CN108103200B - 一种与胃癌相关的生物标志物及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种与胃癌相关的生物标志物及其应用，所述生物标志物为LINC01235，本发明公开了检测LINC01235水平的试剂、试剂盒、芯片及其在制备诊断胃癌的产品中的应用，本发明同时公开了含有LINC01235抑制剂的组合物及其在制备治疗胃癌的药物中的应用。

Description

一种与胃癌相关的生物标志物及其应用
技术领域
本发明属于生物医药领域，涉及一种与胃癌相关的生物标志物及其应用，具体地所述lncRNA为LINC01235。
背景技术
胃癌(gastric cancer GC)是危害人类生命健康的消化系统恶性肿瘤之一，死亡率高居肿瘤相关死亡第三位(Jemal A,Bray F,Center MM，Ferlay J,Ward E,FormanD.Global cancer statistics.CA Cancer J Clin,2011,61(2):69-90)。胃癌高发于东亚、西亚及拉丁美洲等地区，仅中国、韩国和日本的胃癌发病数就占全球总数的一半。在中国胃癌的发病率和死亡率均居消化系统肿瘤前列，占所有恶性肿瘤死亡总数23.24％(ParkinDM,Bray F,Ferlay J,Pisani P.Global cancer statistics,2002.CA Cancer J Clin,2005,55(2):74-108)。目前，胃癌的诊断一般在临床症状的基础上，结合体征及内窥镜检查、X线钡餐检查、B型超声检查、CT检查、磁共振成像MRI检查以及脱落细胞学检查进行诊断，但这些方法在早期诊断上都有一定的缺陷(Madhavan D,Cuk K,Burwinkel B,YangR.Cancer diagnosis and prognosis decoded by blood-based circulating microRNAsignatures.Front Genet,2013,4:116)。由于缺乏特异、敏感的胃癌早期筛查指标，大部分患者就诊时已处于中晚期，治疗效果不佳且预后较差，给临床诊疗带来极大的困难。因此，加强对胃癌病因学及发病机制的研究，对胃癌的预防和早期诊治具有重要的意义。
随着分子遗传机制研究的深入，人们发现表观遗传学在胃癌的发生发展中同样起着重要的作用。表观遗传学机制主要包括：组蛋白修饰、染色质重塑、DNA甲基化和非编码RNA(non-coding RNAs,ncRNAs)。基因组测序发现蛋白编码基因仅占总转录基因的2％，大多数基因被转录为非编码RNA。非编码RNA根据转录本长度不同又分为两类，一类是长度小于200个核苷酸的短链非编码RNA，包括微小RNA(miRNAs)、小干扰RNA(siRNAs)和Piwi相关RNA(piRNAs)。另一类长度超过200核苷酸称为长链非编码RNA(long non-coding RNA，1ncRNA)，其最初被视为“转录噪声”，不具备生物学功能，但越来越多的证据表明lncRNA可以在转录水平、转录后水平以及表观遗传学层面调控基因的表达，从而参与人体的多种生理和病理过程，包括癌症转移、侵袭、细胞分化及凋亡等。随着对lncRNA的研究增多，越来越多的lncRNA在多种肿瘤中被发现，然而目前在胃癌中lncRNA的研究仍处于起步阶段，在胃癌发生发展中作用机制尚不明确，有待进一步研究。
发明内容
为了弥补现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种与胃癌发生发展相关的lncRNA，从而为胃癌的诊断和治疗提供分子靶标，实现患者的个性化诊疗。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明的第一方面提供了一种试剂，所述试剂能够检测LINC01235基因的水平。
进一步，所述试剂选自：
特异性识别LINC01235的探针；或
特异性扩增LINC01235的引物。
进一步，所述的特异性扩增LINC01235基因的引物序列如SEQ ID NO.1～2所示。
本发明的第二发面提供了一种试剂盒，所述试剂盒包括本发明第一方面所述的试剂，所述试剂能够检测LINC01235基因的水平。
