KR20190135283A

KR20190135283A - 인간 사이토크롬 p450 2d6 변이 유전자의 고속 검출용 키트

Info

Publication number: KR20190135283A
Application number: KR1020180060569A
Authority: KR
Inventors: 신재국; 신호정; 차은영; 고민정; 정혜은; 안현정
Original assignee: (주)에스피메드
Priority date: 2018-05-28
Filing date: 2018-05-28
Publication date: 2019-12-06
Also published as: KR102102532B1

Abstract

본 발명은 사이트크롬 P450 2D6 유전자 (Cytochrome P450 2D6, 이하 CYP2D6)의 유전형 분석을 위한 제품에 관한 것이다. 보다 구체적으로 본 발명은 약물 반응의 개인차 및 이상반응 (Adverse drug reaction, ADR)과 관련된 CYP2D6의 주요한 대립 유전자의 존재 여부를 결정하는 키트, CYP2D6 유전자의 *1,*2,*3,*4,*5 (결손, deletion),*6,*9,*10,*14,*17,*18,*21,*29,*41,*49,*52,*60 및 중복 (duplication)의 총 17가지의 특정 CYP2D6 대립 유전자의 존재 여부를 표지 SNP (tagging SNP, tSNP)를 이용하는 키트를 이용하여 신속하게 결정하는 방법 및 이러한 방법을 이용하여 약물 반응의 개인차 및 이상반응 위험 여부를 평가하는 용도에 관한 것이다.

Description

인간 사이토크롬 P450 2D6 변이 유전자의 고속 검출용 키트{High-speed detection kit for human cytochrome P450 2D6 mutation gene}

본 발명은 사이트크롬 P450 2D6 유전자 (Cytochrome P450 2D6, 이하 CYP2D6)의 유전형 분석을 위한 제품에 관한 것이다. 보다 구체적으로 본 발명은 약물 반응의 개인차 및 이상반응 (Adverse drug reaction, ADR)과 관련된 CYP2D6의 주요한 대립 유전자의 존재 여부를 결정하는 키트, CYP2D6 유전자의 *1,*2,*3,*4,*5 (결손, deletion),*6,*9,*10,*14,*17,*18,*21,*29,*41,*49,*52,*60 및 중복 (duplication)의 총 17가지의 특정 CYP2D6 대립 유전자의 존재 여부를 키트를 이용하여 신속하게 결정하는 방법 및 이러한 방법을 이용하여 약물 반응의 개인차 및 이상반응 위험 여부를 평가하는 용도에 관한 것이다.

이하에 기술되는 내용은 단순히 본 발명과 관련되는 배경 정보만을 제공할 뿐 종래기술을 구성하는 것이 아니다.

사이토크롬 P450은 약물, 발암원 및 독소와 같은 외래 화학물질과 스테로이드, 지방산 및 비타민과 같은 내부 기질의 산화를 촉진하는 헴단백질의 일원이다 (Nelson et al., Pharmacogenetics, 6:1-42, 1996). 간을 포함하여 신장, 장관 및 폐와 같은 기관에서 다양한 사이토크롬 P450의 아형이 발견되었다. 이 중에서 사이토크롬 P450 2D6 (Cytochrome P450 2D6, 이하 ‘CYP2D6’라 함) 유전자는 22번째 염색체에 위치해 있으며, CYP2D6 유전자의 한쪽 면에는 유사 유전자 (pseudogene)인 CYP2D7과 CYP2D8이 위치해 있다. 상기 유전자에 의해 코딩되는 효소는 항우울제, 항정신병제, 항구토제, 심혈관질환 약물, 진통제 등 100여 가지 이상의 임상적으로 중요한 약물들을 대사하는 것으로 알려져 있다.

CYP2D6 유전자에 의해 코딩되는 효소는 간에서 주로 생산되며, 사이토크롬 P450 효소의 총량의 약 2%를 차지하지만 30% 정도의 약물 대사에 관여하는 중요한 효소이다. 개체 내에서 상기 효소의 활성은 매우 다양하며 이들은 그 활성 정도에 따라 각각 PM (poor metabolizers, 느린 대사자), IM (intermediate metabolizers, 중간 대사자), NM (normal metabolizers, 일반 대사자), UM (ultrarapid metabolizers, 초고속 대사자) 군으로 분류되고 있다. 상기와 같이 효소의 활성이 각각 다르게 나타나는 것은 CYP2D6의 유전적 다형성에 의한 것이다. 현재, CYP2D6의 유전적 다형성은 약 110여 가지 이상으로 알려져 있으며 (https://www.pharmvar.org/htdocs/archive/cyp2d6.htm), 종족간의 뚜렷한 차이를 보이고 있다. 그런데 이러한 유전자 변이는 다양한 종류가 보고되어 있기 때문에 분석시간과 비용의 효율성을 증대하기 위해 최소한의 단일염기다형성 (single nucleotide polymorphism, SNP)을 통해 정확한 유전형을 결정하는 것이 중요하다.

최근에, 서양인에서 주로 발견되는 CYP2D6 유전자 변이를 중심으로 스냅샷 (SNaPshot) 분석을 이용하여 11개의 SNP을 분석하는 방법 (Sistonen J et al., Clin Chem., 51(7):1291-5, 2005), 및 로슈사의 AmpliChip CYP450 Test, 루미넥스사의 xTAG® CYP2D6 Kit v3 제품이 보고되어 있다. 그러나 이들은 CYP2D6 변이 유전자의 조합이 서양인에서 발견되는 변이를 중심으로 이루어져 있을 뿐, 한국인을 비롯한 동양인과 서양인 모두를 포함한 CYP2D6 유전자 변이 진단에 대한 방법 및 제품은 매우 미흡한 실정이다.

따라서 한국인을 포함한 동양인과 서양인 모두를 포함한 CYP2D6 유전자의 변이를 선발하여 최소한의 표지 세트를 구성하고, 이를 이용하여 CYP2D6 유전형을 결정할 수 있는 제품에 대한 개발이 절실히 요구되고 있다.

이에 본 발명자들은 한국인을 포함한 동양인 및 서구인에게서 나타나는 약물 반응의 개인차 및 이상반응과 관련된 주요한 돌연변이들을 신속하고 효과적으로 진단하기 위한 키트를 개발하였으며, 본 키트를 활용하면 CYP2D6 유전자의 *1, *2, *3, *4, *5 (결손, deletion), *6, *9, *10, *14, *17, *18, *21, *29, *41, *49, *52, *60 및 중복 (duplication) 타입을 신속하고 정확하게 검출할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

1. Jain KK, Mol Digan., 9(3):119-27, 2005 2. Gennis MA, Am. J. Med., 91(6):631-634, 1991 3. Edwards SG, Postgrad. Med. J., 75(889):680-681, 1999

본 발명의 목적은 약물 반응의 개인차 및 이상반응 (Adverse drug reaction, ADR)과 관련된 CYP2D6의 주요한 대립 유전자의 존재 여부를 신속하게 검출하는 키트를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 CYP2D6 유전자의 *1,*2,*3,*4,*5 (결손, deletion),*6,*9,*10,*14,*17,*18,*21,*29,*41,*49,*52,*60 및 중복 (duplication)의 총 17가지의 특정 CYP2D6 대립 유전자의 존재 여부를 상기 키트를 이용하여 신속하게 결정하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 방법을 이용하여 약물 반응의 개인차 및 이상반응 위험 여부를 평가하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명은 약물 반응의 개인차 및 이상반응과 관련된 CYP2D6 변이를 검출하는 키트 및 상기 키트를 이용하여 CYP2D6 변이를 신속하고 정확하게 검출하는 방법을 제공한다.

본 발명에 따른 키트는, 하기 표 1에 기재된 바와 같은, 서열번호 26으로 표시되는 CYP2D6 유전자의 100C>T, 1023C>T, 1611T>A, 1707delT, 1758G>A, 1846G>A, 1887insTA, 2549delA, 2573_2574insC, 2615_2617delAAG, 2850C>T, 2988G>A, 3183G>A, 3877G>A, 4125_4133dupGTGCCCACT, 결손 및 중복 (*1, *2, *3, *4, *5 (결손), *6, *9, *10, *14, *17, *18, *21, *29, *41, *49, *52, *60 및 중복)의 총 17가지 변이의 돌변변이를 검출하는 것을 목적으로 한다.

CYP2D6 유전자의 변이로 인한 효소 활성 효과

유전자	대립유전자	변이체	효소활성 효과
CYP2D6	*1	None (wild type)	정상
	*XN	Gene Duplication	정상, 활성 증가, 활성 감소
	*2	2850C>T	정상
	*3	2549delA	불활성
	*4	1846G>A, 100C>T	불활성
	*5	Gene Deletion	불활성
	*6	1707delT	불활성
	*9	2615_2617delAAG	부분적 활성감소
	*10	100C>T	부분적 활성감소
	*14	1758G>A	불활성
	*17	1023C>T,2850C>T,4180G>C	부분적 활성감소
	*18	4125_4133dupGTGCCCACT	부분적 활성감소
	*21	2573_2574insC	불활성
	*29	1659G>A, 2850C>T, 3183G>A, 4180G>C	부분적 활성감소
	*41	2988G>A	부분적 활성감소
	*49	1611T>A, 100C>T	부분적 활성감소
	*52	3877G>A,100C>T	부분적 활성감소
	*60	1887insTA	불활성

본 발명에 따른 키트의 기능적 변이 포함률 (allele coverage, %)은 한국인을 포함한 동양인 및 서양인 등의 종족에서도 99% 이상 변이를 검출할 수 있다 (Crews KR et al., Clin Pharmacol Ther., 95(4):376-82, 2014).

