CN111455081B - lncRNA147410.3在弓形虫脑病中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供lncRNA147410.3在弓形虫脑病中的应用，属于生物医药和分子生物学技术领域。经研究发现，NONMMUG0147410.3(lncRNA147410.3)在微阵列感染的弓形虫感染的小鼠脑组织中显著上调；同时弓形虫慢性感染小鼠脑组织中lncRNA147410.3的表达影响神经细胞的增殖、分化及凋亡，与弓形虫感染密切相关。lncRNA147410.3是在弓形虫慢性感染脑组织中首次发现的一种非编码RNA。因此，lncRNA147410.3可以作为一种重要的生物靶标，为弓形虫脑病的诊断和基于lncRNA147410.3为靶向的抗弓形虫药物研发提供了依据，具有良好的实际应用之价值。

Description

lncRNA147410.3在弓形虫脑病中的应用

技术领域

本发明属于生物医药和分子生物学技术领域，具体涉及lncRNA147410.3在弓形虫脑病中的应用。

背景技术

公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

弓形虫(Toxoplasma gondii)是世界性分布的寄生原虫，广泛寄生于人体及动物的有核细胞内，引起严重的人兽共患病。弓形虫感染孕早期妇女可导致流产、早产甚至死产，亦可通过胎盘引起新生儿畸形和胎儿眼部并发症。对于免疫力缺乏或者低下的人群(如艾滋病和肿瘤患者)，弓形虫可导致严重的临床症状(如弓形虫脑病)甚至死亡。在免疫功能正常的宿主体内，弓形虫往往形成慢性感染，引起不可逆的中枢神经系统和视力的损害。近年来，越来越多的研究发现，弓形虫隐性感染并不是无症状的带虫状态，而是以一种非常精妙的方式侵入宿主的脑神经细胞，引起宿主的脑损害，智力改变，行为异常，甚至精神疾病的发生。

传统弓形虫检测方法主要有：直接涂片或组织切片法、组织培养法、动物实验法、酶联免疫吸附等。直接涂片或组织切片法虽然简单快速，但漏诊率高；组织培养和动物实验最真实可靠，但操作烦琐，耗时长，成本高；酶联免疫吸附法简便，快速，敏感性尚可，但由于个体免役系统的差异，有时指标不能真实反映虫体感染的情况，可能造成漏诊或误疹。而目前针对弓形虫的临床治疗通常用乙胺嘧啶、磺胺嘧啶和叶酸等联合应用，但治疗常常伴有副作用，且治疗不彻底，易复发。因此，亟需进一步研究开发关于弓形虫脑病的诊断和治疗方法。

发明内容

针对上述现有技术的不足，本发明提供lncRNA147410.3在弓形虫病中的应用。本发明经研发发现，NONMMUG0147410.3(lncRNA147410.3)在微阵列感染的弓形虫感染的小鼠脑组织中显著上调，扩大样本进一步验证证实其表达差异显著，同时，研究发现lncRNA147410.3的靶基因是Hoxb3，并确定弓形虫感染宿主后，Hoxb3的表达上调通过神经胶质细胞的分化，增殖等相关转录调控来抵御弓形虫的入侵。因此，lncRNA147410.3可以作为一种重要的生物靶标，为弓形虫脑病的诊断和基于lncRNA147410.3为靶向的抗弓形虫药物研发提供了依据，具有良好的实际应用之价值。

本发明是通过如下技术方案实现的：

本发明的第一个方面，提供一种弓形虫病分子标志物，所述弓形虫病分子标志物为lncRNA147410.3。

其中，所述lncRNA147410.3的核苷酸序列与SEQ ID NO.1具有90％以上序列同源性；更优选的，所述lncRNA147410.3的核苷酸序列为SEQ ID NO.1。

进一步的，所述分子标志物用于检测、诊断或预测弓形虫病的进展。

进一步的，所述弓形虫病为弓形虫脑病，更具体的为弓形虫感染致弓形虫脑病。经试验证明，所述lncRNA147410.3在弓形虫感染的小鼠脑组织上调表达。

本发明的第二个方面，提供检测上述弓形虫病分子标志物表达水平的物质在制备检测、诊断或预测弓形虫病的进展的产品中的应用。

其中，所述物质包括但不限于基于高通量测序方法和/或基于RT-PCR方法和/或基于定量PCR方法和/或基于探针杂交方法检测上述lncRNA147410.3表达水平的物质。

所述产品包括但不限于试剂盒。

本发明的第三个方面，提供一种用于检测、诊断或预测弓形虫病的进展的组合物，其包含基于高通量测序方法和/或基于RT-PCR方法和/或基于定量PCR方法和/或基于探针杂交方法检测待测样品中lncRNA147410.3或其调控靶基因表达水平的物质；或基于免疫检测方法检测待测样品中lncRNA147410.3调控靶基因的表达情况的物质。

其中，所述靶基因为Hoxb3。

本发明的第四个方面，提供一种试剂盒，所述试剂盒包括上述用于检测、诊断或预测弓形虫病的进展的组合物。

本发明的第五个方面，提供促进lncRNA147410.3表达和/或活性提高的物质和/或促进Hoxb3表达或活性提高的物质在筛选和/或制备弓形虫病预防或治疗药物中的应用。

