CN102918157A - siRNA及其在治疗和/或预防眼病的方法和组合物中的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于治疗/和或预防与香草素-1受体(TRPV)的高的表达水平和/或活性相关的眼病的方法和组合物。

Description

siRNA及其在治疗和/或预防眼病的方法和组合物中的用途
发明领域
本发明涉及提供siRNA产品及其在利用RNA干扰用于治疗和/或预防与瞬时受体电位香草素(TRPV1)的高的表达水平和或活性相关的眼病的方法和组合物中的用途。其中，与眼痛关联的眼病如屈光手术后角膜的不适和改变的敏感性，接触镜片的使用，干眼综合征和舍格伦综合征(Sjogren′ssyndrome)将得到减轻。
发明背景
RNA干扰(RNAi)是天然存在的大多数真核细胞的调控机制，其使用小双链RNA (dsRNA)分子以指引依赖于同源性的基因沉默。Fire和Mello在蠕虫线虫(C.elegans)中的该发现{Fire，1998}获得了2006年的诺贝尔奖。在对其首次描述后不久，RNAi也显示发生在哺乳动物细胞中，不是通过长的dsRNA而是通过21个核苷酸长的双链小干扰RNA(siRNA){Elbashir，2001}。
据信RNA干扰的过程是在进化上保守的细胞防御机制，用于防止外源基因的表达，并且为不同门(phyla)和区系(flora)所共享，其中它被称为转录后基因沉默。自从发现RNAi机制，已经进行了大量研究，用于发现能够选择性地改变基因表达的新的化合物，其通过处理属于利用涉及小分子或蛋白质的常规药物方法“不能用药”的靶标而作为治疗人类疾病的新途径。
根据现有知识，RNAi的机制始于被称为切酶(Dicer)的RNA酶III样蛋白质处理长的双链RNA之时。蛋白质切酶通常包含N端RNA解旋酶结构域，RNA结合所谓Piwi/Argonaute/Zwille(PAZ)结构域，两个RNA酶III结构域和双链RNA结合结构域(dsRBD){Collins，2005}，并且它的活性导致长的双链RNA被处理为21-24个核苷酸的双链siRNA，该双链siRNA具有2个碱基的3′突出端和5′磷酸和3′羟基。所得的siRNA双链体然后结合到被称为RNA诱导的沉默复合物(RISC)的效应物复合物中，其中在双链siRNA分子通过RNA解旋酶活性的依赖三磷酸腺苷(ATP)的解旋{Nykanen，2001}之后，siRNA的反义或指导链指导RISC识别并切割目标mRNA序列{Elbashir，2001}。导致mRNA降解的RISC的催化活性由核酸内切酶Argonaute 2(AGO2)介导{Liu，2004；Song，2004}。AGO2属于高度保守的Argonaute蛋白质家族。Argonaute蛋白质是～100KDa的高度碱性的蛋白质，其包含两个共同的结构域，即PIWI和PAZ结构域{Cerutti，2000}。PIWI结构域对于与切酶的相互作用是关键的并且包含负责切割mRNA的核酸酶活性{Song，2004}。AGO2使用siRNA双链体中的一条链作为指导去找到含互补序列的信使RNA并在相对于指导链的5′端的第10和第11个碱基之间切割磷酸二酯骨架{Elbashir，2001}。RISC活化期间的重要步骤是由AGO2切割正义或信使链，将此链从复合物中去除{Rand，2005}。分析siRNA指导链和PIWI结构域之间相互作用的晶体学研究表明仅第2至第8个核苷酸构成指导RISC识别目标mRNA的“种子序列(seed sequence)”，并且此序列中单个核苷酸的错匹配可以显著影响所述分子的沉默能力{Ma，2005；Doench 2004；Lewis，2003}。一旦mRNA已经被切割，并且由于片段中不受保护的RNA端的出现，mRNA被细胞内的核酸酶进一步切割和降解并且将不会被翻译为蛋白质{Orban，2005}，同时RISC将进行随后若干轮的再循环{Hutvagner，2002}。这构成了导致特定mRNA分子及相应的蛋白质的选择性减少的催化过程。可能利用基因沉默的这种天然机制从而通过直接将siRNA效应物递送到细胞或组织中来调控任何所选基因，在所述细胞或组织中siRNA效应物将活化RISC并且产生目标mRNA的有效和特异的沉默。
已经发表了许多研究，其描述了为获得最大有效性siRNA应当具有的理想特征，有关长度、结构、化学组成和序列。siRNA设计的初始参数由Tuschl及同事在WO02/44321中阐述，虽然从此之后已经发表了许多后续研究、算法和/或改进。