본 발명은 상기 키트를 활용하여 서열번호 26으로 표시되는 CYP2D6 유전자의 100C>T, 1023C>T, 1611T>A, 1707delT, 1758G>A, 1846G>A, 1887insTA, 2549delA, 2573_2574insC, 2615_2617delAAG, 2850C>T, 2988G>A, 3183G>A, 3877G>A, 4125_4133dupGTGCCCACT, 결손 및 중복의 tSNP 변이로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 뉴클레오티드를 확인하는 것을 특징으로 하고, 약물 반응의 개인차 및 이상반응을 예측하기 위해 *1, *2, *3, *4, *5 (결손), *6, *9, *10, *14, *17, *18, *21, *29, *41, *49, *52, *60 및 중복으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 대립유전자의 검출 방법을 제공한다.

바람직하게는, 도 15에 나타난 바와 같이, CYP2D6 유전자의 17가지 변이로 구성된 일배체의 조합으로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나의 조합을 사용한다.

또한 본 발명은 다른 구체예로써, 상기 방법을 수행하기 위해 2X PCR 증폭 믹스 (2X PCR Amplification Mix), CYP2D6 증폭 프라이머 믹스 1 (CYP2D6 Amplification Primer Mix 1), CYP2D6 증폭 프라이머 믹스 2 (CYP2D6 Amplification Primer Mix 2), CYP2D6 증폭 프라이머 믹스 3 (CYP2D6 Amplification Primer Mix 3), 스냅샷 멀티플렉스 시약 (SNaPshot Multiplex Reagent), CYP2D6 스냅샷 프라이머 믹스 1 (CYP2D6 SNaPshot Primer Mix 1), CYP2D6 스냅샷 프라이머 믹스 2 (CYP2D6 SNaPshot Primer Mix 2), 야생형 (Wild Type) DNA 및 뉴클레아제 프리 워터 (Nuclease Free Water)를 포함하는 것을 특징으로 하는, 약물 반응의 개인차 및 이상반응을 예측하기 위한 CYP2D6 대립유전자의 SNP 검출용 키트를 제공한다 (도 2 참조).

상기 키트는 쉬림프 알칼린 포스파타아제 (Shrimp Alkaline Phosphatase (SAP)), 엑소뉴클레아제 1 (Exonuclease 1 (Exo)) 등의 물질을 추가로 더 포함할 수 있다.

또한, 본 발명은 다른 구체예로써, 상기 키트를 활용하여 도출된 SNP의 결과를 이용하여 CYP2D6의 대사 활성 표현형인 PM (poor metabolizers, 느린 대사자), IM (intermediate metabolizers, 중간 대사자), NM (normal metabolizers, 일반 대사자), UM (ultrarapid metabolizers, 초고속 대사자) 군으로 분류되게 하는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 다른 구체예로써, 약물 반응의 개인차 및 이상반응 예측을 위한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.

이는 상기 키트를 활용하여 CYP2D6 유전자의 *1, *2, *3, *4, *5 (결손), *6, *9, *10, *14, *17, *18, *21, *29, *41, *49, *52, *60 및 중복으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 CYP2D6 대립 유전자의 존재를 확인하는 단계 (tSNP을 확인하는 단계); tSNP의 조합으로 CYP2D6 유전자의 대사 활성 표현형을 예측하는 단계; 및 약물 반응의 개인차 및 이상반응을 예측하는 단계를 포함한다.

이 때, 상기 약물은 항우울제 (nortriptyline, paroxetine 등), 항정신병제 (perphenazine, thioridazine 등), 항구토제 (ondansetron, tropisetron 등), 심혈관질환 약물 (perhexiline, metoprolol 등), 진통제 (codein, tramadol 등), 항암제 (tamoxifen 등) 및 이들 유사 약물로 이루어진 군에서 선택되는 1종일 수 있다.

약물반응의 개인차는, 예를 들어, 항우울제인 노르트립틸린 (nortriptyline)의 경우, 대사활성 표현형이 CYP2D6 UM일 대체 약물 사용, CYP2D6 IM일 경우 표준용량의 25% 감량, CYP2D6 PM일 경우 대체 약물을 사용하거나 표준용량의 50% 감량하여 처방하도록 권고하고 있다 (Hicks JK et al., Clin Pharmacol Ther. doi: 10.1002/cpt.597, 2016). 또한, 항암제인 타목시펜 (tamoxifen)의 경우, CYP2D6에 의해 대사되었을 때 활성을 나타내어 CYP2D6 UM일 경우 CYP2D6 EM와 비교 시 재발률이 낮으며 생존율이 높은 반면 PM 환자는 낮은 치료효과를 나타낸다 (곽혜선, 약학정보원, 약물사용에 대한 최신 지견 약물유전체(2)).

약물 이상반응은, 예를 들어, 진통제인 코데인 (codein)의 경우, CYP2D6에 의해 모르핀 (morphine)으로 대사되고, CYP2D6 UM은 CYP2D6 EM과 비교하였을 때 모르핀 농도가 높게 나타나 사망 등 독성이 유발된 사례가 대표적이다.

이와 같이, 본 발명은 상기 키트 및 이를 활용하여 CYP2D6 유전자의 *1, *2, *3, *4, *5 (결손), *6, *9, *10, *14, *17, *18, *21, *29, *41, *49, *52, *60 및 중복으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 CYP2D6 대립 유전자의 존재 확인, 확인된 CYP2D6 대립유전자 결과를 토대로 CYP2D6의 대사 활성 표현형의 결정, 결정된 표현형을 바탕으로 약물반응의 개인차 및 이상반응 예측을 포함하는 모든 용도를 포함한다.

본 발명에 따른 약물 반응의 개인차 및 이상반응과 관련된 CYP2D6 변이를 검출하는 키트 및 이를 이용하여 CYP2D6의 유전형을 분석하는 진단방법은 한국인을 포함한 동양인 및 서양인에 대해 높은 정확성을 나타내며, 신속하고 간편하게 진단할 수 있어, 약물 반응의 개인차 및 이상반응을 예측하여 치료의 효과 및 성공률을 높이는데 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 본 발명에 따른 본 발명에 따른 약물 반응의 개인차 및 이상반응과 관련된 CYP2D6 변이를 검출하는 키트의 외형을 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명에 따른 키트의 구성 및 외관상 특징을 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명에 따른 키트의 기준 및 적용 범위의 일예를 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명에 따른 키트의 제조공정도의 일예를 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명에 따른 키트의 포장 규격의 일예를 나타낸 것이다.
도 6은 본 발명에 따른 키트의 표시 기재 사항의 일예를 나타낸 것이다.
도 7은 본 발명에 따른 키트의 박스표면 라벨 기재사항의 일예를 나타낸 것이다.
도 8은 본 발명에 따른 키트의 용기 포장 기재 사항의 일예를 나타낸 것이다.
도 9는 본 발명에 따른 키트의 첨부 문서 기재 사항의 일예를 나타낸 것이다.
도 10은 본 발명에 따른 키트의 라벨 단위의 일예를 나타낸 것이다.
도 11은 본 발명에 따른 키트의 포장 단위의 일예를 나타낸 것이다.
도 12는 본 발명에 따른 키트의 저장 방법의 일예를 나타낸 것이다.
도 13은 본 발명에 따른 키트의 운송 방법의 일예를 나타낸 것이다.
도 14는 본 발명에 따른 키트를 활용하여 CYP2D6 유전형 분석한 결과 예시이다. 각 SNP의 위치는 진한 검은색으로 표시하였다.
도 15는 본 발명에 따른 키트를 활용하여 CYP2D6 유전형을 분석하기 위한 tSNP의 조합을 나타낸 것이다.
도 16 및 17은 도 15로 도출된 tSNP의 조합 결과를 활용하여 CYP2D6의 대사 활성 표현형으로 도출되게 하는 방법을 나타낸 것이다.
도 18은 본 발명에 따른 키트를 활용하여 CYP2D6의 대사 활성 표현형을 예측하고, 표현형을 활용하여 약물 복용 가이드를 제시하는 일예를 모식도로 나타낸 것이다.
도 19는 CYP2D6 유전형을 분석하기 위한 표지서열을 나타낸 것이다.
도 20은 다중 단일염기 프라이머 확장을 통한 스냅샷 분석법을 수행시, 프라이머의 위치를 예시적으로 나타내는 도면이다.
도 21은 본 발명에서 사용된 프라이머의 서열 및 이를 포함하는 프라이머 믹스의 구성을 나타낸 표이다.
도 22a 내지 22f은 CYP2D6 서열 (GenBank: M33388.1)에서 변이의 위치를 나타낸 도면이다.

본 발명에서 사용되는 용어에 대한 정의는 이하와 같다.

‘유전적 다형성 (genetic polymorphism)’은 인구집단에서 적어도 1% 이상의 빈도로 유전자 변이가 나타나는 경우를 말한다. DNA에서 한 개의 뉴클레오티드의 삽입, 소실, 또는 치환이 일어나는 것을 단일염기다형성 (single nucleotide polymorphism, SNP)이라고 한다.

‘다형성’이라는 용어는 군집 내에서 변하는 유전자의 서열에서의 배치를 지칭한다. 다형성은 상이한 “대립유전자”로 구성된다. 이러한 다형성의 배치는 유전자에서의 그의 위치 및 그에서 발견되는 상이한 아미노산 또는 염기에 의해 확인될 수 있다. 이러한 아미노산 변이는 2개의 상이한 대립유전자인, 2개의 가능한 변이체 염기, C 및 T의 결과이다. 유전자형은 2개의 다른 별개의 대립유전자로 구성되기 때문에, 여러 가능한 변이체 중 임의의 변이체가 어느 한 개체에서 관찰될 수 있다 (예를 들어, 이 예에서, CC, CT 또는 TT), 개개의 다형성은 또한 당업자에게 공지되어 있고, 예를 들면, NCBI 웹사이트 상에서 이용 가능한 뉴클레오티드 염기 변이의 단일 뉴클레오티드 다형성 데이터베이스 (Single Nucleotide Polymorphism Database (dbSNP) of Nucleotide Sequence Variation)에서 사용되는 것인, 지정된 독특한 식별자 (“기준 SNP”, “refSNP” 또는 “rs#)이다.

