KR102543719B1 - 항―ｃｔｌａ４ 항체 및 그의 용도 - Google Patents

항―ｃｔｌａ４ 항체 및 그의 용도 Download PDF

Info

Publication number
KR102543719B1
KR102543719B1 KR1020207008876A KR20207008876A KR102543719B1 KR 102543719 B1 KR102543719 B1 KR 102543719B1 KR 1020207008876 A KR1020207008876 A KR 1020207008876A KR 20207008876 A KR20207008876 A KR 20207008876A KR 102543719 B1 KR102543719 B1 KR 102543719B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
seq
antibody
ser
thr
gly
Prior art date
Application number
KR1020207008876A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20200054220A (ko
Inventor
이 양
야난 구오
샤오동 쳉
연연 첸
징슈 시에
춘얀 동
팡 양
청유안 루
유에레이 쉔
지안 니
Original Assignee
유큐(베이징) 바이오파마 코., 엘티디
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 유큐(베이징) 바이오파마 코., 엘티디 filed Critical 유큐(베이징) 바이오파마 코., 엘티디
Publication of KR20200054220A publication Critical patent/KR20200054220A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR102543719B1 publication Critical patent/KR102543719B1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2818—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against CD28 or CD152
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/33—Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

항-세포독성 T-림프구-관련 단백질 4(CTLA4 또는 CTLA-4) 항체, 그의 항원-결합 단편, 및 용도가 제공된다.

Description

항―ＣＴＬＡ４ 항체 및 그의 용도
본 개시는 세포독성 T-림프구 관련 단백질 4(CTLA4 또는 CTLA-4) 항체 및 그의 용도에 관한 것이다.
암은 현재 가장 높은 인간 사망률을 갖는 질환 중 하나이다. WHO 통계 데이터에 따르면, 2012년에, 전세계 암 발생 건수 및 사망 건수는 각각 1400만 건 및 820만 건에 달했다. 중국에서, 신규 진단 암의 케이스는 307만 건이고, 사망자 수는 220만명이다.
최근 항암 항체의 임상 및 상업적 성공은 항체-기반 치료제에 대한 큰 관심을 가져왔다. 암을 치료하는 다양한 항체-기반 치료제에서 사용하기 위한 항암-항체의 개발에 대한 요구가 존재한다.
요약
본 개시는 항-CTLA4 항체, 그의 항원-결합 단편, 및 그의 용도에 관한 것이다.
일 양태에서, 본 개시는 CTLA4(cytotoxic T-lymphocyte-associated protein 4)에 결합하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편으로서,
CDR(complementarity determining region)1, 2, 및 3을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH)으로서, 상기 VH CDR1 영역은 선택된 VH CDR1 아미노산 서열에 80% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 상기 VH CDR2 영역은 선택된 VH CDR2 아미노산 서열에 80% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하며, 상기 VH CDR3 영역은 선택된 VH CDR3 아미노산 서열에 80% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것인 중쇄 가변 영역(VH); 및
CDR 1, 2, 및 3을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)으로서, 상기 VL CDR1 영역은 선택된 VL CDR1 아미노산 서열에 80% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 상기 VL CDR2 영역은 선택된 VL CDR2 아미노산 서열에 80% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하며, 상기 VL CDR3 영역은 선택된 VL CDR3 아미노산 서열에 80% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것인 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하고,
상기 선택된 VH CDR1, CDR2, 및 CDR3 아미노산 서열 및 상기 선택된 VL CDR1, CDR2, 및 CDR3 아미노산 서열은 하기 중 하나로서:
(1) 상기 선택된 VH CDR1, CDR2, 및 CDR3 아미노산 서열은 각각 서열번호 1, 2, 3이고, 상기 선택된 VL CDR1, CDR2, 및 CDR3 아미노산 서열은 각각 서열번호 4, 5, 6이거나;
(2) 상기 선택된 VH CDR1, CDR2, 및 CDR3 아미노산 서열은 각각 서열번호 7, 8, 9이고, 상기 선택된 VL CDR1, CDR2, 및 CDR3 아미노산 서열은 각각 서열번호 10 11, 12이거나;
(3) 상기 선택된 VH CDR1, CDR2, 및 CDR3 아미노산 서열은 각각 서열번호 45, 46, 47이고, 상기 선택된 VL CDR1, CDR2, 및 CDR3 아미노산 서열은 각각 서열번호 48, 49, 50이거나;
(4) 상기 선택된 VH CDR1, CDR2, 및 CDR3 아미노산 서열은 각각 서열번호 51, 52, 53이고, 상기 선택된 VL CDR1, CDR2, 및 CDR3 아미노산 서열은 각각 서열번호 54, 55, 56인 것인 항체 또는 그의 항원 결합 단편에 관한 것이다.
일부 구체예에서, 상기 VH는 각각 서열번호 1, 2, 및 3으로 기재된 아미노산 서열을 갖는 CDR1, CDR2, 및 CDR3을 포함하고, 상기 VL은 각각 서열번호 4, 5, 및 6으로 기재된 아미노산 서열을 갖는 CDR1, CDR2, 및 CDR3을 포함한다.
일부 구체예에서, 상기 VH는 각각 서열번호 7, 8, 및 9로 기재된 아미노산 서열을 갖는 CDR1, CDR2, CDR3을 포함하고, 상기 VL은 각각 서열번호 10, 11, 및 12로 기재된 아미노산 서열을 갖는 CDR1, CDR2, CDR3을 포함한다.
일부 구체예에서, 상기 항체 또는 항원-결합 단편은 인간 CTLA4에 특이적으로 결합한다. 일부 구체예에서, 상기 항체 또는 항원-결합 단편은 인간화 항체 또는 그의 항원-결합 단편이다. 일부 구체예에서, 상기 항체 또는 항원-결합 단편은 scFV(single-chain variable fragment)이다.
일 양태에서, 본 개시는
(1) 각각 서열번호 1, 2, 및 3으로 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR(complementarity determining region) 1, 2, 및 3을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH)를 포함하고, 상기 VH는, 서열번호 18, 19, 20, 또는 70으로 기재된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL)과 쌍을 이루면, CTLA4에 결합하는 것인 면역글로불린 중쇄 또는 그의 단편;
(2) 각각 서열번호 4, 5, 및 6으로 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR 1, 2, 및 3을 포함하는 VL을 포함하고, 상기 VL은, 서열번호 13, 14, 15, 16, 17, 또는 69로 기재된 아미노산 서열을 포함하는 VH와 쌍을 이루면, CTLA4에 결합하는 것인 면역글로불린 경쇄 또는 그의 단편;
(3) 각각 서열번호 7, 8, 및 9로 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR 1, 2, 및 3을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH)을 포함하고, 상기 VH는, 서열번호 25, 26, 27, 28, 또는 72로 기재된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL)과 쌍을 이루면, CTLA4에 결합하는 것인 면역글로불린 중쇄 또는 그의 단편; 또는
(4) 각각 서열번호 10, 11, 및 12로 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR 1, 2, 및 3을 포함하는 VL을 포함하고, 상기 VL은, 서열번호 21, 22, 23, 24, 또는 71로 기재된 아미노산 서열을 포함하는 VH와 쌍을 이루면, CTLA4에 결합하는 것인 면역글로불린 경쇄 또는 그의 단편;
(5) 각각 서열번호 45, 46, 및 47로 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR 1, 2, 및 3을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH)을 포함하고, 상기 VH는, 서열번호 74로 기재된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL)과 쌍을 이루면, CTLA4에 결합하는 것인 면역글로불린 중쇄 또는 그의 단편;
(6) 각각 서열번호 48, 49, 및 50으로 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR 1, 2, 및 3을 포함하는 VL을 포함하고, 상기 VL은, 서열번호 73으로 기재된 아미노산 서열을 포함하는 VH와 쌍을 이루면, CTLA4에 결합하는 것인 면역글로불린 경쇄 또는 그의 단편;
(7) 각각 서열번호 51, 52, 및 53으로 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR 1, 2, 및 3을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH)을 포함하고, 상기 VH는, 서열번호 76으로 기재된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL)과 쌍을 이루면, CTLA4에 결합하는 것인 면역글로불린 중쇄 또는 그의 단편;
(8) 각각 서열번호 54, 55, 및 56으로 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR 1, 2, 및 3을 포함하는 VL을 포함하고, 상기 VL은, 서열번호 75로 기재된 아미노산 서열을 포함하는 VH와 쌍을 이루면, CTLA4에 결합하는 것인 면역글로불린 경쇄 또는 그의 단편을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 핵산에 관한 것이다.
일부 구체예에서, 상기 핵산은 각각 서열번호 1, 2, 및 3으로 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR 1, 2, 및 3을 포함하는 VH를 포함하는 면역글로불린 중쇄 또는 그의 단편을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
일부 구체예에서, 상기 핵산은 각각 서열번호 4, 5, 및 6으로 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR 1, 2, 및 3을 포함하는 VL을 포함하는 면역글로불린 경쇄 또는 그의 단편을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
일부 구체예에서, 상기 핵산은 각각 서열번호 7, 8, 및 9로 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR 1, 2, 및 3을 포함하는 VH를 포함하는 면역글로불린 중쇄 또는 그의 단편을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
일부 구체예에서, 상기 핵산은 각각 서열번호 10, 11, 및 12로 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR 1, 2, 및 3을 포함하는 VL을 포함하는 면역글로불린 경쇄 또는 그의 단편을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
일부 구체예에서, 상기 VH는 VL과 쌍을 이루면 인간 CTLA4에 특이적으로 결합한다. 일부 구체예에서, 상기 VL은 VH와 쌍을 이루면 인간 CTLA4에 특이적으로 결합한다.
일부 구체예에서, 상기 면역글로불린 중쇄 또는 그의 단편은 인간화 면역글로불린 중쇄 또는 그의 단편이고, 상기 면역글로불린 경쇄 또는 그의 단편은 인간화 면역글로불린 경쇄 또는 그의 단편이다.
일부 구체예에서, 상기 핵산은 scFv(single-chain variable fragment)를 코딩한다. 일부 구체예에서, 상기 핵산은 cDNA이다.
또 다른 양태에서, 본 개시는 또한 본 명세서에 기재된 핵산을 하나 이상 포함하는 벡터를 제공한다. 일부 구체예에서, 상기 벡터는 함께 CTLA4에 결합하는 VL 영역과 VH 영역을 코딩한다.
일 양태에서, 본 개시는 벡터의 쌍으로서, 각각의 벡터는 하나의 본 명세서에 기재된 핵산을 포함하고, 상기 벡터의 쌍은 함께 CTLA4에 결합하는 VL 영역과 VH 영역을 코딩하는 것인 벡터의 쌍에 관한 것이다.
일 양태에서, 본 개시는 본 명세서에 기재된 벡터, 또는 본 명세서에 기재된 벡터의 쌍을 포함하는 세포를 제공한다. 일부 구체예에서, 상기 세포는 CHO 세포이다.
또 다른 양태에서, 본 개시는 본 명세서에 기재된 핵산 중 하나 이상을 포함하는 세포에 관한 것이다.
일 양태에서, 본 개시는 본 명세서에 기재된 핵산을 2개 포함하는 세포를 제공한다.
일부 구체예에서, 상기 2개의 핵산은 함께 CTLA4에 결합하는 VL 영역 및 VH 영역을 함께 코딩한다.
일 양태에서, 본 개시는 또한 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 생산하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 본 명세서에 기재된 세포가 상기 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 생산하기에 충분한 조건에서 상기 세포를 배양하는 단계; 및 상기 세포에 의해 생산된 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 수집하는 단계를 포함한다.
일 양태에서, 본 개시는 선택된 VH 서열에 90% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH), 및 선택된 VL 서열에 90% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함하는, CTLA4에 결합하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편으로서, 상기 선택된 VH 서열 및 상기 선택된 VL 서열은 하기 중 하나로서:
(1) 상기 선택된 VH 서열은 서열번호 13, 14, 15, 16, 17, 또는 69이고, 상기 선택된 VL 서열은 서열번호 18, 19, 20, 또는 70이거나;
(2) 상기 선택된 VH 서열은 서열번호 21, 22, 23, 24, 또는 71이고, 상기 선택된 VL 서열은 서열번호 25, 26, 27, 28, 또는 72이거나;
(3) 상기 선택된 VH 서열은 서열번호 73이고, 상기 선택된 VL 서열은 서열번호 74이거나;
(4) 상기 선택된 VH 서열은 서열번호 75이고, 상기 선택된 VL 서열은 서열번호 76인 것인 CTLA4에 결합하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편에 관한 것이다.
일부 구체예에서, 상기 VH는 서열번호 13의 서열을 포함하고, 상기 VL은 서열번호 19의 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 상기 VH는 서열번호 14의 서열을 포함하고, 상기 VL은 서열번호 19의 서열을 포함한다.
일부 구체예에서, 상기 VH는 서열번호 21의 서열을 포함하고, 상기 VL은 서열번호 25의 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 상기 VH는 서열번호 22의 서열을 포함하고, 상기 VL은 서열번호 25의 서열을 포함한다.
일부 구체예에서, 상기 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 인간 CTLA4에 특이적으로 결합한다. 일부 구체예에서, 상기 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 인간화 항체 또는 그의 항원-결합 단편이다. 일부 구체예에서, 상기 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 scFV(single-chain variable fragment)이다.
일 양태에서, 본 개시는 또한 치료제에 공유결합에 의해, 또는 비-공유결합에 의해(non-covalently) 결합된 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 포함하는 항체-약물 접합체(antibody-drug conjugate)를 제공한다. 일부 구체예에서, 치료제는 세포독성제 또는 세포증식 억제제(cytostatic agent)(예를 들면, 시토칼라신(cytochalasin) B, 그라미시딘(gramicidin) D, 에티디움 브로마이드, 에메틴(emetine), 미토마이신(mitomycin), 에토포시드(etoposide), 테노포시드(tenoposide), 빈크리스틴(vincristine), 빈블라스틴(vinblastine), 콜히친(colchicine), 독소루비신(doxorubicin), 다우노루비신(daunorubicin), 디히드록시 안트라신(dihydroxy anthracin), 마이탄시노이드(maytansinoid), 예를 들면, DM-1 및 DM-4, 디온(dione), 미톡산트론(mitoxantrone), 미트라마이신(mithramycin), 액티노마이신(actinomycin) D, 1-데히드로테스토스테론(1-dehydrotestosterone), 글루코코르티코이드(glucocorticoid), 프로카인(procaine), 테트라카인(tetracaine), 리도카인(lidocaine), 프로프라놀롤(propranolol), 퓨로마이신(puromycin), 에피루비신(epirubicin), 및 시클로포스파미드(cyclophosphamide) 및 유사체)이다.
일 양태에서, 본 개시는 암을 가진 개체를 치료하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 본 명세서에 기재된 항체 또는 그의 항원-결합 단편, 또는 본 명세서에 기재된 항체-약물 접합체를 포함하는 조성물의 치료 유효량(therapeutically effective amount)을 상기 개체에게 투여하는 단계를 포함한다.
일부 구체예에서, 상기 암은 흑색종이다. 일부 구체예에서, 상기 암은 절제불능성(unresectable) 흑색종 또는 전이성 흑색종이다.
일부 구체예에서, 상기 암은 비소세포 폐 암종(NSCLC), 소세포 폐암(SCLC), 방광암, 또는 전이성 호르몬-불응성(hormone-refractor) 전립선암이다.
일 양태에서, 본 개시는 또한 종양의 성장 속도를 감소시키는 방법을 제공한다. 상기 방법은 본 명세서에 기재된 항체 또는 항원-결합 단편을 포함하는 조성물의 유효량을 종양 세포와 접촉시키는 단계를 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 개시는 종양 세포를 사멸시키는 방법에 관한 것이고, 상기 방법은 본 명세서에 기재된 항체 또는 항원-결합 단편, 또는 본 명세서에 기재된 항체-약물 접합체를 포함하는 조성물의 유효량을 종양 세포와 접촉시키는 단계를 포함한다.
일 양태에서, 본 개시는 본 명세서에 기재된 항체 또는 그의 항원-결합 단편, 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.
또 다른 양태에서, 본 개시는 본 명세서에 기재된 항체-약물 접합체, 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.
본 명세서에서 사용된, 용어 "암(cancer)"은 자발적 성장 능력을 갖는 세포를 의미한다. 그와 같은 세포의 예는 빠르게 증식하는 세포 성장을 특징으로 하는 비정상적인 상태 또는 질병을 갖는 세포를 포함한다. 이 용어는 조직병리적 타입이나 침습성(invasiveness)의 병기에 관계없이, 암 증식(cancerous growth), 예를 들면, 종양; 발암 과정(oncogenic process), 전이 조직, 및 악성 형질전환(malignantly transformed) 세포, 조직, 또는 기관을 포함하도록 의도된다. 또한, 다양한 기관계(organ system), 예를 들면, 호흡계, 심혈관계, 신장계(renal system), 생식계(reproductive system), 혈액계(hematological system), 신경계(neurological system), 간장계(hepatic system), 위장관계(gastrointestinal system), 및 내분비계의 악성종양; 및 대부분의 결장암, 신세포 암종(rental-cell carcinoma), 전립선암, 및/또는 고환 종양, 폐의 비소세포 암종(non-small cell carcinoma of the lung), 및 소장암을 포함한 선암이 포함된다. "자연적으로 발생하는(naturally arising)" 암은 암세포의 개체로의 이식에 의해 실험적으로 유도되지 않은 암을 포함하고, 예를 들면, 자발적으로 발생하는 암, 환자의 발암 물질로의 노출에 의해 유발된 암, 형질전환 종양 유전자(transgenic oncogene)의 삽입 또는 종양 억제 유전자(tumor suppressor gene)의 넉아웃에 의해 초래된 암, 및 감염, 예를 들면, 바이러스 감염에 의해 유발된 암을 포함한다. 용어 "암종(carcinoma)"은 당해 분야에서 인정되며, 상피 조직 또는 내분비 조직의 악성 종양을 의미한다. 이 용어는 또한 암육종(carcinosarcoma)을 포함하고, 이는 암 조직(carcinomatous tissue) 및 육종 조직(sarcomatous tissue)으로 이루어진 악성 종양을 포함한다. "선암종(adenocarcinoma)"은 종양 세포가 샘 구조(glandular structure)로부터 유래된 암종 또는 종양 세포가 인식가능한 샘 구조를 형성한 것인 암종을 의미한다. 용어 "육종(sarcoma)"은 당해 분야에서 인정되며, 중간엽 유래의 악성 종양을 의미한다. 용어 "조혈성 신생물 질환(hematopoietic neoplastic disorder)"은 조혈 기원의 과형성성/신생물성(hyperplastic/neoplastic) 세포와 관련된 질환을 포함한다. 조혈성 신생물 질환은 골수, 림프, 또는 적혈구 계통, 또는 그들의 전구 세포로부터 유래될 수 있다.
본 명세서에서 사용된, 용어 "항체(antibody)"는 하나 이상(예를 들면, 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 또는 6개)의 상보성 결정 영역(complementary determining region) (CDR) (예를 들면, 면역글로불린 경쇄로부터의 3개의 CDR 중 하나 또는 면역글로불린 중쇄로부터의 3개의 CDR 중 하나)을 포함하고, 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있는 항원-결합 분자를 의미한다. 항체의 비-한정적 예는: 단일클론 항체, 다중클론 항체, 다중-특이성(multi-specific) 항체(예를 들면, 이중-특이성(bi-specific) 항체), 단쇄 항체(single-chain antibody), 키메라 항체, 인간 항체, 및 인간화(humanized) 항체를 포함한다. 일부 구체예에서, 항체는 인간 항체의 Fc 영역을 포함할 수 있다. 용어 항체는 또한, 유도체(derivative), 예를 들면, 항체 단편으로부터 형성된 이중-특이성 항체, 단쇄 항체, 디아바디(diabody), 선형 항체(linear antibody), 및 다중-특이성 항체를 포함한다.