本发明的第三方面提供了一种芯片，所述芯片包括本发明第一方面所述的试剂，所述试剂能够检测能够检测LINC01235基因的水平。
本发明的第四方面提供了一种组合物，所述组合物包括LINC01235的抑制剂。所述抑制剂选自：以LINC01235或其转录本为靶序列、且能够抑制LINC01235基因表达或基因转录的干扰分子，包括：shRNA(小发夹RNA)、小干扰RNA(siRNA)、dsRNA、微小RNA、反义核酸，或能表达或形成所述shRNA、小干扰RNA、dsRNA、微小RNA、反义核酸的构建物。
进一步，所述抑制剂为siRNA，优选的，siRNA的序列如SEQ ID NO.7～8所示。
进一步，所述组合物还包括与所述抑制剂配伍的其他药类以及药学上可接受的载体和/或辅料。
本发明的药物还可与其他治疗胃癌的药物联用，其他治疗性化合物可以与主要的活性成分同时给药，甚至在同一组合物中同时给药。
本发明的第五方面提供了一种筛选治疗胃癌的候选物质的方法，所述方法包括：
用待筛选物质处理表达或含有LINC01235基因的体系；和
检测所述体系中LINC01235基因的表达；
其中，若所述待筛选物质可抑制LINC01235基因的水平，则表明该筛选物质是治疗胃癌的候选物质。
本发明的第六方面提供了如下任一项所述的应用：
a.本发明第一方面所述的试剂在制备诊断胃癌的产品中的应用；
b.本发明第二方面所述的试剂盒在制备诊断胃癌的产品中的应用；
c.本发明第三方面所述的芯片在制备诊断胃癌的产品中的应用；
d.本发明第四方面所述的组合物在制备治疗胃癌的产品中的应用；
e.本发明第四方面所述的组合物在制备治疗胃癌侵袭的产品中的应用；
f.本发明第四方面所述的组合物在制备治疗胃癌转移的产品中的应用；
g.本发明第五方面所述的方法在筛选治疗胃癌的潜在物质中的应用。
附图说明
图1是利用QPCR检测LINC01235基因在胃癌组织中的表达情况图；
图2是利用QPCR检测LINC01235基因在胃癌细胞系中的表达情况图；
图3是利用QPCR检测LINC01235在胃癌细胞中的转染情况图；
图4是MTS法检测LINC01235基因对胃癌细胞增殖的影响图；
图5是利用Transwell小室检测LINC01235对胃癌细胞迁移和侵袭的影响图；其中
图A是LINC01235对胃癌细胞迁移的影响图；图B是LINC01235对胃癌细胞侵袭的影响图。
具体的实施方式
本发明经过广泛而深入的研究，通过高通量方法，采用目前覆盖数据库最广的lncRNA芯片，检测胃癌标本中lncRNA在肿瘤组织和癌旁组织的表达，发现其中具有明显表达差异的lncRNA，探讨其与胃癌的发生发展之间的关系，从而为胃癌的诊断及靶向治疗寻找更好的途径和方法。通过筛选，本发明首次发现了胃癌中LINC01235显著性上调，实验证明，通过降低LINC01235的表达水平，能够有效地抑制胃癌细胞的增殖和侵袭。
LINC01235基因
LINC01235是位于人9号染色短臂2区3带上，在本发明的实施例中，一种代表性的人LINC01235基因的核苷酸序列如目前国际公共核酸数据库GeneBank中LINC01235基因(NR_033863.1)所示。本发明的LINC01235核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。本发明中的LINC01235包括野生型、突变型或其片段。
本发明可以利用本领域内已知的任何方法测定基因表达。本领域技术人员应当理解，测定基因表达的手段不是本发明的重要方面。可以在转录水平上检测生物标志物的表达水平。
检测技术
本发明的lncRNA使用本领域普通技术人员已知的多种核酸技术进行检测，这些技术包括但不限于：核酸测序、核酸杂交和核酸扩增技术。
核酸测序技术的示例性非限制性实例包括但不限于链终止子(Sanger)测序和染料终止子测序。本领域的普通技术人员将认识到，由于RNA在细胞中不太稳定并且在实验中更易受到核酸酶攻击，因此在测序前通常将RNA逆转录成DNA。
本发明可在检测前或与检测同时地对核酸(例如，ncRNA)进行扩增。核酸扩增技术的示例性非限制性实例包括但不限于：聚合酶链式反应(PCR)、逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)、转录介导的扩增(TMA)、连接酶链式反应(LCR)、链置换扩增(SDA)和基于核酸序列的扩增(NASBA)。本领域的普通技术人员将认识到，某些扩增技术(例如，PCR)需要在扩增前将RNA逆转录成DNA(例如，RT-PCR)，而其他扩增技术则直接扩增RNA(例如，TMA和NASBA)。