‘유전자형’이라는 용어는 세포 또는 조직 샘플에서 특정 유전자의 특이적 대립 유전자를 지칭한다. ‘표현형’은 유전형에 의해서 결정되는 개체의 형태학적, 생리학적, 또는 생화학적 특징을 표현형이라 한다. 유전형이란 표현형과 구별되는 것으로, 개인의 유전자 구성을 뜻하며, 보다 좁은 의미로는 한 유전자 위에 존재하는 대립 유전자들(alleles)을 말한다.

‘대립인자’또는 ‘대립 유전자’란 같은 염색체 위치 (same chromosomal locus)를 점유하는 한 유전자의 둘 또는 그 이상의 선택적인 형태 (alternative forms) 중 하나를 뜻한다. 대립유전자의 등가 유전 표지는 관심 대상의 대립유전자에 연관된 유전 표지로서, 즉, 그것은 관심 대상의 대립유전자와 연관불균형을 나타낸다.

‘대립유전자 빈도’는 대립유전자가 개체 내, 계통 내, 또는 계통의 집단 내에 존재하는 빈도 (비율 또는 백분율)를 지칭한다. 계통 또는 집단 내에서의 대립 유전자 빈도 또는 계통 또는 집단으로부터 개체들의 샘플의 대립유전자 빈도를 평균화함으로써 추정할 수 있다.

‘위험’은 특정 다형성 대립유전자를 보유하지 않은 개체의 구성원에서의 질환 또는 상태의 발생 빈도에 비교하여, 특정 다형성 대립유전자를 보유한 개체에서의 질환 또는 상태의 발생 빈도가 통계적으로 높음을 나타낸다.

‘핵산’은 데옥시리보핵산 (DNA), 및 적절하다면 리보핵산 (RNA)과 같은 폴리뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드를 나타낸다. 이 용어는 또한, 동등하게, 뉴클레오티드 유사체 (예, 펩티드 핵산)로부터 제조된 RNA 또는 DNA 중 어느 하나의 유사체, 및, 서술된 구체예에 적용된 대로, 단일 (센스 또는 안티센스) 및 이중나선 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 본 발명에서는 ‘핵산’이라는 용어와 ‘뉴클레오티드’가 병용하여 쓰이고 있다.

‘프라이머’는 상보성 RNA 또는 DNA 표적 폴리뉴클레오티드에 혼성화하고 예를 들어 폴리머라제 연쇄 반응에서 발생하는 뉴클레오티딜트랜스퍼라제의 작용에 의해 모노뉴클레오티드로부터 폴리뉴클레오티드의 단계적 합성을 위한 출발점으로 기능하는 올리고뉴클레오티드 서열을 의미한다.

“기능적 등가물”이라는 용어는 예를 들어, 기준 (reference) 서열로부터 하나 또는 그 이상의 치환, 결실 또는 부가, 기준 서열과 실험 (subject) 서열 사이의 다양한 기능적 비유사성을 낳지 않는 실제 효과 (net effect) 등 변화된 돌연변이 서열의 뉴클레오티드와 핵산서열 모두를 의미한다. 바람직하게는, 뉴클레오티드 서열은 최소한 약 65%의 동일성, 보다 바람직하게는 최소한 약 75%의 동일성, 가장 바람직하게는 약 95%의 동일성을 가진다. 본 발명의 목적을 위해서는, 실질적으로 등가적인 생물학적 활성과 실질적으로 등가적인 함성 특징을 가지는 서열들은 실질적 등가물로 취급된다.

‘대상’ 또는 ‘환자’는 인간, 소, 개, 기니아 피그, 토끼, 닭, 곤충 등을 포함하여 치료가 요구되는 임의의 단일 개체를 의미한다. 또한, 임의의 질병 임상 소견을 보이지 않는 임상 연구 시험에 참여한 임의의 대상 또는 역학 연구에 참여한 대상 또는 대조군으로 사용된 대상이 대상에 포함된다. 본 발명의 일 실시예에서는 인간을 대상으로 하였다.

‘조직 또는 세포 샘플’은 대상 또는 환자의 조직으로부터 얻은 유사한 세포의 집합체를 의미한다. 조직 또는 세포 샘플의 공급원은 신선한, 동결된 및/또는 보존된 장기 또는 조직 샘플 또는 생검 또는 흡인물로부터의 고형 조직; 혈액 또는 임의의 혈액 구성분; 대상의 임신 또는 발생의 임의의 시점의 세포일 수 있다. 조직 샘플은 또한 1차 또는 배양 세포 또는 세포주일 수 있다.

본 발명에서 사용되는 모든 기술용어는, 달리 정의되지 않는 이상, 본 발명의 관련 분야에서 통상의 당업자가 일반적으로 이해하는 바와 같은 의미로 사용된다. 또한 본 명세서에는 바람직한 방법이나 시료가 기재되나, 이와 유사하거나 동등한 것들도 본 발명의 범주에 포함된다. 본 명세서에 참고문헌으로 기재되는 모든 간행물의 내용은 본 발명에 도입된다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

인간 사이토크롬 P450 2D6 변이 유전자의 고속 검출용 키트

본 발명은 약물반응의 개인차 및 이상반응의 예측과 관련된 CYP2D6 유전자의 *1, *2, *3, *4, *5 (결손), *6, *9, *10, *14, *17, *18, *21, *29, *41, *49, *52, *60 및 중복 대립유전자를 인간 사이토크롬 P450 2D6 변이 유전자의 고속 검출용 키트를 이용하여 신속하고 정확하게 검출하는 방법 및 이의 용도에 관한 것이다.

이하, 본 발명에 따른 키트의 구성 및 특징을 예를 들어 설명하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 키트는 서열번호 1 내지 25로 이루어진 군에서 선택되는 프라이머를 하나 이상 포함하는 것을 특징으로 한다 (도 21 참조).

구체적으로, 도 2에 제시한 바와 같이, 상기 키트는 2X PCR 증폭 믹스, CYP2D6 증폭 프라이머 믹스 1, CYP2D6 증폭 프라이머 믹스 2, CYP2D6 증폭 프라이머 믹스 3, 스냅샷 멀티플렉스 시약, CYP2D6 스냅샷 프라이머 믹스 1, CYP2D6 스냅샷 프라이머 믹스 2, 야생형 DNA 및 뉴클레아제 프리 워터를 포함하는 것을 특징으로 한다. 이때 2X PCR 증폭 믹스는 1회 10 ul 당 10X EF 태그 폴리머라제 완충액 2 ul, 5X 밴드 닥터 1 ul, 2.5mM dNTP 2 ul, 2.5U EF 태그 폴리머라제 0.25 ul 및 뉴클레아제 프리 워터 4.75 ul로 구성된다.

상기 CYP2D6 증폭 믹스 1은 서열번호 1 내지 4의 올리고머로 구성되고, CYP2D6 증폭 믹스 2는 서열번호 5 및 6의 올리고머로 구성되며, CYP2D6 증폭 믹스 3은 서열번호 7 및 8의 올리고머로 구성된다.

상기 스냅샷 멀티플렉스 시약은 어플라이드 바이오시스템즈 (Applied biosystems) 사의 판매용 시약을 사용하며, CYP2D6 스냅샷 프라이머 믹스 1은 서열번호 9 내지 18의 올리고머로 구성되고, CYP2D6 스냅샷 프라이머 믹스 2는 서열번호 19 내지 25의 올리고머로 구성된다. 뉴클레아제 프리 워터는 솔젠트 (Solgent) 사의 판매용 시약을 사용한다.

도 3에서 제시한 바와 같이, 본 발명의 키트의 기준 및 적용 범위는 의료기기 품목군은 25, 체외진단 의료기기용 시약류, 품목명 약물유전자검사키트, 분류번호는 D06030.01[3]이며, 사람의 혈액, 전혈 핵산 등의 생체 시료로부터 마련된 게놈 DNA를 사용하여 CYP2D6 유전자의 대립유전자를 단일염기확장법 (Single Base Extension, SBE, SNaPshot, Mutation identification by primer extension)으로 정성하여 관련 약물 반응의 개인차 및 이상반응을 예측하는데 도움을 주는 체외진단용 의료기기인 것을 특징으로 한다. 포장단위는 제품 (키트) 당 24번의 테스트가 가능하고, 개봉 전/후 모두 냉동 보관 (-15~-25℃)이 필요하며, 사용기한은 미개봉일 경우 제조일로부터 12개월, 개봉일 경우 제조일로부터 6개월이다.

도 4에서 제시한 바와 같이, 상기 키트는 원자재 구매, 원자재 입고, 원자재 입고검사, 원자재 공정(생산), 공정검사, 라벨공정, 분주공정, 포장공정, 최종검사, 완제품 보관, 출하검사, 출하의 과정의 과정을 거치는 것을 특징으로 한다. 이는 본 발명에 따른 키트의 품질에 직·간접적으로 영향을 미치는 설계 및 개발, 원자재 구매, 입고검사, 생산, 공정검사, 최종검사, 포장, 라벨링, 출하, 보관 및 유통과 관련되는 모든 활동 및 주요 공정에 대해 적용하며 생산공정을 위해 투입되는 인원, 설비, 시설, 작업환경, 방법 등의 자원을 포함한다. 원자재 입고 검사의 경우 제품 생산에 사용되는 원료 및 부자재 등을 입고 시에 원료 규격에 따라 적합성 여부를 확인 판정하는 검사; 공정검사의 경우 생산 공정 중에서의 반제품이 규정된 품질 사양에 적합하고 후속 공정에 인도 되어도 좋은가를 판정하기 위하여 실시하는 검사; 최종 검사의 경우 완제품의 품질, 공정 진행 및 기록 상태 등이 규정된 품질에 적합한가를 판정하기 위해 실시하는 검사; 및 출하 검사의 경우 최종검사가 완료된 완제품을 출하하기 전 검사원이 실시하는 검사를 의미한다.