본 명세서에서 사용된, 용어 "항원-결합 단편(antigen-binding fragment)"은 전장 항체(full-length antibody)의 부분으로서, 상기 항체의 부분은 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 것인 부분을 의미한다. 일부 구체예에서, 항원-결합 단편은 하나 이상의 가변 도메인(예를 들면, 중쇄의 가변 도메인 또는 경쇄의 가변 도메인)을 포함한다. 항체 단편의 비-한정적 예는 예를 들면, Fab, Fab', F(ab')2, 및 Fv 단편을 포함한다.
본 명세서에서 사용된, 용어 "인간 항체(human antibody)"는 인간에 존재하는 내인성 핵산(endogenous nucleic acid)(예를 들면, 재배열된 인간 면역글로불린 중쇄 또는 경쇄 로커스(locus))에 의해 코딩된 항체를 의미한다. 일부 구체예에서, 인간 항체는 인간으로부터 수집되거나 또는 인간 세포 배양물(예를 들면, 인간 하이브리도마 세포)에서 생산된다. 일부 구체예에서, 인간 항체는 비-인간 세포(non-human cell)(예를 들면, 마우스 또는 햄스터 세포주)에서 생산된다. 일부 구체예에서, 인간 항체는 박테리아 세포 또는 효모 세포에서 생산된다. 일부 구체예에서, 인간 항체는 미-재배열(unrearranged) 또는 재배열 인간 면역글로불린 로커스(예를 들면, 중쇄 또는 경쇄 면역글로불린 로커스)를 포함하는 형질전환 비-인간 동물(transgenic non-human animal)(예를 들면, 소)에서 생산된다.
본 명세서에서 사용된, 용어 "키메라 항체(chimeric antibody)"는 2종 이상의 상이한 항체에 존재하는 서열을 포함하는 항체(예를 들면, 2개의 상이한 포유동물 종으로부터의 항체, 예를 들면, 인간 항체와 마우스 항체)를 의미한다. 키메라 항체의 비-한정적 예는 비-인간 (예를 들면, 마우스) 항체의 가변 도메인 서열(예를 들면, 경쇄 및/또는 중쇄 가변 도메인 서열의 전부 또는 일부) 및 인간 항체의 불변 도메인(constant domain)을 포함하는 항체이다. 키메라 항체의 추가적인 예가 본 명세서에 기재되고 당해 기술 분야에서 공지되어 있다.
본 명세서에서 사용된, 용어 "인간화 항체(humanized antibody)"는 비-인간 (예를 들면, 마우스) 면역글로불린으로부터 유래된 최소 서열(minimal sequence)을 포함하고 인간 면역글로불린으로부터 유래된 서열을 포함하는 비-인간 항체를 의미한다. 비-한정적 예에서, 인간화 항체는 수령자(recipient) 항체의 초가변(hypervariable) (CDR) 영역 잔기가 원하는 특이성, 친화도, 및 능력(capacity)을 갖는, 비-인간 항체(예를 들면, 공여자(donor) 항체), 예를 들면, 마우스, 랫트, 또는 토끼 항체로부터의 초가변 (CDR) 영역 잔기에 의해 치환된 것인 인간 항체(수령자 항체)이다. 일부 구체예에서, 인간 면역글로불린의 Fv 프레임워크 잔기는 상응하는 비-인간(예를 들면, 마우스) 면역글로불린 잔기에 의해 치환된다. 일부 구체예에서, 인간화 항체는 수령자 항체 또는 공여자 항체에서 발견되지 않는 잔기들을 포함할 수 있다. 이러한 변형은 항체 성능을 더 개선하기 위해 이루어질 수 있다. 일부 구체예에서, 인간화 항체는 초가변 루프(hypervariable loop)(CDR)의 전부 또는 실질적으로 전부가 비-인간(예를 들면, 마우스) 면역글로불린의 것에 해당하고, 프레임워크 영역의 전부 또는 실질적으로 전부가 인간 면역글루불린의 것인 하나 이상, 및 통상적으로 2개의 가변 도메인의 실질적으로 전부를 포함한다. 인간화 항체는 또한 면역글로불린 불변 영역(Fc)의 적어도 일부, 통상적으로 인간 면역글로불린의 불변 영역의 적어도 일부를 포함한다. 인간화 항체는 당해 기술 분야에서 공지된 분자 생물학적 방법을 이용하여 생산될 수 있다. 인간화 항체를 생성하는 방법의 비-한정적 예가 본 명세서에 기재된다.
본 명세서에서 사용된, 용어 "단쇄 항체(single-chain antibody)"는 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 2개 이상의 면역글로불린 가변 도메인 (예를 들면, 포유동물 면역글로불린 중쇄 또는 경쇄의 가변 도메인)을 포함하는 단일 폴리펩티드를 의미한다. 단쇄 항체의 비-한정적 예가 본 명세서에 기재된다.
본 명세서에서 사용된, 용어 "다량체 항체(multimeric antibody)"는 4개 이상(예를 들면, 6개, 8개, 또는 10개)의 면역글로불린 가변 도메인을 포함하는 항체를 의미한다. 일부 구체예에서, 다량체 항체는 1개의 표적 분자(예를 들면, CTLA4)를 포유동물 세포(예를 들면, 인간 T-세포)의 표면에 있는 1개 이상의 제2 표적 분자(예를 들면, PD1)에 가교시킬 수 있다.
본 명세서에서 사용된, 용어 "개체(subject)" 및 "환자(patient)"는 본 명세서 전체에서 호환적으로 사용되고 본 발명의 방법에 따른 치료가 제공될 동물, 인간 또는 인간이 아닌 비-인간(non-human) 동물을 의미한다. 수의학적(veterinary) 및 비-수의학적(non-veterinary) 적용이 본 발명에 의해 고려된다. 인간 환자는 성인 또는 청소년(예를 들면, 18세 이하의 인간)이다. 인간 외에, 환자는 마우스, 랫트, 햄스터, 기니어-피그, 토끼, 흰족제비(ferret), 고양이, 개, 및 영장류를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 예를 들면, 비-인간 영장류(예를 들면, 원숭이, 침팬지, 고릴라, 등), 설치류 (예를 들면, 랫트, 마우스, 저빌(gerbil), 햄스터, 흰족제비, 토끼), 토끼류(lagomorph), 돼지(swine)(예를 들면, 돼지(pig), 미니 돼지), 말, 개, 고양이, 소, 및 기타 애완 동물, 가축, 및 동물원 동물을 포함한다.
항체를 언급할 때, 본 명세서에서 사용된, 구 "특이적으로 결합하는(specifically binding)" 및 "특이적으로 결합한다(specifically binds)"는 항체가 그의 표적 분자(예를 들면, CTLA4), 바람직하게는 다른 분자와 상호작용한다는 것을 의미하고, 이는 상호작용이 표적 분자에 있는 특정한 구조(즉, 항원 결정기(antigenic determinant) 또는 에피토프)의 존재에 의존적이기 때문이며; 달리 말하면, 시약은 일반적으로 모든 분자에 결합하는 것이 아니고, 특정한 구조를 포함하는 분자를 인식하고 결합한다. 표적 분자에 특이적으로 결합하는 항체는 표적-특이적 항체로 지칭될 수 있다. 예를 들면, CTLA4 분자에 특이적으로 결합하는 항체는 CTLA4-특이적 항체 또는 항-CTLA4 항체로 지칭될 수 있다.
본 명세서에서 사용된, 용어 "폴리펩티드(polypeptide)", "펩티드(peptide)", 및 "단백질(protein)"은 2개 이상의 아미노산의 임의의 길이의 아미노산의 중합체를 의미하기 위해 호환적으로 사용된다.
본 명세서에서 사용된, 용어 "폴리뉴클레오티드(polynucleotide)", "핵산 분자(nucleic acid molecule)", 및 "핵산 서열(nucleic acid sequence)"은 2개 이상의 뉴클레오티드의 임의의 길이의 뉴클레오티드의 중합체를 의미하는 것으로 본 명세서에서 호환적으로 사용되고, 한정 없이, DNA, RNA, DNA/RNA 하이브리드, 및 이들의 변형을 포함한다.
달리 정의되지 않으면, 본 명세서에서 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 기술자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본 발명에서 사용하기 위한 방법 및 재료가 본 명세서에 기재된다; 당해 기술 분야에서 공지된 기타, 적합한 방법 및 재료도 사용될 수 있다. 재료, 방법 및 실시예는 단지 예시하기 위한 것이고 한정하는 것으로 의도되지 않는다. 본 명세서에서 언급된 모든 출판물, 특허 출원, 특허, 서열, 데이터베이스 입력사항, 및 기타 참조문헌은 그 전체로 참조에 의해 본 명세서에 포함된다. 상충의 경우에, 정의를 포함한 본 명세서가 지배할 것이다.
본 발명의 기타 특징 및 장점이 하기의 상세한 설명과 도면, 및 청구항으로부터 자명할 것이다.
상세한 설명
본 개시는 세포독성 T-림프구-관련 단백질 4(cytotoxic T-lymphocyte-associated protein 4)(CTLA-4, CTLA4, 또는 CD152로도 알려짐)에 결합하는 항체, 그의 항원-결합 단편의 예를 제공한다.
CTLA4는 활성화된 T 세포에 의해 발현되고, T 세포에 억제 신호를 전달하는 면역글로불린 수퍼패밀리(superfamily)의 일원이다. CTLA4는 면역 관문(immune checkpoint)이고 CD80 또는 CD86에 결합되면 "오프(off)" 스위치로 작용하여, 면역 반응을 하향조절한다.
본 개시는 또한 인간화 항-CTLA4 항체의 서열, 및 이 항체를 제조하고 사용하는 방법을 제공한다.
CTLA4와 암
면역계는 신체에서 정상 세포와 "외래(foreign)"로 인식하는 세포를 구별할 수 있어서, 면역계가 정상 세포는 그대로 두면서, 외래 세포를 공격할 수 있게 한다. 이 메카니즘은 종종 면역 관문(immune checkpoint)이라 불리는 단백질과 관련된다. 면역 관문은 면역계에서 신호(공동-자극(co-stimulatory) 분자)를 켜거나 또는 신호를 끄는 분자이다.
관문 억제제(checkpoint inhibitor)는 면역계가 정상 조직을 공격하는 것을 방지하고 그에 의해 자가면역 질환을 예방할 수 있다. 다수의 종양 세포도 관문 억제제를 발현한다. 이러한 종양 세포는 특히, 종양 항원에 특이적인 T 세포에서 특정한 면역-관문 경로를 이용하여(co-opt) 면역 감시(immune surveillance)를 회피한다(Creelan, Benjamin C. "Update on immune checkpoint inhibitors in lung cancer." Cancer Control 21.1 (2014): 80-89). 다수의 면역 관문이 리간드-수용체 상호작용에 의해 개시되므로, 이들은 리간드 및/또는 그의 수용체에 대한 항체에 의해 용이하게 차단될 수 있다.
면역 관문 경로는 정상적인 조건 하에서 T 세포에 의해 과다한 효과인자 활성(effector activity)을 방지하는 정교한 일련의 세포 상호작용을 포함한다. 이 경로의 하나의 부분이 CTLA4(cytotoxic T-lymphocyte antigen-4, CD152)로 불리는 세포 표면 수용체이다. CTLA4는 T-세포에서만 발현되는 면역글로불린 수퍼패밀리의 일원이다. CTLA4는 T-세포 활성화를 억제하기 위해 작용하고 헬퍼 T-세포(helper T cell) 활성을 억제하고, 조절성 T-세포(regulatory T-cell) 면역억제 활성을 강화하는 것으로 보고되어 있다. 따라서, CTLA-4는 "오프(off)" 스위치로 작용하고, 면역 반응을 저하시킨다. 세포독성 T 세포가 활성화되면, T 세포는 세포 표면에 CTLA-4를 발현하고, 그 후 상호 간에 공유된 리간드(mutually shared ligand)인, APC 상에 있는 B7-1 (CD80) or B7-2 (CD86)에 대해 공동자극(costimulatory) 분자 CD28과 경쟁한다. 이러한 "음-양(yin-yang)" 균형이 T-세포 기능이 자기-한정적 방식(self-limited manner)으로 진행될 수 있게 하면서, 세포독성 활성을 저지한다(Creelan, Benjamin C. "Update on immune checkpoint inhibitors in lung cancer." Cancer Control 21.1 (2014): 80-89).
다수의 종양 세포가 T 세포에서 CTLA-4의 비정상적 발현을 촉진할 수 있고, 이러한 CTLA-4 이상 T 세포(CTLA-4 aberrant T cell)는 면역성 결여(anergic) 표현형을 보인다. 따라서, 암 세포가 순찰성 T 세포(patrolling T cell)를 회피하기 위해 CTLA-4 경로를 끌어들일 수 있다. CTLA-4를 억제하는 단일클론 항체의 도입이 여러 암, 예를 들면, 흑색종에서 일관되고 지속적인 항암 반응을 달성할 수 있다. 이러한 항-CTLA4 항체 (예를 들면, 트레멜리무맙(tremelimumab) 및 이필리무맙(ipilimumab)(Yervoy))는 CTLA4에 결합하여, 억제성 신호를 차단하고, 이는 세포독성 T-림프구가 암세포를 파괴할 수 있게 한다. 따라서, 항-CTLA4 항체는 암을 치료하기 위해 이용될 수 있다.
본 개시는 여러 항-CTLA4 항체, 그의 항원-결합 단편, 및 이러한 항-CTLA4 항체 및 그의 항원-결합 단편을 사용하여 암을 치료하는 방법을 제공한다.
항체 및 항원 결합 단편
본 개시는 항-CTLA4 항체 및 그의 항원-결합 단편을 제공한다. 일반적으로, 항체(면역글로불린으로도 불림)는 2 종류의 폴리펩티드 사슬, 경쇄(light chain) 및 중쇄(heavy chain)으로 이루어진다. 본 개시의 비-한정적 항체는 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄를 포함하는, 온전한 4 면역글로불린 사슬 항체(intact, four immunoglobulin chain antibody)이다. 항체의 중쇄는 IgM, IgG, IgE, IgA, 또는 IgD를 포함한 이소형(isotype), 또는 IgG1, IgG2, IgG2a, IgG2b, IgG3, IgG4, IgE1, IgE2, 등을 포함한 서브-이소형(sub-isotype)일 수 있다. 경쇄는 카파 경쇄(kappa light chain) 또는 람다(lamda) 경쇄일 수 있다. 항체는 2개의 경쇄의 동일한 카피와 2개의 중쇄의 동일한 카피를 포함할 수 있다. 각각 하나의 가변 도메인(또는 가변 영역, VH) 및 복수 개의 불변 도메인(또는 불변 영역)을 포함하는 중쇄는 그들의 불변 도메인 내에 있는 디술피드 결합(disulfide bonding)을 통해 상호 간에 결합하여 항체의 "줄기(stem)" 형성한다. 각각 하나의 가변 도메인 (또는 가변 영역, VL) 및 하나의 불변 도메인(또는 불변 영역)을 포함하는 경쇄는 각각 디술피드 결합을 통해 하나의 중쇄에 결합한다. 각 경쇄의 가변 영역은 결합하는 중쇄의 가변 영역과 정렬된다. 경쇄 및 중쇄 모두의 가변 영역은 보다 보존된 프레임워크 영역(FR) 사이에 샌드위치된 3개의 초가변 영역을 포함한다.
상보성 결정 영역(complementary determining region)(CDR)으로 알려진, 이러한 초가변 영역은 항체의 주요 항원 결합 표면을 포함하는 루프를 형성한다. 4개의 프레임워크 영역은 대체적으로 베타-쉬트 구조(beta-sheet conformation)를 취하고, CDR은 연결하는 루프를 형성하고, 일부 경우에, 베타-쉬트 구조의 일부를 형성한다. 각 사슬 중 CDR은 프레임워크 영역에 의해 인접하게 유지되고, 다른 사슬로부터의 CDR과 함께, 항원-결합 부위의 형성에 기여한다.
항체의 아미노산 서열을 분석하는 것에 의해, 항체의 CDR 영역을 식별하는 방법이 잘 알려져 있으며, 다수의 CDR 정의가 일반적으로 이용된다. Kabat 정의는 서열 가변성(sequence variability)에 기반하고, Chothia 정의는 구조적 루프 영역(structural loop region)의 위치에 기반한다. 이러한 방법 및 정의가 예를 들면, Martin, "Protein sequence and structure analysis of antibody variable domains," Antibody engineering, Springer Berlin Heidelberg, 2001. 422-439; Abhinandan, et al. "Analysis and improvements to Kabat and structurally correct numbering of antibody variable domains," Molecular immunology 45.14 (2008): 3832-3839; Wu, T.T. and Kabat, E.A. (1970) J. Exp. Med. 132: 211-250; Martin et al., Methods Enzymol. 203:121-53 (1991); Morea et al., Biophys Chem. 68(1-3):9-16 (Oct. 1997); Morea et al., J Mol Biol. 275(2):269-94 (Jan .1998); Chothia et al., Nature 342(6252):877-83 (Dec. 1989); Ponomarenko and Bourne, BMC Structural Biology 7:64 (2007);에 기재되고, 이들 각각은 그 전체가 참조에 의해 본 명세서에 포함된다.
CDR은 항원의 에피토프를 인식하기 위해 중요하다. 본 명세서에서 사용된, "에피토프(epitope)"는 항체의 항원 결합 도메인에 의해 특이적으로 결합될 수 있는 표적 분자의 최소 부분이다. 에피토프의 최소 크기(minimal size)는 약 3개, 4개, 5개, 6개, 또는 7개의 아미노산일 수 있으나, 에피토프는 항원의 2차 및 3차 구조에 기반한 항원의 3차원 구조에 의존적일 수 있기 때문에, 이러한 아미노산이 항원의 일차 구조(primary structure)의 연속된 선형 서열일 필요는 없다.
일부 구체예에서, 항체는 온전한 면역글로불린 분자(예를 들면, IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3, IgM, IgD, IgE, IgA)이다. IgG 서브클래스(subclass)(IgG1, IgG2, IgG3, 및 IgG4)는 고도로 보존되고, 그들의 불변 영역, 특히, 그들의 힌지(hinge) 및 상부(upper) CH2 도메인에서 상이하다. IgG 서브클래스의 서열 및 차이가 당해 기술 분야에서 알려져 있으며, 예를 들면, Vidarsson, Gestur, Gillian Dekkers, and Theo Rispens. "IgG subclasses and allotypes: from structure to effector functions." Frontiers in immunology 5 (2014); Irani, Vashti, et al. "Molecular properties of human IgG subclasses and their implications for designing therapeutic monoclonal antibodies against infectious diseases." Molecular immunology 67.2 (2015): 171-182; Shakib, Farouk, ed. The human IgG subclasses: molecular analysis of structure, function and regulation. Elsevier, 2016;에 기재되고, 이들 각각은 전체로서 참조에 의해 본 명세서에 포함된다.
항체는 임의의 종(예를 들면, 인간, 설치류, 마우스, 낙타과(camelid))으로부터 유래된 면역글로불린 분자일 수 있다. 본 명세서에 개시된 항체는 또한 다중클론 항체, 단일클론 항체, 단일 특이성(monospecific) 항체, 다중 특이성(multispecific) 항체, 및 또 다른 폴리펩티드에 융합된 면역글로불린 결합 도메인을 포함하는 키메라 항체를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 용어 "항원 결합 도메인(antigen binding domain)" 또는 "항원 결합 단편(antigen bidnign fragment)"는 온전한 항체의 특이적 결합 활성을 보유하는 항체의 부분, 즉, 온전한 항체의 표적 분자 상에 있는 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있는 항체의 부분이다. 이는 예를 들면, Fab, Fab', F(ab')2, 및 이 단편들의 변이체(variant)를 포함한다. 따라서, 일부 구체예에서, 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 예를 들면, scFv, Fv, Fd, dAb, 이중 특이성 항체, 이중 특이성 scFv, 디아바디, 선형 항체(linear antibody), 단쇄 항체 분자, 항체 단편으로부터 형성된 다중-특이성 항체, 및 항체 결합 도메인이거나, 또는 그와 동종인(homologous) 결합 도메인을 포함하는 폴리펩티드일 수 있다. 항원 결합 도메인의 비-한정적 예는 예를 들면, 온전한 항체의 중쇄 및/또는 경쇄 CDR, 온전한 항체의 중쇄 및/또는 경쇄 가변 영역, 온전한 항체의 전장 중쇄 또는 경쇄, 또는 온전한 항체의 중쇄 또는 경쇄로부터의 개별적인 CDR을 포함한다.