同样，已经进行了很多努力以加强siRNA稳定性，考虑到RNA酶在生物流体中的普遍性质，这被认为是基于siRNA的治疗的主要障碍之一。用于增强稳定性的后继的主要策略之一是使用修饰的核苷酸如2′-O-甲基核苷酸，2′-氨基核苷酸，含2′-O或4′-C亚甲基桥的核苷酸。同样，已经描述了修饰连接邻近的核苷酸的核糖核苷酸骨架，主要通过引入硫代磷酸盐修饰的核苷酸。似乎增强的稳定性通常与效力成反比(Parish，2000)，并且仅一定数目、位置和/或组合的经修饰的核苷酸可以产生稳定的沉默化合物。因为这是基于siRNA的治疗中重要的障碍，所以已经发表了不同研究，所述研究描述了特定修饰模式显示良好的结果，其实例包括EP1527176，WO2008/050329，WO2008/104978或WO2009/044392，虽然文献中可以找到更多的多。
瞬时受体电位香草素-1(TRPV1)，也被称为香草素受体1(VR-1)，是辣椒素响应性配 体门控的阳离子通道，其首先发现于1997年(Caterina，1997)。TRPV1主要被表达在感觉神经元上并且充当热、辣椒素、质子和内香草素的分子检测器(Caterina，2001；Montell，2002；Baumann，2000)。虽然本申请的发明人也已发现在来自泪腺和睫状体的组织中的TRPV1表达。
当TRPV1由激动剂如辣椒素和其他因子如热、酸中毒、脂加氧酶产物或花生四烯酸乙醇酰胺活化时，钙进入细胞并且启动疼痛信号。通道的活化诱使神经肽从中枢和外周感觉神经末端释放，导致痛觉，神经性炎症，并且有时，导致平滑肌收缩和咳嗽。实际上，目前的证据暗示了TRPV1在疼痛、咳嗽、哮喘和尿失禁中的作用(Jia，2005)。实际上，TRPV1是在对痛刺激的反应中通过镇痛进行治疗的已知靶标。此外，使用不同技术来降低TRPV1表达水平的治疗已经描述于聚焦于疼痛治疗的WO2004/042046或(Schubert，2005)中。
多觉伤害性感受器(polymodal nociceptors)是在角膜中发现的最大量的伤害性感受器类型。存在药理学证据表明这些受体纤维由于它们响应辣椒素、热和酸而表达TRPV1受体。此外，高剂量的辣椒素使角膜多觉伤害性感受器对热和酸的响应失活而机械响应性不受影响。这暗示存在于角膜多觉神经末梢中的TRPV1受体被选择性失活。因此，可能的是，响应于角膜损伤和伴随炎症的持续痛觉以及该组织中的刺激性过程的急性伤害性感受器的重要部分由TRPV1活化介导。
此外，WO2007/045930描述了使用TRPV1特异性siRNA用于治疗与眼痛(ocular pain)和干眼综合征(dry eye syndrome)相关的眼病。然而，本发明提供改进的产品用于降低TRPV1表达及随之发生的眼睛不适。与常规化学抑制剂相比，使用siRNA产品治疗这些病症的优势在于基于siRNA的治疗将具有更长的持续效果。该结果是由于：一旦效应器分子不再存在，细胞将不得不从无到有地合成新的受体；而常规治疗将使细胞膜上的受体水平保持不变。
由于目前的生活方式，受到与改变的眼睛敏感性相关的眼病影响的人群的数目相当高，并且其随人群的老化而增加。屈光手术和接触镜片的使用通常导致改变的角膜敏感性和患者的干眼感觉。这由于工作时长时间注视电脑屏幕以及使用通常进一步使空气干燥的空调系统而进一步恶化。同样，眼泪的数量和质量随年龄而降低。伴随干眼综合征的症状包括眼组织的痒、灼烧和刺激。干眼更严重的形式发生于患有舍格伦综合征的患者中。在本文的含义内，这些感觉中的一种或不同的组合的出现被称为眼痛。目前，估计干眼综合征影响超过1千万美国人。
附图描述
图1是这样的图，其显示使用Qrt-PCR，在利用靶向TRPV1的不同siRNA转染HeLa细胞后，TRPV1的时间表达特征：根据本发明的化合物(SEQ ID NO：2)，之前描述的靶向不同区域的化合物(SEQ ID NO：7)，以及设计成靶向TRPV1的另外四种siRNA(SEQ ID NO：17至20)和用作阴性对照的乱序序列(scramble sequence)。显示相同结果的两种备选表示法以保证清晰。
图2是这样的图，其显示使用Qrt-PCR，在利用本发明的不同的siRNA转染HeLa细胞后，TRPV1的时间表达特征：SEQ ID NO：2至SEQ ID NO：6，和SEQ ID NO：8至SEQ ID NO：16，以及用作阴性对照的乱序序列。
图3显示与抗辣椒碱(capsazepine)(一种被接受的用于TRPV1依赖性疼痛的特异性镇痛药)进行比较的、用辣椒素刺激后来自用本发明的化合物(SEQ ID NO：2)处理的兔子的眼睛的以mm测量的眼睑开口(palpebralopening)的时间线。
图4是这样的图，其显示在用辣椒素诱发疼痛后，由于用本发明的化合物(SEQ ID NO：2)和抗辣椒碱处理而产生的眼睑开口相对于测试前值的比(％)。
图5是这样的图，其显示在暴露于10％血浆达24小时后剩余的保持完整的产品的量(％)。
发明详述
在第一方面，本发明涉及提供siRNA分子，其中所述分子特异性地靶向SEQ ID NO：1并且当引入到细胞中时减少TRPV1基因的表达。