도 5에 제시된 바와 같이, 상기 키트의 포장 규격은 2X PCR 증폭 믹스, CYP2D6 증폭 프라이머 믹스 1 내지 3, 스냅샷 멀티플렉스 시약, CYP2D6 스냅샷 프라이머 믹스 1 및 2, 야생형 DNA 및 뉴클레아제 프리 워터로 구성되고, 상기 9개의 구성품 모두 멸균된 폴리프로필렌 튜브를 사용한다.

포장의 일예로, 2X PCR 증폭 믹스 800 ul가 분주된 빨간 뚜껑이 달린 2.0 ml 무색 튜브 1개를 첫 번째 줄 첫 번째 구멍에 꽂는다. CYP2D6 증폭 프라이머 믹스 1 내지 3은 각 100 ul가 분주된 파란 뚜껑이 달린 2.0 ml의 무색 튜브 각 1개를 첫 번째 줄 두 번째, 세 번째 및 네 번째 구멍에 꽂는다. 스냅샷 멀티플렉스 시약 25 ul가 분주된 빨간 뚜껑이 달린 2.0 ml 무색 튜브 1개를 두 번째 줄 첫 번째 구멍에 꽂는다. CYP2D6 스냅샷 프라이머 믹스 1 및 2 25 ul가 분주된 노란 뚜껑이 달린 2.0 ml 무색 튜브 각 1개를 두 번째 줄 두 번째 및 세 번째 구멍에 꽂는다. 야생형 DNA 100 ul가 분주된 초록색 뚜껑이 달린 2.0 ml 무색 튜브 1개를 두 번째 줄 네 번째 구멍에 꽂는다. 마지막으로, 뉴클레아제 프리 워터 1000 ul가 분주된 무색 뚜껑이 달린 2.0 ml 무색 튜브 1개를 두 번째 줄 다섯 번째 구멍에 꽂는다.

본 발명에 따른 키트 제품의 표시 기재 사항은 도 6에 제시된 바와 같이 상호 및 로고, 회사명, 주소, 연락처가 포함된다.

도 7에 제시된 바와 같이, 상기 키트의 박스표면 라벨 기재사항은, 품목명은 약물유전자검사키트, 품목허가번호는 의료기기 허가 후 기재, 제조번호는 생산된 연월 (YYYY-MM), 사용기한은 제조일로부터 1년, 중량 및 포장단위는 24 테스트/키트, 경고 및 주의사항은 체외진단용 의료기기, 일회용, 재사용금지, 보관 및 저장방법은 개봉 전/후 -15 ~ -25℃, 외자 표시기재는 카달로그번호 REF SGSAA1, 심볼 마크는 로트(배치) 번호(LOT 연월순서YYMMNN-LOT170901/예시), 유효기한, 체외진단용 의료기기 표시, 저장온도, 경고 및 주의사항, 사용설명서, 제조자가 표시된다.

도 8에 제시된 바와 같이, 상기 키트의 용기 포장 기재 사항은 ㈜에스피메드의 상호 및 로고, 주소, 연락처, 제품명, 모델명 및 로트 번호가 포함된다.

도 9에 제시된 바와 같이, 상기 키트의 첨부문서 기재사항은, 품목명은 약물유전자검사키트, 형품목 허가번호는 허가 후 기재, 제조번호는 연월순서(YYMMNN), 제조자는 ㈜에스피메드, 제조국은 대한민국, 사용목적/특징/사용방법/사용 시 주의사항의 경우 별도의 사용설명서 참고로 표시되며, 사용기한은 제조일로부터 12개월 이내, 중량/포장단위는 24 테스트/키트, 보관 및 저장방법은 개봉 전/후 -15 ~ -25℃, 폐기방법은 ‘폐기물 관리법’에 따라 의료폐기물로 처리, 첨부문서 개정연월은 연월(YYYY-MM), 비고로 표시 된다.

도 10에 제시된 바와 같이, 상기 키트의 라벨 단위는, 내부는 스펀지 랙 (rack), 박스 상단은 W 88 mm X H 60 mm X D 53 mm, 박스 하단은 W 82 mm X H 51 mm X D 47 mm, 박스 상단의 라벨 도안은 W 75 mm X H 38 mm, 박스 후면 허가 라벨 도안은 W 75 mm X H 50 mm로 구성되어 있다.

도 11에 제시된 바와 같이, 상기 키트의 포장 단위는 2X PCR 증폭 믹스 (2X PCR AM), CYP2D6 증폭 프라이머 믹스 1 (CYP2D6 APM1), CYP2D6 증폭 프라이머 믹스 2 (CYP2D6 APM2), CYP2D6 증폭 프라이머 믹스 3 (CYP2D6 APM3), 스냅샷 멀티플렉스 시약 (SNaPshot MR), CYP2D6 스냅샷 프라이머 믹스 1 (CYP2D6 SPM1), CYP2D6 스냅샷 프라이머 믹스 2 (CYP2D6 SPM2), 야생형 DNA (WT DNA) 및 뉴클레아제 프리 워터 각 1개씩 총 9개로 구성되어 있다.

도 12에 제시된 바와 같이, 상기 키트는 -15 ~ -25℃에서 보관되어야 하며 미개봉시 제조일로부터 12개월, 개봉 후 6개월로 권장하고 있다. 시약의 동결 해당 가능횟수는 최대 3회이며, 자주 사용할 경우 분주하여 냉동해서 사용하고 -20℃ 이상의 냉동보관 상태로 포장이 개봉되지 않은 상태로 보관하며, 고온 다습한 장소는 피하고 외부와의 출입이 차단될 수 있는 곳에서 보관하고, 화학약품이나 기타 이물질이 혼입되는 장소를 피하도록 권장하고 있다.

도 13에 제시된 바와 같이, 상기 키트의 운송방법은 -15 ~ -25℃가 유지되는 아이스박스 포장으로, 운송기한은 아이스박스의 드라이아이스가 녹지 않는 약 24시간 이내, 운송 중 관리 방법은 아이스박스의 드라이아이스가 유지되는 조건하에서 운반하거나 운송조건이 유지되는 탑차를 이용하여 운송하도록 한다.

본 발명에 따른 키트를 이용한 CYP2D6 유전형 분석 방법

CYP2D6 유전형은 다양한 공지의 방법, 예를 들어, 서열 기반 유전자형 분석방법 (시퀀싱, Sequencing) 또는 대립 형질 특이적 PCR, 리얼 타임 (Real time) PCR 등에 의해 검출할 수 있지만, 시퀀싱 방법은 판독 시간 및 검사 소요 비용이 많이 소요되고, 대립 형질 특이적 PCR, 리얼 타임 PCR은 CYP2D6 유전자의 가유전자 (Pseudogene), CNV (Copy number variation)가 존재하여 PCR에 의한 오류 가능성을 내포한다. 하지만, 본 발명에서 검출하고자 하는 CYP2D6의 유전형 *1, *2, *3, *4, *5 (결손), *6, *9, *10, *14, *17, *18, *21, *29, *41, *49, *52, *60 및 중복의 서브 타입은 tSNP을 이용하여 분석하는 것으로, 시퀀싱 방법을 축소한 방법이며, 정확도 및 시간단축에 있어 효율적이다.

또한, 본 발명의 방법은 유전자 내 일배체형의 구조 및 각각의 일배체형을 대표하는 SNP를 파악하여 효과적인 전유전체 (genome-side) 연관 구조를 분석하는데 사용할 수 있다.

그러므로 본 발명은 CYP2D6의 유전형 *1, *2, *3, *4, *5 (결손), *6, *9, *10, *14, *17, *18, *21, *29, *41, *49, *52, *60 및 중복의 tSNP를 이용하는 것을 특징으로 하는, 상기 CYP2D6 유전자를 신속하게 분석할 수 있는 방법을 제공한다.

본 발명의 고속 분석 방법은 CYP2D6의 *1, *2, *3, *4, *5 (결손), *6, *9, *10, *14, *17, *18, *21, *29, *41, *49, *52, *60 및 중복의 유전형 (다형성)을 특이적으로 검출할 수 있는 표지 서열 (tagging sequence)을 이용하여, 서열번호 26으로 표시된 CYP2D6의 1758번째 뉴클레오티드, 100번째 뉴클레오티드, 1611번째 뉴클레오티드, 2573번째 뉴클레오티드, 2988번째 뉴클레오티드, 3877번째 뉴클레오티드, 4125~4133번째 뉴클레오티드, 2850번째 뉴클레오티드, 1887번째 뉴클레오티드, 4878번째 뉴클레오티드, 2549번째 뉴클레오티드, 1846번째 뉴클레오티드, 1707번째 뉴클레오티드, 2615-2617번째 뉴클레오티드, 1023번째 뉴클레오티드, 3183번째 뉴클레오티드 및 -7274번째 뉴클레오티드로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 위치에서의 뉴클레오티드 유전형을 확인하여 CYP2D6의 *1, *2, *3, *4, *5 (결손), *6, *9, *10, *14, *17, *18, *21, *29, *41, *49, *52, *60 및 중복의 보유 여부를 결정하는 것을 포함하는 것을 특징으로 한다 (도 22a 내지 22f 참조).

따라서 본 발명은, CYP2D6 유전형을 SNP (단일염기 다형성)를 검출하는 방법으로서, (a) CYP2D6의 *1, *2, *3, *4, *5 (결손), *6, *9, *10, *14, *17, *18, *21, *29, *41, *49, *52, *60 및 중복 유전형을 특이적으로 검출할 수 있는 SNP를 확정하는 단계; (b) CYP2D6의 유전자를 특이적으로 증폭하기 위해 다중 중합효소 연쇄반응을 수행하는 단계; 및 (c) 다중 단일염기 프라이머를 사용하여 스냅샷 (SNaPshot) 분석법을 수행하여 생성산물에 대한 SNP를 분석하여 유전형을 확인하는 단계를 포함한다.