일부 구체예에서, 항원 결합 단편은 키메라 항원 수용체(chimeric antigen receptor)(CAR)의 일부를 형성할 수 있다. 일부 구체예에서, 키메라 항원 수용체는 CD3-제타 막관통- 및 엔도도메인(CD3-zeta transmembrane- and endodomain)에 융합된, 본 명세서에 기재된 바와 같은 단쇄 가변 단편의 융합체(fusion)이다. 일부 구체예에서, 키메라 항원 수용체는 또한 다양한 공동자극 단백질 수용체(예를 들면, CD28, 41BB, ICOS)로부터의 세포내 신호전달 도메인(intracellular signaling domain)을 포함한다. 일부 구체예에서, 키메라 항원 수용체는 효능을 증가시키기 위해 복수 개의 신호전달 도메인, 예를 들면, CD3z-CD28-41BB 또는 CD3z-CD28-OX40을 포함한다. 따라서, 일 양태에서, 본 개시는 또한 본 명세서에 기재된 바와 같은 키메라 항원 수용체를 발현하는 세포(예를 들면, T 세포)를 제공한다.
일부 구체예에서, scFV는 하나의 중쇄 가변 도메인 및 하나의 경쇄 가변 도메인을 갖는다.
항- CTLA4 항체 및 항원-결합 단편
본 개시는 CTLA4에 특이적으로 결합하는 항체 및 그의 항원 결합 단편을 제공한다. 본 명세서에 기재된 항체 및 항원-결합 단편은 CTLA4에 결합할 수 있고, CTLA4 억제성 경로를 억제하여 면역 반응을 증가시킨다. 본 개시는 마우스 항-CTLA4 항체 CT4-04-13A4 ("13A4"), CT4-03-4G12 ("4G12"), CT4-20-6D2 ("6D2"), 및 CT4-20-7E12 ("7E12"), 및 그의 인간화 항체를 제공한다.
13A4, 및 13A4 유래 항체 (예를 들면, 인간화 항체)의 CDR 서열은 Kabat 번호표기(numbering)에 의해 정의된, 중쇄 가변 도메인의 CDR, 서열번호 1-3, 및 경쇄 가변 도메인의 CDR, 서열번호 4-6을 포함한다. CDR은 또한 Chothia 시스템에 의해 정의될 수 있다. Chothia 번호표기 하에, 중쇄 가변 도메인의 CDR 서열은 서열번호 29-31로 기재되고, 경쇄 가변 도메인의 CDR 서열은 서열번호 32-34로 기재된다.
유사하게, 4G12, 및 4G12 유래 항체의 CDR 서열은 Kabat 번호표기에 의해 정의된, 중쇄 가변 도메인의 CDR, 서열번호 7-9, 및 경쇄 가변 도메인의 CDR, 서열번호 10-12를 포함한다. Chothia 번호표기 하에, 중쇄 가변 도메인의 CDR 서열은 서열번호 35-37로 기재되고, 경쇄 가변 도메인의 CDR은 서열번호 38-40으로 기재된다.
6D2, 및 6D2 유래 항체의 CDR 서열은 Kabat 번호표기에 의해 정의된, 중쇄 가변 도메인의 CDR, 서열번호 45-47, 및 경쇄 가변 도메인의 CDR, 서열번호 48-50을 포함한다. Chothia 번호표기 하에, 중쇄 가변 도메인의 CDR 서열은 서열번호 57-59로 기재되고, 경쇄 가변 도메인의 CDR은 서열번호 60-62로 기재된다.
7E12, 및 7E12 유래 항체의 CDR 서열은 Kabat 번호표기에 의해 정의된, 중쇄 가변 도메인의 CDR, 서열번호 51-53, 및 경쇄 가변 도메인의 CDR, 서열번호 54-56을 포함한다. Chothia 번호표기 하에, 중쇄 가변 도메인의 CDR 서열은 서열번호 63-65로 기재되고, 경쇄 가변 도메인의 CDR은 서열번호 66-68로 기재된다.
인간화 항체의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열도 제공된다. 마우스 항체를 인간화하는 상이한 방법들이 있으므로(예를 들면, 서열이 상이한 아미노산에 의해 치환될 수 있음), 항체의 중쇄 및 경쇄는 인간화 서열의 2개 이상의 버전을 가질 수 있다. 인간화 13A4 항체의 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 서열번호 13-17로 기재된다. 인간화 13A4 항체의 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 서열번호 18-20으로 기재된다. 이러한 중쇄 가변 영역 서열(서열번호 13-17) 중 하나가 이러한 경쇄 가변 영역 서열(서열번호 18-20) 중 하나와 쌍을 이룰 수 있다.
유사하게, 인간화 4G12 항체의 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 서열번호 21-24로 기재된다. 인간화 4G12 항체의 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 서열번호 25-28로 기재된다. 이러한 중쇄 가변 영역 서열(서열번호 21-24)은 이러한 경쇄 가변 영역 서열(서열번호 25-28)과 쌍을 이룰 수 있다.
도 25에 도시된 바와 같이, 인간화 비율(humanization percentage)은 IMGT(International Immunogenetics Information System) 데이터베이스의 인간 항체 서열 대비 중쇄 또는 경쇄 가변 영역 서열의 백분율 동일성(percentage identity)을 의미한다. 탑 히트(top hit)는 중쇄 또는 경쇄 가변영역 서열이 다른 종 대비 특정 종에 더 가깝다는 것을 의미한다. 예를 들면, 인간으로의 탑 히트는 다른 종에 비해 인간에 더 가깝다는 것을 의미한다. 인간 및 마카카 파시쿨라리스(Macaca fascicularis)로의 탑 히트는 해당 서열이 인간 서열과 마카카 파시쿨라리스 서열에 대해 동일한 백분율 동일성을 갖고, 이 백분율 동일성이 다른 종의 서열 대비 가장 높다는 것을 의미한다. 일부 구체예에서, 인간화 비율은 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 또는 95%보다 높다. 인간화 비율을 결정하는 방법 및 탑 히트를 결정하는 방법에 대한 상세한 설명이 당해 분야에서 알려져 있고, 예를 들면, Jones, Tim D., et al. "The INNs and outs of antibody nonproprietary names." MAbs. Vol. 8. No. 1. Taylor & Francis, 2016에 기재되고, 이는 그 전체로 참조에 의해 본 명세서에 포함된다.
또한, 일부 구체예에서, 본 명세서에 기재된 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 서열번호 1-3, 서열번호 7-9, 서열번호 29-31, 서열번호 35-37, 서열번호 45-47, 서열번호 51-53, 서열번호 57-59, 및 서열번호 63-65의 군으로부터 선택된 1개, 2개, 또는 3개의 중쇄 가변 영역 CDR; 및/또는 서열번호 4-6, 서열번호 10-12, 서열번호 32-34, 서열번호 38-40, 서열번호 48-50, 서열번호 54-56, 서열번호 60-62, 및 서열번호 66-68의 군으로부터 선택된 1개, 2개, 또는 3개의 경쇄 가변 영역 CDR을 포함할 수 있다.
일부 구체예에서, 항체는 상보성 결정 영역(CDR) 1, 2, 3을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH)으로서, 상기 CDR1 영역은 선택된 VH CDR1 아미노산 서열에 80%, 85%, 90%, 또는 95% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 그로 구성되고, 상기 CDR2 영역은 선택된 VH CDR2 아미노산 서열에 80%, 85%, 90%, 또는 95% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 그로 구성되며, 상기 CDR3 영역은 선택된 VH CDR3 아미노산 서열에 80%, 85%, 90%, 또는 95% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 그로 구성되는 것인 중쇄 가변 영역, 및 CDR 1, 2, 3을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)으로서, 상기 CDR1 영역은 선택된 VL CDR1 아미노산 서열에 80%, 85%, 90%, 또는 95% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 그로 구성되고, 상기 CDR2 영역은 선택된 VL CDR2 아미노산 서열에 80%, 85%, 90%, 또는 95% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 그로 구성되며, 상기 CDR3 영역은 선택된 VL CDR3 아미노산 서열에 80%, 85%, 90%, 또는 95% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 그로 구성되는 것인 경쇄 가변 영역(VL)을 가질 수 있다. 선택된 VH CDR 1, 2, 3 아미노산 서열 및 선택된 VL CDR 1, 2, 3 아미노산 서열이 도 23 (Kabat CDR) 및 도 24 (Chothia CDR)에 표시된다.
일부 구체예에서, 본 명세서에 기재된 항체 또는 항원-결합 단편은 0개, 1개, 또는 2개의 아미노산 삽입, 결실, 또는 치환을 갖는 서열번호 1; 0개, 1개, 또는 2개의 아미노산 삽입, 결실, 또는 치환을 갖는 서열번호 2; 0개, 1개, 또는 2개의 아미노산 삽입, 결실, 또는 치환을 갖는 서열번호 3의 CDR 중 1개, 2개, 또는 3개를 포함하는 중쇄 가변 도메인을 포함할 수 있다.
일부 구체예에서, 본 명세서에 기재된 항체 또는 항원-결합 단편은 0개, 1개, 또는 2개의 아미노산 삽입, 결실, 또는 치환을 갖는 서열번호 7의 CDR; 0개, 1개, 또는 2개의 아미노산 삽입, 결실, 또는 치환을 갖는 서열번호 8의 CDR; 0개, 1개, 또는 2개의 아미노산 삽입, 결실, 또는 치환을 갖는 서열번호 9의 CDR 중 1개, 2개, 또는 3개를 포함하는 중쇄 가변 도메인을 포함할 수 있다.
일부 구체예에서, 본 명세서에 기재된 항체 또는 항원-결합 단편은 0개, 1개, 또는 2개의 아미노산 삽입, 결실, 또는 치환을 갖는 서열번호 29의 CDR; 0개, 1개, 또는 2개의 아미노산 삽입, 결실, 또는 치환을 갖는 서열번호 30의 CDR; 0개, 1개, 또는 2개의 아미노산 삽입, 결실, 또는 치환을 갖는 서열번호 31의 CDR 중 1개, 2개, 또는 3개를 포함하는 중쇄 가변 도메인을 포함할 수 있다.
일부 구체예에서, 본 명세서에 기재된 항체 또는 항원-결합 단편은 0개, 1개, 또는 2개의 아미노산 삽입, 결실, 또는 치환을 갖는 서열번호 35의 CDR; 0개, 1개, 또는 2개의 아미노산 삽입, 결실, 또는 치환을 갖는 서열번호 36의 CDR; 0개, 1개, 또는 2개의 아미노산 삽입, 결실, 또는 치환을 갖는 서열번호 37의 CDR 중 1개, 2개, 또는 3개를 포함하는 중쇄 가변 도메인을 포함할 수 있다.
일부 구체예에서, 본 명세서에 기재된 항체 또는 항원-결합 단편은 0개, 1개, 또는 2개의 아미노산 삽입, 결실, 또는 치환을 갖는 서열번호 45의 CDR; 0개, 1개, 또는 2개의 아미노산 삽입, 결실, 또는 치환을 갖는 서열번호 46의 CDR; 0개, 1개, 또는 2개의 아미노산 삽입, 결실, 또는 치환을 갖는 서열번호 47의 CDR 중 1개, 2개, 또는 3개를 포함하는 중쇄 가변 도메인을 포함할 수 있다.
일부 구체예에서, 본 명세서에 기재된 항체 또는 항원-결합 단편은 0개, 1개, 또는 2개의 아미노산 삽입, 결실, 또는 치환을 갖는 서열번호 51의 CDR; 0개, 1개, 또는 2개의 아미노산 삽입, 결실, 또는 치환을 갖는 서열번호 52의 CDR; 0개, 1개, 또는 2개의 아미노산 삽입, 결실, 또는 치환을 갖는 서열번호 53의 CDR 중 1개, 2개, 또는 3개를 포함하는 중쇄 가변 도메인을 포함할 수 있다.
일부 구체예에서, 본 명세서에 기재된 항체 또는 항원-결합 단편은 0개, 1개, 또는 2개의 아미노산 삽입, 결실, 또는 치환을 갖는 서열번호 57의 CDR; 0개, 1개, 또는 2개의 아미노산 삽입, 결실, 또는 치환을 갖는 서열번호 58의 CDR; 0개, 1개, 또는 2개의 아미노산 삽입, 결실, 또는 치환을 갖는 서열번호 59의 CDR 중 1개, 2개, 또는 3개를 포함하는 중쇄 가변 도메인을 포함할 수 있다.
일부 구체예에서, 본 명세서에 기재된 항체 또는 항원-결합 단편은 0개, 1개, 또는 2개의 아미노산 삽입, 결실, 또는 치환을 갖는 서열번호 63의 CDR; 0개, 1개, 또는 2개의 아미노산 삽입, 결실, 또는 치환을 갖는 서열번호 64의 CDR; 0개, 1개, 또는 2개의 아미노산 삽입, 결실, 또는 치환을 갖는 서열번호 65의 CDR 중 1개, 2개, 또는 3개를 포함하는 중쇄 가변 도메인을 포함할 수 있다.
일부 구체예에서, 본 명세서에 기재된 항체 또는 항원-결합 단편은 0개, 1개, 또는 2개의 아미노산 삽입, 결실, 또는 치환을 갖는 서열번호 4의 CDR; 0개, 1개, 또는 2개의 아미노산 삽입, 결실, 또는 치환을 갖는 서열번호 5의 CDR; 0개, 1개, 또는 2개의 아미노산 삽입, 결실, 또는 치환을 갖는 서열번호 6의 CDR 중 1개, 2개, 또는 3개를 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함할 수 있다.
일부 구체예에서, 본 명세서에 기재된 항체 또는 항원-결합 단편은 0개, 1개, 또는 2개의 아미노산 삽입, 결실, 또는 치환을 갖는 서열번호 10의 CDR; 0개, 1개, 또는 2개의 아미노산 삽입, 결실, 또는 치환을 갖는 서열번호 11의 CDR; 0개, 1개, 또는 2개의 아미노산 삽입, 결실, 또는 치환을 갖는 서열번호 12의 CDR 중 1개, 2개, 또는 3개를 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함할 수 있다.
일부 구체예에서, 본 명세서에 기재된 항체 또는 항원-결합 단편은 0개, 1개, 또는 2개의 아미노산 삽입, 결실, 또는 치환을 갖는 서열번호 32의 CDR; 0개, 1개, 또는 2개의 아미노산 삽입, 결실, 또는 치환을 갖는 서열번호 33의 CDR; 0개, 1개, 또는 2개의 아미노산 삽입, 결실, 또는 치환을 갖는 서열번호 34의 CDR 중 1개, 2개, 또는 3개를 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함할 수 있다.
일부 구체예에서, 본 명세서에 기재된 항체 또는 항원-결합 단편은 0개, 1개, 또는 2개의 아미노산 삽입, 결실, 또는 치환을 갖는 서열번호 38의 CDR; 0개, 1개, 또는 2개의 아미노산 삽입, 결실, 또는 치환을 갖는 서열번호 39의 CDR; 0개, 1개, 또는 2개의 아미노산 삽입, 결실, 또는 치환을 갖는 서열번호 40의 CDR 중 1개, 2개, 또는 3개를 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함할 수 있다.
일부 구체예에서, 본 명세서에 기재된 항체 또는 항원-결합 단편은 0개, 1개, 또는 2개의 아미노산 삽입, 결실, 또는 치환을 갖는 서열번호 48의 CDR; 0개, 1개, 또는 2개의 아미노산 삽입, 결실, 또는 치환을 갖는 서열번호 49의 CDR; 0개, 1개, 또는 2개의 아미노산 삽입, 결실, 또는 치환을 갖는 서열번호 50의 CDR 중 1개, 2개, 또는 3개를 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함할 수 있다.
일부 구체예에서, 본 명세서에 기재된 항체 또는 항원-결합 단편은 0개, 1개, 또는 2개의 아미노산 삽입, 결실, 또는 치환을 갖는 서열번호 54의 CDR; 0개, 1개, 또는 2개의 아미노산 삽입, 결실, 또는 치환을 갖는 서열번호 55의 CDR; 0개, 1개, 또는 2개의 아미노산 삽입, 결실, 또는 치환을 갖는 서열번호 56의 CDR 중 1개, 2개, 또는 3개를 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함할 수 있다.
일부 구체예에서, 본 명세서에 기재된 항체 또는 항원-결합 단편은 0개, 1개, 또는 2개의 아미노산 삽입, 결실, 또는 치환을 갖는 서열번호 60의 CDR; 0개, 1개, 또는 2개의 아미노산 삽입, 결실, 또는 치환을 갖는 서열번호 61의 CDR; 0개, 1개, 또는 2개의 아미노산 삽입, 결실, 또는 치환을 갖는 서열번호 62의 CDR 중 1개, 2개, 또는 3개를 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함할 수 있다.
일부 구체예에서, 본 명세서에 기재된 항체 또는 항원-결합 단편은 0개, 1개, 또는 2개의 아미노산 삽입, 결실, 또는 치환을 갖는 서열번호 66의 CDR; 0개, 1개, 또는 2개의 아미노산 삽입, 결실, 또는 치환을 갖는 서열번호 67의 CDR; 0개, 1개, 또는 2개의 아미노산 삽입, 결실, 또는 치환을 갖는 서열번호 68의 CDR 중 1개, 2개, 또는 3개를 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함할 수 있다.
삽입, 결실, 및 치환은 CDR 서열 내에서, 또는 CDR 서열의 양 말단 중 하나 또는 둘 모두에서 일어날 수 있다.
본 개시는 또한 CTLA4에 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 제공한다. 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 선택된 VH 서열에 80%, 85%, 90%, 또는 95% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 그로 구성된 중쇄 가변 영역(VH), 및 선택된 VL 서열에 80%, 85%, 90%, 또는 95% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하거나 그로 구성된 경쇄 가변 영역(VL)을 포함한다. 일부 구체예에서, 선택된 VH 서열은 서열번호 13, 14, 15, 16, 17, 또는 69이고, 선택된 VL 서열은 서열번호 18, 19, 20, 또는 70이다. 일부 구체예에서, 선택된 VH 서열은 서열번호 21, 22, 23, 24, 또는 71이고, 선택된 VL 서열은 서열번호 25, 26, 27, 28, 또는 72이다. 일부 구체예에서, 선택된 VH 서열은 서열번호 73이고, 선택된 VL 서열은 서열번호 74이다. 일부 구체예에서, 선택된 VH 서열은 서열번호 75이고, 선택된 VL 서열은 서열번호 76이다.
2개의 아미노산 서열, 또는 2개의 핵산 서열의 퍼센트 동일성을 결정하기 위해, 서열들이 최적 비교 목적을 위해 정렬된다(예를 들면, 최적 정렬(optimal alignment)을 위해 제1 아미노산 서열과 제2 아미노산 서열 또는 제1 핵산 서열과 제2 핵산 서열 중 하나 또는 모두에 갭(gap)이 도입될 수 있고, 비-상동성 서열이 비교 목적을 위해 무시될 수 있다). 비교 목적을 위해 정렬된 기준 서열(reference sequence)의 길이는 기준 서열의 길이의 80% 이상이고, 일부 구체예에서, 적어도 90%, 95%, 또는 100%이다. 그 후, 상응하는 아미노산 위치 또는 뉴클레오티드 위치에 있는 아미노산 잔기들 또는 뉴클레오티드들이 비교된다. 제1 서열 중 위치가 제2 서열 중 상응하는 위체와 동일한 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드에 의해 차지된 경우, 그 분자들은 그 위치에서 동일하다. 2개의 서열 간 퍼센트 동일성은 2개의 서열의 최적 정렬을 위해 도입되어야 하는 갭의 개수, 및 각 갭의 길이를 고려한, 서열들에 의해 공유된 동일한 위치의 개수의 함수이다. 본 개시의 목적을 위해, 서열의 비교 및 2개의 서열 간 퍼센트 동일성의 결정은 12의 갭 페널티(gap penalty), 4의 갭 연장 페널티(gap extend penalty), 및 5의 프레임쉬프트 갭 페널티(frameshift gap penalty)에 의한 Blossum 62 스코어링 매트릭스(scoring matrix)를 이용하여 달성될 수 있다.