通常称为PCR的聚合酶链式反应使用变性、引物对与相反链的退火以及引物延伸的多个循环，以指数方式增加靶核酸序列的拷贝数；TMA的转录介导的扩增(在基本上恒定的温度、离子强度和pH的条件下自身催化地合成靶核酸序列的多个拷贝，其中靶序列的多个RNA拷贝自身催化地生成另外的拷贝；LCR的连接酶链式反应使用与靶核酸的相邻区域杂交的两组互补DNA寡核苷酸；其他扩增方法包括例如：通常称为NASBA的基于核酸序列的扩增；使用RNA复制酶(通常称为Qβ复制酶)扩增探针分子本身的扩增；基于转录的扩增方法；以及自我维持的序列扩增。
本发明中非扩增或扩增的核酸可通过任何常规的手段检测。
芯片、试剂盒
本发明提供了检测中LINC01235基因的表达水平的产品，所述产品包括(但不限于)芯片或试剂盒。其中芯片包括：固相载体；以及有序固定在所述固相载体上的寡核苷酸探针，所述的寡核苷酸探针特异性地对应于LINC01235所示的部分或全部序列。
所述固相载体包括无机载体和有机载体，所述无机载体包括但不限于有硅载体、玻璃载体、陶瓷载体等；所述有机载体包括聚丙烯薄膜、尼龙膜等。
术语“探针”指能与另一分子的特定序列或亚序列或其它部分结合的分子。除非另有指出，术语“探针”通常指能通过互补碱基配对与另一多核苷酸(往往称为“靶多核苷酸”)结合的多核苷酸探针。根据杂交条件的严格性，探针能和与该探针缺乏完全序列互补性的靶多核苷酸结合。探针可作直接或间接的标记，其范围包括引物。杂交方式，包括，但不限于：溶液相、固相、混合相或原位杂交测定法。
本发明中的示例性探针包括PCR引物以及基因特异性DNA寡核苷酸探针，例如固定于微阵列基底上的微阵列探针、定量核酸酶保护检验探针、与分子条形码连接的探针、以及固定于珠上的探针。
这些探针具有与靶点基因的特定的碱基序列互补的碱基序列。这里，所谓“互补”，只要是杂交即可，可以不是完全互补。这些多核苷酸通常相对于该特定的碱基序列具有80％以上、优选90％以上、更优选95％以上、特别优选100％的同源性。这些探针可以是DNA，也可以是RNA，另外，可以为在其一部分或全部中核苷酸通过PNA、LNA、ENA、GNA、TNA等人工核酸置换得到的多核苷酸。
本发明提供了一种试剂盒，所述试剂盒可用于检测LINC01235的表达。优选的，所述的制剂或试剂盒中还含有用于标记RNA样品的标记物，以及与所述标记物相对应的底物。此外，所述的试剂盒中还可包括用于提取RNA、PCR、杂交、显色等所需的各种试剂，包括但不限于：抽提液、扩增液、杂交液、酶、对照液、显色液、洗液等。此外，所述的试剂盒中还包括使用说明书和/或芯片图像分析软件。
抑制剂和药物组合物
基于本发明的发现，本发明提供了一种药物组合物，所述药物组合物包含LINC01235的抑制剂。
所述的LINC01235的抑制剂是指任何可降低LINC01235基因水平的物质，这些物质均可用于本发明，作为对于下调LINC01235基因的表达有用的物质，从而可用于治疗胃癌。举例来说，本发明的抑制剂可以是以LINC01235基因为靶序列、且能够抑制LINC01235基因的干扰分子，包括：shRNA(小发夹RNA)、小干扰RNA(siRNA)、dsRNA、微小RNA、反义核酸，或能表达或形成所述shRNA、小干扰RNA、dsRNA、微小RNA、反义核酸的构建物。
作为本发明的一种优选方式，所述LINC01235的抑制剂是一种LINC01235特异性的小干扰RNA分子。如本文所用，所述的“小干扰RNA”是指一种短片段双链RNA分子，能够以同源互补序列的mRNA为靶目标降解特定的mRNA，这个过程就是RNA干扰(RNA interference)过程。小干扰RNA可以制备成双链核酸的形式，它含有一个正义链和一个反义链，这两条链仅在杂交的条件下形成双链。一个双链RNA复合物可以由相互分离的正义链和反义链来制备。因此，举例来讲，互补的正义链和反义链是化学合成的，其后可通过退火杂交，产生合成的双链RNA复合物。
在筛选有效的siRNA序列时，本发明人通过大量的比对分析，从而找出最佳的有效片段。本发明人设计合成了多种siRNA序列，并将它们分别通过转染试剂转染胃癌细胞系进行验证，选出干扰效果最佳的siRNA，进一步地在细胞水平实验，结果证明对于该siRNA在能有效的抑制细胞中LINC01235基因的表达水平，以及胃癌细胞的增殖。