이때 상기 (b)단계에서 다중 중합효소 연쇄반응은 서열번호 1 내지 4의 프라이머 쌍(CYP2D6 APM1)을 이용하여 CYP2D6 유전자를 특이적으로 증폭하고, 서열번호 5 및 6의 프라이머 쌍 (CYP2D6 APM 2)을 이용하여 CYP2D6 결손 유전자를 특이적으로 증폭하고, 서열번호 7 및 8의 프라이머쌍 (CYP2D6 APM3)을 이용하여 CYP2D6 중복 유전자를 특이적으로 증폭한다.

상기 (c) 단계에서 스냅샷 분석을 위한 다중 단일염기 프라이머는 서열번호 9 내지 25의 프라이머로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 프라이머를 이용한다.

상기 (c) 단계에서 유전형 확인은, 서열번호 26으로 표시되는 CYP2D6 유전자의 1758번째 뉴클레오티드가 G 또는 A; 100번째 뉴클레오티드가 C 또는 T; 1611번째 뉴클레오티드가 T 또는 A; 2573번째 뉴클레오티드가 G 또는 C; 2988번째 뉴클레오티드가 G 또는 A; 3877번째 뉴클레오티드가 G 또는 A; 4125-4133번째 뉴클레오티드가 G 또는 T; 2850번째 뉴클레오티드가 C 또는 T; 1887번째 뉴클레오티드가 G 또는 A; 4878번째 뉴클레오티드가 A 또는 G; 2549번째 뉴클레오티드가 A 또는 G; 1846번째 뉴클레오티드가 G 또는 A; 1707번째 뉴클레오티드가 T 또는 G; 2615-2617번째 뉴클레오티드가 A 또는 G; 1023번째 뉴클레오티드가 C 또는 T; 3183번째 뉴클레오티드가 G 또는 A; 및/또는 -7274번째 뉴클레오티드가 G 또는 A인지 확인하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법을 제공한다 (도 15 참조).

일 구체예로서 상기 방법은 다음과 같은 방법으로 수행될 수 있다.

(a) https://www.pharmvar.org/htdocs/archive/cyp2d6.htm 등의 공지 게놈 DNA 서열을 참조하여 CYP2D6의 *1, *2, *3, *4, *5 (결손), *6, *9, *10, *14, *17, *18, *21, *29, *41, *49, *52, *60 및 중복의 유전형을 특이적으로 검출할 수 있는 표지서열을 확정한다.

(b) 그리고, 목적하는 CYP2D6, CYP2D6 결손, CYP2D6 중복의 특정 부위를 증폭한다.

본 발명의 일 실시예에서는 CYP2D6 유전자의 9개의 엑손과 1.8kb의 프로모터 부위가 증폭되도록 하였다. 이때, 적절한 공지의 방법을 선택하여 사용할 수 있는데, 예를 들어, 다중 중합효소연쇄반응 (multiplex polymerase chain reaction, multiplex PCR) 등의 방법을 사용할 수 있다.

본 발명의 실시예에서는 상기 증폭을 위해 서열번호 1 내지 8의 프라이머 세트를 사용하였다.

상기 서열번호 1 내지 4의 프라이머 쌍은 CYP2D6 특이적 프라이머이고, 서열번호 5 및 6은 CYP2D6 결손 특이적 프라이머이며, 서열번호 7 및 8은 CYP2D6 중복 특이적 프라이머이다. 본 발명은 이러한 프라이머 세트 및 이에 대한 용도를 포함한다.

(c) 다중 단일염기 프라이머 확장을 통한 스냅샷 분석법을 수행하여 SNP를 분석한다.

이 단계에서 사용할 프라이머를 CYP2D6의 *1, *2, *3, *4, *5 (결손), *6, *9, *10, *14, *17, *18, *21, *29, *41, *49, *52, *60 및 중복이 구별될 수 있는 tSNP의 앞쪽에 정렬되도록 설계하고 다중 단일염기 다형성 (SNP) 부위에 상기 프라이머를 이용하여 확장 반응을 수행한다 (도 20 참조).

본 발명의 일 실시예에서 사용한 다중 단일 염기 프라이머는 서열 번호 9 내지 25의 올리고머로서, 이들의 서열 및 용도 또한 본 발명의 범위에 포함된다.

그리고 나서, 생성 산물에 대한 단일 염기 다형성 (SNP)에 대한 최고점을 분석하여 유전형을 확인함으로써 CYP2D6 유전자의 *1, *2, *3, *4, *5 (결손), *6, *9, *10, *14, *17, *18, *21, *29, *41, *49, *52, *60 및 중복의 각 대립 유전자 여부를 결정한다.

본 발명의 일 실시예에서는 하기와 같은 결과를 수득하였다 (도 14 및 15 참조).

서열번호 26의 CYP2D6 서열 중 1758번째 뉴클레오티드에서 *14의 대립 유전자 G 또는 A (파랑 또는 초록); 100번째 뉴클레오티드에서 *4, *10B, *49, *52의 대립 유전자 C 또는 T (검정 또는 빨강); 1611번째 뉴클레오티드에서 *49의 대립유전자 T 또는 A (초록 또는 빨강); 2573번째 뉴클레오티드에서 *21B의 대립 유전자 G 또는 C (파랑 또는 검정); 2988번째 뉴클레오티드에서 *41의 대립유전자 G 또는 A (파랑 또는 초록); 3877번째 뉴클레오티드에서 *52의 대립유전자 G 또는 A (검정 또는 빨강); 4125-4133번째 뉴클레오티드에서 *18의 대립유전자 G 또는 T (파랑 또는 빨강); 2850번째 뉴클레오티드에서 *2, *14, *17, *21B, *29, *41의 대립 유전자 C 또는 T (파랑 또는 초록); 1887번째 뉴클레오티드에서 *60의 대립 유전자 G 또는 A (검정 또는 빨강); 4878번째 뉴클레오티드에서 *5의 대립유전자 A 또는 G (빨강 또는 검정); 2549번째 뉴클레오티드에서 *3의 대립유전자 A 또는 G (초록 또는 파랑); 1846번째 뉴클레오티드에서 *4의 대립유전자 G 또는 A (파랑 또는 초록); 1707번째 뉴클레오티드에서 *6의 대립유전자 T 또는 G (초록 또는 검정); 2615-2617번째 뉴클레오티드에서 *9의 대립유전자 A 또는 G (초록 또는 파랑); 1023번째 뉴클레오티드에서 *17의 대립유전자 C 또는 T (검정 또는 빨강); 3183번째 뉴클레오티드에서 *29의 대립유전자 G 또는 A (검정 또는 빨강); 및 -7274번째 뉴클레오티드에서 *XN의 대립유전자 G 또는 A (검정 또는 빨강)가 확인되었다. 상기 특정 위치에서의 유전형을 확인함으로써 CYP2D6 유전자의 *1, *2, *3, *4, *5 (결손, deletion), *6, *9, *10, *14, *17, *18, *21, *29, *41, *49, *52, *60, 중복 (duplication)의 보유 여부 또는 존재 여부를 결정할 수 있다.

CYP2D6 유전자의 특이적인 엑손 영역에 존재하는 상기의 특정 대립 유전자 (다형성 마커)의 존재는 해당하는 약물 반응의 개인차 및 이상반응 예측의 판단 기준이 될 수 있다.

따라서 임의의 이용 가능한 방법에 의한 이러한 tSNP 마커의 검출이 진단 목적, 예컨대, 약물 부작용에 대한 감수성의 조기 검출, 환자에 대한 예후, 진단 및 치료를 보조하는데 사용될 수 있다.

상기 방법에 의한 본 발명의 또 다른 측면은 약리게놈학 프로파일링의 방법이다. “약리게놈학 프로파일링”은 질병 또는 의학적 상태, 특히 약물에 대한 부작용과 관련된, 대상자 (subject)에 존재하는 유전 인자의 결정을 의미한다. 이 방법은 CYP2D6 *1, *2, *3, *4, *5 (결손), *6, *9, *10, *14, *17, *18, *21, *29, *41, *49, *52, *60 및 중복으로 이루어지는 군에서 선택된 적어도 하나의 CYP2D6 대립 유전자의 존재를 결정하는 단계를 포함한다. 상기 방법은 필요에 따라 다른 유전 인자 (genetic factor)의 결정을 포함할 수 있다. 그러한 다른 유전 인자는 약물 이상반응을 포함하는 어떤 질병 또는 의학적 상태의 소인과도 관련될 수 있다.

본 발명에 따른 키트는 환자로부터 생체 시료를 수집하기 위한 도구 및/또는 시약 뿐 아니라 그 시료로부터 게놈 DNA, RNA, cDNA 또는 단백질을 준비하기 위한 도구 및/ 또는 시약을 더 포함할 수 있다. 예를 들면, 게놈 DNA의 관련 영역을 증폭하기 위한 PCR 프라이머를 포함할 수 있다. 상기 키트는 약리게놈학적 프로파일링에 유용한 유전 인자용의 프로브를 포함할 수 있다. 또한, 이러한 키트의 사용에 있어서, 표지화된 올리고뉴클레오티드를 사용하여 분석 중 용이하게 동정할 수 있다. 사용될 수 있는 표지의 예로서는 방사능 표지, 효소, 형광 화합물, 스트렙타비딘, 아비딘, 바이오틴, 자성 부분, 금속 결합 부분, 항원 또는 항체 부분 등이 있다.

특히, 본 발명에서는 CYP2D6 *1, *2, *3, *4, *5 (결손), *6, *9, *10, *14, *17, *18, *21, *29, *41, *49, *52, *60 및 중복으로 구성된 군에서 하나 이상의 CYP2D6 대립 유전자의 tSNP 및 표지 단일염기 다형성 영역의 증폭을 위한 프라이머 세트, 예를 들어 서열번호 9 내지 25로 표시되는 프라이머 세트들을 포함하는 것이 바람직하다.