经研究发现，lncRNA147410.3的靶基因为Hoxb3，且二者呈正调控关系，而Hoxb3在发育的早期阶段在神经干/祖细胞中表达，同时也参与了小脑神经干/祖细胞的维护，并且与神经干细胞和少突胶质细胞前体细胞(OPCs)的分化状态有关。Hoxb3的表达上调通过神经胶质细胞(如BV-2小胶质细胞)的分化、增殖等相关转录调控来抵御弓形虫的入侵。而小胶质细胞是中枢神经系统的免疫细胞，作为中枢神经系统的一种重要的防线，同时也是弓形虫主要的感染神经细胞之一，促进BV-2小胶质细胞的增殖、分化等，显然有利于弓形虫病的预防和治疗。

本发明的第六个方面，提供一种用于预防或治疗弓形虫病的药物组合物，其包含促进lncRNA147410.3表达和/或活性提高的物质和/或促进Hoxb3表达和/或活性提高的物质。

本发明的第七个方面，提供促进lncRNA147410.3表达和/或活性提高的物质和/或促进Hoxb3表达和/或活性提高的物质在制备具有如下任一用途产品中的应用：

1)促进小胶质细胞的增殖；

2)促进小胶质细胞的凋亡。

其中，所述小胶质细胞为Bv-2。

上述一个或多个技术方案的有益技术效果：

首次证明了lncRNA147410.3在弓形虫感染的小鼠脑组织中表达上调，同时也验证了体外lncRNA147410.3对BV-2细胞的影响。lncRNA-147410.3可以作为一种重要的生物靶标，为弓形虫脑病的诊断和基于lncRNA147410.3为靶向的抗弓形虫药物研发提供了依据，具有良好的实际应用之价值。

附图说明

构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。

图1为本发明实施例1中lncRNA147410.3脑组织qPCR验证图。

图2为本发明实施例1中lncRNA147410.3在脑组织上的定位图。

图3为本发明实施例1中lncRNA147410.3在细胞水平验证图。

图4为本发明实施例1中检测lncRNA147410.3对BV-2细胞增殖的影响图。

图5为本发明实施例1中流式细胞术检测lncRNA147410.3对BV-2细胞周期的影响图。

图6为本发明实施例1中TUNEL检测lncRNA147410.3对BV-2细胞凋亡的影响图。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。下列具体实施方式中如果未注明具体条件的实验方法，通常按照本领域技术内的分子生物学的常规方法和条件，这种技术和条件在文献中有完整解释。参见例如Sambrook等人，《分子克隆：实验手册》中所述的技术和条件，或按照制造厂商所建议的条件。

技术人员应理解，本发明中使用的术语长链非编码RNA(Long non-coding RNA,lncRNA)是长度大于200个核苷酸的非编码RNA，其在很多生物过程中有着重要的作用，参与调节染色质修饰，基因转录，mRNA翻译和蛋白质功能等重要的生物学功能，而表达异常的lncRNA往往与临床疾病相关。同时，由于非编码RNA不编码蛋白质，所受的调控相对较少，灵敏度、特异性和稳定性更高，因此可以作为更有效的诊断生物学指标。

术语“表达水平”是指在特定的时间点体内或样品中存在的基因产物的量。表达水平可以例如通过由基因表达的蛋白质或mRNA来测量/量化/检测。可以例如如下量化表达水平：用相同样品或参考样品(例如，在相同时间从同一个体得到的样品或相同样品的相同尺寸(重量、体积)的部分)中相同类型基因产物的总量(总蛋白质或mRNA)归一化样品中存在的目的基因产物的量，或者确定目的基因产物的量/限定的样品尺寸(重量、体积等)。可以通过本领域已知的任何方法来测量或检测表达水平，所述方法例如用于目的基因产物的直接检测和量化的方法(例如质谱)，或者通常通过目的基因产物与对目的基因产物具有特异性的一种或更多种不同分子或检测装置(例如，引物、探针、抗体、蛋白质支架)结合而工作的用于间接检测和测量目的基因产物的方法。技术人员还已知的是确定基因拷贝的水平，其还包括确定一个或更多个片段的不存在或存在(例如，通过核酸探针或引物，例如定量PCR、多重连接依赖性探针扩增(Multiplex ligation-dependent probe amplification，MLPA)PCR)。

术语“指标”和“标志”在本发明中可互换使用，并且是指病症的体征或信号或者用于监测病症。这样的“病症”是指细胞、组织或器官的生物状态，或者是指个体的健康和/或疾病状态。指标可以是包括但不限于肽、蛋白质和核酸的分子的存在或不存在，或者可以是细胞、或组织、器官或个体中这样的分子的表达水平或模式变化。指标可以是个体中疾病的发生、发展或存在或者这样的疾病的进一步进展的体征。指标也可以是在个体中发生疾病的风险的体征。

术语指标的水平“上调”、“升高”或“提高”是指与参考或参考样品相比，样品中这样的指标的水平降低。

术语指标的水平“下调”、“降低”或“下降”是指与参考或参考样品相比，样品中这样的指标的水平降低。

本发明的一个具体实施方式中，提供一种弓形虫病分子标志物，所述弓形虫病分子标志物为lncRNA147410.3。

本发明的又一具体实施方式中，所述lncRNA147410.3的核苷酸序列与SEQ IDNO.1具有90％以上序列同源性；更优选的，所述lncRNA147410.3的核苷酸序列为SEQ IDNO.1。