本领域的技术人员熟知的方法能用于构建本发明所需的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如卡拉霉素、庆大霉素、潮霉素、氨苄青霉素抗性。
在本发明中，是本领域已知的各种载体，如市售的载体、包括质粒、粘粒、噬菌体、病毒等。表达载体向宿主细胞中的导入可以使用电穿孔法、磷酸钙法、脂质体法、DEAE葡聚糖法、显微注射、病毒感染、脂质体转染、与细胞膜透过性肽的结合等周知的方法。
术语“宿主细胞”包括原核细胞和真核细胞。常用的原核宿主细胞的例子包括大肠杆菌、枯草杆菌等。常用的真核宿主细胞包括酵母细胞、昆虫细胞和哺乳动物细胞。较佳地，该宿主细胞是真核细胞，如CHO细胞、COS细胞等。
药物组合物
本发明中的药物组合物包括LINC01235的抑制剂、和/或与所述抑制剂配伍的其他药类以及药学上可接受的载体和/或辅料。
药学上可接受的载体可以是一种也可以是多种，所述载体包括但不限于粘合剂、增甜剂、崩解剂、稀释剂、调味剂、包衣剂、防腐剂、润滑剂和/或延时剂(timedelayagent)。合适的粘合剂包括阿拉伯胶、明胶、玉米淀粉、黄耆树胶、海藻酸钠、羧甲基纤维素或聚乙二醇。合适的增甜剂包括蔗糖、乳糖、葡萄糖、阿斯巴特或糖精。合适的崩解剂包括玉米淀粉、甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、瓜尔胶、黄原胶、膨润土、藻酸或琼脂。合适的稀释剂包括乳糖、山梨醇、甘露醇、右旋糖、高岭土、纤维素、碳酸钙、硅酸钙或磷酸二钙。合适的调味剂包括薄荷油、冬青油、樱桃、柑橘或树莓调味剂。合适的包衣剂包括丙烯酸和/或甲基丙烯酸和/或它们的酯类的聚合物或共聚物、蜡、脂肪醇、玉米蛋白、虫胶或麸质。合适的防腐剂包括苯甲酸钠、维生素E、α-生育酚、抗坏血酸、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯或亚硫酸氢钠。合适的润滑剂包括硬脂酸镁、硬脂酸、油酸钠、氯化钠或滑石。合适的延时剂包括单硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯。本发明中的药物组合物还可以包括稳定剂、杀菌剂、缓冲剂、等渗剂、螯合剂、pH控制剂及表面活性剂等添加剂。
如本文所用，所述“有效量”是指其用量足以治疗疾病，以适用于任何医学治疗的合理的利益/风险比率。组合物的有效剂量水平可以根据受试者的类型、疾病的严重程度、受试者的年龄和性别、药物活性、对药物的敏感性、给药时间，给药途径、排泄率、治疗时间、与组合物联用的药物和医疗领域中其他已知因素来确定。本发明的药物组合物可单独使用或与其它治疗剂组合施用，并且可以与常规的治疗剂依次或同时给药。可采用一种或多种剂型中施用组合物。考虑所有上述因素，在能够表现出最大效果而不引起副作用的最小量下施用组合物至关重要，该最小量可由本领域技术人员容易地确定。
术语“有效的”表示治疗引起受试者体内病理性上调的基因表达下降，病理性下调的基因表达上升或胃癌的大小、流行性(prevalence)或转移潜力降低。当预防性采取所关注的治疗时，术语“有效的”指治疗能够延迟或防止乳房肿瘤的形成，或者能延迟、防止或减轻胃癌的临床症状。乳房肿瘤的评价可以按标准的临床方案进行。
本发明的药物组合物还可与其他治疗胃癌的药物联用，其他治疗性化合物可以与主要的活性成分同时给药，甚至在同一组合物中同时给药。
本发明的药物组合物还可以以单独的组合物或与主要的活性成分不同的剂量形式单独给予其它治疗性化合物。主要成分的部分剂量可以与其它治疗性化合物同时给药，而其它剂量可以单独给药。在治疗过程中，可以根据症状的严重程度、复发的频率和治疗方案的生理应答，调整本发明药物组合物的剂量。
药物筛选
本发明提供了一种筛选治疗胃癌药物的方法，即：
在实验组中，向培养体系中加入待测化合物，并测定LINC01235的表达水平；在对照组中，向同样的培养体系中不加入待测化合物，并测定LINC01235的表达水平；其中，如果实验组中LINC01235的表达水平小于对照组，则说明该待筛选的物质为LINC01235的潜在物质。