본 개시는 또한 면역글로불린 중쇄 또는 면역글로불린 경쇄를 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 핵산을 제공한다. 면역글로불린 중쇄 또는 면역글로불린 경쇄는 도 23 또는 도 24에 표시된 CDR을 포함하거나, 또는 도 25 또는 도 27에 표시된 서열을 갖는다. 폴리펩티드가 상응하는 폴리펩티드(예를 들면, 상응하는 중쇄 가변 영역 또는 상응하는 경쇄 가변 영역)와 쌍을 이루면, 쌍을 이룬 폴리펩티드(paired polypeptides)는 CTLA4에 결합한다.
항-CTLA4 항체 및 항원-결합 단편은 또한 항체 또는 항체 단편, 및 다중-특이성(예를 들면, 이중-특이성) 항체 또는 항체 단편의 항체 변이체(유도체(derivative) 및 접합체(conjugate) 포함)일 수 있다. 본 명세서에서 제공된 추가적인 항체는 다중클론 항체, 단일클론 항체, 다중-특이성(다량체(multimeric), 예를 들면, 이중-특이성) 항체, 인간 항체, 키메라 항체(예를 들면, 인간-마우스 키메라), 단쇄 항체, 세포내-생성 항체(intracellularly-made antibodies)(즉, 인트라바디(intrabodies)) 및 그들의 항원-결합 단편이다. 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 임의의 종류(type)(예를 들면, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA, 및 IgY), 클래스(class)(예를 들면, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, 및 IgA2), 또는 서브클래스(subclass)일 수 있다. 일부 구체예에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 IgG 항체 또는 그의 항원-결합 단편이다.
항체의 단편은 그들이 전장 항체의 원하는 친화도 및 특이성을 보유하는 한, 제공된 방법에서 사용하기에 적합하다. 따라서, CTLA-4에 결합하는 항체의 단편은 CTLA-4에 결합하는 능력을 보유할 것이다. Fv 단편은 완전한 항원 인식 및 결합 부위를 포함하는 항체 단편이다. 이 영역은 예를 들면, scFv에서, 속성상 공유결합일 수 있는, 밀접하게 결합(tight asssociation)된 하나의 중쇄 가변 도메인과 하나의 경쇄 가변 도메인의 이량체로 구성된다. 각각의 가변 도메인의 3개의 CDR이 VH-VL 이량체의 표면 상에 항원 결합 부위를 정의하기 위해 상호작용하는 것이 이 구조(configuration)에서 이루어진다. 종합하면, 6개의 CDR, 또는 그들의 서브세트가 항체에 항원 결합 특이성을 부여한다. 그러나, 통상적으로 전체 결합 부위보다는 더 낮은 친화도이기는 하나, 단일 가변 도메인(또는 항원에 특이적인 3개의 CDR만 포함하는 Fv의 절반)도 항원을 인식하고 결합하는 능력을 가질 수 있다.
단쇄 Fv 또는 (scFv) 항체 단편은 항체의 VH 및 VL 도메인(또는 영역)을 포함하고, 이 도메인들은 단일 폴리펩티드 사슬에 존재한다. 일반적으로, Fv 폴리펩티드는 VH 도메인과 VL 도메인 사이에 폴리펩티드 링커를 더 포함하여, scFv가 항원 결합을 위한 원하는 구조를 형성할 수 있게 한다.
Fab 단편은 경쇄의 가변 도메인 및 불변 도메인과 중쇄의 가변 도메인 및 제1 불변 도메인(CH1)을 포함한다. F(ab')2 항체 단편은 일반적으로 그들 사이의 힌지 시스테인(hinge cysteine)에 의해 카르복시 말단 근처에서 일반적으로 공유결합에 의해 결합된 Fab 단편의 쌍을 포함한다. 항체 단편들의 다른 화학적 결합(chemical coupling)도 당해 분야에서 알려져 있다.
디아바디는 두 개의 항원-결합 부위를 갖는 작은 항체 단편이고, 이 단편들은 동일한 폴리펩티드 사슬 중 VL에 결합된 VH를 포함한다(VH 및 VL). 너무 짧아서 동일한 사슬에 있는 두 개의 도메인 간에 쌍 형성(pairing)을 가능하게 할 수 없는 링커를 이용하여, 도메인들은 또 다른 사슬의 상보적 도메인과 쌍을 형성하여 2개의 항원-결합 부위를 형성하도록 강제된다.
선형 항체는 상보적 경쇄 폴리펩티드와 함께, 한 쌍의 항원 결합 영역을 형성하는, 한 쌍의 탠뎀 Fd 세그먼트(VH-CH1-VH-CH1)를 포함한다. 선형 항체는 이중 특이성이거나 또는 단일 특이성일 수 있다.
본 개시의 항체 및 항체 단편은 원하는 효과인자(effector) 기능 또는 혈청 반감기를 제공하기 위해 Fc 영역에서 변형될 수 있다.
항체의 다량체화는 항체의 천연 응집(natrual aggregation)을 통해 또는 당해 분야에서 공지된 화학적 또는 재조합 연결(linking) 기법을 통해 달성될 수 있다. 예를 들면, 정제된 항체 제제(preparation)(예를 들면, 정제된 IgG1 분자)의 일부는 자발적으로 항체 동형이량체(homodimer) 및 기타 고차 항체 다량체(higher-order antibody multimer)를 포함한 단백질 응집체(protein aggregate)를 형성한다.
대안적으로, 항체 동형이량체는 당해 분야에서 공지된 화학적 결합 기법을 통해 형성될 수 있다. 예를 들면, SMCC(succinimidyl 4-(maleimidomethyl)cyclohexane-1-carboxylate) 및 SATA(N-succinimidyl S-acethylthio-acetate)를 포함하나, 이에 한정되지 않는 헤테로-이관능성 가교제(heterobifunctional crosslinking agent)가 항체 다량체를 형성하기 위해 이용될 수 있다. 항체 동형이량체의 형성을 위한 전형적 프로토콜이 Ghetie et al. (Proc. Natl . Acad . Sci . U.S.A . 94: 7509-7514, 1997)에 기재된다. 항체 동형이량체는 펩신에 의한 분해(digestion)을 통해 Fab'2 동형이량체로 전환될 수 있다. 항체 동형이량체를 형성하는 또 다른 방법은 Zhao et al. (J. Immunol . 25:396-404, 2002)에 기재된 자기지향성(autophilic) T15 펩티드의 이용을 통해서이다.
일부 구체예에서, 다중-특이성 항체는 이중-특이성 항체이다. 이중-특이성 항체는 재조합 세포 배양물로부터 회수되는 이형이량체(heterodimer)의 비율을 최대화하기 위해 한 쌍의 항체 사이의 인터페이스를 공학적으로 조작(engineering)하는 것에 의해 제조될 수 있다. 예를 들면, 인터페이스는 항체 불변 도메인의 CH3 도메인의 적어도 일부를 포함할 수 있다. 이 방법에서, 제1 항체 분자의 인터페이스로부터의 하나 또는 그 이상의 작은 아미노산 곁사슬이 더 큰 곁사슬(예를 들면, 티로신 또는 트립토판)에 의해 교체된다. 큰 아미노산 곁사슬을 더 작은 곁사슬(예를 들면, 알라닌 또는 트레오닌)로 치환하는 것에 의해 제2 항체 분자의 인터페이스 상에 큰 곁사슬과 동일하거나 또는 유사한 크기의 보상적(compensatory) "공간(cavity)"이 생성된다. 이는 동형이량체와 같은 기타 원치않는 최종-생성물 대비 이형이량체의 수율을 증가시키는 메카니즘을 제공한다. 이 방법은 예를 들면, 그 전체가 참조에 의해 본 명세서에 포함된, WO 96/27011에 기재된다.
이중-특이성 항체는 가교된 또는 "이형접합체(heteroconjugate)" 항체를 포함한다. 예를 들면, 이형접합체에서 항체 중 하나는 아비딘에 결합되고, 나머지 하나는 비오틴에 결합될 수 있다. 이형접합체 항체는 또한 편리한 가교-방법을 이용하여 제조될 수 있다. 적합한 가교제 및 가교 기법이 당해 분야에서 잘 알려져 있고, 참조에 의해 그 전체가 본 명세서에 포함된, 미국특허 제4,676,980호에 개시된다.
항체 단편으로부터 이중-특이성 항체를 생산하는 방법이 또한 당해 분야에서 알려져 있다. 예를 들면, 이중-특이성 항체는 화학적 결합(chemical linkage)를 통해 제조될 수 있다. Brennan et al. (Science 229:81, 1985)은 온전한 항체가 단백질 가수분해에 의해(proteolytically) 절단되어 F(ab')2 단편을 생성하는 것인 절차를 기재한다. 이 단편들은 인접한 디티올을 안정화시키고 분자간 이황화결합(intermolecular disulfide) 형성을 방지하기 위해 디티올 착화제(complexing agent) 아비산 나트륨(sodium arsenite)의 존재 하에 환원된다. 그 후, 생성된 Fab' 단편이 티오니트로벤조에이트 (TNB) 유도체로 전환된다. 그 후, Fab' TNB 유도체 중 하나가 머캅토에틸아민(mercaptoethylamine)에 의한 환원에 의해 Fab' 티올로 재전환되고, 동일 몰량(equimolar amount)의 또 다른 Fab' TNB 유도체와 혼합되어 이중-특이성 항체를 형성한다.
본 명세서에 기재된 항체 또는 항원-결합 단편은 안정화 분자(예를 들면, 개체 또는 용액 중에서 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 반감기를 증가시키는 분자)에 접합될 수 있다. 안정화 분자의 비-한정적 예는 중합체(예를 들면, 폴리에틸렌 글리콜) 또는 단백질(예를 들면, 혈청 알부민, 예를 들면, 인간 혈청 알부민)을 포함한다. 안정화 분자의 접합(conjugation)은 인 비트로(예를 들면, 조직 배양 중에서 또는 약제학적 조성물로 보관될 때) 또는 인 비보(예를 들면, 인간에서)에서 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 반감기를 증가시키거나 또는 생물학적 활성을 연장시킬 수 있다.
항체 특성 (Antibody Characteristics)
본 명세서에 기재된 항체 또는 항원-결합 단편은 CTAL4와 CD80 간의 결합, 및/또는 CTLA4와 CD86 간의 결합을 차단할 수 있다. CTAL4와 CD80 간의 결합, 및/또는 CTLA4와 CD86 간의 결합을 차단하는 것에 의해, 항-CTLA4 항체는 CTLA4 억제 경로를 방해하고, 면역 반응을 상향조절한다.
일부 구체예에서, 항체(또는 그의 항원-결합 단편)는 1 x 10-6 M 미만, 1 x 10-7 M 미만, 1 x 10-8 M 미만, 1 x 10-9 M 미만, 1 x 10-10 M 미만의 해리 상수(dissociation constant)(Kd)로 CTLA4(예를 들면, 인간 CTLA4, 원숭이 CLTA4, 마우스 CTLA4, 및/또는 키메라 CTLA4)에 특이적으로 결합한다. 일부 구체예에서, Kd는 20 nM 미만, 15 nM 미만, 10 nM 미만, 9 nM 미만, 8 nM 미만, 7 nM 미만, 6 nM 미만, 5 nM 미만, 4 nM 미만, 3 nM 미만, 2 nM 미만, 또는 1 nM 미만이다.
일부 구체예에서, Kd는 1 x 10-7 M 초과, 1 x 10-8 M 초과, 1 x 10-9 M 초과, 1 x 10-10 M 초과, 1 x 10-11 M 초과, 또는 1 x 10-12 M 초과이다.
항원에 대한 항체의 친화도를 측정하는 일반적인 기법은 예를 들면, ELISA, RIA, 및 표면 플라스몬 공명(surface plasmon resonance)(SPR)을 포함한다. 일부 구체예에서, 항체는 인간 CTLA4 (서열번호 41), 원숭이 CTLA4 (예를 들면, 레서스 원숭이(rhesus macaque) CTLA4, 서열번호 43), 키메라 CTLA4 (서열번호 44), 및/또는 마우스 CTLA4 (서열번호 42)에 결합한다. 일부 구체예에서, 항체는 인간 CTLA4 (서열번호 41), 원숭이 CTLA4 (예를 들면, 레서스 원숭이 CTLA4, 서열번호 43), 키메라 CTLA4 (서열번호 44), 및/또는 마우스 CTLA4 (서열번호 42)에 결합하지 않는다.
일부 구체예에서, 항체는 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 110%, 120%, 130%, 140%, 150%, 160%, 170%, 180%, 190%, 또는 200% 보다 높은 종양 성장 억제율(tumor growth inhibition percentage)(TGI%)을 갖는다. 일부 구체예에서, 항체는 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 110%, 120%, 130%, 140%, 150%, 160%, 170%, 180%, 190%, 또는 200% 미만의 종양 성장 억제율을 갖는다. TGI%는 예를 들면, 치료 개시 후 3 일, 4 일, 5 일, 6 일, 7 일, 8 일, 9 일, 10 일, 11 일, 12 일, 13 일, 14 일, 15 일, 16 일, 17 일, 18 일, 19 일, 20 일, 21 일, 22 일, 23 일, 24 일, 25 일, 26 일, 27 일, 28 일, 29 일, 또는 30 일에, 또는 치료 개시 후, 1 개월, 2 개월, 3 개월, 4 개월, 5 개월, 6 개월, 7 개월, 8 개월, 9 개월, 10 개월, 11 개월, 또는 12 개월에 측정될 수 있다. 본 명세서에서 사용된, 종양 성장 억제율(TGI%)은 하기 식을 이용하여 계산된다:
TGI (%) = [1-(Ti-T0)/(Vi-V0)]x100
Ti는 i일차에 치료군(treatment group)의 평균 종양 부피(average tumor volume)이다. T0는 0일차에 치료군의 평균 종양 부피이다. Vi는 i일차에 대조군의 평균 종양 부피이다. V0는 0일차에 대조군의 평균 종양 부피이다.
항- CTLA4 항체의 제조 방법
인간 CTLA4의 단리된 단편이 다중클론 항체 및 단일클론 항체 제조를 위한 표준 기법을 이용하여 항체를 생성하기 위해 면역원(immunogen)으로 사용될 수 있다. 다중클론 항체는 항원성 펩티드 또는 단백질의 복수 주사(예를 들면, 피하 주사 또는 복막내 주사)에 의해 동물에서 유도될 수 있다. 일부 구체예에서, 항원성 펩티드 또는 단백질은 하나 이상의 아쥬반트(adjuvant)와 함께 주사된다. 일부 구체예에서, 항원성 펩티드 또는 단백질은 면역화될 종에서 면역원성인 작용제(agent)에 접합될 수 있다. 동물은 항원성 펩티드 또는 단백질을 2회 이상(예를 들면, 2회, 3회, 또는 4회) 주사받을 수 있다.
전장 폴리펩티드 또는 단백질이 면역원으로서 사용될 수 있거나, 또는 대안적으로 그의 항원성 펩티드 단편이 면역원으로서 사용될 수 있다. 단백질의 항원성 펩티드는 상기 펩티드에 대해 유도된 항체가 CTLA4와 특이적 면역 복합체를 형성하도록, CTLA4의 아미노산 서열의 8개 이상(예를 들면, 10개 이상, 15개 이상, 20개 이상, 또는 30개 이상)의 아미노산 잔기를 포함하고 CTLA4의 에피토프를 포함한다. 전술된 바와 같이, 인간 CTLA4의 전장이 당해 기술 분야에서 공지되어 있다(서열번호 41).
면역원은 일반적으로 적합한 개체(예를 들면, 인간 또는 하나 이상의 인간 면역글로불린 로커스(locus)를 발현하는 형질전환 동물)를 면역화시키는 것에 의해 항체를 제조하기 위해 사용된다. 적합한 면역원성 제제(immunogenic preparation)는 예를 들면, 재조합에 의해 발현된(recombinantly-expressed) 또는 화학적으로 합성된(chemically-synthesized) 폴리펩티드(예를 들면, 인간 CTLA4의 단편)를 포함할 수 있다. 제제는 또한 아쥬반트, 예를 들면, 프로인트 완전 또는 불완전 아쥬반트(Freund's complete or incomplete adjuvant), 또는 유사한 면역자극제(immunostimulatory agent)를 더 포함할 수 있다.
다중클론 항체는 면역원으로서 CTLA4 폴리펩티드, 또는 그의 항원성 펩티드 (예를 들면, CTLA4의 일부)로 적합한 개체를 면역화시키는 것에 의해 전술된 바와 같이 제조될 수 있다. 표준 기법, 예를 들면, 고정화된 CTLA4 폴리펩티드 또는 펩티드를 이용한 ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay)에 의해, 시간의 경과에 따라 면역화된 개체의 항체 역가(antibody titer)를 모니터링할 수 있다. 필요한 경우, 항체 분자를 포유동물로부터(예를 들면, 혈액으로부터) 단리하고, 공지된 기법, 예를 들면, IgG 분획을 얻기 위한 단백질 G 크로마토그래피의 단백질 A에 의해 더 정제할 수 있다. 면역화 후 적절한 시점에, 예를 들면, 특이적 항체 역가가 최고치일때, 개체로부터 항체-생성 세포를 수득하고, 표준 기법, 예를 들면, Kohler et al. (Nature 256:495-497, 1975)에 의해 최초로 기재된 하이브리도마 기법, 인간 B 세포 하이브리도마 기법(Kozbor et al., Immunol . Today 4:72, 1983), EBV-하이브리도마 기법(Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96, 1985), 또는 트리오마(trioma) 기법에 의해 단일클론 항체를 제조하기 위해 사용할 수 있다. 하이브리도마를 생산하는 기술이 잘 알려져 있다(전반적으로, Current Protocols in Immunology, 1994, Coligan et al. (Eds.), John Wiley & Sons, Inc., New York, NY 참조). 단일클론 항체를 생산하는 하이브리도마 세포는 목적 폴리펩티드 또는 에피토프에 결합하는 항체에 대해, 예를 들면, 표준 ELISA 분석을 이용하여 하이브리도마 배양물 상층액을 스크리닝하는 것에 의해 검출된다.
본 명세서에 기재된 항체 또는 항원-결합 단편의 변이체는 본 명세서에 기재된 인간 항체, 인간화 항체, 또는 그의 항원-결합 단편을 코딩하는 DNA에 적절한 뉴클레오티드 변화를 도입하는 것에 의해, 또는 펩티드 합성에 의해 제조될 수 있다. 그러한 변이체는 예를 들면, 항체 또는 항원-결합 도메인의 항원-결합 부위를 구성하는 아미노산 서열 내에 아미노산 잔기의 결실, 삽입, 또는 치환을 포함한다. 그러한 변이체의 집단에서, 일부 항체 또는 항원-결합 단편은 표적 단백질, 예를 들면, CTLA4에 대한 증가된 친화도를 가질 것이다. 표적에 대한 증가된 결합 친화도를 갖는 항체 또는 항원-결합 단편에 도달하기 위해 결실, 삽입, 및/또는 치환의 임의의 조합이 이루어질 수 있다. 항체 또는 항원-결합 단편 내에 도입된 아미노산 변화는 또한 항체 또는 항원-결합 단편을 변화시키거나 또는 그에 새로운 번역후 변형(post-translational modification)을 도입할 수 있고, 예를 들면, 글리코실화 부위의 개수를 변화(예를 들면, 증가 또는 감소)시키거나, 글리코실화 부위의 타입을 변화시키거나(예를 들면, 세포에 존재하는 효소에 의해 다른 당이 부착되도록 아미노산 서열을 변화시키거나), 또는 새로운 글리코실화 부위를 도입할 수 있다.