术语“同源”主要是指序列上的同源，也就是用来说明两个或多个蛋白质或DNA序列具有相同的祖先。同源的序列一般有相似的功能。蛋白质和DNA的同源性常常通过它们序列的相似性来判定，相似性是指序列比对过程中用来描述检测序列和目标序列之间相同DNA碱基或氨基酸残基顺序所占比例的高低。

本发明的又一具体实施方式中，所述弓形虫病为弓形虫脑病，更具体的为弓形虫(慢性)感染。经试验证明，所述lncRNA147410.3在弓形虫感染的小鼠脑组织上调表达。

本发明的又一具体实施方式中，提供检测上述弓形虫病分子标志物表达水平的物质在制备检测、诊断或预测弓形虫病的进展的产品中的应用。

其中，所述物质包括但不限于基于高通量测序方法和/或基于RT-PCR方法和/或基于定量PCR方法和/或基于探针杂交方法检测上述lncRNA147410.3表达水平的物质。

所述产品包括但不限于试剂盒。

本发明的又一具体实施方式中，提供一种用于检测、诊断或预测弓形虫的进展的组合物，其包含基于高通量测序方法和/或基于RT-PCR方法和/或基于定量PCR方法和/或基于探针杂交方法检测待测样品中lncRNA147410.3或其调控靶基因表达水平的物质；或基于免疫检测方法检测待测样品中lncRNA147410.3调控靶基因的表达情况的物质。

本发明的又一具体实施方式中，所述靶基因为Hoxb3。

本发明的又一具体实施方式中，提供一种试剂盒，所述试剂盒包括上述用于检测、诊断或预测弓形虫病的进展的组合物。

本发明的又一具体实施方式中，提供促进lncRNA147410.3表达和/或活性提高的物质和/或促进Hoxb3表达和/或活性提高的物质在筛选和/或制备弓形虫病预防或治疗药物中的应用。

经研究发现，lncRNA147410.3的靶基因为Hoxb3，且二者呈正调控关系，而Hoxb3在发育的早期阶段在神经干/祖细胞中表达，同时也参与了小脑神经干/祖细胞的维护，并且与神经干细胞和少突胶质细胞前体细胞(OPCs)的分化状态有关。Hoxb3的表达上调通过神经胶质细胞(如BV-2小胶质细胞)的分化、增殖等相关转录调控来抵御弓形虫的入侵。而小胶质细胞是中枢神经系统的免疫细胞，作为中枢神经系统的一种重要的防线，同时也是弓形虫主要的感染神经细胞之一，促进BV-2小胶质细胞的增殖、分化等，显然有利于弓形虫病的预防和治疗。

本发明的又一具体实施方式中，提供一种用于预防或治疗弓形虫病的药物组合物，其包含促进lncRNA147410.3表达和/或活性提高的物质和/或促进Hoxb3表达和/或活性提高的物质。

本发明的又一具体实施方式中，所述促进lncRNA147410.3表达和/或活性提高的物质包括采用基于基因特异性Mimics技术上调lncRNA147410.3表达和/或促进其活性的物质；如人工合成lncRNA147410.3的短发夹RNA(short hairpin RNA，shRNA)或上调lncRNA147410.3表达的启动子；同时也包括化合物类促进剂。

本发明的又一具体实施方式中，所述药物组合物还包括至少一种药物非活性成分。

所述药物非活性成分可以是药学上通常使用的载体、赋形剂及稀释剂等。而且，根据通常的方法，可以制作成粉剂、颗粒剂、片剂、胶囊剂、混悬剂、乳剂、糖浆剂、喷雾剂等的口服剂、外用剂、栓剂及无菌注射溶液形式的剂型使用。

所述可以包含的载体、赋形剂及稀释剂等非药物活性成分在领域内是熟知的，本领域普通技术人员能够确定其符合临床标准。

本发明的又一具体实施方式中，所述载体、赋形剂及稀释剂包括但不限于有乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露醇、木糖醇、赤藓糖醇、麦芽糖醇、淀粉、阿拉伯胶、藻酸盐、明胶、磷酸钙、硅酸钙、纤维素、甲基纤维素、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、水、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石粉、硬脂酸镁和矿物油等。

本发明的又一具体实施方式中，本发明的药物可通过已知的方式施用至体内。例如通过静脉全身递送或者局部注射递送到感兴趣组织中。可选地经由静脉内、经皮、鼻内、粘膜或其他递送方法进行施用。这样的施用可以经由单剂量或多剂量来进行。本领域技术人员理解的是，本发明中有待施用的实际剂量可以在很大程度上取决于多种因素而变化，如靶细胞、生物类型或其组织、待治疗受试者的一般状况、给药途径、给药方式等等。

本发明的又一具体实施方式中，所述药物组合物施用对象可以是人和非人哺乳动物，如小鼠、大鼠、豚鼠、兔、狗、猴、猩猩等。

本发明的又一具体实施方式中，提供促进lncRNA147410.3表达和/或活性提高的物质和/或促进Hoxb3表达和/或活性提高的物质在制备具有如下任一用途产品中的应用：