CYP2D6 유전형을 활용한 대사활성 표현형 평가

또한, 본 발명은 또 다른 관점에서 상기 방법에 의해 환자로부터 생체 시료 및 본 발명의 키트를 사용하여 도출된 유전형 결과를 활용하여 CYP2D6 대사활성 표현형을 평가하는 방법에 관한 것이다.

도 16 및 17에 제시된 바와 같이, 각 유전형을 활성 점수(activity score)로 분류하여, 합이 2 이상은 CYP2D6 대사활성 표현형이 UM (Ultrarapid metabolizer, 초고속 대사자); 1에서 2 사이는 CYP2D6 대사활성 표현형이 NM (Normal metabolizer, 일반 대사자); 0.5는 CYP2D6 대사활성 표현형이 IM (Intermediated metabolizer, 중간 대사자); 0은 CYP2D6 대사활성 표현형이 PM (Poor metabolizer, 느린 대사자)로 평가할 수 있다.

CYP2D6 표현형을 활용한 약물 반응의 개인차 및 이상반응 평가

또한, 본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 방법에 의해 환자로부터 생체 시료 및 본 발명의 키트를 사용하여 도출된 유전형 결과를 활용하여 CYP2D6 대사활성 표현형을 평가하는 것을 포함하는, 약물 반응의 개인 차 및 약물 이상반응 예측을 평가하는 방법에 관한 것이다.

즉, 상기 CYP2D6 유전 표지 1, *2, *3, *4, *5 (결손), *6, *9, *10, *14, *17, *18, *21, *29, *41, *49, *52, *60 및 중복의 존재 또는 부재에 기초하여 환자의 약물 반응의 개인차 및 이상반응의 발병 위험 여부를 평가하는 방법을 제공한다. 이때 하나 이상으로 선택되는 대립유전자의 존재는 약물 반응의 개인차 및 이상반응을 유도하는 위험의 지표이다.

상기 약물은 바람직하게는 amitriptyline, clomipramine, codein, desipramine, doxepin, fluvoxamine, imipramine, nortriptyline, ondansetron, paroxetine, tamoxifen, trimipramine, tropisetron, aripiprazole, atomoxetine, carvedilol, clomipramine, clozapine, doluxetine, flecainide, flupenthixol, haloperidole, metoprolol, mirtazapine, olanzapine, oxycodone, propafenone, risperidone, tramadol, venlafaxine, zuclopenthixol, cevimeline, propanolol, thioridazine, tolterodine, qunidine, protriptyline, terbinafine, tetrabenazine, tiotropium, venlafaxine, citalopram, desipramine, modafinil, galantamine, pimozide, nefazodone, dextromethorphan, iloperidone, gefitinib, doluxetine, escitalopram, nebivolol, donepezil, ondansetron, quinine, timolol 및 이들 유사 약물로 이루어지는 군에서 선택된다.

본 발명에서 약물 화합물은, 상기 약물 화합물 그 자체, 또는 그 약물 중의 적어도 하나의 수소가 할로, 히드록시, 아실아미노, 알킬, 알케닐, 알키닐, 알콕시, 아릴옥시, 아릴, 아릴옥시아릴, 카복시, 카복시알킬, 카복시-치환된 알킬, 카복시-사이클로알킬, 카복시 치환된 사이클로알킬, 카복시아릴, 카복시-치환된 아릴, 카복시헤테로아릴, 카복시-치환된 헤테로아릴, 카복시헤테로사이클릭, 카복시-치환된 헤테로사이클릭, 사이클로알킬, 치환된 알킬, 치환된 알콕시, 치환된 아릴, 치환된 아릴옥시, 치환된 아릴옥시아릴, 치환된 사이클로알킬, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 헤테로사이클릭 또는 치환된 헤테로사이클릭기로 치환된 것을 제외하고는 그 약물과 같은 화합물을 의미한다. 상기 치환기가 함유하는 탄소수는 0 내지 10, 0 내지 6, 0 내지 4, 또는 0 내지 2일 수 있다.

상기 약물에 대해 약물반응의 개인차 및 이상반응은 코데인 (codein)을 예로 들 수 있다. 코데인의 경우 CYP2D6 대사활성 표현형이 UM (ultrarapid metabolizer)의 경우 체내 모르핀 (morphin)의 농도가 높아져 독성이 나타날 위험이 높아 대체 약물 사용을 권고하고, CYP2D6 대사활성 표현형이 IM (intermediate metabolizer)의 경우 표준 용량에 비해 다소 감소된 용량으로 처방하되 나이나 몸무게 등 임상적인 상황을 고려하여 처방하고, 약효가 없을 때는 대체 약물을 권고하고 있으며, CYP2D6 대사활성 표현형이 PM (poor metabolizer)의 경우 코데인 처방으로도 모르핀의 형성이 떨어져 통증 완화가 불충분한 약효가 없을 수 있어 대체 약물 처방을 권고하고 있다.

본 발명은 또한, 환자에 있어서 약물 반응 개인차 및 이상반응을 유발하는 유사 화합물을 동정하는 방법을 포함한다. 이 방법을 신약 개발에 있어 스크리닝법으로 사용하여 약물 반응 개인차 및 이상반응을 유발할 수 있는 약물 화합물을 찾아낼 수 있다.

이와 같이, 본 발명은 CYP2D6 유전자 1, *2, *3, *4, *5 (결손), *6, *9, *10, *14, *17, *18, *21, *29, *41, *49, *52, *60 및 중복의 신속 정확한 검출 방법 및 이러한 결과를 활용할 수 있는, 약물 부작용 평가, 약물 동정 등을 포함하는 모든 용도를 포함한다.

<실시예>

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

달리 지시되지 않는 한, 핵산은 좌측에서 우측으로 5‘->3’ 배향으로 기록된다. 명세서 내에서 열거된 수치 범위는 범위를 정의하는 숫자를 포함하고, 정의된 범위 내의 각각의 정수 또는 임의의 비-정수 분획을 포함한다.

달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 분야의 당업자가 통상적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본원에 기술된 것들과 유사하거나 등가인 임의의 방법 및 재료가 본 발명을 테스트하기 위한 실행에서 사용될 수 있지만, 바람직한 재료 및 방법이 본원에서 기술된다.

실시예 1: 표지 서열의 확정

https://www.pharmvar.org/htdocs/archive/cyp2d6.htm에서 한국인을 포함한 동양인과 서양인 등에서 확인되는 CYP2D6 서열 (M33388, https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/M33388?report=GenBank)을 이용하여 CYP2D6 유전자 1, *2, *3, *4, *5 (결손), *6, *9, *10, *14, *17, *18, *21, *29, *41, *49, *52, *60 및 중복의 유전형을 특이적으로 검출할 수 있는 표지 서열을 확정하였으며, 그 결과를 도 19에 표시하였다.

실시예 2: 중합효소연쇄반응 (polymerase chain reaction, PCR)

특정 CYP2D6, CYP2D6 결손, CYP2D6 중복 부위를 증폭하기 위하여 CYP2D6, CYP2D6 결손 및 CYP2D6 중복과 타유전자를 정확하게 구별할 수 있는 프라이머를 이용하였다. 구체적으로, CYP2D6는 서열번호 1 내지 4로 구성된 본 발명에 따른 키트의 CYP2D6 증폭 프라이머 믹스 1 (CYP2D6 APM1), CYP2D6 결손은 서열번호 5 및 6으로 구성된 CYP2D6 증폭 프라이머 믹스 2 (CYP2D6 APM2), 및 CYP2D6 중복은 서열번호 7 및 8로 구성된 CYP2D6 증폭 프라이머 믹스 3 (CYP2D6 APM3)을 사용하였다. 중합효소 연쇄 반응은 ABI 9700 (Applied Biosystems, Foster, USA)을 이용하여 실시하였다.

CYP2D6의 경우, 반응액은 의뢰검체 100 ng, 2X PCR 증폭 믹스 (2X PCR AM) 10 ul 및 CYP2D6 증폭 프라이머 믹스 1 (CYP2D6 APM1) 4 ul를 포함하도록 최종 20 ul를 맞추어 구성하였다. 상기 반응액을 94℃에서 5분간 처리한 후에, 98℃ 20초, 64℃ 30초, 72℃ 3분씩 35회 반응시켰고, 최종연장 반응은 72℃에서 5분간 수행하였다.

CYP2D6 결손의 경우, 반응액은 의뢰검체 100 ng, 2X PCR 증폭 믹스 (2X PCR AM) 10 ul, CYP2D6 증폭 프라이머 믹스 2 (CYP2D6 APM2) 4 ul를 포함하도록 최종 20 ul를 맞추어 구성하였다. 상기 반응액을 94℃에서 5분간 처리한 후에, 98℃ 20초, 64℃ 30초, 72℃ 3분씩 35회 반응시켰고, 최종연장 반응은 72℃에서 5분간 수행하였다.

CYP2D6 중복의 경우, 반응액은 의뢰검체 100 ng, 2X PCR 증폭 믹스 (2X PCR AM) 10 ul, CYP2D6 증폭 프라이머 믹스 3 (CYP2D6 APM3) 4 ul를 포함하도록 최종 20 ul를 맞추어 구성하였다. 상기 반응액을 94℃에서 5분간 처리한 후에, 98℃ 20초, 64℃ 30초, 72℃ 3분씩 35회 반응시켰고, 최종연장 반응은 72℃에서 5분간 수행하였다.

다음으로 중합효소 연쇄반응이 끝난 산물을 얼음 수조로 옮긴 후, 파라필름 (parafilm) 위에 PCR 산물 2 ul, 6X 로딩 버퍼 1 ul를 섞어, 1% 아가로오스 겔에 1 kb의 믹스드 DNA 래더 (Mixed DNA ladder) 2 ul를 0.5X TBE 버퍼와 섞어서 100 V, 60분간 전기영동을 실시하였다.