当例如siRNA分子选择性地降低或抑制基因的表达时，该基因被根据本发明的siRNA所“靶向”。短语″选择性地降低或抑制″当用于本文时包括影响一种基因(在此情况中是TRPV1)的表达的siRNA。备选地，当siRNA在严格条件下与该基因的转录物(即，其mRNA)杂交时，siRNA靶向所述基因。能够″在严格条件″下杂交是指：在标准条件下，例如不利于杂交的高温和/或低盐含量，向目标mRNA区域退火。合适的方案(包括0.1x SSC，68℃，2小时)描述于Maniatis，T.等，Molecular Cloning：A Laboratory Manual(分子克隆：实验室手册)，Cold Spring Harbor Laboratory(冷泉港实验室)，1982，387-389页。
除非另外说明，本文列举的核酸序列书写为5′至3′方向。术语″核酸″是指DNA或RNA或其修饰形式，其包括存在于DNA中的嘌呤或嘧啶碱基(腺嘌呤″A″，胞嘧啶″C″，鸟嘌呤″G″，胸腺嘧啶″T″)或RNA中的嘌呤或嘧啶碱基(腺嘌呤″A″，胞嘧啶″C″，鸟嘌呤″G″，尿嘧啶″U″)。本文提供的干扰RNA可以包含″T″碱基，例如在3′端，即使″T″碱基并不天然存在于RNA中。在一些情况中，这些碱基显示作″dT″以区别核糖核酸链中存在的脱氧核糖核苷酸。
以上限定的靶序列在用于定义数据库中用于设计siRNA的转录物变体时，描述为靶DNA序列，而所用的具体化合物将是被如此定义的RNA序列。
对应于TRPV1的不同转录物变体已经被鉴定。对应于通过备选剪接产生的四个TRPV1转录物的GenBank登录号是：NM 080704(NM 080704.3，Gl：117306161)，NM 018727(NM 018727.5，Gl：117306160)，NM_080706(NM_080706.3，Gl：117306163)和NM_080705(NM_080705.3，Gl：117306162)。此外，ENSEMBL(MBL-EBI/Wellcome TrustSanger Institute)有另外5个公开的TRPV1转录物：ENST00000174621，ENST00000310522，ENST00000344161，ENST00000399752，ENST00000399756，ENST00000399759，ENST00000425167。
本发明提供抑制TRPV1基因表达的siRNA，与已经在现有技术中公开的那些相比，这些siRNA尤其有效。尤其有效是指它们及时获得更高程度的抑制和/或更加延长的效果。
这些新的siRNA被设计为针对前面段落所述的TRPV1的所有转录物变体所共有的靶序列，并且因此介导出现在编码TRPV1蛋白质的细胞中的所有可能的mRNA的RISC介导的降解。本发明鉴定的所述优选的目标区域在SEQ ID NO：1(5′-AAGCGCATCTTCTACTTCA-3′)中被确定。
因此，根据本发明的siRNA将优选包括双链RNA分子，所述分子的反义链将包含与SEQ ID NO：1基本互补的RNA序列，并且其正义链将包括与所述反义链互补的RNA序列，其中两条链通过核苷酸之间的标准碱基配对杂交。
在本发明的含义中，与目标mRNA序列″基本互补″，也被理解为与所述靶序列″基本相同″。″同一性″，如本领域技术人员所已知的，是核苷酸序列之间序列关联性的程度，如通过在序列之间匹配核苷酸的次序和同一性所确定的。在一个实施方案中，与目标mRNA序列具有80％，以及80％多至100％互补性，例如，85％、90％或95％互补性的siRNA的反义链被认为是基本互补的并且可以用于本发明。互补性的百分比描述能够在Watson-Crick意义上与第二核酸分子中的一组连续核苷酸碱基配对的第一核酸分子中的连续核苷酸的百分比。
如由现有技术已知的，已经提出许多不同结构用于实现RNA干扰。通常这些双链分子的长度为约19至约25个核苷酸，并且包括平末端结构以及具有突出端的那些。突出端已经被描述为是有优势的并且当其减少RNA酶的识别并模仿切酶的天然底物时，可以存在于任一条链的5′端或3′端上。一些作者推荐在分子的两个3′端包括突出端，而另一些则认为一个突出端就足够了。其他已经描述了使用具有特定修饰模式的平末端结构(EP 1527176，WO 2008/104978及其他很多)。
突出端可以由1至5个核苷酸组成，通常突出端由双核苷酸形成。用于本领域中的典型分子包括19个核苷酸的双链分子，所述19个核苷酸的双链分子还包括优选包含脱氧核苷酸的3′双核苷酸突出端，如在Tuschl的最初研究(WO02/44321)中所教导的。据说这些突出端还可以增强对核酸酶(RNase)降解的抗性。之后，Kim等2005描述了21体产物(含双核苷酸突出端)对于在RISC上加载是必需的。此外，Bramsen等2009描述了将可能的去稳定化修饰引入到突出端进一步增加沉默效力。
同样，本发明的优选实施方案涉及靶向包含至少一个突出端的SEQ IDNO：1的siRNA分子。
本发明的另一个备选实施方案提供平末端分子。