1)促进小胶质细胞的增殖；

2)促进小胶质细胞的凋亡。

其中，所述小胶质细胞为Bv-2。

以下通过实施例对本发明做进一步解释说明，但不构成对本发明的限制。应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。另外，实施例中未详细说明的分子生物学方法均为本领域常规的方法，具体操作可参看分子生物指南或产品说明书。

实施例1

1材料

1.1细胞与质粒

神经小胶质细胞(Bv-2)由山东大学基础医学院寄生虫教研室实验室冻存。6-8周雌性BALB/c小鼠，购自山东大学实验动物中心。饲养环境，饲养流程以及实验操作过程严格遵守山东大学实验动物伦理规范。

(1)shRNA干扰lncRNA147410.3载体的构建

我们通过Ensembl Genome Browser和UCSC Genome Browser Home数据库确定lncRNA147410.3序列，由济南博尚生物有限公司，利用质粒pGPU6/GFP/Neo构建shRNA干扰体系。

(2)过表达lncRNA147410.3载体的构建

将lncRNA147410.3构建于质粒pcDNA3.1+，克隆位点是HindIII-EcoRI，由济南博尚生物技术有限公司构建

1.2主要试剂

PBS(美国Hyclone公司)，氯化钠注射液0.9％(山东齐都药业有限公司)，无水乙醇(国药集团化学试剂有限公司)，EASYspin Plus组织/细胞RNA快速提取试剂盒(北京艾德莱生物技术有限公司)，

ⅡQRT SuperMix for qPCRs试剂盒(南京诺唯赞生物科技有限公司)，ChamQTM

qPCR Master Mix(南京诺唯赞生物科技有限公司)。Micropoly-transfecterTM(南通迈可锐生物技术有限公司)

1.3主要仪器

Optec倒置生物显微镜(重庆奥特光学仪器有限公司)，Bio-Rad荧光定量PCR仪(美国Bio-Rad公司)，漩涡混合器DG-800(北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司)，SCILOGEXS1010E掌上离心机(上海川翔生物科技有限公司)，Eppendorf RNA浓度测定仪(德国Eppendorf公司)，MDF-382E超低温冰箱(日本SANYO公司)，数显恒温水浴锅XMTD-204(天津欧诺仪器仪表有限公司)，Biofuge Stratos台式高速冷冻离心机(德国SORBALL公司)，梯度PCR扩增仪(德国Eppendorf公司)。

2方法

2.1细胞的复苏

准备工作：将15ml离心管、T25培养瓶、DMEM培养基(100ml配方：DMEM90ml+10ml血清+1ml双抗)、一次性吸管、酒精灯、废液缸放入生物安全柜(超净台)中，紫外消毒30-60分钟。同时将水浴锅打开至37℃。将冻存细胞从液氮罐中取出，快速放入37℃水浴锅中复苏，轻轻晃动，使细胞能在1-2min内完全解冻。用75％酒精喷后放入超净台，将管内细胞转移至15ml离心管，加入2ml培养基，轻轻吹打。1000rpm，离心5分钟。弃上清，保留沉淀。加入新鲜培养基。轻轻吹打，转移至T25细胞培养瓶中，放置37℃，5％CO₂的培养箱内培养,每隔24h换1次培养液，48h传代1次。

1.2细胞的传代

待细胞长至80-90％时，进行传代，准备工作与上述一致。弃掉原培养瓶中培养基，用生理盐水或者PBS冲洗干净。加入1-2ml胰酶，37℃,5％CO₂的培养箱1-2min，显微镜下可见细胞30％左右飘起，变圆。弃掉胰酶，加入新鲜培养基重悬。弃掉一半，加入新鲜培养基。混匀后放置37℃，5％CO₂的培养箱中培养。每一次新复苏的细胞都要传三代以上方可以进行下一步实验。

2.3细胞的冻存

准备工作与上述一致，弃掉原培养瓶中培养基，用生理盐水或者PBS冲洗干净。加入1-2ml胰酶，37℃反应1-2min，显微镜下可见30％左右飘起，变圆，弃掉胰酶，加入新鲜培养基重悬，将所有溶液转移至15ml离心管，1000rpm，离心10min，弃上清，加入冻存液(由10％DMSO和90％FBS混合配置而成)重悬细胞，转移至冻存管中，标记清楚，放置梯度冻存盒，转移至-80℃冰箱中过夜，然后放到液氮长期保存。

2.4.质粒提取

1感受态的制备

(1)挑取E.coli单菌落，接种于LB液体培养基中，37℃恒温，200r/min振荡培养4小时左右。

(2)将1.5ml菌液转移到无菌的1.5ml离心管中，冰浴反应30分钟，使培养物冷却至0℃。

(3)室温，4000r/min离心5分钟，彻底弃上清，回收细胞。

(4)加入0.8ml预冷的0.1mol/L CaCl₂，悬浮细胞，冰上预冷10分钟。

(5)室温，4000r/min离心5分钟，弃上清，回收细胞。

(6)加入0.2ml预冷的0.1mol/LCaCl2，悬浮细胞，等分装于2个1.5ml离心管中，冰上放置，此细胞即是感受态细胞，即可使用。

2质粒转化

(1)将公司合成的质粒12000rpm，离心10分钟后，加入50ul无菌水，充分溶解，备用。

(2)将自制的感受态细胞分装，每管各50ul，备用。

(3)每50ul感受态细胞加1μl质粒，轻轻混匀，在冰上放置30分钟。

(4)反应完成后迅速将感受态细胞转移至42℃水浴锅中，恰恰放置90秒。

(5)反应完成后迅速将感受态细胞转移至冰浴中，使细胞冷却2分钟。

(6)每管中加入800ul LB培养基，放置于37℃，200rpm摇床震荡培养1小时。(7)8000rpm，室温离心1分钟，除去上清，加入100ul LB培养基重悬。