이후, 1% 아가로오스 겔을 형광 물질을 함유한 겔 레드 (gel red)로 염색하여 DNA 크기를 확인하였다. PCR 산물 크기를 확인한 후 샘플 내의 프라이머와 dNTP를 제거하기 위한 ExoSAP-IT (USB corp., Cleveland, USA)처리를 하였다. CYP2D6 스냅샷 프라이머 믹스 1 (CYP2D6 SPM1)에 대하여 ExoSAP-IT 2.5 ul, CYP2D6 2 ul 및 CYP2D6 결손 PCR 산물 3 ul를 섞어 37℃ 35분, 80℃ 15분간 반응시켰다. 또한 CYP2D6 스냅샷 프라이머 믹스 2 (CYP2D6 SPM2)를 위하여 ExoSAP-IT 2.5ul, CYP2D6 2ul 및 CYP2D6 중복 산물 3 ul를 섞어 37℃ 35분, 80℃ 15분간 반응시켰다.

실시예 3: 다중 단일염기 프라이머 확장 반응 (multiplex single based primer extension, SNaPshot assay)을 이용한 유전자형 검사

3-1. 유형별 프라이머 설계

다중 단일염기 프라이머 확장반응 (multiplex single based primer extension, SNaPshot assay)을 위한 유형별 프라이머는 서열번호 9 내지 25의 프라이머를 사용하였다.

프라이머들의 3‘ 끝이 CYP2D6 유전자에 있는 1, *2, *3, *4, *5 (결손), *6, *9, *10, *14, *17, *18, *21, *29, *41, *49, *52, *60 및 중복을 구별할 수 있는 tSNP들의 직전 뉴클레오티드와 정렬되도록 설계하였다 (도 20 참조).

3-2. 스냅샷 분석법

스냅샷 분석을 위해 중합효소연쇄반응 산물을 주형으로 하여 CYP2D6 스냅샷 프라이머 믹스 1(CYP2D6 SPM1)에 대하여 서열번호 9 내지 18의 프라이머를 사용하여 10개의 단일염기다형성 부위에 대해 길이를 다르게 설계한 10개의 유형별 프라이머를 이용하여 다중 단일염기 프라이머 확장반응을 시행하였다.

또한, CYP2D6 스냅샷 프라이머 믹스 2(CYP2D6 SPM2)에 대하여 서열번호 19 내지 25의 프라이머를 사용하여 7개의 단일염기다형성 부위에 대해 길이를 다르게 설계한 7개의 유형별 프라이머를 이용하여 다중 단일염기 프라이머 확장반응을 시행하였다.

다중 단일염기 프라이머 확장반응은 CYP2D6 스냅샷 프라이머 믹스 1 (CYP2D6 SPM1)의 경우 본 발명에 따른 키트의 스냅샷 멀티플렉스 시약 (SNaPshot RM) 1 ul, 1/2 텀 (term) 버퍼 4 ul, Exo-SAP-IT 산물 및 CYP2D6 스냅샷 프라이머 믹스 1 (CYP2D6 SPM1) 4 ul로 구성하였다.

CYP2D6 스냅샷 프라이머 믹스 2 (CYP2D6 SPM2)의 경우 스냅샷 멀티플렉스 시약 (SNaPshot RM) 1 ul, 1/2 텀 (term) 버퍼 4 ul, Exo-SAP-IT 산물 및 CYP2D6 스냅샷 프라이머 믹스 2 (CYP2D6 SPM2) 4 ul로 구성하였다.

준비한 산물들은 96℃ 10초, 50℃ 5초, 60℃ 30초를 40회 반응 시킨 뒤, SAP을 1.8 ul (1 U/ul)를 각각 첨가하여 37℃ 60분, 65℃ 15분간 반응시켜 남아있는 ddNTP를 제거하였다.

반응 산물 1.5 ul에 GeneScan-120 LIZ 사이즈 스탠다드 0.5 ul 및 Hi-Di 포름아미드 8.0 ul를 넣어 ABI 3130 유전자 분석기 (Applied biosystems, Foster, USA)를 이용하여 분석하였다.

3-3. 단일 염기 다형성 (SNP) 분석

각 단일염기 다형성 위치에 상보적인 형광을 붙인 ddNTP가 각 프라이머 3‘ 끝에 오도록 조합하여 확장 반응 산물을 얻어, 각 SNP에 대한 각각의 최고점을 분석하였다. 소프트웨어는 GeneMapper v4.0 (Applied Biosystems, Foster, USA)을 이용하였으며 분석결과에 따라 CYP2D6 1, *2, *3, *4, *5 (결손), *6, *9, *10, *14, *17, *18, *21, *29, *41, *49, *52, *60 및 중복의 존재 여부를 확인하였다.

그리고 실험으로 통해 얻어진 결과를 표준검사법 (gold standard, Sequencing)으로 얻어진 유전자 서열 정보 (sequencing data)와 비교하였다.

도 14는 CYP2D6의 모든 tSNP가 야생형으로 검출된 것을 나타내는 도면이다. 이는 본 발명에 따른 키트의 구성품인 야생형 DNA를 활용하여 검출된 결과이다.

이러한 결과를 통해, 약물 반응의 개인차 및 이상반응 관련 유전자 CYP2D6 1, *2, *3, *4, *5 (결손), *6, *9, *10, *14, *17, *18, *21, *29, *41, *49, *52, *60 및 중복으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 CYP2D6 대립 유전자의 존재 여부를 빠르고 정확하게 확인할 수 있음을 알 수 있다. 따라서 본 발명을 이용하여 상기 특정 CYP2D6 대립 유전자의 타입을 고속으로 검출하여 약물 반응의 개인차 및 이상반응의 위험도 예측 및 진단 방법에 효과적으로 활용할 수 있을 것이다.

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허 청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

<110> SPMED Co.,Ltd. <120> High-speed detection kit for human cytochrome P450 2D6 mutation gene <130> DPP180149KR <160> 26 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CYP2D6 Ampl00F <400> 1 ccatttggta gtgaggcagg t 21 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CYP2D6 Ampl887R <400> 2 cctgcagaga ctcctcggtc t 21 <210> 3 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CYP2D6 Amp2850F <400> 3 tggggcctga gacttgtcca gg 22 <210> 4 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CYP2D6 AmpR <400> 4 actgagccct gggaggtagg ta 22 <210> 5 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CYP2D6 DelF <400> 5 acctctctgg gccctcaggg a 21 <210> 6 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CYP2D6 DelR <400> 6 caggcatgag ctaaggcacc cagac 25 <210> 7 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CYP2D6 DupF <400> 7 cctcaccaca ggactggcca cc 22 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CYP2D6 DupR <400> 8 cacgtgcagg gcacctagat 20 <210> 9 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 1758seqF(T0) <400> 9 cgccttcgcc aaccactcc 19 <210> 10 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> l00seqF (T0) <400> 10 caacgctggg ctgcacgcta c 21 <210> 11 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 1611seqR (T10) <400> 11 tttttttttt gggcccatag cgcgccagga 30 <210> 12 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 2573seqF (T16) <400> 12 tttttttttt tttttttggg acccagccca gccccccc 38 <210> 13 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 2988seqF (T20) <400> 13 tttttttttt tttttttttt agtgcagggg ccgagggag 39 <210> 14 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3877seqR (T25) <400> 14 tttttttttt tttttttttt tttttctggg catccaggaa gtgtt 45 <210> 15 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 4125seqF (T28) <400> 15 tttttttttt tttttttttt tttttttttt cagcttctcg gtgcccactg 50 <210> 16 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 2850seqR (T35) <400> 16 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttcaggt cagccaccac tatgc 55 <210> 17 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 1887seqR (T40) <400> 17 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt agggaggcga tcacgttgct 60 60 <210> 18 <211> 65 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DeletionseqR (T45) <400> 18 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttctcgt cactggtcag 60 gggtc 65 <210> 19 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 1846seqF (T0) <400> 19 acccgcatct cccaccccca 20 <210> 20 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 2549seqF(T7) <400> 20 tttttttatg agctgctaac tgagcac 27 <210> 21 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 1023seqF(T9) <400> 21 tttttttttg accgcccgcc tgtgcccatc a 31 <210> 22 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 2615seqF(T13) <400> 22 tttttttttt tttgccttcc tggcagagat ggag 34 <210> 23 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 1707seqR(T20) <400> 23 tttttttttt tttttttttt ggcggcctcc tcggtcaccc 40 <210> 24 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3183seqR(T26) <400> 24 tttttttttt tttttttttt ttttttgtcg ccgcacctgc cctatca 47 <210> 25 <211> 65 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DuplicationseqR (T45) <400> 25 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttctcgt cactggtcag 60 gggtc 65 <210> 26 <211> 15928 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CYP2D6 <400> 26 cttttagcta gaaataaagg ttccccaagt ccccaccaga ttagctagat agagtgctaa 60 ttggtgcatg cacgaacccg gagctagaca cagagtgctg attggtgcat atacaatcct 120 ctggctagac ataaaagttc tccaagtccc cacctgactc aggagcccag ccagcttcgc 180 ctagtggatc ctatgccagg gccacaggca gagctgcctg ctagtcccac accgggcacc 240 tgtactcctc agcccttggg cagtggacgg gaccaggtgc cgtggagcag tgggaggcac 300 ccatccggga ggctcgggcc tcgcagggag cccaccgtag ggaggcttgg gcatggcagg 360 ctgcaagtcc tgagccctgc cccgcgggga ggtgactgag gcctggcgac aattcaagtg 420 tggtgagcgc cggcaggcca gcagtactgg gggacccggt gccccctctg cagctgctgg 480 cccaggtgct aagcccctca ctgcctgggg ccagaggcac cagccggccg ctccgagtgc 540 agggcccgct gagcccctgc ccacccagaa ctggtgctgg cccgcgagca acccaggttc 600 ccgcacacgc ctctccctcc atacctcccc gcaagcagac ggagccggct ccagcctcca 660 ccagtccaga gaggggctcc cacagtgcag cgctgggctg aagggctcct caagtgtggt 720 cagagcagaa gctgaggccg aggaggcgct gagagcgagc gaggaccacc agcacgttga 780 cacctctcaa cctcaccaca ggactggcca cctctctggg ccctcaggga tgctgctgtc 840 tggacccctg accagtgacg agttcgcact cagggccagg ctggcgctgg aggaggacac 900 ttgtttggct ccaaccctag gtaccatcct cccagtaggg atcaggcagg gcccacaggc 960 ctgccctagg gacaggagtc aaccttggac ccataaggca ctggggcggg cagagaagga 1020 ggaggtggca tgggcagctg agagccagag accctgaccc tagtccttgc tctgccatta 1080 ccccgtgtga ccccgggccc acccttcccc acccttcccc acccttcccc accccgggct 1140 tctgtttccc ttctgccaac gagaaggctg cttcacctgc cccgagtcct gtcttcctgc 1200 tctgccttct ggggctgtgg cccttgctgg cctggagccc caaccaaggg cagggactgc 1260 tgtcctccac gtctgtcctc 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Claims

