる脱毛の発症の危険性を判定するためのキット。
- 有効成分としてチオプリンを含有する炎症性腸疾患を治療するための医薬組成物であって、チオプリンが6-メルカプトプリンであり、
NUDT15遺伝子の第３エクソンの５’末端から６０番目の塩基における多型がT/Cであると判定された被検体に、投与開始から８週間までの間、6-メルカプトプリンが1日0.2-0.3mg/kgの量で投与されるように用いられる、医薬組成物。 - 初期開始から一年を超えて継続して投与される請求項１１に記載の医薬組成物。
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