(8)取100ul菌悬液均匀涂在LK/LA平板，倒置培养12-16小时。

3质粒DNA的提取

(1)挑单菌落至10-15ml LK/LA培养基，37℃，300rpm，培养12-16小时。

(2)室温5000g离心10分钟，弃上清。

(3)加500ul Solution I/RNase A，涡旋/移液管上下吹打混匀，彻底悬浮细胞，转移菌液至新的2ml离心管。

(4)加500ul Solution II，轻轻颠倒混匀，孵育2-3分钟。注：避免剧烈震荡，裂解不超过5分钟。Solution II不使用时要密封。

(5)加250ul预冷的N3 buffer，温和颠倒EP管数次至形成絮状白色沉淀。≥

13000g，离心10分钟，立即将上清转移至新的1.5ml EP管中，测量体积。

(6)加1/10体积的ETR Solution，颠倒十次混匀。

(8)冰浴10分钟，冰浴期间要混匀数次，42℃，水浴5分钟。

(9)25℃，12000g，离心3分钟，ETR Solution在管底形成蓝色分层。将上层水相转移至新的1.5ml EP管中，加1/2体积的无水乙醇，轻轻颠倒6-7次，于室温静置1-2分钟。

(10)加100ul 3M NaOH,最大速度离心30-60秒，弃滤液，平衡吸附柱，将吸附柱放入2ml收集管中。

(11)加700ul混合液至吸附柱，最大速度离心1分钟，弃滤液。重复，直至所有混合物全部加入吸附柱。

(12)加500ul HBC buffer，最大速度离心1分钟，弃滤液。

(13)加700ul DNA Wash buffer，最大速度离心1分钟，弃滤液。重复一次。

(14)将空的吸附柱及收集管最大速度离心2分钟。

(15)将吸附柱放至新的1.5ml离心管中。

(16)加80-100ul Elution buffer至吸附膜，室温静置1分钟，最大速度离心1分钟。即可直接进行下游实验或者-20℃储存。

2.5 lncRNA147410.3质粒的转染

按照0.5×10⁵个细胞/ml的密度将细胞均匀的铺在12孔板中，放于37℃,5％CO₂的培养箱中培养24小时左右，待细胞密度长到60％～80％时，方可以转染。将mimics/inhibitor与4ul的转染试剂直接混合，用移液枪充分混匀后，室温放置10min，即完成转染混合物(核酸-纳米混合物)的制备，确保制备核酸-纳米复合物时管壁无液体残留，随后，将制备好的转染混合物加入细胞培养基中，并轻柔混匀，放入培养箱中继续培养，转染24小时后，对细胞进行换液，48小时进行提取细胞RNA。

2.6组织/细胞RNA提取

组织：将感染弓形虫慢性PRU虫株的小鼠于饲养45天后，取其完整的脑组织进行研磨，取20-30mg组织加入600ul的裂解液R LT Plus后吹打裂解混匀。细胞：加600ul裂解液RLT Plus，吹打混匀进行充分混匀裂解。13000rpm，离心2分钟，取上清加到DNA清除柱上。13000rpm，离心1分钟，用移液器量取滤过液体积，然后加入等体积的70％乙醇，用移液器抽吸混匀。转移至吸附柱RA中12000rpm，离心30秒，丢弃过滤液保留吸附柱RA。加入700ulRW1，室温静置1分钟，12000rpm，离心30秒，弃过滤液。加500ul RW，室温12000rpm，离心30秒，弃过滤液。重复一次。将吸附柱RA置于新收集管中，13000rpm，离心2分钟(保证吸附柱中没有残留洗脱液，保证RNA洗脱质量)。将吸附柱RA，放入一个RNase-free离心管中，在吸附膜的中间部位加50ulRNase-free water，室温放置2分钟，12000rpm离心1分钟。提取的RNA可直接用于后续试验，也可以于-80℃长期保存。

2.7 RNA逆转录

严格按照南京诺唯赞生物技术公司反转录试剂盒miRNA 1^st Strand cDNASynthesis Kit(by stem-loop)进行逆转录。全部操作在RNase-free离心管中进行。基因组DNA的去除；RNase-free ddH2O to 10ul，5×gDNA Wiper Mix 2ul，Total RNA 10pg-1ug，用移液器轻轻吹打混匀，42℃2min。第一链cDNA的合成：RNase-free ddH2O to 20ul，上一步混合液10ul，Stem-loop primer(2uM)1ul，10×RT Mix 2ul，HiScriptll Enzyme Mix2ul，用移液器轻柔混匀，反应条件25℃5min，50℃15min，85℃5min。反应完成产物可直接用于RT-PCR反应，或者保存于-20℃。