在本发明中，所述的方法还包括：对上面步骤获得的潜在物质进一步测试其抑制胃癌的效果，若测试化合物对胃癌有显著的抑制效果，则说明该化合物为治疗胃癌的潜在物质。
所述培养体系包括(但不限于)细胞体系、亚细胞体系、溶液体系、组织体系、器官体系或动物体系(如动物模型，优选非人哺乳动物的动物模型，如鼠、兔、羊、猴等)等。
当将通过本发明的筛选方法分离的化合物作为药物施用于人或其它哺乳动物，其包括但不限于小鼠、大鼠、豚鼠、兔、猫、犬、羊、猪、牛、猴子、狒狒、黑猩猩时，分离的化合物可以直接施用，或者可以利用已知的药物制备方法配制成各种剂型。例如，根据需要，所述药物可以作为糖衣片剂、胶囊剂、酏剂和微胶囊口服施用；或者用水或任何其它药物可接受的液体配制成无菌溶液或悬浮液，以注射剂的形式非口服施用。例如，可以将化合物以一般接受的药物施用方式所需的单位剂型(unit dose)、与药学可接受的载体或介质混合在一起，所述载体或介质包括但不限于无菌水、生理盐水、植物油、乳化剂、悬浮剂、表面活性剂、稳定剂、调味剂、赋形剂(excipient)、媒介物(vehicle)、防腐剂、粘合剂等。根据这些制剂中有效成分的含量，可以获得在指定范围内的合适的给药量。
统计学分析
在本发明的具体实施例中，实验都是按照至少重复3次来完成的，结果数据都是以平均值±标准差的方式来表示，采用SPSS18.0统计软件来进行统计分析的，两者之间的差异采用t检验，认为当P<0.05时具有统计学意义。
下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1 筛选与胃癌相关的基因标志物
1、样品收集
分别收集8例胃癌癌旁组织和胃癌组织样本，以正常的胃组织3例，全部病例在手术前均未接收化疗和放疗，所有的患者均已知情同意，并取得均通过组织伦理委员会的同意。
2、RNA样品的制备
利用QIAGEN的组织RNA提取试剂盒进行组织RNA的提取，按说明书的具体步骤进行操作。
3、总RNA定量与纯度分析
使用Bio-Red紫外分光光度计测定总RNA在280nm和260nm处的光密度值，当OD260/OD280的值在1.8～2.0时认为总RNA的纯度是可靠的，用于下一步的实验。
4、lncRNA表达芯片分析
利用Arraystar公司的Arraystar Human 1ncRNA Array检测胃癌组织和癌旁组织中lncRNA表达谱的差异。
5、数据分析
利用Agilent GeneSpring软件对芯片结果进行分析，筛选表达量具有显著性差异(标准为该lncRNA在癌与癌旁的表达量相差2倍以上，而且p<0.05)的lncRNA。
6、结果
结果显示，LINC01235在胃癌患者中呈现差异性表达，与癌旁组织以及正常胃组织相比，其在癌组织中的表达水平显著上调
实施例2 QPCR测序验证LINC01235基因的差异表达
1、对LINC01235基因差异表达进行大样本QPCR验证。按照实施例1中的样本收集方式选择胃癌癌旁组织和胃癌组织各50例以及正常组织10例。
2、RNA提取
利用QIAGEN的组织RNA提取试剂盒提取RNA样品，具体操作详见说明书。
3、QPCR
1)反应体系：
RNA模板1μl，随机引物1μl，双蒸水加至12μl，混匀，低转速离心，65℃5min，然后放在冰上冷却。
继续在12μl反应液中加入下列成分：
5×反应缓冲液4μl，RNA酶抑制剂(20U/μl)1μl，10mM dNTP混合液2μl，AMV反转录酶(200U/μl)1μl；充分混匀并进行离心处理；
2)逆转录反应条件
25℃5min，42℃60min，70℃5min。
3)聚合酶链反应
引物设计：
根据Genebank中LINC01235基因和GAPDH基因的编码序列设计QPCR扩增引物，由博迈德生物公司合成。具体引物序列如下：
LINC01235基因：
正向引物为5’-AATCAAGCACTAATCTCA-3’(SEQ ID NO.1)；
反向引物为5’-TAGACTGTAAGACCATTG-3’(SEQ ID NO.2)。
GAPDH基因：
正向引物为5’-AATCCCATCACCATCTTCCAG-3’(SEQ ID NO.3)；
反向引物为5’-GAGCCCCAGCCTTCTCCAT-3’(SEQ ID NO.4)。
配制PCR反应体系：
2×qPCR混合液12.5μl，基因引物2.0μl，反转录产物2.5μl，ddH2O 8.0μl。