此外，本发明的优选实施方案涉及靶向SEQ ID NO：1的包含19个核苷酸的双链结构或由其组成的siRNA。惊人地，与之前所述的具有21个核苷酸和3′突出端的产品相比，所述19个核苷酸的双链RNA被证明更耐受降解，如可见于图5中的。
本发明的特殊实施方案涉及靶向SEQ ID NO：1的19个核苷酸的双链平末端siRNA。在特殊的实施方案中，该化合物被确定为SEQ ID NO：2(5′-AAGCGCAUCUUCUACUUCA-3′)。在进一步优选的实施方案中，该siRNA的反义链与SEQ ID NO：1至少80％，优选至少90％互补。
此外，如在技术背景部分所述，由于RNA酶的普遍性，siRNA分子的重要问题是它们在生物流体中的不稳定性。因此，已经描述了对核苷酸使用许多不同的化学修饰用于增强化合物的稳定性的目的。
siRNA分子的另一个固有问题是其免疫原性，由此发现siRNA诱导先天免疫系统的非特异性活化，包括上调某些细胞因子，例如I型和/或II型干扰素以及IL-12、IL-6和/或TNFα生产。这些作用的源头被认为是siRNA活化Toll样受体如TLR7、TLR8和/或TLR3。
这两种作用，RNA酶识别和免疫原性，也已经被描述为是依赖于序列的。
一些通过减小对RNA酶的敏感度来增加化合物稳定性的化学修饰也能够减小随后响应的免疫识别的诱发。然而在siRNA中插入化学修饰的核苷酸也可以导致减小的沉默效力，如在之前的部分所述的，并且因此必须小心地处理。
因而，在本发明的优选实施方案中，siRNA还包含至少一个具有化学修饰的核苷酸。
增强稳定性并减小免疫原性作用的优选的化学修饰包括2′-O-甲基核苷酸，2′-氟核苷酸2′-氨基核苷酸，2′-脱氧核苷酸，含2′-O或4′-C亚甲基桥的核苷酸。同样，通过引入硫代磷酸盐修饰的核苷酸的连接邻近核苷酸的核糖核苷酸骨架的修饰。本发明含义内进一步优选的化学修饰涉及用脱氧胸腺嘧啶(脱氧核糖核苷酸)置换尿嘧啶(uracyl)核糖核苷酸。在本发明另一个优选的实施方案中，至少一个经化学修饰的核苷酸是在siRNA的正义链上，在反义链上或在两条链上。
因此，在一个实施方案中，siRNA选自SEQ ID.NO.3、4、5、6、8、9、10、11、12、13、14、15或16。
可以使用本领域中已知方法将如上所述的siRNA分子以其天然结构递送到细胞内部。例如，当在体外研究基因沉默时，使用标准转染试剂施用这些化合物。为在体内实现作用，这些化合物也可以裸露施用或者使用递送增强剂如例如结合特殊部分的脂质体等，尽管许多不同备选方案在本领域中是已知的，并且可以取决于体内所需的靶点而不同地使用。
备选地，在细胞内本发明的siRNA分子可以从真核启动子表达。能够表达siRNA分子的重组载体可以被递送并保持在靶细胞中。备选地，可以使用提供核酸分子的瞬时表达的载体。如果需要，这样的载体可以重复施用。一旦表达，siRNA分子与目标mRNA相互作用并产生RNA干扰反应。以此方式产生的siRNA分子通常被称为shRNA(短发卡RNA)，因为它们的正义和反义链通过核苷酸的小环连接。siRNA分子表达载体的递送可以是全身的，如通过静脉内或肌肉内给药，通过向从受试者外植的靶细胞施用，继之以再次引入到该受试者中，或者通过允许向所需的靶细胞引入的任何其他手段。
本发明的另一个方面涉及靶向SEQ ID NO.1的siRNA在制备用于在治疗眼病的方法中使用的药物中的用途，所述眼病特征为增加的TRPV1的表达和/或活性。所述方法包括在患者中抑制TRPV1的表达。术语抑制用于指表达或活性的减小或下调。优选地，所述眼病是眼痛。在一个实施方案中，眼病选自由以下各项组成的组：眼睛不适和屈光手术后的改变的角膜敏感性，接触镜片的使用，干眼综合征，舍格伦综合征，以及其他眼病。
预期利用针对TRPV1mRNA的siRNA的治疗性治疗相对于小分子眼局部滴剂的有益之处在于增加了观察到效果的时间长度，由此允许较低频率的用药和较好的患者顺从性。这在如干眼综合征和改变的角膜敏感性的情况中尤其重要，因为它们通常是慢性病。
考虑制备这样的药物时，可以配置本发明的siRNA。优选地，所述siRNA的组合物和制剂可以局部给药于目标器官，在甚至更优选的实施方案中，它们可以被配制成用于向眼睛局部给药，优选向眼睛的角膜表面给药。向角膜表面给药可以例如以滴眼液、凝胶、洗剂、膏剂或眼睛放入物(ocular inserts)的形式。其他向眼睛给药的形式可以包括向眼睛中注射。
本发明进一步优选的实施方案涉及如在前面段落中所述的特异性靶向SEQ ID NO：1的siRNA，其用作用于治疗眼病的药物，所述眼病特征为增加的TRPV1的表达和/或活性。如上所述，它可以是包含靶向SEQ IDNO：1的19个核苷酸的双链结构或由其组成的siRNA。该siRNA可以是平末端的。优选地，该siRNA是SEQ ID NO：2。用于根据本发明使用的其他siRNA可以选自SEQ ID.NO.3、4、5、6、8、9、10、11、12、13、14、15或16。