본 명세서에 기재된 항체는 포유류를 포함한, 동물의 종으로부터 유래될 수 있다. 원형 항체(native antibody)의 비-한정적 예는 인간, 영장류, 예를 들면, 원숭이 및 유인원, 소, 돼지, 말, 양, 낙타과(예를 들면, 낙타 및 라마), 닭, 염소, 및 인간 항체를 생산하도록 유전적으로 조작된 형질전환 설치류를 포함한, 설치류(예를 들면, 랫트, 마우스, 햄스터, 및 토끼)로부터 유래될 수 있다.
인간 및 인간화 항체는 인간 생식세포계열 면역글로불린 서열(human germline immunoglobulin sequence)로부터 유래된(또는 이들로부터 유래된 것과 동일한 아미노산 서열을 갖는) 가변 영역 및 불변 영역을 갖는 항체를 포함한다. 인간 항체는 예를 들면, CDR에, 인간 생식세포계열 면역글로불린 서열에 의해 코딩되지 않은 아미노산 잔기(예를 들면, 인 비트로에서 랜덤 또는 부위-특이적 돌연변이생성이나, 인 비보에서 체세포 돌연변이에 의해 도입된 돌연변이)를 포함할 수 있다.
인간화 항체는 통상적으로 비-인간 CDR에 그래프트된(grafted) 인간 프레임워크(FR)를 갖는다. 따라서, 인간화 항체는 그에 도입된 비-인간 출처로부터 유래된 하나 이상의 아미노산 서열을 갖는다. 이러한 비-인간 아미노산 잔기들은 종종 "이입(import)" 잔기로 지칭되고, 이들은 통상적으로 "이입" 가변 도메인으로부터 취해진다. 인간화는 본질적으로, 예를 들면, 인간 항체의 상응하는 서열을 설치류 CDR 서열로 치환하는 것에 의해 수행될 수 있다. 이러한 방법은 예를 들면, Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332:323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536 (1988)에 기재되고; 이들 각각은 전체로 참조에 의해 본 명세서에 포함된다. 따라서, "인간화(humanized)"는 온전한 인간 V 도메인의 일부가 비-인간 종으로부터의 상응하는 서열에 의해 치환된 것인 키메라 항체이다. 실제로, 인간화 항체는 통상적으로, 일부 CDR 잔기 및 일부 FR 잔기가 인간 항체의 유사한 부위로부터의 잔기에 의해 치환된 것인 마우스 항체이다.
인간화 항체의 제조에서 사용되는 인간 VH 및 VL 도메인의 선택이 면역원성의 저하를 위해 매우 중요하다. 소위 "최적합(best-fit)" 방법에 따라, 마우스 항체의 V 도메인의 서열이 공지된 인간-도메인 서열의 전체 라이브러리에 대해 스크리닝된다. 마우스의 서열에 가장 근접한 인간 서열이 인간화 항체를 위한 인간 FR로서 허용된다(Sims et al., J. Immunol., 151:2296 (1993); Chothia et al., J. Mol. Biol., 196:901 (1987)).
항체가 항원에 대한 높은 특이성 및 친화도와 기타 유용한 생물학적 특성을 유지하면서 인간화되는 것이 또한 중요하다. 이 목표를 달성하기 위해, 부모(parental) 서열 및 인간화 서열의 3차원 모델을 이용하여 부모 서열과 다양한 개념적 인간화 산물(conceptual humanized product)의 분석 과정에 의해 인간화 항체가 제조될 수 있다. 삼차원 면역글로불린 모델이 일반적으로 이용가능하고, 당업자에게 익숙하다. 선택된 후보 면역글로불린 서열의 개연성 있는(probable) 3차원 입체적 구조를 예시하고 표시하는 컴퓨터 프로그램이 이용가능하다. 이러한 표시의 검토는 후보 면역글로불린 구조의 기능에서의 잔기의 가능한 역할의 분석, 즉, 후보 면역글로불린이 그의 항원에 결합하는 능력에 영향을 미치는 잔기의 분석을 가능하게 한다. 이러한 방식으로, 원하는 항체 특성, 예를 들면, 표적 항원에 대한 증가된 친화도가 달성될 수 있도록 수령자 및 이입 서열로부터 FR 잔기가 선택되고, 조합될 수 있다.
통상적으로, 인간, 인간화, 또는 키메라 항-CTLA4 항체의 아미노산 서열 변이체는 원본 항체(original antibody)의 경쇄 또는 중쇄에 존재하는 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 것이다.
원본 서열(original sequence)에 대한 동일성(identity) 또는 상동성(homology)은 서열들을 정렬하고, 필요한 경우, 최대 퍼센트 서열 동일성을 달성하기 위해 갭을 도입하고, 보존적 치환을 서열 동일성의 일부로 고려하지 않은 후, 인간, 인간화, 또는 키메라 항-CTLA4 항체 내에 존재하는 서열과 동일한 후보 서열 내에 존재하는 아미노산 잔기의 비율이다. 항체 서열로의 N-말단, C-말단, 또는 내부 연장(extension), 결실, 또는 삽입은 서열 동일성 또는 상동성에 영향을 미치는 것으로 해석되지 않을 것이다.
항-CTLA4 항체 또는 항원-결합 단편으로의 추가적인 변형이 이루어질 수 있다. 예를 들면, 시스테인 잔기가 Fc 영역에 도입되어, 그에 의해 이 영역에서 사슬간 이황화 결합(interchain disulfide bond) 형성을 가능하게 할 수 있다. 그에 의해 생성된 동형이량체 항체(homodimeric antibody)는 인 비트로 및/또는 인 비보에서 증가된 반감기를 가질 수 있다. 인 비트로 및/또는 인 비보 증가된 반감기를 갖는 동형이량체 항체는 또한 예를 들면, Wolff et al. (Cancer Res. 53:2560-2565, 1993)에 기재된 바와 같이, 이형-이관능성 가교제(heterobifunctional cross-linker)를 이용하여 제조될 수 있다. 대안적으로, 이중(dual) Fc 영역을 갖는 항체가 공학적으로 제조될 수 있다(engineered)(예를 들면, Stevenson et al., Anti-Cancer Drug Design 3:219-230, 1989 참조).
일부 구체예에서, 항-CTLA4 항체 또는 그의 항원-결합 단편에 공유결합에 의한 변형이 이루어질 수 있다. 이러한 공유결합에 의한 변형이 화학적 합성 또는 효소에 의한 합성(enzymatic synthesis) 또는 효소에 의한 절단(cleavage) 또는 화학적 절단에 의해 이루어질 수 있다. 항체 또는 단편의 표적화된 아미노산을, 선택된 곁사슬 또는 N-말단 잔기 또는 C-말단 잔기와 반응할 수 있는 유기 유도화제(organic derivatization agent)와 반응시키는 것에 의해 항체 또는 항체 단편의 다른 종류의 공유결합적 변형이 분자에 도입될 수 있다.
재조합 벡터
본 개시는 또한 본 명세서에 개시된 단리된 폴리뉴클레오티드(예를 들면, 본 명세서에 개시된 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드)를 포함하는 재조합 벡터(예를 들면, 발현 벡터), 그 내부로 재조합 벡터가 도입된 숙주 세포(즉, 숙주 세포가 폴리뉴클레오티드 및/또는 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 포함함), 및 재조합 기법에 의한 재조합 항체 폴리펩티드 또는 그의 단편의 생산을 제공한다.
본 명세서에서 사용된, "벡터(vector)"는 벡터가 숙주 세포에 도입된 경우, 숙주 세포에 하나 이상의 목적 폴리뉴클레오티드(polynucleotide of interest)를 전달할 수 있는 구조체(construct)이다. "발현 벡터(expression vector)"는 발현 벡터가 도입된 숙주 세포에 하나 이상의 목적 폴리뉴클레오티드를 전달하고, 코딩된 폴리펩티드로 발현시킬 수 있다. 따라서, 발현 벡터에서, 목적 폴리뉴클레오티드는 벡터 내에서, 또는 숙주 세포의 게놈에서 목적 폴리뉴클레오티드의 통합 부위(integration site)에 있거나, 그 부근에 있거나, 또는 그를 플랭킹하는 프로모터(promoter), 인핸서(enhancer), 및/또는 폴리-A 테일(poly-A tail)과 같은 조절 요소(regulatory element)에 작동가능하게 연결되는 것에 의해 벡터 내에서 발현을 위해 배치되어, 목적 폴리뉴클레오티드가 발현 벡터가 도입된 숙주 세포에서 번역될 것이다.
벡터는 당해 기술 분야에서 공지된 방법, 예를 들면, 전기천공(electroporation), 화학적 형질감염(chemical transfection)(예를 들면, DEAE-덱스트란), 형질전환(transformation), 형질감염, 및 감염 및/또는 형질도입(transduction)(예를 들면, 재조합 바이러스에 의한 것)에 의해 숙주 세포 내로 도입될 수 있다. 따라서, 벡터의 비-한정적 예는 바이러스 벡터(재조합 바이러스를 생성하기 위해 이용될 수 있음), 노출된(naked) DNA 또는 RNA, 플라스미드, 코스미드(cosmid), 파아지 벡터(phage vector), 및 양이온성 축합제(catiionic condensing agent)와 결합된 DNA 또는 RNA 발현 벡터를 포함한다.
일부 구체예에서, 본 명세서에 개시된 폴리뉴클레오티드(예를 들면, 본 명세서에 개시된 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드)는 바이러스 발현 시스템(예를 들면, 백시니아(vaccinia) 또는 기타 폭스(pox) 바이러스, 레트로바이러스, 또는 아데노바이러스)를 이용하여 도입될 수 있고, 이는 비-병원성(결함형(defective)), 복제 가능 바이러스(replication competent virus)의 이용을 포함할 수 있거나, 또는 복제 결함 바이러스(replication defective virus)를 이용할 수 있다. 후자의 경우에, 바이러스 증식은 일반적으로 바이러스 패키징 세포(virus packaging cell)를 보완하는 것에 의해 일어날 것이다. 적합한 시스템이, 예를 들면, Fisher-Hoch et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:317-321; Flexner et al., 1989, Ann. N.Y. Acad Sci. 569:86-103; Flexner et al., 1990, Vaccine, 8:17-21; 미국특허 제4,603,112호, 제4,769,330호, 및 제5,017,487호; WO 89/01973; 미국특허 제4,777,127호; GB 2,200,651; EP 0,345,242; WO 91/02805; Berkner-Biotechniques, 6:616-627, 1988; Rosenfeld et al., 1991, Science, 252:431-434; Kolls et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91:215-219; Kass-Eisler et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:11498-11502; Guzman et al., 1993, Circulation, 88:2838-2848; 및 Guzman et al., 1993, Cir. Res., 73:1202-1207에 개시된다. 그러한 발현 시스템에 DNA를 내포시키는 기법이 당업자에게 잘 알려져 있다. DNA는 또한, 예를 들어, Ulmer et al., 1993, Science, 259:1745-1749, 및 Cohen, 1993, Science, 259:1691-1692에 기재된 바와 같이, "노출된(naked)" 것일 수 있다. 노출된 DNA의 흡수는 세포 내로 효율적으로 수송되는 생분해성 비드 상에 DNA를 코팅하는 것에 의해 증가될 수 있다.
발현을 위해, 본 명세서에 개시된 항체-코딩 또는 폴리펩티드-코딩 폴리뉴클레오티드를 포함하는 DNA 삽입물(DNA insert)은 일부 예를 들면, 파아지 람다 PL(phage lamda PL) 프로모터, 대장균 lac, trp 및 tac 프로모터, SV40 초기 프로모터 및 후기 프로모터(SV40 early and late promoters), 및 레트로바이러스 LTR의 프로모터와 같은 적절한 프로모터(예를 들면, 이종기원(heterologous) 프로모터)에 작동가능하게 연결될 수 있다. 기타 적합한 프로모터가 당업자에게 공지되어 있다. 발현 구조체(expression construct)는 발현 개시, 종료, 및 발현된 영역 중 번역을 위한 리보솜 결합 부위(ribosome binding site)를 더 포함할 수 있다. 발현 구조체에 의해 발현된 성숙 전사물(mature transcript)의 코딩 부분은 번역될 폴리펩티드의 개시부에 번역 개시 코돈 및 말단에 적절하게 위치한 종료 코돈(UAA, UGA, 또는 UAG)을 포함할 수 있다.
표시된 바와 같이, 발현 벡터는 하나 이상의 선택 마커(selectable marker)를 포함할 수 있다. 그러한 마커는 진핵세포 배양을 위한 디히드로폴레이트 리덕타아제(dihydrofolate reductase) 유전자 또는 네오마이신 저항성(neomycin resistance) 유전자 및 대장균 및 기타 박테리아의 배양을 위한 테트라사이클린 또는 암피실린 저항성 유전자를 포함할 수 있다. 적합한 숙주의 대표적 예는 박테리아 세포, 예를 들면, 대장균(E. coli), 스트렙토마이세스(Streptomyces) 및 살모넬라 티피뮤리움(Salmonella typhimurium) 세포; 균류 세포(fungal cell), 예를 들면, 효모 세포; 곤충 세포, 예를 들면, 드로소필라(Drosophila) S2 및 스포돕테라(Spodoptera) Sf9 세포; 동물 세포, 예를 들면, CHO, COS, 보우즈 흑색종(Bowes melanoma), 및 HK 293 세포; 및 식물 세포를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 본 명세서에 기재된 숙주 세포를 위한 적합한 배양 배지 및 조건이 당해 분야에서 공지되어 있다.
박테리아에서 사용하기 위한 벡터의 비-한정적 예는 Qiagen으로부터 입수가능한 pQE70, pQE60 및 pQE-9; Stratagene으로부터 입수가능한 pBS 벡터, Phagescript 벡터, Bluescript 벡터, pNH8A, pNH16a, pNH18A, pNH46A; 및 Pharmacia로부터 입수가능한 ptrc99a, pKK223-3, pKK233-3, pDR540, pRIT5를 포함한다. 비-한정적 진핵세포 벡터는 Stratagene으로부터 입수가능한 pWLNEO, pSV2CAT, pOG44, pXT1 및 pSG; 및 Pharmacia로부터 입수가능한 pSVK3, pBPV, pMSG 및 pSVL을 포함한다. 기타 적합한 벡터가 당업자에게 용이하게 자명할 것이다.
사용하기에 적합한 비-한정적 박테리아 프로모터는 대장균 lacI 및 lacZ 프로모터, T3 및 T7 프로모터, gpt 프로모터, 람다 PR 및 PL 프로모터 및 trp 프로모터를 포함한다. 적절한 진핵세포 프로모터는 CMV IE(CMV immediate early) 프로모터, HSV TK(thymidine kinase) 프로모터, 초기 및 후기 SV40 프로모터(early and late SV40 promoter), 레트로바이러스 LTR의 프로모터, 예를 들면, RSV(Rous sarcoma virus)의 프로모터, 및 메탈로티오네인(metallothionein) 프로모터, 예를 들면, 마우스 메탈로티오네인-I 프로모터(mouse metallothionein-I promoter)를 포함한다.
효모 사카로마이세스 세레비시애(Saccharomyces cerevisiae)에서, 구성적(constitutive) 프로모터 또는 유도성(inducible) 프로모터, 예를 들면, 알파 인자(alpha factor), 알코올 옥시다아제, 및 PGH를 포함하는 다수의 벡터가 사용될 수 있다. 리뷰를 위해, Ausubel et al. (1989) Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, N.Y, and Grant et al., Methods Enzymol., 153: 516-544 (1997)를 참조한다.
구조체(construct)를 숙주 세포 내로 도입하는 것은 칼슘 포스페이트 형질감염(calcium phosphate transfection), DEAE-덱스트란 매개 형질감염, 양이온성 지질-매개 형질감염, 전기천공, 형질도입(transduction), 감염 또는 기타 방법에 의해 이루어질 수 있다. 그러한 방법이 다수의 표준 실험실 매뉴얼, 예를 들면, Davis et al., Basic Methods In Molecular Biology (1986)에 기재된다.
고등 진핵생물에 의한 본 개시의 항체를 코딩하는 DNA의 전사는 벡터 내에 인핸서 서열을 삽입시키는 것에 의해 증가될 수 있다. 인핸서는 주어진 숙주 세포 타입에서 프로모터의 전사 활성을 증가시키도록 작용하는, 통상 약 10 내지 300 bp DNA의 시스-작용 요소(cis-acting element)이다. 인핸서의 예는 복제 원점으로부터 후측(late side)에 100 내지 270 bp로 위치한, SV40 인핸서, CMV EP 인핸서 (cytomegalovirus early promoter enhancer), 복제 원점의 후측 폴리오마 인핸서(polyoma enhancer) 및 아데노바이러스 인핸서를 포함한다.
번역된 단백질의 소포체(ER)의 내강(lumen), 주변세포질 공간(periplasmic space), 또는 세포외 환경으로의 분비를 위해, 적합한 분비 신호가 발현되는 단백질에 내포될 수 있다. 신호는 폴리펩티드에 내생적일 수 있거나, 또는 신호는 이종기원(heterologous) 신호일 수 있다.
폴리펩티드 (예를 들면, 항체)는 변형된 형태, 예를 들면, 융합 단백질(예를 들면, GST-융합체(fusion)) 또는 히스티딘-택(histidine-tag)을 갖는 형태로 발현될 수 있고, 분비 신호뿐 아니라, 추가적인 이종기원 기능 영역(heterologous functional region)을 포함할 수 있다. 예를 들면, 추가적인 아미노산, 특히 하전된 아미노산의 영역이 숙주 세포 내에서, 정제 동안, 또는 후속 처리 및 보관 동안, 안정성 및 지속성(persistence)를 개선하기 위해 폴리펩티드의 N-말단에 첨가될 수 있다. 또한, 정제를 촉진하기 위해, 폴리펩티드에 펩티드 모이어티가 첨가될 수 있다. 그러한 영역은 폴리펩티드의 최종 제조 전에 제거될 수 있다. 분비 또는 배출을 가능하게 하고, 안정성을 개선하고, 정제를 촉진하기 위한 펩티드 모이어티의 폴리펩티드로의 첨가가 특히 당해 분야에서 익숙하고, 일반적인 기법이다.
치료 방법
본 개시의 항체 또는 항체들, 또는 그의 항원-결합 단편은 다양한 치료 목적을 위해 이용될 수 있다. 일 양태에서, 본 개시는 개체에서 암을 치료하는 방법, 개체에서 시간의 경과에 따라 종양의 부피 증가 속도를 감소시키는 방법, 전이를 발생할 위험을 감소시키는 방법, 또는 개체에서 추가적인 전이를 발생할 위험을 감소시키는 방법을 제공한다. 일부 구체예에서, 치료는 암의 진행을 중단시키거나, 둔화시키거나, 지연시키거나, 또는 억제할 수 있다. 일부 구체예에서, 치료는 개체에서 암의 하나 이상의 증상의 개수, 중증도, 및/또는 지속기간(duration)의 감소를 가져올 수 있다.