CYP2D6의 *1, *2, *3, *4, *5 (결손, deletion), *6, *9, *10, *14, *17, *18, *21, *29, *41, *49, *52, *60 및 중복 (duplication)의 유전형 (다형성)을 특이적으로 검출할 수 있는 표지 서열 (tagging sequence, 표지 SNP (tagging SNP, tSNP)을 이용하여, 서열번호 26으로 표시되는 CYP2D6 유전자의 1758번째 뉴클레오티드, 100번째 뉴클레오티드, 1611번째 뉴클레오티드, 2573번째 뉴클레오티드, 서2988번째 뉴클레오티드, 3877번째 뉴클레오티드, 4125~4133번째 뉴클레오티드, 2850번째 뉴클레오티드, 1887번째 뉴클레오티드, 4878번째 뉴클레오티드, 2549번째 뉴클레오티드, 1846번째 뉴클레오티드, 1707번째 뉴클레오티드, 2615-2617번째 뉴클레오티드, 1023번째 뉴클레오티드, 3183번째 뉴클레오티드 및 -7274번째 뉴클레오티드로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 위치에서의 뉴클레오티드 유전형을 확인하여 CYP2D6의 *1, *2, *3, *4, *5 (결손), *6, *9, *10, *14, *17, *18, *21, *29, *41, *49, *52, *60 및 중복의 보유 여부를 결정하는 것을 특징으로 하는, 약물 반응의 개인차 및 이상반응 관련 유전형 CYP2D6 1, *2, *3, *4, *5 (결손), *6, *9, *10, *14, *17, *18, *21, *29, *41, *49, *52, *60 및 중복으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 CYP2D6 대립유전자의 SNP 검출 방법.
제1항에 있어서,
(a) CYP2D6의 *1, *2, *3, *4, *5 (결손), *6, *9, *10, *14, *17, *18, *21, *29, *41, *49, *52, *60 및 중복 유전형을 특이적으로 검출할 수 있는 SNP를 확정하는 단계;
(b) CYP2D6의 유전자를 특이적으로 증폭하기 위해 다중 중합효소 연쇄반응을 수행하는 단계; 및
(c) 다중 단일염기 프라이머를 사용하여 스냅샷 (SNaPshot) 분석법을 수행하여 생성산물에 대한 SNP를 분석하여 유전형을 확인하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제2항에 있어서,
상기 (b)단계에서 다중 중합효소 연쇄반응은 서열번호 1 내지 4의 프라이머 쌍(CYP2D6 APM1)을 이용하여 CYP2D6 유전자를 특이적으로 증폭하고, 서열번호 5 및 6의 프라이머 쌍 (CYP2D6 APM 2)을 이용하여 CYP2D6 결손 유전자를 특이적으로 증폭하고, 서열번호 7 및 8의 프라이머쌍 (CYP2D6 APM3)을 이용하여 CYP2D6 중복 유전자를 특이적으로 증폭하는 것을 특징으로 하는 방법.
제2항에 있어서,
상기 (c) 단계에서 스냅샷 분석을 위한 다중 단일염기 프라이머는 서열번호 9 내지 25의 프라이머로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 프라이머인 것을 특징으로 하는 방법.
제2항에 있어서,
상기 (c) 단계에서 유전형 확인은, 서열번호 26으로 표시되는 CYP2D6 유전자의 1758번째 뉴클레오티드가 G 또는 A; 100번째 뉴클레오티드가 C 또는 T; 1611번째 뉴클레오티드가 T 또는 A; 2573번째 뉴클레오티드가 G 또는 C; 2988번째 뉴클레오티드가 G 또는 A; 3877번째 뉴클레오티드가 G 또는 A; 4125-4133번째 뉴클레오티드가 G 또는 T; 2850번째 뉴클레오티드가 C 또는 T; 1887번째 뉴클레오티드가 G 또는 A; 4878번째 뉴클레오티드가 A 또는 G; 2549번째 뉴클레오티드가 A 또는 G; 1846번째 뉴클레오티드가 G 또는 A; 1707번째 뉴클레오티드가 T 또는 G; 2615-2617번째 뉴클레오티드가 A 또는 G; 1023번째 뉴클레오티드가 C 또는 T; 3183번째 뉴클레오티드가 G 또는 A; 및/또는 -7274번째 뉴클레오티드가 G 또는 A인지 확인하는 것임을 특징으로 하는 방법.
제2항에 있어서,
상기 서열번호 26으로 표시되는 CYP2D6 유전자의 1758, 100, 1611, 2573-2574, 2988, 3877, 4125-4133, 2850, 1887, 4878, 2549, 1846, 1707, 2615-2617, 1023, 3183 및 -7274번째 뉴클레오티드를 확인하기 위한 표지 SNP (tSNP)는 CYP2D6의 1, *2, *3, *4, *5 (결손), *6, *9, *10, *14, *17, *18, *21, *29, *41, *49, *52, *60 및 중복 일배체의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 조합인 것을 특징으로 하는 방법.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 방법을 수행하기 위한, 서열번호 1 내지 25로 이루어진 군에서 선택되는 프라이머를 하나 이상 포함하는 것을 특징으로 하는, 약물 반응의 개인차 및 이상반응 관련 유전자 CYP2D6 1, *2, *3, *4, *5 (결손), *6, *9, *10, *14, *17, *18, *21, *29, *41, *49, *52, *60 및 중복으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 CYP2D6 대립 유전자의 SNP 검출용 키트.
제7항에 있어서,
다중 중합효소 연쇄반응시, CYP2D6 유전자를 특이적으로 증폭하기 위한 서열번호 1 내지 4의 프라이머 쌍(CYP2D6 APM1), CYP2D6 결손 유전자를 특이적으로 증폭하기 위한 서열번호 5 및 6의 프라이머 쌍 (CYP2D6 APM 2), 및 CYP2D6 중복 유전자를 특이적으로 증폭하기 위한 서열번호 7 및 8의 프라이머쌍 (CYP2D6 APM3)으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 프라이머를 포함하는 것을 특징으로 하는, 키트.
제7항에 있어서,
스냅샷 (SNaPshot) 분석용 다중 단일염기 프라이머로서 서열번호 9 내지 25의 프라이머로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 프라이머를 포함하는 것을 특징으로 하는, 키트.
제1항의 방법을 이용하여 약물 반응의 개인차 및 이상반응 관련 유전자 CYP2D6 1, *2, *3, *4, *5 (결손), *6, *9, *10, *14, *17, *18, *21, *29, *41, *49, *52, *60 및 중복으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 CYP2D6 대립 유전자의 존재를 확인하는 단계; 및 상기 CYP2D6 대립 유전자가 존재할 때 약물반응의 개인차 및 이상반응 위험이 있는 것으로 결정하는 단계를 포함하는, 약물 부작용 위험도 예측을 위한 정보를 제공하는 방법.
제10항에 있어서,
상기 약물은 amitriptyline, clomipramine, codein, desipramine, doxepin, fluvoxamine, imipramine, nortriptyline, ondansetron, paroxetine, tamoxifen, trimipramine, tropisetron, aripiprazole, atomoxetine, carvedilol, clomipramine, clozapine, doluxetine, flecainide, flupenthixol, haloperidole, metoprolol, mirtazapine, olanzapine, oxycodone, propafenone, risperidone, tramadol, venlafaxine, zuclopenthixol, cevimeline, propanolol, thioridazine, tolterodine, qunidine, protriptyline, terbinafine, tetrabenazine, tiotropium, venlafaxine, citalopram, desipramine, modafinil, galantamine, pimozide, nefazodone, dextromethorphan, iloperidone, gefitinib, doluxetine, escitalopram, nebivolol, donepezil, ondansetron, quinine 및 timolol로 이루어지는 군에서 선택되는 1종인 것을 특징으로 하는 방법.
제10항에 있어서, 약물 반응의 개인차 및 이상반응은 치료 실패(약효 부족), 용량 조절, 독성 증가 및/또는 대체 약물 권고인 것을 특징으로 하는 방법.
약물 반응의 개인차 및 이상반응과 관련된 CYP2D6 대립 유전자를 보유하는 환자의 시료로부터 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항의 방법 또는 키트에 의해 CYP2D6 1, *2, *3, *4, *5 (결손), *6, *9, *10, *14, *17, *18, *21, *29, *41, *49, *52, *60 및 중복으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 CYP2D6 대립 유전자의 존재를 확인하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 약물 반응의 개인차 및 이상반응 유발 약물을 동정하는 방법.