PCR反应条件：95℃10min，(95℃15s，60℃60s)×40个循环，60℃5min延伸反应。75℃至95℃，每20s升温1℃，绘制溶解曲线。以SYBR Green作为荧光标记物，在Light Cycler荧光定量PCR仪上进行PCR反应，通过融解曲线分析和电泳确定目的条带，ΔΔCT法进行相对定量。
4、ROC曲线分析
使用R语言中的pROC包分析LINC01235的受试者工作特征，计算二项精确置信空间，绘制ROC曲线。
5、统计学方法
实验都是按照重复3次来完成的，结果数据都是以平均值±标准差的方式来表示，采用SPSS18.0统计软件来进行统计分析的，癌与癌旁组织的配对比较采用t检验，认为当P<0.05时具有统计学意义。
6、结果
QPCR结果如图1所示，与胃癌癌旁组织相比，LINC01235在胃癌组织中表达下调，差异具有统计学意义(P<0.05)；ROC分析结果显示，LINC01235的ROC曲线下面积(AUC)值高达0.91575，提示LINC01235可应用于胃癌的特异性诊断，LINC01235应用于胃癌的诊断具有较高的准确性。
实施例3 LINC01235在胃癌细胞系中的表达情况
1、细胞培养
人永生化胃粘膜上皮细胞系GES-1、人胃癌细胞系HGC-27、MGC-803、AGS(均购自广州莱德尔生物科技有限公司)在含10％胎牛血清和1％P/S的RPMI1640培养基于37℃、5％CO2、相对湿度为90％的培养箱中培养。2-3天换液1次，使用0.25％含EDTA的胰蛋白酶常规消化传代，取处于对数生长期的细胞用于实验。
2、RNA的提取与浓度测定
使用QIAGEN的细胞RNA提取试剂盒提取细胞总RNA，具体操作参照说明书。
3、QPCR具体步骤同实施例2
4、统计学分析
实验都是按照重复3次来完成的，结果数据都是以平均值±标准差的方式来表示，采用SPSS18.0统计软件来进行统计分析的，癌与癌旁组织的配对比较采用t检验，认为当P<0.05时具有统计学意义。
5、结果
结果如图2所示，与胃粘膜上皮细胞相比，LINC01235基因在胃癌细胞HGC-27、MGC-803、AGS中表达均上调，差异具有统计学意义(P<0.05)，其中在HGC-27细胞中的差异最为显著，因此选择HGC-27细胞进行后续的实验，研究LINC01235对胃癌细胞的作用。
实施例4 LINC01235基因的沉默
1、细胞培养步骤同实施例3
2、siRNA的设计
针对LINC01235基因的序列设计siRNA，设计的siRNA序列如下所示：
阴性对照siRNA序列(siRNA-NC)：
正义链：5’-UUCUCCGAACGUGUCACGU-3’(SEQ ID NO.5)，
反义链：5’-ACGUGACACGUUCGGAGAA-3’(SEQ ID NO.6)；
siRNA1：
正义链：5’-ACCAUUUCUCUUUUCUCUCAA-3’(SEQ ID NO.7)，
反义链：5’-GAGAGAAAAGAGAAAUGGUGA-3’(SEQ ID NO.8)；
siRNA2：
正义链：5’-AAAUAUUCGGGUUUCUCUCCC-3’(SEQ ID NO.9)，
反义链：5’-GAGAGAAACCCGAAUAUUUGG-3’(SEQ ID NO.10)；
siRNA3：
正义链为5’-UGACUUUGUAUUAUCACAGUU-3’(SEQ ID NO.11)，
反义链为5’-CUGUGAUAAUACAAAGUCAGU-3’(SEQ ID NO.12)
siRNA4：
正义链为5’-UUUCCUUUGUUAGUCUUACAG-3’(SEQ ID NO.13)，
反义链为5’-GUAAGACUAACAAAGGAAAAU-3’(SEQ ID NO.14)
3、转染
将HGC-27细胞按2×105/孔接种到六孔细胞培养板中，在37℃、5％CO2培养箱中细胞培养24h；在无双抗、含10％FBS的DMEM培养基中，转染按照脂质体转染试剂3000(购自于Invitrogen公司)的说明书转染。
实验分为空白对照组(HGC-27)、阴性对照组(siRNA-NC)和实验组(siRNA1、siRNA2、siRNA3、siRNA4)，其中阴性对照组siRNA与LINC01235基因的序列无同源性，浓度为20nM/孔，同时分别进行转染。
4、QPCR检测LINC01235基因的转录水平