일 양태에서, 본 개시는 필요로 하는 개체(예를 들면, 암을 갖거나, 암을 갖는 것으로 확인되거나 또는 진단된 개체)에게 본 명세서에 기재된 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 치료 유효량을 투여하는 단계를 포함하는 방법을 포함하고, 암은 예를 들면, 유방암(예를 들면, 3중-음성 유방암(triple-negative breast cancer)), 유암종(carcinoid cancer), 자궁경부암, 자궁내막암, 신경교종, 두경부암, 간암, 폐암, 소세포폐암, 림프종, 흑색종, 난소암, 췌장암, 전립선암, 신장암, 대장암, 위암, 고환암, 갑상선암, 방광암, 요도암, 또는 혈액암(hematologic malignancy)일 수 있다. 일부 구체예에서, 상기 암은 절제불능(unresectable) 흑색종 또는 전이성 흑색종, 비-소세포폐암(NSCLC), 소세포폐암(SCLC), 방광암, 또는 전이성 호르몬-불능성 전립선암(metastatic hormone-refractory prostate cancer)이다.
일부 구체예에서, 본 명세서에 기재된 조성물 및 방법은 암에 대한 위험성이 있는 환자의 치료를 위해 이용될 수 있다.
본 명세서에서 사용된, "유효량(effective amount)"은 질병, 예를 들면, 암의 진행의 중단, 둔화, 지연, 또는 억제를 포함한 유용한 또는 원하는 결과를 가져오기에 충분한 양 또는 용량(dosage)을 의미한다. 유효량은 예를 들면, 항체, 항원-결합 단편, 항체-코딩 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터, 및/또는 그의 조성물이 투여될 개체의 연령 및 체중, 증상의 중증도, 및 투여 경로 등에 따라 변할 것이고, 따라서, 투여는 개별적 기준으로 결정될 것이다.
유효량은 1회 또는 그 이상의 투여로 투여될 수 있다. 예로서, 항체 또는 항원-결합 단편의 유효량은 환자에서 암의 진행을 개선하고, 중단하고, 안정화시키고, 역전시키고, 억제하고, 둔화시키고, 및/또는 지연시키기에 충분한 양이거나 또는 인 비트로에서 세포(예를 들면, 생검된 세포(biopsied cell), 본 명세서에 기재된 암세포 또는 세포주(예를 들면, 암세포주))의 증식을 개선시키고, 중단하고, 안정화시키고, 역전시키고, 둔화시키고, 및/또는 지연시키기에 충분한 양이다. 당해 분야에서 이해되는 바와 같이, 항체 또는 항원-결합 단편의 유효량은 특히(inter alia), 환자 병력 및 사용되는 항체의 타입(및/또는 투여량)과 같은 기타 인자에 따라 변할 수 있다.
본 명세서에 개시된 항체, 항체-코딩 폴리뉴클레오티드, 및/또는 조성물의 투여를 위한 유효량 및 일정(schedule)은 경험적으로(empirically) 결정될 수 있고, 그러한 결정을 내리는 것은 당업자의 기술 내에 속한다. 당업자는 투여되어야 하는 용량이 예를 들면, 본 명세서에 개시된 항체, 항체-코딩 폴리뉴클레오티드, 및/또는 조성물을 투여받을 포유류, 투여 경로, 포유류에게 투여될 본 명세서에 개시된 항체, 항체-코딩 폴리뉴클레오티드, 항원-결합 단편, 및/또는 조성물 및 기타 약물의 특정한 타입에 의해 변할 것이라는 것을 이해할 것이다. 항체 또는 항원-결합 단편의 적합한 용량의 선택에 대한 지침(guidance)은 항체 및 항원-결합 단편의 치료 용도에 대한 문헌, 예를 들면, Handbook of Monoclonal Antibodies, Ferrone et al., eds., Noges Publications, Park Ridge, N.J., 1985, ch. 22 및 pp. 303-357; Smith et al., Antibodies in Human Diagnosis and Therapy, Haber et al., eds., Raven Press, New York, 1977, pp. 365-389에서 찾을 수 있다.
항체의 유효량의 통상적인 일일 용량(daily dosage)은 0.01 mg/kg 내지 100 mg/kg이다. 일부 구체예에서, 용량은 100 mg/kg 미만, 10 mg/kg 미만, 9 mg/kg 미만, 8 mg/kg 미만, 7 mg/kg 미만, 6 mg/kg 미만, 5 mg/kg 미만, 4 mg/kg 미만, 3 mg/kg 미만, 2 mg/kg 미만, 1 mg/kg 미만, 0.5 mg/kg 미만, 또는 0.1 mg/kg 미만일 수 있다. 일부 구체예에서, 용량은 10 mg/kg 초과, 9 mg/kg 초과, 8 mg/kg 초과, 7 mg/kg 초과, 6 mg/kg 초과, 5 mg/kg 초과, 4 mg/kg 초과, 3 mg/kg 초과, 2 mg/kg 초과, 1 mg/kg 초과, 0.5 mg/kg 초과, 0.1 mg/kg 초과, 0.05 mg/kg 초과, 또는 0.01 mg/kg 초과일 수 있다. 일부 구체예에서, 용량은 약 10 mg/kg, 약 9 mg/kg, 약 8 mg/kg, 약 7 mg/kg, 약 6 mg/kg, 약 5 mg/kg, 약 4 mg/kg, 약 3 mg/kg, 약 2 mg/kg, 약 1 mg/kg, 약 0.9 mg/kg, 약 0.8 mg/kg, 약 0.7 mg/kg, 약 0.6 mg/kg, 약 0.5 mg/kg, 약 0.4 mg/kg, 약 0.3 mg/kg, 약 0.2 mg/kg, 또는 약 0.1 mg/kg일 수 있다.
본 명세서에 기재된 방법에서, 하나 이상의 항체, 그의 항원-결합 단편, 또는 약제학적 조성물(예를 들면, 본 명세서에 기재된 항체, 항원-결합 단편, 또는 약제학적 조성물 중 하나) 및, 선택적으로, 하나 이상의 추가적인 치료제가 개체에게 주당 1회 이상(예를 들면, 주당 1회, 주당 2회, 주당 3회, 주당 4회, 1일 l회, 1일 2회, 또는 1일 3회) 투여될 수 있다. 일부 구체예에서, 2종 이상의 상이한 항체 및/또는 항원-결합 단편이 동일한 조성물(예를 들면, 액체 조성물)로 투여된다. 일부 구체예에서, 하나 이상의 항체 또는 항원-결합 단편 및 하나 이상의 추가적인 치료제가 동일한 조성물(예를 들면, 액체 조성물)로 투여된다. 일부 구체예에서, 하나 이상의 항체 또는 항원-결합 단편 및 하나 이상의 추가적인 치료제가 2종의 상이한 조성물(예를 들면, 하나 이상의 항체 또는 항원-결합 단편을 포함하는 액체 조성물 및 하나 이상의 추가적인 치료제를 포함하는 고체 경구 조성물)로 투여된다. 일부 구체예에서, 상기 하나 이상의 추가적인 치료제는 알약(pill), 정제(tablet), 또는 캡슐로 투여된다. 일부 구체예에서, 상기 하나 이상의 추가적인 치료제는 지연-방출형 경구 제형(sustained-release oral formulation)으로 투여된다.
일부 구체예에서, 하나 또는 그 이상의 추가적인 치료제는 하나 이상의 항체, 항원-결합 항체 단편, 또는 약제학적 조성물(예를 들면, 임의의 본 명세서에 기재된 항체, 항원-결합 항체 단편, 또는 약제학적 조성물)의 투여 전에 또는 그 후에 개체에게 투여될 수 있다. 일부 구체예에서, 상기 하나 또는 그 이상의 추가적인 치료제 및 상기 하나 이상의 항체, 항원-결합 항체 단편, 또는 약제학적 조성물(예를 들면, 임의의 본 명세서에 기재된 항체, 항원-결합 항체 단편, 또는 약제학적 조성물)은 개체에서 상기 하나 또는 그 이상의 추가적인 치료제 및 상기 하나 이상의 항체 또는 항원-결합 단편(예를 들면, 임의의 본 명세서에 기재된 항체 또는 항원-결합 단편)의 생체활성 기간(bioactive period)이 중첩되도록 개체에게 투여된다.
일부 구체예에서, 개체에 연장된 기간에 걸쳐(예를 들면, 적어도 1 주, 2 주, 3 주, 1 개월, 2 개월, 3 개월, 4 개월, 5 개월, 6 개월, 7 개월, 8 개월, 9 개월, 10 개월, 11 개월, 12 개월, 1 년, 2 년, 3 년, 4 년, 또는 5 년의 기간에 걸쳐) 상기 하나 이상의 항체, 항원-결합 항체 단편, 또는 약제학적 조성물(예를 들면, 임의의 본 명세서에 기재된 항체, 항원-결합 항체 단편, 또는 약제학적 조성물)이 투여될 수 있다. 숙련된 의료 전문가가 진단을 위한 본 명세서에 기재된 방법을 이용하거나 또는 치료의 유효성(예를 들면, 암의 하나 이상의 증상의 관찰)에 따라 치료 기간의 길이를 결정할 수 있다. 본 명세서에 기재된 바와 같이, 숙련된 의료 전문가는 또한 개체에게 투여되는 항체 또는 항원-결합 항체 단편(및/또는 하나 이상의 추가적인 치료제)의 실체(identity) 및 개수(예를 들면, 증가 또는 감소)를 변경할 수 있고, 또한 치료의 유효성의 평가(예를 들면, 본원 명세서에 기재되고 당해 분야에서 공지된 방법을 이용한 평가)에 근거하여 하나 이상의 항체 또는 항원-결합 항체 단편(및/또는 하나 이상의 추가적인 치료제)의 투여의 용량 또는 빈도를 조정(예를 들면, 증가 또는 감소)할 수 있다.
약제학적 조성물 및 투여 경로
또한, 본 명세서에 기재된 항체 또는 항원-결합 단편을 하나 이상(예를 들면, 1개, 2개, 3개, 또는 4개) 포함하는 약제학적 조성물이 본 명세서에서 제공된다. 본 명세서에 기재된 항체 또는 항원-결합 단편 중 2개 또는 그 이상(예를 들면, 2개, 3개, 또는 4개)이 임의의 조합으로 약제학적 조성물에 존재할 수 있다. 약제학적 조성물은 당해 분야에서 공지된 방식으로 제형화될 수 있다.
약제학적 조성물은 의도된 투여 경로(예를 들면, 정맥내, 동맥내, 근육내, 피내(intradermal), 피하, 또는 복막내 경로)에 적합하도록 제형화된다. 조성물은 무균 희석제(예를 들면, 무균수 또는 무균 염수(sterile saline)), 고정유(fixed oil), 폴리에틸렌 글리콜, 글리세린, 프로필렌 글리콜, 또는 기타 합성 용매, 항세균제 또는 항진균제, 예를 들면, 벤질 알코올, 또는 메틸 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 아스코르브산, 티메로살, 등, 항산화제, 예를 들면, 아스코르브산 또는 소디움 비술피트(sodium bisulfite), 킬레이트제, 예를 들면, 에틸렌디아민테트라아세트산, 완충제, 예를 들면, 아세테이트, 시트레이트, 또는 포스페이트, 및 등장화제(isotonic agent), 예를 들면, 당(예를 들면, 덱스트로오스), 폴리알코올(예를 들면, 만니톨 또는 소르비톨), 또는 염(예를 들면, 염화나트륨), 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 리포좀 현탁액(liposomal suspension)이 또한 약제학적으로 허용가능한 담체로 이용될 수 있다(예를 들면, 미국특허 제4,522,811호 참조). 조성물의 제제(preparations of the compositions)는 제형화되고, 앰플, 1회용 주사기, 또는 복수 용량 바이알(multiple dose vial)에 담길 수 있다. 필요한 경우(예를 들면, 주사 제형에서와 같이), 적절한 유동성(fluidity)이 예를 들면, 레시틴과 같은 코팅이나 계면활성제의 이용에 의해 유지될 수 있다. 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 흡수는 흡수를 지연시키는 작용제(예를 들면, 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴)를 포함시키는 것에 의해 연장될 수 있다. 대안적으로, 제어 방출(controlled release)이 생분해성, 생체적합성(biocompatible) 폴리머(예를 들면, 에틸렌 비닐 아세테이트, 폴리산무수물(polyanhydride), 폴리글리콜산, 콜라겐, 폴리오르토에스테르(polyorthoesters), 및 폴리락트산; Alza Corporation 및 Nova Pharmaceutical, Inc.)를 포함할 수 있는, 마이크로캡슐화 전달 시스템(microencapsulated delivery system) 및 이식물에 의해 달성될 수 있다.
본 명세서에 기재된 항체 또는 항원-결합 단편 중 하나 이상을 포함하는 조성물은 비경구(예를 들면, 정맥내, 동맥내, 근육내, 피내, 피하, 또는 복막내 ) 투여를 위해 투여 단위 제형(dosage unit form) (즉, 투여의 용이성 및 용량의 균일성을 위한 미리 정해진 양의 활성 화합물을 포함하는 물리적으로 구별되는 단위)으로 제형화될 수 있다.
조성물의 독성 및 치료적 효능은 세포 배양물 또는 실험 동물(예를 들면, 원숭이)에서 표준 약제학적 절차에 의해 결정될 수 있다. 예를 들면, LD50(집단의 50%에 대한 치사량) 및 ED50 (집단의 50%에서 치료적 유효량)을 결정할 수 있고: 치료 지수(therapeutic index)는 LD50:ED50의 비이다. 높은 치료 지수를 보이는 작용제가 바람직하다. 작용제가 원치않는 부작용을 보이는 경우, 잠재적 손상을 최소화하기 위해(즉, 원치않는 부작용을 줄이기 위해) 주의를 기울여야 한다. 독성 및 치료적 효능은 기타 표준 약제학적 절차에 의해 결정될 수 있다.
세포 배양물 분석 및 동물 연구로부터 수득된 데이터가 개체(예를 들면, 인간)에서의 사용을 위해 주어진 작용제의 적합한 용량을 제형화하기 위해 이용될 수 있다. 하나 이상(예를 들면, 1개, 2개, 3개, 또는 4개)의 항체 또는 그의 항원-결합 단편(예를 들면, 본원 명세서에 기재된 항체 또는 항체 단편)의 치료 유효량은 개체(예를 들면, 암을 갖는 것으로 확인된 인간 개체), 또는 질병을 발병할 위험을 갖는 것으로 확인된 개체(예를 들면, 이전에 암을 발병했었으나, 현재는 치료된 개체)에서 질병을 치료하거나(예를 들면, 암세포를 사멸시키거나) 개체(예를 들면, 인간)에서 질병의 하나 이상의 증상의 중증도, 빈도 및/또는 지속기간을 감소시키는 양일 것이다. 본 명세서에 기재된 항체 또는 항원-결합 단편의 효과 및 투여(dosing)는 보건 전문가 또는 수의학 전문가에 의해 당해 분야에서 공지된 방법을 이용하여, 및 개체(예를 들면, 인간)에서 질병의 하나 이상의 증상의 관찰에 의해 결정될 수 있다. 특정 인자들(예를 들면, 질병 또는 질환의 중증도, 치료 이력(previous treatments), 개체의 전반적인 건강 및/또는 연령, 및 기타 질병의 존재)이 개체를 효과적으로 치료하기 위해 요구되는 용량 및 시기에 영향을 미칠 수 있다.
예시적인 용량은 개체의 중량 킬로그램당 본 명세서에 기재된 항체 또는 항원-결합 단편의 밀리그램 또는 마이크로그램의 양(예를 들면, 약 1 ㎍/kg 내지 약 500 mg/kg; 약 100 ㎍/kg 내지 약 500 mg/kg; 약 100 ㎍/kg 내지 약 50 mg/kg; 약 10 ㎍/kg 내지 약 5 mg/kg; 약 10 ㎍/kg 내지 약 0.5 mg/kg; 또는 약 1 ㎍/kg 내지 약 50 ㎍/kg)을 포함한다. 이러한 투여량이 넓은 범위를 포함하나, 당업자는 항체 및 그의 항원-결합 단편을 포함한 치료제가 효능이 다양하고, 유효량이 당해 분야에서 공지된 방법에 의해 결정될 수 있다는 것을 이해할 것이다. 통상적으로, 비교적 낮은 용량이 먼저 투여되고, (치료적 응용의 경우)담당 의료 전문가 또는 수의학 전문가, 또는 (여전히 개발 단계에서 진행 중인 경우) 연구자가 적합한 반응이 수득될 때까지 뒤이어 및 점진적으로 용량을 증가시킬 수 있다. 또한, 특정한 개체에 대한 구체적인 용량 수준은 사용되는 특정 화합물의 활성, 개체의 연령, 체중, 전신 건강, 성별, 및 식이(diet), 투여 시기, 투여 경로, 배출 속도, 및 항체 또는 항체 단편의 인 비보 반감기를 포함한 다양한 인자들에 의존적일 것이다.
약제학적 조성물은 투여에 대한 설명서와 함께 용기, 팩(pack), 또는 디스펜서(dispenser)에 담길 수 있다.
도 1은 항-CTLA4 항체를 제조하는 예시적인 프로토콜의 제1부(first part)를 보여주는 흐름도(flow chart)이다.
도 2는 항-CTLA4 항체를 제조하는 예시적인 프로토콜의 제2부를 보여주는 흐름도이다.
도 3은 항-CTLA4 항체가 CTLA4와 CD80 간의 결합을 차단한다는 것을 보여주는 유세포 분석 그래프(flow cytometry graph)의 일 세트를 보여준다.
도 4는 항-CTLA4 항체가 CTLA4와 CD86 간의 결합을 차단한다는 것을 보여주는 유세포 분석 그래프의 일 세트를 보여준다.
도 5는 원숭이 CTLA4(rmCTLA4), 마우스 CTLA4(mCTLA4), 및 인간-마우스 키메라 CTLA4(chiCTLA4)에 대한 항-CTLA4 항체의 교차-반응성(cross-reactivity)의 유세포 분석 결과를 보여주는 그래프의 일 세트를 보여준다.
도 6은 항-CTLA4 항체 13A4 및 4G12로 처리된 MC-38 종양을 가진 B-hCTLA-4 인간화 마우스의 시간의 경과에 따른 체중을 보여주는 그래프이다.
도 7은 항-CTLA4 항체 13A4 및 4G12로 처리된 MC-38 종양을 가진 B-hCTLA-4 인간화 마우스의 시간의 경과에 따른 체중의 변화율(percentage change)을 보여주는 그래프이다.
도 8은 항-CTLA4 항체 13A4 및 4G12로 처리된 MC-38 종양을 가진 B-hCTLA-4 인간화 마우스의 시간의 경과에 따른 종양 크기를 보여주는 그래프이다.
도 9는 여보이(Yervoy) 및 13A4로 처리된 MC-38 종양을 가진 B-hCTLA-4 인간화 마우스의 시간의 경과에 따른 체중을 보여주는 그래프이다.
도 10은 여보이 및 13A4로 처리된 MC-38 종양을 가진 B-hCTLA-4 인간화 마우스의 시간의 경과에 따른 체중의 변화율을 보여주는 그래프이다.
도 11은 여보이 및 13A4로 처리된 MC-38 종양을 가진 B-hCTLA-4 인간화 마우스의 시간의 경과에 따른 종양 크기를 보여주는 그래프이다.
도 12는 여보이, 인간화 항-hCTLA4 항체 4G12-H1K1-IgG1 및 4G12-H2K1-IgG1로 처리된 MC-38 종양을 가진 B-hCTLA-4 인간화 마우스의 시간의 경과에 따른 체중을 보여주는 그래프이다.
도 13은 여보이, 인간화 항-hCTLA4 항체 4G12-H1K1-IgG1 및 4G12-H2K1-IgG1로 처리된 MC-38 종양을 가진 B-hCTLA-4 인간화 마우스의 시간의 경과에 따른 체중의 변화율을 보여주는 그래프이다.
도 14는 여보이, 인간화 항-hCTLA4 항체 4G12-H1K1-IgG1 및 4G12-H2K1-IgG1로 처리된 MC-38 종양을 가진 B-hCTLA-4 인간화 마우스의 시간의 경과에 따른 종양 크기를 보여주는 그래프이다.