在本发明的语境内，为了″特异性靶向″序列，本发明的siRNA必须包含至少相同的种子序列。因此，特异性靶向SEQ ID No.1的根据本发明的任何序列在反义链的位置2-8必须是相同的。
尽管如此，本发明的siRNA可以用于在除眼睛以外的组织中沉默TRPV1表达。因而，所述siRNA应当被因此配制。
例如，siRNA分子可以包括递送载体，所述递送载体包括脂质体，以向受试者施用。载体和稀释剂及其盐可以存在于药用制剂中。核酸分子可以通过本领域技术人员已知的多种方法施用于细胞，包括但不限于，包裹在脂质体中，通过离子电渗疗法(iontophoresis)，或通过结合到其他载体中，如可生物降解的聚合物，水凝胶，环糊精聚乳酸-乙醇酸共聚物(PLGA)和PLCA微球，可生物降解的纳米胶囊，以及生物可粘附微球，或通过蛋白质载体。在另一个实施方案中，本发明的核酸分子也可以与聚乙烯亚胺及其衍生物如聚乙烯亚胺-聚乙二醇-N-乙酰半乳糖胺(PEI-PEG-GAL)或聚乙烯亚胺-聚乙二醇-三-N-乙酰半乳糖胺(PEI-PEG-triGAL)衍生物一起配制或复合。
本发明的siRNA分子可以与膜破裂剂和/或阳离子脂质或辅助脂质分子一起复合。
可以用于本发明的递送系统包括，例如，水性和非水性凝胶，膏剂，复合型乳剂，微型乳剂，脂质体，软膏，水溶液和非水溶液，洗剂，气溶胶，烃类基质和粉剂，并且可以包含赋形剂如增溶剂，增渗剂(例如，脂肪酸，脂肪酸酯，脂肪醇和氨基酸)，和亲水聚合物(例如，聚卡波非和聚乙烯吡咯烷酮)。在一个实施方案中，药用载体是脂质体或透皮增强剂。
本发明的药物制剂是以适于向细胞或受试者(包括例如人)给药(例如，全身或局部给药)的形式。合适的形式部分取决于用途或进入的途径，例如口服的、经皮的或通过注射。其他因素在本领域中是已知的，并且包括要考虑的事项如毒性和阻止组合物或制剂发挥其作用的形式。
本发明还包括被制备以用于存储或给药的组合物，所述组合物包括在药用载体或稀释剂中的药物有效量的所需化合物。用于治疗性用途的可用载体或稀释剂在药物领域是众所周知的。例如，可以提供防腐剂、稳定剂、染料和调味剂。这些包括苯甲酸钠、山梨酸和对羟基苯甲酸的酯。此外，可以使用抗氧化剂和混悬剂。
药物有效剂量是防止、抑制发生或治疗(在某种程度上减轻症状，优选所有症状)疾病状态所需的剂量。药物有效剂量取决于疾病的类型、所用的组合物、给药途径、被治疗的哺乳动物类型、考虑中的具体哺乳动物的身体特征、同时使用的药物和医药领域技术人员将认识到的其他因素。
本发明及本文所述的制剂或siRNA可以以单位剂量制剂给药，所述单位剂量制剂包含常规的无毒性的药用载体、辅剂和/或赋形剂。制剂可以是以适于口服使用的形式，例如，作为片剂、锭剂(troches)、糖锭(lozenges)、水或油性混悬剂、可分散的粉剂或粒剂、乳剂、硬或软胶囊或糖浆或酏剂。意在用于口服使用的组合物可以根据药物组合物制备领域已知的任何方法制备，并且这样的组合物可以包含一种或多种这样的增甜剂、调味剂、着色剂或防腐剂以提供在制药学上良好和美味的制剂。片剂包含与适于制备片剂的非毒性药用赋形剂混合的活性成分。
这些赋形剂可以是，例如，惰性稀释剂；如碳酸钙、碳酸钠、乳糖、磷酸钙或磷酸钠；成粒剂和崩解剂，例如，玉米淀粉或海藻酸；粘合剂，例如淀粉、明胶或阿拉伯树胶；以及润滑剂，例如硬脂酸镁、硬脂酸或滑石。片剂可以是无包被的或者它们可以通过已知技术包被。在一些情况中，这样的包被可以通过已知技术制备以延迟在胃肠道中的崩解和吸收并且由此在较长的周期内提供持续的作用。例如，可以采用延时材料如单硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯。
用于口服使用的制剂也可以呈现为硬的明胶胶囊，其中活性成分与惰性固体稀释剂混合，所述惰性固体稀释剂例如，碳酸钙、磷酸钙或高岭土；或者呈现为软的明胶胶囊，其中活性成分与水或油介质混合，例如花生油、液体石蜡或橄榄油。
水性混悬液包含与适于制备水性混悬液的赋形剂混合的活性材料。这样的赋形剂是混悬剂，例如羧甲纤维素钠、甲基纤维素、羟丙甲纤维素、海藻酸钠、聚乙烯吡咯烷酮、黄菁胶和阿拉伯胶；分散剂或湿润剂可以是天然存在的磷脂，例如，卵磷脂或氧化烯与脂肪酸的缩合产物，例如聚乙二醇硬脂酸酯，或者氧化乙烯与长链脂肪醇的缩合产物，例如十七乙烯氧基十六烷醇(heptadecaethyleneoxycetanol)，或氧化乙烯与源自脂肪酸和己糖醇如聚乙二醇山梨醇单油酸酯的偏酯的缩合产物，或氧化乙烯与源自脂肪酸和己糖醇酐例如聚乙二醇山梨醇酐单油酸酯的偏酯的缩合产物。水性混悬剂也可以包含一种或多种防腐剂，例如对羟基苯甲酸乙酯或对羟基苯甲酸正丙酯，一种或多种着色剂，一种或多种调味剂，以及一种或多种增甜剂，如蔗糖或糖精。
油性混悬剂可以通过将活性成分混悬于植物油例如花生油、橄榄油、芝麻油、或椰油中，或矿物油如液体石蜡中来配制。油性混悬剂可以包含增稠剂，例如蜂蜡、固体石蜡或十六醇。可以加入增甜剂和调味剂以提供可口的口服制剂。这些组合物可以通过加入抗氧化剂如抗坏血酸来保存。