4.1细胞总RNA的提取
使用QIAGEN细胞RNA提取试剂盒提取细胞中的总RNA，具体步骤详见说明书。
4.2逆转录步骤同实施例2。
4.3 QPCR扩增步骤同实施例2。
5、统计学方法
实验都是按照重复3次来完成的，结果数据都是以平均值±标准差的方式来表示，采用SPSS18.0统计软件进行统计分析。
6、结果
结果如图3显示，与HGC-27和转染空载siRNA-NC组相比，实验组(siRNA1～4)能降低LINC01235的水平，其中siRNA1的效果最为显著，因此选择siRNA1进行后续实验。
实施例5 LINC01235基因对胃癌细胞增殖的影响
采用MTS实验检测LINC01235基因对胃癌细胞增殖能力影响。
1、细胞培养与转染步骤同实施例4。
2、各组处理的细胞经胰酶消化后重悬细胞、计数，调整细胞浓度为l×105/ml按100μl/孔的密度接种于96孔板，即每孔细胞数为1×104个。
3、待细胞到达相应的检测时间点(0d、24h、48h、72h、96h)后，按10μL/孔加入CelITiter96AQ单溶液细胞增殖检测(MTS)试剂，微量振荡器振荡1～2min；置于5％CO2、37℃的细胞培养箱中孵育4h。
4、酶标仪读板，在490nm波长测定其吸光度(A)值。
5、统计学分析
实验都是按照重复3次来完成的，采用SPSS18.0统计软件来进行统计分析，两者之间的差异采用t检验，认为当P<0.05时具有统计学意义。
6、结果
结果如图4所示，与对照相比，实验组(siRNA1)的细胞生长速度明显低于对照组的细胞的生长速度，差异具有统计学意义(P<0.05)，上述结果表明LINC01235的过表达促进胃癌细胞的增殖，提示LINC01235可作为分子靶点应用于胃癌的治疗。
实施例6细胞迁移及侵袭实验
1、Transwell小室制备
无菌条件下Matrigel冰浴融化，用PBS进行20倍稀释，以50μl/孔的体积铺在Transwell小室的聚碳酸酯膜上。37℃放置4h，待Matrigel胶聚合成凝胶后取出，轻轻吸出上层析出液。每孔中加入50μl的含BSA的无血清培养液对基底膜进行水化处理，37℃放置30min。
2、配置细胞悬液
细胞饥饿处理12-24h，胰酶消化离心，使用无血清培养基进行重悬，调整细胞密度为5×l05个/ml。
3、细胞接种
取细胞悬液200μl加入到Transwell小室中，在24孔板下室加入500μl含FBS的DMEM培养基。把细胞放入细胞培养箱中培养24h。
4、染色
细胞在培养结束后使用DAPI染色。把小室细胞先用PBS漂洗2遍，放入DAPI工作液中室温染色5-20min。用PBS漂洗2遍，放入荧光显微镜下观察并计数。
5、结果
结果如图5所示，与对照组相比，实验组的迁移及侵袭能力均有明显下降，结果说明LINC01235水平的降低能够抑制胃癌的迁移及侵袭，提示LINC01235可作为靶标应用于胃癌转移的治疗。
上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。
序列表
<110> 北京泱深生物信息技术有限公司
<120> 一种与胃癌相关的生物标志物及其应用
<160> 14
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
aatcaagcac taatctca 18
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tagactgtaa gaccattg 18
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
aatcccatca ccatcttcca g 21
<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gagccccagc cttctccat 19
<210> 5
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
uucuccgaac gugucacgu 19
<210> 6
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
acgugacacg uucggagaa 19
<210> 7