도 15는 여보이, 인간화 항-hCTLA4 항체 13A4-H1K2-IgG1, 13A4-H2K2-IgG1, 13A4-H1K2-IgG4, 및 13A4-H1K2-IgG1-N297A로 처리된 MC-38 종양을 가진 B-hCTLA-4 인간화 마우스의 시간의 경과에 따른 체중을 보여주는 그래프이다.
도 16은 여보이, 인간화 항-hCTLA4 항체 13A4-H1K2-IgG1, 13A4-H2K2-IgG1, 13A4-H1K2-IgG4, 및 13A4-H1K2-IgG1-N297A로 처리된 MC-38 종양을 가진 B-hCTLA-4 인간화 마우스의 시간의 경과에 따른 체중의 변화율을 보여주는 그래프이다.
도 17은 여보이, 인간화 항-hCTLA4 항체 13A4-H1K2-IgG1, 13A4-H2K2-IgG1, 13A4-H1K2-IgG4, 및 13A4-H1K2-IgG1-N297A로 처리된 MC-38 종양을 가진 B-hCTLA-4 인간화 마우스의 시간의 경과에 따른 종양 크기를 보여주는 그래프이다.
도 18은 항-CTLA4 항체가 CTLA4와 인간 CD86 간의 결합을 차단한다는 것을 보여주는 유세포 분석 그래프의 일 세트이다.
도 19는 원숭이 CTLA4, 마우스 CTLA4, 및 인간-마우스 키메라 CTLA4에 대한 항-CTLA4 항체들의 교차 반응성의 유세포 분석 결과를 보여주는 그래프의 일 세트이다.
도 20은 CT4-04-13A4, CT4-20-6D2, 및 CT4-20-7E12로 처리된 MC-38 종양을 갖는 B-hCTLA-4 인간화 마우스의 시간의 경과에 따른 체중을 보여주는 그래프이다.
도 21은 CT4-04-13A4, CT4-20-6D2, 및 CT4-20-7E12로 처리된 MC-38 종양을 갖는 B-hCTLA-4 인간화 마우스의 시간의 경과에 따른 체중의 변화율을 보여주는 그래프이다.
도 22는 CT4-04-13A4, CT4-20-6D2, 및 CT4-20-7E12로 처리된 MC-38 종양을 갖는 B-hCTLA-4 인간화 마우스의 시간의 경과에 따른 종양 크기를 보여주는 그래프이다.
도 23은 Kabat 번호표기(numbering)에 의해 정의된 항-CTLA4 항체 13A4, 4G12, 6D2, 7E12 및 그들의 인간화 항체의 CDR 서열을 열거한다.
도 24는 Chothia 번호표기에 의해 정의된 항-CTLA4 항체 13A4, 4G12, 6D2, 7E12 및 그들의 인간화 항체의 CDR 서열을 열거한다.
도 25는 인간화 항-CTLA4 항체의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 열거한다.
도 26은 인간 CTLA4, 마우스 CTLA4, 원숭이 CTLA4, 및 키메라 CTLA4의 아미노산 서열을 열거한다.
도 27은 여러 마우스 항-hCTLA4 항체의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 보여준다.
실시예
본 발명은 하기 실시예에서 더 설명되고, 이들은 청구항에 기재된 본 발명의 범위를 한정하지 않는다.
실시예 1. 마우스 항- hCTLA4 항체의 생성
인간 CTLA4 (hCTLA4; 서열번호 41)에 대한 마우스 항체를 생성하기 위해, 6-8주령 암컷 BALB/c 마우스를 인간 CTLA4로 면역화시켰다. 하기에 기재된 방법에 의해 항-hCTLA4 항체를 수집하였다(도 1 및 도 2).
마우스의 면역화(immunization)
6-8주령 암컷 BALB/c 마우스를 20 ㎍/마우스로 100 ㎍/ml 농도의 his-태깅(his-tagged) 인간 CTLA4 단백질로 면역화시켰다. his-태깅 인간 CTLA4 단백질을 아쥬반트(adjuvant)로 유화시키고, 마우스의 등에 4개의 위치에서 주사했다. 1차 피하(s.c.) 주사를 위해, 희석된 항원을 동일한 부피의 CFA(Complete Freund's Adjuvant)로 유화시켰다. 후속 피하 주사에서, 단백질을 동일 부피의 IFA(Incomplete Freund's Adjuvant)로 유화시켰다. 3차 주사 또는 부스터 면역화(booster immunization) 후 3일차에, 혈액(혈청)을 수집하고 ELISA를 이용하여 항체 역가(antibody titer)를 분석하였다.
또 다른 실험에서, 6-8 주령 암컷 BALB/c 마우스에 인간 CTLA4를 코딩하는 발현 플라스미드를 주사하는 것에 의해 마우스를 면역화시켰다. 마우스당 60 ㎍으로, 1000 ㎍/㎕의 농도에서 유전자 총(gene gun)을 이용하여 마우스의 전경골근(tibialis anterior muscle)에 항원을 코딩하는 플라스미드를 주사하였다(근육내 주사; i.m. 주사). 각 주사 간 14일 이상의 간격으로 4회 이상 주사를 수행하였다. 마지막 면역 접종(immunizaiton) 후 7일차에 혈액(혈청)을 수집하고 ELISA에 의해 항체 역가에 대해 혈청을 테스트하였다.
이전 면역화 후 14일 이상 경과시 면역화를 강화하기 위한 절차를 또한 (플라스미드를 주사하거나 또는 단백질을 주사하는 것에 의해) 수행하였다. 표면에 CTLA4 항원을 발현하는 CHO 세포를 꼬리 정맥을 통해 마우스에 정맥내로 주사하였다. 주사 후 4일차에 비장을 수집하였다.
SP2/0 세포와 비장 세포의 융합
비장 조직을 분쇄했다. 먼저 비장 세포를 CD3ε Microbeads 및 Anti-Mouse IgM Microbeads에 의해 선택하고, SP2/0 세포와 융합시켰다. 그 후, 세포를 HAT(hypoxanthine-aminopterin-thymidine) 배지를 담은 96-웰 플레이트에 플레이팅했다.
하이브리도마의 일차 스크리닝
표준 절차에 따라 FACS(Fluorescence-Activated Cell Sorting)를 이용하여, 96-웰 플레이트에서 하이브리도마 상층액의 일차 스크리닝을 수행하였다. 스크리닝 전에 CHO(Chinese hamster ovary) 세포를 96-웰 플레이트에 첨가했다(웰 당 2 x 104개 세포). 50 ㎕의 상층액을 사용했다. 실험에서 사용된 항체는 다음과 같다:
(1) Fluorescein (FITC)-접합 AffiniPure F(ab)2 Fragment Goat Anti-Mouse IgG, Fcγ 단편 특이적, 및
(2) Alexa Fluor® 647-접합 AffiniPure F(ab)2 Fragment Goat Anti-Human IgG, Fcγ 단편 특이적.
서브- 클로닝 (Sub-cloning)
ClonePix2를 이용하여 서브-클로닝을 수행하였다. 요약하면, 일차 스크리닝 동안 확인된 양성 웰을 반고체(semisolid) 배지로 옮기고, IgG 양성 클론을 확인하고 테스트하였다. FITC 항-마우스 IgG Fc 항체를 사용하였다.
복수액 항체( Ascites fluid antibodies)
1 x 106개 양성 하이브리도마 세포를 B-NDG® 마우스(Beijing Biocytogen, Beijing, China)에 복막내로 주사하였다. 마우스의 복강 내에서 하이브리도마 세포를 증식시키는 것에 의해 단일클론 항체를 생산하였다. 하이브리도마 세포를 증식시키고 마우스의 복부에서 복수액을 생산하였다. 수득된 복수액은 향후 사용을 위해 채취될 수 있는 고농도의 항체를 포함했다.
항체의 정제
복수액 중 항체를 GE AKTA 단백질 크로마토그래피(GE Healthcare, Chicago, Illinois, United States)에 의해 정제하였다. CT4-04-13A4 ("13A4"), CT4-03-4G12 ("4G12"), CT4-20-6D2 ("6D2"), 및 CT4-20-7E12 ("7E12")가 전술된 방법에 의해 생성된 마우스 항체들에 속한다. 이 항체들의 중쇄 및 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열이 도 27에 제공된다.
실시예 2. 마우스 항체의 인간화
인간화를 위한 출발점은 마우스 항체(예를 들면, 13A4 및 4G12)였다. 이러한 마우스 항체의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 결정했다. 13A4에 대해, 상이한 치환의 순열(permutation)을 포함하는 5종의 인간화 중쇄 가변 영역 변이체(서열번호 13-17) 및 3종의 인간화 경쇄 가변 영역 변이체(서열번호 18-20)를 작제하였다(도 25). 인간화 13A4의 중쇄 및 경쇄 CDR1, CDR2, 및 CDR3 아미노산 서열이 서열번호 1-6 (Kabat 번호표기) 또는 서열번호 29-34 (Chothia 번호표기)로 표시되었다.
4G12에 대해, 상이한 치환의 순열을 포함하는 4종의 인간화 중쇄 가변 영역 변이체 (서열번호 21-24) 및 4종의 인간화 경쇄 가변 영역 변이체 (서열번호 25-28)를 작제하였다 (도 25). 인간화 4G12의 중쇄 및 경쇄 CDR1, CDR2, 및 CDR3 아미노산 서열이 서열번호 7-12 (Kabat 번호표기) 또는 서열번호 35-40 (Chothia 번호표기)으로 표시되었다.
이러한 인간화 항체를 표준 절차에 의해 생성하고 BioLuminate 1.0 (Schrodinger, Shanghai, China)의 사용에 의해 촉진시켰다.
실시예 3. 마우스 항- hCTLA4 항체의 인 비트로 테스팅 : CTLA4의 CD80 및 CD86으로의 결합 차단.
항-CTLA4 항체가 CTLA4와 CD80 간의 결합 및 CTLA4와 CD86 간의 결합을 차단할 수 있는지 여부를 결정하기 위해 차단 분석(blocking assay)를 수행하였다.
마우스 복수액으로부터 항-CTLA4 항체를 수집하고, 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 인간 CTLA4로 일시적으로 형질감염된 CHO 세포 25 ㎕를 플레이트의 각 웰에 첨가하였다. 정제된 항체를 50, 5, 0.5, 0.05, 0.005 ㎍/ml의 최종 농도까지 적정하였다. 적정된 항체를 4℃에서 웰당 25 ㎕로 각 웰에 첨가하고 30분 동안 인큐베이션시켰다.
Biotin-hCD80 또는 Biotin-hCD86을 0.4 ㎍/ml까지 적정시켰다. 50 ㎕의 리간드 용액을 각 웰에 첨가하여, Biotin-hCD80 또는 Biotin-hCD86의 최종 농도를 0.2 ㎍/ml가 되게 했다. 세포를 Biotin-hCD80 또는 Biotin-hCD86과 4℃에서 15분 동안 인큐베이션시켰다.
PBS(phosphate-buffered saline)로 세척 후에, 50 ㎕의 항-마우스 IgG Fc 항체 플루오레신 이소시아네이트 접합체(fluorescein isothiocyanate conjugate)(IgG Fc-FITC)와 스트렙타비딘-피코에리트린(streptavidin-Phycoerythrin) (streptavidin-PE)을 각 웰에 1:100 희석으로 4℃에서 첨가하고 15분 동안 인큐베이션시키고, 뒤이어 PBS로 세척하였다. 유세포 분석(flow cytometry)에 의해 FITC 및 PE에 대한 신호를 측정하였다.
도 3에 도시된 바와 같이, 마우스-항-hCTLA4 항체(CT4-04-13A4 및 CT4-03-4G12)의 농도가 증가한 경우, PE의 신호는 감소되어, 인간 CTLA4와 Biotin-hCD80 간의 결합이 CT4-04-13A4 및 CT4-03-4G12 항체에 의해 차단되었다는 것을 시사했다.
유사하게, 도 4에서, 항-hCTLA4 항체(CT4-04-13A4 및 CT4-03-4G12)의 농도가 증가한 경우, PE의 신호는 감소되어, 인간 CTLA4와 Biotin-hCD86 간의 결합이 CT4-04-13A4 및 CT4-03-4G12 항체에 의해 차단되었다는 것을 시사했다.
실시예 4. 원숭이, 마우스, 및 인간-마우스 키메라 CTLA4에 대한 키메라 항-hCTLA 항체의 교차-반응성
CHO 세포를 레서스 원숭이(rhesus macaque) CTLA4 (rmCTLA4, 서열번호 43), 마우스 CTLA4 (mCTLA4, 서열번호 42), 및 키메라 (마우스와 인간) CTLA4 (chiCTLA4, 서열번호 44)로 형질감염시켰다.
25 ㎕ CHO 세포를 각 웰에 첨가하였다. 25 ㎕의 정제된 키메라 항-hCTLA 항체(1 ㎍/ml) (CT4-03-4G12-mHvKv-IgG1 및 CT4-04-13A4-mHvKv-IgG1)를 각 웰에 첨가하고 4℃에서 30분 동안 인큐베이션시켰다. CT4-03-4G12-mHvKv-IgG1 및 CT4-04-13A4-mHvKv-IgG1은 키메라 항-hCTLA 항체이다. CT4-03-4G12-mHvKv-IgG1은 마우스 항체 4G12로부터의 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 도메인과 인간 IgG1 항체 불변 도메인(CL, CH1, CH2, CH3)을 갖는다. 유사하게, CT4-04-13A4-mHvKv-IgG1은 마우스 항체 13A4로부터의 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 도메인, 및 인간 IgG1 항체 불변 도메인(CL, CH1, CH2, CH3)을 갖는다.
PBS (1200 rmp, 5 분)로 2회 세척 후, 50 ㎕의 항-인간 IgG Fc 항체 플루오레신 이소티오시아네이트 접합체(IgG Fc-FITC)를 각 웰에 1:100 희석으로 첨가하고, 4℃에서 30분 동안 인큐베이션시키고, 뒤이어 PBS로 세척하였다. 유세포 분석에 의해 FITC에 대한 신호를 측정하였다.
도 5에 도시된 바와 같이, CT4-04-13A4-mHvKv-IgG1은 마우스 CTLA4와 교차 반응하지 않았고, rmCTLA4 및 키메라 CTLA4와 강한 교차 반응성을 가졌다. 유사하게, CT4-03-4G12-mHvKv-IgG1은 마우스 CTLA4와 교차 반응하지 않았고, rmCTLA4 및 키메라 CTLA4와 강한 교차 반응성을 가졌다. 도 5에서, NC는 음성 대조군(negative control)을 의미하고, PC는 양성 대조군(positive control)을 의미한다.
실시예 5. 마우스 항- hCTLA4 항체의 인 비보 테스팅
인 비보에서 항-hCTLA4 항체를 테스트하고, 인체에서 이러한 항체들의 효과를 예측하기 위해, CTLA-4 인간화 마우스 모델을 제조하였다. CTLA4 인간화 마우스 모델은 마우스 CTLA4 단백질의 세포외 영역의 일부가 인간 CTLA4 세포외 영역에 의해 치환된 것인 키메라 CTLA4 단백질(서열번호 44)을 발현하도록 작제되었다(engineered). 서열번호 44의 위치 41-143의 아미노산 잔기들은 인간 CTLA4로부터 유래된다. 인간화 마우스 모델 (B-hCTLA-4 인간화 마우스)은 인간과 마우스 CTLA4를 발현하는 일반 마우스 간의 임상 결과의 차이를 유이성 있게 감소시키는 것에 의해 임상적 상황(clinical setting)에서 신규한 치료법(therapeutic treatment)을 테스트하기 위한 새로운 도구를 제공할 수 있다.
결장암의 모델에서 인 비보 종양 성장에 대한 항-hCTLA4 항체의 효과를 입증하기 위해 항-hCTLA4 항체를 테스트하였다. MC-38 종양 세포(결장 선암(colon adenocarcinoma) 세포)를 B-hCTLA-4 인간화 마우스에 피하로 주사하였다. 마우스의 종양이 150 ± 50 mm3의 부피에 도달했을 때, 마우스를 종양의 부피에 기반하여 상이한 그룹으로 무작위로 배치하였다. 그 후, 마우스에 PBS 및 항-hCTLA4 항체를 정맥내로 주사하였다. 총 15일 동안, 매 3일 마다 항체를 주사하였다(총 6회 주사). 주사 용량은 마우스의 중량을 기준으로 10 ㎕/g로 계산하였다. 종양의 장축과 단축의 길이는 매주 2회 측정하고, 종양의 부피는 0.5 x (장축) x (단축)2으로 계산하였다. 주사 전, 마우스를 상이한 그룹에 배치했을 때(1차 항체 주사 전), 항체 주사 기간 동안 주당 2회, 및 안락사 전에 마우스의 중량도 측정하였다.
종양 성장 억제율(tumor growth inhibition　percentage)(TGI%)을 하기 식을 이용하여 계산하였다: TGI (%) = [1-(Ti-T0)/(Vi-V0)]x100. Ti는 i일차 치료군의 평균 종양 부피이다. T0은 0일차 치료군의 평균 종양 부피이다. Vi는 i일차 대조군의 평균 종양 부피이다. V0은 0일차 대조군의 평균 종양 부피이다.
통계 분석을 위해 T-검정을 수행하였다. 60%보다 높은 TGI%는 종양 성장의 유의한 억제를 나타낸다. P < 0.05가 유의한 차이를 나타내는 기준점(threshold)이다.
마우스 항- hCTLA4 항체 13A4 및 4G12에 대한 인 비보 결과
전체 치료 기간 동안 마우스의 중량을 모니터링하였다. 상이한 그룹 모두에서 마우스의 중량이 증가했다 (도 6, 및 도 7). 대조군과 항-hCTLA4 치료군 간에 중량의 유의성 있는 차이가 관찰되지 않았다. 결과는 항-hCTLA4 항체가 내약성이 우수했고(well tolerated) 마우스에 독성이 없었다는 것을 나타냈다.
그러나, 종양 크기는 항체 13A4 및 4G12로 처리된 그룹에서 유의성 있는 차이를 보였다(도 8). 도 8에 도시된 바와 같이, 13A4와 4G12는 농도 의존적 방식으로 종양 성장을 억제했다. 흥미롭게도, 0.3 mg/kg의 용량에서 4G12는 1 mg/kg 용량의 4G12에 비해 더 우수한 결과를 가져서, 4G12의 상대적으로 낮은 용량(예를 들면, 0.5 mg/kg 미만, 또는 0.1 mg/kg 내지 0.5 mg/kg)이 최상의 결과를 달성할 수 있다는 것을 시사했다.
각 치료군의 22일차 TGI%를 하기 표에 표시된 바와 같이 계산하였다.
그룹 항체 TGI%
G2 13A4 (3mg/kg) 103.00%
G3 13A4 (1mg/kg) 82.90%
G4 13A4 (0.3mg/kg) 69.00%
G5 4G12 (3mg/kg) 45.20%
G6 4G12 (1mg/kg) 10.10%
G7 4G12 (0.3mg/kg) 73.60%
13A4 및 여보이(Yervoy)에 대한 인 비보 결과
CTLA4 항체의 효능을 비교하기 위해, 13A4에 의한 동일한 실험에서 여보이를 사용했다. 상이한 그룹 모두에서 마우스의 중량이 치료 기간 동안 증가했다(도 9, 및 도 10). 독성 효과는 관찰되지 않았다.
13A4와 여보이 처리는 모두 종양 크기의 유의성 있는 감소를 가져왔다(도 11). 명백히, 13A4 처리는 여보이와 비교하여 적어도 비슷한 효과를 가져왔다. 두 치료군에 대한 28일차 TGI%가 하기에 표시된다.
그룹 항체 TGI%
G3 여보이(Yervoy) 104.60%
G5 13A4 104.70%
실시예 6. 인간화 항- hCTLA4 항체의 인 비보 결과.