2.8荧光定量Real-Time PCR(qPCR)

实验均在无RNA酶的PCR管中进行。实验流程：2x ChamQ SYBR Color qPCR MasterMix 10.0ul，Primer 1(10uM)0.4ul，Primer 2(10uM)0.4ul，Template DNA/cDNA 1ul，ddH2O 8.2ul。混合均匀，短暂离心，每个实验组设三次重复。反应体系：预变性：95℃30s，循环反应(40个循环)：95℃10s，60℃30s，融解曲线：95℃15s，60℃60s，95℃15s。严格按照Bio-Rad荧光定量PCR仪(美国Bio-Rad公司)操作规程进行仪器使用。

2.9 CCK-8实验

在96孔板中接种100ul的BV-2细胞悬液，将96孔板放在37℃，5％CO2的培养箱中培养，待细胞长至70-80％进行shRNA干扰和过表达miR-132的表达，观察lnc147410.3对BV-2细胞增殖的影响。培养48小时后，弃掉原来培养基，每孔加入10ul CCK-8溶液和100ul新鲜DMEM细胞培养基，将96孔板在培养箱内孵育1-4小时后，用酶标仪测定450nm处的吸光值。

2.10流式周期

(1)在6孔板中接种BV-2细胞悬液，37℃，5％CO2的培养条件下培养。待细胞长至70-80％时进行shRNA干扰及过表达转染，培养细胞48小时。

(2)收集细胞，加入适量胰酶消化细胞，将细胞悬液转入离心管中，1500rpm离心5分钟。

(3)加入适量的预冷PBS重悬细胞，1500rpm离心10分钟，弃上清。沉淀震荡混匀。

(4)用适量的预冷75％乙醇重悬细胞，混匀后放入4℃冰箱孵育过夜。

(5)重复步骤三。

(6)加入2μl的RNaseA(1mg/ml)，37℃水浴40分钟，去除RNA。

(7)加入100μl的PI染色液(100ug/ml)，避光反应20分钟。

(8)激发波长488nm，发射波长585±21nm进行检测，用Modfit软件进行分析。

2.11 lncRNA147410.3在细胞上定位

1.按照1×10⁴细胞/孔的密度将贴壁细胞接种于48孔板(孔内提前放入已处理好的且大小合适的盖玻片)中(建议事先铺在CONFOCAL专用培养皿中)，混匀后于37℃ 5％CO₂培养箱中培养过夜。

2.吸弃孔板中的培养基，PBS洗两次，每次5min。

3.吸弃PBS，每孔加入100μl 4％多聚甲醛，室温固定15min。

4.吸弃4％多聚甲醛，每孔加入100μl 0.1％Buffer A(现用现配)室温处理细胞15min。

5.吸弃0.1％Buffer A，PBS洗两次，每次5min。

6.吸弃PBS，每孔加入100μl 2×Buffer C，37℃培养箱放置30min。

7.吸弃2×Buffer C，每孔加入100μl 70％乙醇，室温放置3min。

8.吸弃70％乙醇，每孔加入100μl 85％乙醇，室温放置3min。

9.吸弃85％乙醇，每孔加入100μl无水乙醇，室温放置3min。

10.吸弃无水乙醇，室温干燥。

11.Buffer E提前在37℃水浴锅孵育2h。

12.探针稀释：

可参看探针标签或报告单上所示参数：nmole/OD260，例如：nmole/OD260＝4.17，则在每OD探针干粉制品中加入41.7μl灭菌DEPC水，混匀后即得浓度约为100μM的储存液。

13.配制探针混合液：

例：70μl Buffer E，2μl探针，28μl DEPC水，终体积为100μl；(可先做预实验确定所需的探针浓度，即探针5μl～0.6μl，70μl Buffer E，加DEPC水补足至100μl。)

14.探针混合液73℃变性5min，每孔加入上述探针混合液100μl，37℃培养箱杂交孵育过夜12～16h。

15.杂交次日，将样本从37℃培养箱取出，吸弃探针混合液，每孔加入100μl 0.1％Buffer F洗涤5min。

16.吸弃0.1％Buffer F，每孔加入100μl的2×Buffer C洗涤5min。

17.吸弃2×Buffer C，每孔加入100μl的1×Buffer C洗涤5min，吸弃洗涤液。

18.吸弃1×Buffer C，每孔加入100μl稀释后的DAPI工作液，避光染色20min，吸弃，加入100μl PBS，尽快于荧光显微镜下观察。

2.12 lncRNA147410.3在组织上定位

1.脱蜡：

1)石蜡切片在60℃烤箱中预热30min；

2)将切片浸入二甲苯I,II中各放置10min(建议在染缸中进行)；

3)在梯度酒精中(100％、95％、90％、80％、70％)室温孵育各10min(建议在染缸中进行)；

4)PBS洗切片两次，每次2min(建议在染缸中进行)

2.蛋白酶处理：

1)蛋白酶K稀释溶液预热至37℃；2)每张切片滴加蛋白酶K稀释溶液100μl，37℃孵育20min；3)每张切片滴加2×Buffer C溶液100μl在室温下洗切片3次，每次1min；4)梯度酒精70％、80％、90％、100％脱水，每次2min，空气中干燥(建议在染缸中进行)。