适于通过加入水来制备水性混悬剂的可分散粉剂和粒剂提供与分散剂或湿润剂、混悬剂和一种或多种防腐剂混合的活性成分。合适的分散剂或湿润剂或混悬剂的示例为以上已经提及的那些。其他赋形剂，例如增甜剂、调味剂和着色剂也可以存在。
本发明的药物组合物也可以是以水包油乳剂的形式。油相可以是植物油或矿物油或这些的混合物。合适的乳化剂可以是天然存在的树胶，例如阿拉伯树胶或黄菁树胶，天然存在的磷脂，例如大豆、卵磷脂，和来源于脂肪酸和己糖醇、酐的酯或偏酯，例如山梨醇酐单油酯，以及所述偏酯与氧化乙烯的缩合产物，例如聚乙二醇山梨醇酐单油酯。乳剂还可以包含增甜剂或调味剂。
糖浆和酏剂可以与增甜剂例如甘油、丙二醇、山梨醇、葡萄糖或蔗糖一起配制。这样的制剂还可以包含缓和剂、防腐剂和调味剂以及着色剂。本发明的以及本文所述的药物组合物或siRNA可以以无菌可注射水性混悬剂或油质混悬剂的形式。
此混悬剂可以根据现有技术使用以上提及的那些合适的分散剂或湿润剂和混悬剂来配制。
无菌可注射制剂也可以是在无毒性的肠胃外可用的稀释剂或溶剂中的无菌可注射溶液或混悬剂，例如作为在1，3-丁二醇中的溶液。在可以采用的可用赋形剂和溶剂中的是水、Ringer溶液和等渗氯化钠溶液。此外，无菌的、固定油类通常作为溶剂或混悬基质而被采用。为此，可以采用任何温和的固定油，包括合成的甘油单酯或甘油二酯。此外，脂肪酸如油酸可用于可注射制剂。
本发明的核酸分子也可以以栓剂的形式给药，例如，对于直肠给药的药物。这些组合物可以通过以下方式制备：将药物与在常温为固态而在直肠温度为液态并将由此在直肠中融化从而释放药物的合适的非刺激性赋形剂混合。这样的材料包括可可油和聚乙二醇。
本发明的核酸分子可以在无菌介质中经肠胃外给药。取决于所用的赋形剂和浓度，药物可以混悬或溶解在赋形剂中。有利的是，辅剂如局麻药、防腐剂和缓冲剂可以溶解在赋形剂中。
同样，本发明进一步优选的实施方案涉及这样的药物组合物，其中所述组合物至少包含靶向SEQ ID NO：1的siRNA，如前面段落已经描述的。
要理解，用于任何特定受试者的具体剂量水平取决于多种因素，包括所用具体化合物的活性、年龄、体重、全面的健康、性别、饮食、给药时间、给药途径以及排泄速率、药物组合以及经受治疗的特定疾病的严重程度。
本发明的核酸分子还可以与其他治疗性化合物组合地施用给受试者以增加总体治疗效果。使用多种化合物以治疗适应证可以增加有益效果同时减少副作用的出现。
本发明进一步描述于以下非限制性实施例中。
实施例
体外分析
为了发现用于沉默TRPV1的siRNA的尤其有效的靶序列(其对基因表达产生重要抑制)，测试了六种不同的siRNA。这些siRNA被描述为SEQ IDNO：2、SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：17至20。
SEQ ID NO：2是根据本发明的靶向SEQ ID NO：1的siRNA，其具有以下序列：
正义：5’-AAGCGCAUCUUCUACUUCA-3’
反义：5’-UGAAGUAGAAGAUGCGCUU-3’
SEQ ID NO：7(5’-UCGCCACGACAUGCUCUUGdTdT-3’)对应于之前描述于WO 2007/045930中的、有效靶向TRPV1并且减小眼睛对辣椒素刺激的反应的典型的siRNA分子(长度为21个核苷酸，包含由脱氧胸腺嘧啶构成的3′突出端)。SEQ ID NO：17至19对应于根据本领域中可用的不同算法，如由Reynolds等2004或Ui-Tei等2004及其他所描述的那些算法，针对TRPV1设计的siRNA。SEQ ID NO：20是由Ambion提供的可商购的siRNA并被设计成针对TRPV1。
SEQ ID NO：17
正义：5’-CGCAUCUUCUACUUCAACU-3′
反义：5′-AGUUGAAGUAGAAGAUGCG-3’
SEQ ID NO：18
正义：5’-GCGCAUCUUCUACUUCAAC-3’
反义：5’-GUUGAAGUAGAAGAUGCGC-3’
SEQ ID NO：19
正义：5’-AAAGCCAUGCUCAACCUGC-3′
反义：5’-GCAGGUUGAGCAUGGCUUU-3’
SEQ ID NO：20
正义：5’-UGAUCGCAGGAGUAUCUUUdTdT-3’
反义：5’-AAAGAUACUCCUGCGAUCAdTdT-3’
使用HeLa(人子宫颈腺癌)细胞培养物作为测试上述siRNA的有效性的模型。HeLa细胞用100nM的不同化合物以及作为转染试剂的Lipofectamine 2000转染。所有的转染都遵照标准的生产商条件进行。在相同转染中，使用不同的乱序siRNA作为对照。在24、48和72小时收集细胞沉淀(pellets)以在蛋白质水平上评估可能的变化，并且通过实时PCR处理。为了定量通过实时Qrt-PCR获得的结果，我们使用比较阈值法(Comparative Threshold Method)。