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
accauuucuc uuuucucuca a 21
<210> 8
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
gagagaaaag agaaauggug a 21
<210> 9
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
aaauauucgg guuucucucc c 21
<210> 10
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
gagagaaacc cgaauauuug g 21
<210> 11
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
ugacuuugua uuaucacagu u 21
<210> 12
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
cugugauaau acaaagucag u 21
<210> 13
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
uuuccuuugu uagucuuaca g 21
<210> 14
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
guaagacuaa caaaggaaaa u 21

Claims (6)

1.一种筛选治疗胃癌的候选物质的方法，其特征在于，所述方法包括：
用待筛选物质处理含有LINC01235基因的培养体系；和
检测所述培养体系中LINC01235基因的表达；
其中，若所述待筛选的物质可以抑制LINC01235基因的表达水平，则表明该待筛选物质是治疗胃癌的候选物质。
2.如下任一项所述的应用：
a.检测LINC01235基因的水平的试剂在制备诊断胃癌的产品中的应用；
b.试剂盒在制备诊断胃癌的产品中的应用，其特征在于，所述试剂盒包括检测LINC01235基因的水平的试剂；
c.芯片在制备诊断胃癌的产品中的应用，其特征在于，所述芯片包括检测LINC01235基因的水平的试剂；
d.组合物在制备治疗胃癌的药物中的应用，其特征在于，所述组合物包括LINC01235的抑制剂；
e.组合物在制备治疗胃癌侵袭的药物中的应用，其特征在于，所述组合物包括LINC01235的抑制剂；
f.组合物在制备治疗胃癌转移的药物中的应用，其特征在于，所述组合物包括LINC01235的抑制剂；
g.权利要求1所述的方法在筛选治疗胃癌的潜在物质中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，a、b或c中所述的试剂包括：
特异性识别LINC01235的探针；或
特异性扩增LINC01235的引物。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，特异性扩增LINC01235的引物序列如SEQID NO.1~2所示。
5.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，d、e或f中所述的抑制剂为siRNA。
6.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，d、e或f中所述组合物还包括药学上可接受的载体。
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Non-Patent Citations (1)

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yael haberman et al..Long ncRNA landscape in the ileum of treatment-naïve early-onset crohn disease.《inflamn bowel dis》.2018, *

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