3.变性：

1)78℃预热变性液；

2)每张切片滴加预热变性液100μl，78℃孵育8min；3)梯度酒精70％、80％、90％、100％脱水，每次2min，空气中干燥(建议在染缸中进行)。

4.杂交：

1)探针稀释：

可参看探针标签或报告单上所示参数：nmole/OD260，例如：nmole/OD260＝4.17，则在每OD探针干粉制品中加入41.7μl灭菌DEPC水，混匀后即得浓度约为100μM的储存液。

2)配制探针混合液：

例：70μl Buffer E，2μl探针，28μl DEPC水，终体积为100μl，(可先做预实验确定所需的探针浓度，即探针5μl～0.6μl，70μl Buffer E，加DEPC水补足至100μl。)配制好的探针混合液73℃变性5min；3)准备湿盒，用免疫组化笔沿组织周围划圈，水平放置切片；

4)滴加100μl探针混合液在切片组织上；5)盖上湿盒盖，37℃孵育12～16h。

5.杂交后水洗：

1)43℃预热杂交后水洗溶液；

2)吸弃杂交溶液，每张切片滴加预热的杂交后水洗溶液100μl洗切片15min；

3)每张切片滴加2×Buffer C(预热至37℃)100μl洗2次，每次10min；4)PBS洗切片1次，10min(建议在染缸中进行)。

6.细胞核染色：

1)每张切片加100μl稀释后的DAPI工作液，在室温下避光孵育20min；

2)吸弃DAPI工作液，PBS洗切片2次，每次2min(建议在染缸中进行)；

3)滴加甘油或抗淬灭剂，盖上盖玻片，于激光共聚焦显微镜下观察。

2.8数据分析

根据qPCR扩增曲线得到Ct值，以snRNA U6和GAPDH做内参，采用2^-ΔΔCt算法计算microRNA相对于内参的表达比率。-ΔΔCt＝(实验组Ct-内参Ct)-(对照组Ct-内参Ct)，实验数据均采用T检验和方差分析方法，并用GraphPad 7.0软件进行统计分析，数据p＜0.05表示具有统计学意义。

实验结果

1.lncRNA147410.3组织QPCR验证，靶基因为Hoxb3

如图1所示，感染了弓形虫PRU虫株45天的小鼠脑组织中的lncRNA147410.3表达量显著高于正常小鼠脑细胞(对照组)的表达量。同时也证实了lncRNA147410.3和其靶基因Hoxb3呈正调控关系。

2lncRNA147410.3在组织上的定位

在基因芯片的基础上，通过cis/trans预测出lncRNA147410.3的直接靶基因是Hoxb3，运用RT-qPCR技术对感染弓形虫慢性虫株PRU的小鼠脑组织进行定量分析，如图2所示，在感染的小鼠脑组织中，lncRNA147410.3的表达上调，Hoxb3的表达和lncRNA147410.3的表达呈现显著正反馈调节，和芯片结果表达一致。

3细胞水平验证

通过构建shRNA过表达和干扰体系，在Bv-2细胞中进行转染过表达和干扰质粒，实现对lncRNA147410.3的稳定过表达以及敲降，转染48小时后，提取细胞总RNA以及反转录进行RT-qPCR对LncRNA147410.3和Hoxb3的表达进行定量分析，如图3所示，在Bv-2细胞中转染过表达lncRNA147410.3质粒后，lncRNA147410.3和Hoxb3的表达同时上调，同时，在转染干扰lncRNA147410.3的实验组中，lncRNA147410.3和Hoxb3表达显然同时下调，因此证明，靶基因Hoxb3的表达和lncRNA147410.3的表达呈正相关。

4 cck-8实验证明增殖

通过CCK-8实验证实lncRNA147410.3对BV-2细胞增殖的影响，通过分别转染lncRNA147410.3过表达/干扰质粒、，转染12、24、36、48、60、72小时后测定450nm处的吸光值。如图4所示，与正常组相比，在干扰掉lncRNA147410.3以后，细胞增殖变得缓慢，而过表达lncRNA147410.3以后，细胞增殖明显变快。因此，初步判断，lncRNA147410.3能够影响BV-2细胞的增殖。

5细胞周期

通过流式细胞术检测分别转染干扰和过表达lncRNA147410.3质粒后，对Bv-2细胞周期的影响。如图5所示：在干扰对照组，细胞G1、S、G2期分别是47.44％、38.34％、14.22％，在干扰组，细胞G1、S、G2期分别是60.52％、33.47％、6.02％，在过表达对照组中，细胞G1、S、G2期分别是60.30％、33.47％、6.23％。在过表达组，细胞G1、S、G2期分别是59.97％、34.99％、5.05％，在干扰掉lncRNA147410.3以后，G0-G1，G2-M期的表达显著低于干扰对照组，而过表达lncRNA147410.3后和过表达的对照组相比，G0-G1，S，G2-M，都无明显差异，因此在干扰了lncRNA147410.3后，出现了细胞周期G1-G0，G2-M停滞，可能导致了细胞的增殖。