如结果显示(图1)，针对靶序列SEQ ID NO：1的siRNA在TRPV1基因沉默方面比之前所述的针对相同基因的不同区域的siRNA产品有效得多。此外，该效果在时间上得到维持，如在转染后72小时对mRNA水平仍然有显著的下调。所述效果的这样的持续时间是不可预知的并且是序列特异的。
为了提供进一步改善的产品，根据以下描述，将不同的化学修饰引入到以上产品上：
SEQ ID NO：3，
正义：5’-AAGCGCAUCUUCUACUUCA-3’
反义：5’-UGAAGUAGAAGAUGCGCUU-3’
SEQ ID NO：4，
正义：5′-AAGCGCAUCUUCUACUUCA-3’
反义：5’-UGAAGUAGAAGAUGCGCUU-3’
SEQ ID NO：8，
正义：5’-AAGCGCAUCUUCUACUUCA-3’
反义：5’-UGAAGUAGAAGAUGCGCUU-3’
SEQ ID NO：9，
正义：5′-AAGCGCAUCUUCUACUUCA-3’
反义：5’-UGAAGUAGAAGAUGCGCUU-3’
SEQ ID NO：10，
正义：5’-AAGCGCAUCUUCUACUUCA-3’
反义：5’-UGAAGUAGAAGAUGCGCUU-3’
SEQ ID NO：11，
正义：5’-AAGCGCAUCUUCUACUUCA-3’
反义：5’-UGAAGUAGAAGAUGCGCUU-3’
其中下划线表示含2′-O甲基的碱基。
SEQ ID NO：5，
正义：5’-AAGCGCAdTCdTdTCdTACdTdTCA-3’
反义：5’-UGAAGUAGAAGAUGCGCUU-3’
SEQ ID NO：6，
正义：5’-AAGCGCAdTCdTdTCdTACdTdTCA-3’
反义：5’-dTGAAGdTAGAAGAdTGCGCdTdT-3’
SEQ ID NO：12，
正义：5’-AAGCGCAdTCUdTCdTACdTdTCA-3’
反义：5’-UGAAGUAGAAGAUGCGCUU-3’
SEQ ID NO：13，
E义：5’-AAGCGCAdTCUdTCdTACUdTCA-3’
反义：5’-UGAAGUAGAAGAUGCGCUU-3’
SEQ ID NO：14，
正义：5’-AAGCGCAdTCUUCdTACUdTCA-3’
反义：5’-UGAAGUAGAAGAUGCGCUU-3’
SEQ ID NO：15，
正义：5’-AAGCGCAdTCUUCUACUdTCA-3’
反义：5’-UGAAGUAGAAGAUGCGCUU-3’
SEQ ID NO：16，
正义：5’-AAGCGCAdTCUUCUACUdTCA-3’
反义：5’-UGAAGdTAGAAGAdTGCGCUU-3’
其中一些或全部的尿嘧啶核苷酸已经被置换为脱氧胸腺嘧啶核苷酸。
这些化合物与SEQ ID NO：2(不具有任何修饰的核苷酸的相同的化合物)一起在免疫原性测定中被测试。结果显示：所有这些化合物显著减少外周血单核细胞中免疫反应的诱发。此外，大多数化合物所诱导的反应的最高水平与包括在由测定中作为对照的已经通过人临床实验的siRNA(bevasiranib和Sirna-027)所产生的一样低。
因为改变修饰程度可以改变siRNA的基因沉默能力，所以通过向HeLa细胞中转染来进一步测试这些化合物的RNA干扰能力，并且根据前面段落所述的方法测量作为结果的TRPV1mRNA水平。
如在图2中所示，所有化合物以不同的程度保持有效降低TRPV1mRNA水平的能力。
来源于上述化合物的另外的意想不到的有益效果是它们增强对由RNA酶所致的降解的耐受，如在图5所示。
对于这些实验，将化合物混悬于在PBS中的10％人血浆中，终浓度为2μM，并且在37℃孵育24小时。然后使用HPLC-UV分析样品，并且测定剩余的完整的产品的量。如在图5中所观察到，SEQ ID NO：2的19个核苷酸的双链化合物(不具有任何化学修饰)对降解的耐受几乎是前述的包含3′突出端的SEQ ID NO：21：5′-CAAGAUCGCACAGGAGAGCdTdT-3′(同样描述于WO 2007045930中)的3倍。对于包括如前面段落所述的一些经化学修饰的核苷酸的SEQ ID NO：3，该效果进一步增强。
体内分析
干眼和眼痛的动物模型通常使用兔子，在此情况中是新西兰白兔(NewZealand White rabbits)。为此，本发明的siRNA的进一步的优势在于：在不同的动物序列中，靶序列(SEQ ID NO：1)是TRPV1基因的高度保守的区域。实际上，该序列在人和兔子之间是相同的，使得该动物模型尤其适于研究所述疾病。
以下所述的实验使用本领域技术人员已知的眼痛的标准模型进行(Gonzalez等1993)。简言之，通过使用合适的微量加液器将30μl 1％的辣椒素(已知的TRPV1激动剂)溶液滴注到眼睛来诱发疼痛。出于伦理考虑，要被辣椒素处理的动物之前接受了5mM剂量的抗辣椒碱(已知的辣椒素拮抗剂)，或者40μl含待测化合物的溶液。因此，测量镇痛效果，并与作为参比治疗的抗辣椒碱相比较。
在右眼中，测试项和参比项从第1天至第3天每天滴注一次，并且在第4天一天滴注两次(相隔60分钟)。在第4天，在最后一次滴注后15分钟，通过单次滴注1％的辣椒素在右眼中诱发角膜疼痛。对侧的眼睛在整个研究中用PBS滴注并充当对照。
为测量对疼痛的反应，测量眼睑开口。据信，眼睛闭合以响应于疼痛，并且随着痛觉减退，眼睑开口将增加回到正常水平。在以下时间测量眼睑开口：治疗前(基线)，在疼痛诱发前，并且然后在疼痛诱发后1、5、10、15、20、25、30分钟。
如在图3和4中所示，测试根据本发明的化合物，具体是SEQ ID NO：2的化合物，并且观察到相比于抗辣椒碱诱发更强的镇痛效果(如通过眼睑开口的程度测量的眼睛恢复)。因此，证明该化合物对于眼睛不适是有效的治疗性治疗。
此外，进行另一个体内实验，其中本发明的化合物(SEQ ID NO：2、SEQID NO：4和SEQ ID NO：5)以及之前在WO 2007045930中所述的SEQ IDNO：21被给药于兔眼。在此情况中，兔子(6只动物/治疗组)在连续的3天期间每日接受所述化合物的给药。在第三天，在最后一次滴注后两小时，将动物宰杀。回收这些兔子的眼组织并且使用RT-PCR分析TRPV1特异mRNA的存在。下表显示在特定组织中获得的TRPV1基因沉默的水平，该水平表示作相对于化合物SEQ ID NO：21的所获得的％抑制率。
  SEQ ID NO：2   SEQ ID NO：4   SEQ ID NO：5
  泪腺   3.06   3.15   1.92
  睫状体   6.54   2.48   3.57
如由这些结果清楚所示，当在眼组织中沉默TRPV1基因表达时，本发明的化合物比之前所述的化合物有效得多。
本发明化合物的更高的效力以及更长的持续效果将提供有优势的给药方案，因为给药之间允许更长的时间将显著改善患者的生活质量。
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Figure IDA00002475183500021
Figure IDA00002475183500051
Figure IDA00002475183500061
Figure IDA00002475183500071
Figure IDA00002475183500081
Figure IDA00002475183500091
Figure IDA00002475183500101
Figure IDA00002475183500111

Claims (15)

1.用于治疗眼病的siRNA，所述眼病的特征为增加的TRPV1表达和/或活性，其中所述分子特异性靶向SEQ ID NO：1。
2.根据权利要求1所述的siRNA，其中所述眼病是眼痛。
3.根据权利要求1或2所述的siRNA，其中所述眼病选自屈光手术后改变的敏感性、接触镜片的使用、干眼综合征和舍格伦综合征。
4.根据前述权利要求所述的siRNA，其中所述siRNA包括19个核苷酸的双链结构。
5.根据权利要求4所述的siRNA，其中所述siRNA是平末端的。
6.siRNA分子，其中当被引入到细胞中时，所述分子特异性地靶向SEQ ID NO：1并且降低TRPV1基因的表达，并且其中所述siRNA包括19个核苷酸的平末端双链结构。
7.根据前述权利要求所述的siRNA分子，其中所述siRNA是SEQ IDNO：2。
8.根据前述权利要求所述的siRNA分子，其中至少一个核苷酸包含化学修饰。
9.根据权利要求8所述的siRNA分子，其中核苷酸的所述化学修饰选自：2′-O甲基化和用脱氧胸腺嘧啶核苷酸置换尿嘧啶核糖核苷酸，以及它们的组合。
10.根据权利要求8或9所述的siRNA分子，其中所述化学修饰是在正义链上、反义链上或在两者上。
11.根据权利要求8至10中任一项所述的siRNA分子，其中所述siRNA选自SEQ ID NO：3至SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：8至SEQ ID NO：16。
12.根据任一项前述权利要求所述的siRNA在制备用于治疗眼病的药物中的用途，所述眼病的特征为增加的TRPV1表达和/或活性。
13.根据权利要求12所述的用途，其中所述眼病是眼痛。
14.根据权利要求12或13所述的用途，其中所述眼病选自：屈光手术后改变的敏感性、接触镜片的使用、干眼综合征和舍格伦综合征。
15.药物组合物，其中所述组合物包含至少权利要求6-11中所述的siRNA。
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