6 lnc147410.3TUNEL结果图

为了证明lncRNA147410.3对Bv-2细胞的凋亡机制的影响，进行了TUNEL细胞凋亡检测实验，如图6所示，过表达lncRNA147410.3后，和对照组相比，细胞凋亡显著增加，而干扰组并无显著影响，因此，lncRNA147410.3过表达后，促进了Bv-2细胞的凋亡，表明了lncRNA147410.3在神经胶质Bv-2细胞凋亡机制中参与了重要的调节作用。

应注意的是，以上实例仅用于说明本发明的技术方案而非对其进行限制。尽管参照所给出的实例对本发明进行了详细说明，但是本领域的普通技术人员可根据需要对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 山东大学

<120> lncRNA147410.3在弓形虫脑病中的应用

<130>

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1945

<212> DNA

<213> lncRNA147410.3

<400> 1

agttgcttct cctgcgctcc aagtcgcccg gcccagcgcc attttgagca tcgttcctat 60

ttcccgcgct ctctgccgct cgccgtgcta cttctgtgag ccaaaagcct cttgccacgc 120

ccgggcctcc cttcttccct acaaaattcc taagccccat tctagtcctc aaggacctgg 180

agccccaagg cagcatcggg cgcacagcgc aggcctcggc ctaagcttgc agactcaaag 240

cccgcaggct agcaaaccca aggatttctc cttcaactct tttaaccctc tgcgcagcct 300

ccaaggctca aagctggcct ctgagacatt ttcttgtacc cgcttctgca cccccccccc 360

cagaacgctg tttttccacc caccccacat ttatttccaa gcagggaccc agggaacatc 420

ttagcaggac tggaaacggt ctgtttgcag atgaaccaag cttccataaa ctcttcctgg 480

tgtcttggac aaagaaatag tcaccaagca gggccccttt tgtaccaccc ggactttgtc 540

agcctgggag atgggaccat gccttccctt gggtcgcttg agccagagct aaaccaactt 600

caagcggaga gtgggaaagc aaagactggc cgtagggact tggcaaaaag agctagatcc 660

caacacaaac actcgttttc atattataaa gacatttatt tacgctatga aaataatgta 720

caataaatac tttccccctt tcctattatt aaacaatttt aataaataat ctacaatcta 780

aaacttaaaa aagaggaaaa taggtccctc tagttctttg taagaaaacc ctctcccact 840

agagtttaat tattcctgag atttcgttgg aaggagtttt accaagtgga attttttgtg 900

tgtggtttta aaaagcgaaa aggagtgaat gaaacgctaa ttcgttacta tctggatttt 960

aacaaaacgg cataaatgta tccacgagtg gagaaggccc gattcccccc gcccccaaca 1020

gccaaggagg accagacgga aaggaccaaa gatggaaaac agttagggaa actgcaagtc 1080

gatggcacag agcgtgctgg tgaagaagtc cagctcttcc tcggaaaagg gcacggggct 1140

atcgagagaa ccctgcaggc tgggtgaaag gcctccggac atctggagac aggagtctgc 1200

agcgaagaaa ttgaggtccg gtagaaaagg cgaatcctgc cgctcggggc aggcgtcttc 1260

gggtaggggc tcgctctgcc ggcctccggc tctgagcatt gtgcagccgg ggctcgatgc 1320

gcccacactc tccagggtgg tggcaggcag cgctgacggc ggtgcgcccc ggggtccctg 1380

cgcggcctcg gcggggtgga agcaggcttc ccgcagccgg tgagtcgcga cgtcgcccgg 1440

gctgaccgtg ggttcctcgg ctggctctcc cgcgtcgtcc tgggcgctcg gcccgcctgg 1500

ttctccctcg ggcggctctc gatgctgcgt ctgccgcttg tgtttcatgc gtcggttctg 1560

gaaccagact ttgacctgcc tttcggtgag gtccagcaag gcagcgatct cgacgcgacg 1620

cggccggcac agacccaatg atggttgggc ttcgggtcac gtgacagcct cattgtagct 1680

ccggaagaga acgtgaagtt taggttgcct ggaagaagca gtaataagct agactgaaag 1740

ggagaacaaa aaaaatcaag attttgggga aattacccac agagatgcaa gggaaaaaga 1800

aaaaggaaaa ggaaaaactg tgcatctgct ggaatctctt ttctactgag atgggggaaa 1860

ttatccagga tgagaaagac tcacaaaaca atttgaacac tattcttctc tggattcaaa 1920

ggggaggctg tttactgagg ttccc 1945

Claims (5)

1.检测弓形虫病分子标志物lncRNA147410.3表达水平的物质在制备检测、诊断或预测弓形虫脑病进展的产品中的应用；

所述lncRNA147410.3的核苷酸序列为SEQ ID NO.1。

2.如权利要求1所述应用，其特征在于，所述物质包括基于高通量测序方法和/或基于RT-PCR方法和/或基于定量PCR方法和/或基于探针杂交方法检测lncRNA147410.3表达水平的物质。

3.如权利要求1所述应用，其特征在于，所述产品包括试剂盒。

4.促进lncRNA147410.3表达和/或活性提高的物质在制备具有如下任一用途产品中的应用：

1）促进小胶质细胞的增殖；

2）促进小胶质细胞的凋亡；

所述lncRNA147410.3的核苷酸序列为SEQ ID NO.1。

5.如权利要求4所述的应用，其特征在于：所述小胶质细胞为BV-2。

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