실시예 2에 기재된 방법에 의해 인간화 항체를 제조하였다. 인간화 항체의 치료 효과를 확인하기 위해, 6종의 인간화 항-hCTLA4 항체(4G12-H1K1-IgG1; 4G12-H2K1-IgG1; 13A4-H1K2-IgG1; 13A4-H2K2-IgG1; 13A4-H1K2-IgG4; 13A4-H1K2-IgG1-N297A)의 인 비보 종양 성장에 대한 효과를 입증하기 위해 이들을 B-hCTLA-4 인간화 마우스에서 테스트하였다(도 12-17). 또한, 글리칸 이종성(glycan heterogeneity)을 감소시키기 위해, 인간화 항체 13A4-H1K2-IgG1의 Fc 영역을 297번 위치에 있는 아스파라긴을 알라닌으로 치환하도록 더 조작하였다(도 17). 항체의 경쇄 및 중쇄 가변 영역이 하기 표에 표시된다.
인간화 항체 중쇄 가변 영역 경쇄 가변 영역 타입
4G12-H1K1-IgG1 서열번호 21 서열번호 25 IgG1
4G12-H2K1-IgG1 서열번호 22 서열번호 25 IgG1
13A4-H1K2-IgG1 서열번호 13 서열번호 19 IgG1
13A4-H2K2-IgG1 서열번호 14 서열번호 19 IgG1
13A4-H1K2-IgG4 서열번호 13 서열번호 19 IgG4
13A4-H1K2-IgG1-N297A 서열번호 13 서열번호 19 Fc 영역에 N297A 돌연변이를 갖는 IgG1
실시예 5에 기재된 것과 유사한 절차를 이용했다. MC-38 암 종양 세포(결장 선암 세포)를 B-hCTLA-4 인간화 마우스에 피하로 주사했다. 마우스의 종양이 150 ± 50 mm3의 부피에 도달했을 때, 마우스를 종양의 부피에 기반하여 상이한 그룹으로 무작위로 배치하였다. 그 후, 마우스에 PBS 및 항-hCTLA4 항체를 정맥내로 주사하였다. 3주 동안, 주당 2회(각 주의 1일차 및 4일차) 항체를 주사하였다(총 6회 주사). 용량(투여량)은 마우스의 중량을 기준으로 10 mg/kg로 계산하였다. 종양의 장축과 단축의 길이는 매주 2회 측정하고, 종양의 부피는 0.5 x (장축) x (단축)2으로 계산하였다. 주사 전 및 마우스를 상이한 그룹에 배치했을 때(1차 항체 주사 전) 마우스의 중량도 측정하였다. 또한, 항체 주사 기간 동안 주당 2회, 및 안락사 직전에도 중량을 측정하였다.
종양 성장 억제율(TGI%)을 하기 식을 이용하여 계산하였다: TGI (%) = [1-(Ti-T0)/(Vi-V0)]x100. Ti는 i일차 치료군의 평균 종양 부피이다. T0은 0일차 치료군의 평균 종양 부피이다. Vi는 i일차 대조군의 평균 종양 부피이다. V0은 0일차 대조군의 평균 종양 부피이다.
통계 분석을 위해 T-검정을 수행하였다. 60%보다 높은 TGI%는 종양 성장의 유의한 억제를 나타낸다. P < 0.05는 유의한 차이를 나타내는 것으로 간주된다.
4G12- H1K1 - IgG1 및 4G12- H2K1 - IgG1의 인 비보 결과
마우스를 4개의 그룹으로 나누었다: 1) G1에서, 인간 IgG를 대조군으로 사용하고; 2) G4에서, 비교 목적으로 여보이를 마우스에 투여하였으며; 3) G10에서, 4G12-H1K1-IgG1을 마우스에 투여하고; 및 4) G11에서, 4G12-H2K1-IgG1을 마우스에 투여했다.
4개의 그룹에서 마우스의 중량을 전체 치료 기간 동안 모니터링하였다 (도 12 및 도 13). 결과는 각 그룹의 마우스는 전반적으로 건강했고, 결과는 항-CTLA4 항체가 내약성이 우수하고 마우스에 독성이 없다는 것을 보여주었다.
그러나, 종양 크기는 여보이, 4G12-H1K1-IgG1 및 4G12-H2K1-IgG1로 치료된 그룹에서 훨씬 더 작았다 (도 14). 도 14에 도시된 바와 같이, 4G12-H1K1-IgG1 (P=0.002) 및 4G12-H2K1-IgG1 (P=0.002)은 대조군 대비 종양 성장을 억제했고, 여보이(P=0.007)에 비해 더 우수한 결과를 가졌다(P=0.007). 각 치료군에 대한 21일차 TGI%가 하기에 표시된다.
그룹 항체 TGI%
G4 여보이 82.20%
G10 4G12-H1K1-IgG1 90.50%
G11 4G12-H2K1-IgG1 90.50%
13A4- H1K2 - IgG1 , 13A4- H2K2 - IgG1 , 13A4- H1K2 - IgG4 및 13A4- H1K2 - IgG1 - N297A에 대한 인 비보 결과
마우스를 6개의 그룹으로 배치했다: 1) G1에서, 인간 IgG를 대조군으로 사용하고; 2) G4에서, 비교 목적으로 여보이를 마우스에 투여하였으며; 3) G6에서, 13A4-H1K2-IgG1을 마우스에 투여하고; 4) G7에서, 13A4-H2K2-IgG1을 마우스에 투여하며; 5) G8에서, 13A4-H1K2-IgG4를 마우스에 투여하고; 및 6) G9에서, 13A4-H1K2-IgG1-N297A를 마우스에 투여했다.
6개의 그룹에서 마우스의 중량을 전체 치료 기간 동안 모니터링하였다 (도 15 및 도 16). 결과는 각 그룹의 마우스는 전반적으로 건강했고, 항-CTLA4 항체가 마우스에 독성이 없다는 것을 보여주었다.
그러나, 종양 크기는 각 그룹에서 상이했다. 도 17에 도시된 바와 같이, 모든 항-CTLA4 항체는 대조군 대비 종양 성장을 억제할 수 있다. 특히, 13A4-H1K2-IgG1 및 13A4-H2K2-IgG1은 여보이에 비해 더 우수한 결과를 가졌다.
각 치료군에 대한 21일차 TGI%가 하기에 표시된다.
그룹 항체 TGI%
G4 여보이 82.20%
G6 13A4-H1K2-IgG1 99.00%
G7 13A4-H2K2-IgG1 96.60%
G8 13A4-H1K2-IgG4 56.10%
G9 13A4-H1K2-IgG1-N297A 47.30%
실시예 7. 마우스 항- hCTLA4 항체: CT4-20- 6D2 (" 6D2 ") 및 CT4-20- 7E12 ("7E12")의 인 비트로 테스팅
마우스 복수액으로부터 항-CTLA4 항체를 수집하고, 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 인간 CTLA4로 일시적으로 형질감염된 CHO 세포 25 ㎕를 플레이트의 각 웰에 첨가하였다. 정제된 항체를 50, 5, 0.5, 0.05, 0.005 ㎍/ml의 최종 농도까지 적정하였다. 적정된 항체를 4℃에서 웰당 25 ㎕로 각 웰에 첨가하고 30분 동안 인큐베이션시켰다. Biotin-hCD86을 0.4 ㎍/ml까지 적정시켰다. 50 ㎕의 리간드 용액을 각 웰에 첨가하여, Biotin-hCD86의 최종 농도를 0.2 ㎍/ml가 되게 했다. 세포를 Biotin-hCD86과 4℃에서 15분 동안 인큐베이션시켰다. PBS로 세척 후에, 4℃에서 50 ㎕의 항-마우스 IgG Fc 항체 플루오레신 이소시아네이트 접합체(IgG Fc-FITC)와 스트렙타비딘-피코에리트린(streptavidin-PE)을 각 웰에 1:100 희석으로 첨가하고 15분 동안 인큐베이션시키고, 뒤이어 PBS로 세척하였다. 유세포 분석에 의해 FITC 및 PE에 대한 신호를 측정하였다.
도 18에 도시된 바와 같이, 항-hCTLA4 항체(CT4-20-6D2 및 CT4-20-7E12)의 농도가 증가한 경우, PE의 신호는 감소되어, 인간 CTLA4와 Biotin-hCD86 간의 결합이 CT4-20-6D2 및 CT4-20-7E12 항체에 의해 차단되었다는 것을 시사했다.
실시예 8. 원숭이, 마우스, 및 인간-마우스 키메라 CTLA4에 대한 항- hCTLA 항체의 교차-반응성
CHO 세포를 레서스 원숭이 CTLA4 (rmCTLA4, 서열번호 43), 마우스 CTLA4 (mCTLA4, 서열번호 42), 및 키메라 (마우스와 인간) CTLA4 (chiCTLA4, 서열번호 44)로 형질감염시켰다.
25 ㎕ CHO 세포를 각 웰에 첨가하였다. 25 ㎕의 정제된 마우스 항-hCTLA 항체(1 ㎍/ml) (CT4-20-6D2 및 CT4-20-7E12)를 각 웰에 첨가하고 4℃에서 30분 동안 인큐베이션시켰다.
PBS (1200 rmp, 5 분)로 2회 세척 후, 50 ㎕의 항-인간 IgG Fc 항체 플루오레신 이소티오시아네이트 접합체(IgG Fc-FITC)를 각 웰에 1:100 희석으로 첨가하고, 4℃에서 30분 동안 인큐베이션시키고, 뒤이어 PBS로 세척하였다. 유세포 분석에 의해 FITC에 대한 신호를 측정하였다.
도 19에 도시된 바와 같이, CT4-20-6D2 및 CT4-20-7E12는 마우스 CTLA4와 교차 반응하지 않았고, 키메라 CTLA4와 약한 교차 반응성 및 rmCTLA4와 비교적 강한 교차 반응성을 가졌다.
실시예 9. 마우스 항- hCTLA4 항체의 인 비보 테스팅
결장암의 모델에서 인 비보 종양 성장에 대한 항-hCTLA4 항체의 효과를 입증하기 위해 항-hCTLA4 항체를 테스트하였다. MC-38 종양 세포(결장 선암(colon adenocarcinoma) 세포)를 B-hCTLA-4 인간화 마우스에 피하로 주사하였다. 마우스의 종양이 150 ± 50 mm3의 부피에 도달했을 때, 마우스를 종양의 부피에 기반하여 상이한 그룹으로 무작위로 배치하였다. 그 후, 마우스에 PBS 및 항-hCTLA4 항체를 정맥내로 주사하였다. 항체를 주당 2회 투여하였다(총 6회 주사). 대조군에서, 염수(saline)을 마우스에 투여하였다. 주사 부피는 주사 용량은 마우스의 중량을 기준으로 10 ㎕/g로 계산하였다. 종양의 장축과 단축의 길이는 매주 2회 측정하고, 종양의 부피는 0.5 x (장축) x (단축)2으로 계산하였다. 주사 전, 마우스를 상이한 그룹에 배치했을 때(1차 항체 주사 전), 항체 주사 기간 동안 주당 2회, 및 안락사 전에 마우스의 중량도 측정하였다.
통계 분석을 위해 T-검정을 수행했다. 60%보다 높은 TGI%는 유의성 있는 종양 성장의 억제를 나타낸다. P < 0.05는 유의성 있는 차이를 나타내는 것으로 간주된다.
마우스의 중량을 전체 치료 기간 동안 모니터링하였다. 상이한 그룹들에서 마우스의 중량은 모두 증가했다(도 20 및 도 21). 대조군과 항-hCTLA4 치료군 간에 중량에 있어서 유의성 있는 차이는 없었다. 결과는 항-hCTLA4 항체가 마우스에 독성이 없다는 것을 보여주었다.
그러나, 종양 크기는 항체 13A4, 6D2 및 7E12로 치료된 그룹에서 유의성 있는 차이를 보였다(도 22). 도 22에 도시된 바와 같이, 13A4, 6D2, 및 7E12는 모두 마우스에서 종양 성장을 억제했다.
각 치료군에 대한 21일차 TGI%가 하기에 표시된다.
그룹 항체 TGI%
G2 13A4 109.70%
G3 6D2 69.80%
G4 7E12 65.60%
기타 구체예
본 발명이 발명의 상세한 설명과 함께 기재되었으나, 전술된 설명은 본 발명을 예시하고, 발명의 범위를 한정하지 않도록 의도되며, 발명의 범위는 첨부된 청구항에 의해 정의된다. 기타 양태, 장점, 및 변형이 하기 청구항의 범위 내에 속한다.
SEQUENCE LISTING <110> EUCURE (BEIJING) BIOPHARMA CO., LTD <120> ANTI-CTLA4 ANTIBODIES AND USES THEREOF <130> 20170921 <150> PCT/CN2017/102816 <151> 2017-09-21 <160> 76 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 1 Asp Tyr Glu Met His 1 5 <210> 2 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 2 Val Ile Asp Pro Glu Thr Gly Gly Thr Ala Tyr Asn Gln Lys Phe Lys 1 5 10 15 Gly <210> 3 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 3 Gly Thr Thr Val Val Gly Leu Asp Tyr 1 5 <210> 4 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 4 Arg Ala Ser Gly Asn Ile His Asn Tyr Leu Ala 1 5 10 <210> 5 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 5 Lys Glu Lys Thr Leu Thr Asp 1 5 <210> 6 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 6 Gln His Phe Trp Ser Thr Pro Trp Thr 1 5 <210> 7 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 7 Ser Tyr Thr Met Ser 1 5 <210> 8 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 8 Thr Ile Ser Arg Gly Gly Gly Tyr Thr Ser Tyr Pro Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 9 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 9 Glu Asp Tyr Gly Ser Ser Tyr Val His Trp Phe Ala Tyr 1 5 10 <210> 10 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 10 Arg Ala Gly Glu Asn Ile Tyr Ser Tyr Leu Ala 1 5 10 <210> 11 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 11 Asn Ala Arg Thr Leu Ala Glu 1 5 <210> 12 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 12 Gln His His Tyr Gly Ser Pro Arg Thr 1 5 <210> 13 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 13 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Glu Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Val Ile Asp Pro Glu Thr Gly Gly Thr Ala Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Val Thr Leu Thr Ala Asp Thr Ser Thr Asp Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Arg Gly Thr Thr Val Val Gly Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Thr Leu Thr Val Ser Ser 115 <210> 14 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 14 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Thr Val Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Glu Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Val Ile Asp Pro Glu Thr Gly Gly Thr Ala Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Val Thr Leu Thr Ala Asp Thr Ser Thr Asp Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Arg Gly Thr Thr Val Val Gly Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Thr Leu Thr Val Ser Ser 115 <210> 15 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 15 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Thr Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Glu Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Val Ile Asp Pro Glu Thr Gly Gly Thr Ala Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Val Thr Leu Thr Ala Asp Thr Ser Thr Asp Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Arg Gly Thr Thr Val Val Gly Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Thr Leu Thr Val Ser Ser 115 <210> 16 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 16 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Glu Met His Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Val Ile Asp Pro Glu Thr Gly Gly Thr Ala Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Val Thr Leu Thr Ala Asp Arg Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Arg Gly Thr Thr Val Val Gly Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Thr Leu Thr Val Ser Ser 115 <210> 17 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 17 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Thr Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Glu Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Val Ile Asp Pro Glu Thr Gly Gly Thr Ala Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Ala Thr Leu Thr Ala Asp Arg Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Arg Gly Thr Thr Val Val Gly Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Thr Leu Thr Val Ser Ser 115 <210> 18 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 18 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gly Asn Ile His Asn Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Leu 35 40 45 Tyr Lys Glu Lys Thr Leu Thr Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Gln Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Phe Trp Ser Thr Pro Trp 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Asn Leu Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 19 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 19 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gly Asn Ile His Asn Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Val 35 40 45 Tyr Lys Glu Lys Thr Leu Thr Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Phe Trp Ser Thr Pro Trp 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Asn Leu Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 20 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 20 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gly Asn Ile His Asn Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Val 35 40 45 Tyr Lys Glu Lys Thr Leu Thr Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Phe Trp Ser Thr Pro Trp 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Asn Leu Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 21 <211> 122 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 21 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Thr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Thr Ile Ser Arg Gly Gly Gly Tyr Thr Ser Tyr Pro Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Asp Tyr Gly Ser Ser Tyr Val His Trp Phe Ala Tyr Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala 115 120 <210> 22 <211> 122 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 22 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Thr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Thr Ile Ser Arg Gly Gly Gly Tyr Thr Ser Tyr Pro Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Asp Tyr Gly Ser Ser Tyr Val His Trp Phe Ala Tyr Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala 115 120 <210> 23 <211> 122 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 23 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Thr Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Gly Lys Arg Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Thr Ile Ser Arg Gly Gly Gly Tyr Thr Ser Tyr Pro Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Asp Tyr Gly Ser Ser Tyr Val His Trp Phe Ala Tyr Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala 115 120 <210> 24 <211> 122 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 24 Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Thr Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Thr Ile Ser Arg Gly Gly Gly Tyr Thr Ser Tyr Pro Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Asp Tyr Gly Ser Ser Tyr Val His Trp Phe Ala Tyr Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala 115 120 <210> 25 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 25 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Gly Glu Asn Ile Tyr Ser Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asn Ala Arg Thr Leu Ala Glu Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His His Tyr Gly Ser Pro Arg 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 26 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 26 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Gly Glu Asn Ile Tyr Ser Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Gln Gly Lys Ser Pro Lys Leu Leu Val 35 40 45 Tyr Asn Ala Arg Thr Leu Ala Glu Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His His Tyr Gly Ser Pro Arg 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 27 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 27 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Gly Glu Asn Ile Tyr Ser Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Gln Gly Lys Ser Pro Lys Leu Leu Val 35 40 45 Tyr Asn Ala Arg Thr Leu Ala Glu Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His His Tyr Gly Ser Pro Arg 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 28 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 28 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Gly Glu Asn Ile Tyr Ser Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Gln Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Val 35 40 45 Tyr Asn Ala Arg Thr Leu Ala Glu Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His His Tyr Gly Ser Pro Arg 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 29 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 29 Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr Glu Met His 1 5 10 <210> 30 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 30 Asp Pro Glu Thr Gly Gly 1 5 <210> 31 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 31 Gly Thr Thr Val Val Gly Leu Asp Tyr 1 5 <210> 32 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 32 Arg Ala Ser Gly Asn Ile His Asn Tyr Leu Ala 1 5 10 <210> 33 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 33 Lys Glu Lys Thr Leu Thr Asp 1 5 <210> 34 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 34 Gln His Phe Trp Ser Thr Pro Trp Thr 1 5 <210> 35 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 35 Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Thr Met Ser 1 5 10 <210> 36 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 36 Ser Arg Gly Gly Gly Tyr 1 5 <210> 37 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 37 Glu Asp Tyr Gly Ser Ser Tyr Val His Trp Phe Ala Tyr 1 5 10 <210> 38 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 38 Arg Ala Gly Glu Asn Ile Tyr Ser Tyr Leu Ala 1 5 10 <210> 39 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 39 Asn Ala Arg Thr Leu Ala Glu 1 5 <210> 40 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 40 Gln His His Tyr Gly Ser Pro Arg Thr 1 5 <210> 41 <211> 223 <212> PRT <213> Human <400> 41 Met Ala Cys Leu Gly Phe Gln Arg His Lys Ala Gln Leu Asn Leu Ala 1 5 10 15 Thr Arg Thr Trp Pro Cys Thr Leu Leu Phe Phe Leu Leu Phe Ile Pro 20 25 30 Val Phe Cys Lys Ala Met His Val Ala Gln Pro Ala Val Val Leu Ala 35 40 45 Ser Ser Arg Gly Ile Ala Ser Phe Val Cys Glu Tyr Ala Ser Pro Gly 50 55 60 Lys Ala Thr Glu Val Arg Val Thr Val Leu Arg Gln Ala Asp Ser Gln 65 70 75 80 Val Thr Glu Val Cys Ala Ala Thr Tyr Met Met Gly Asn Glu Leu Thr 85 90 95 Phe Leu Asp Asp Ser Ile Cys Thr Gly Thr Ser Ser Gly Asn Gln Val 100 105 110 Asn Leu Thr Ile Gln Gly Leu Arg Ala Met Asp Thr Gly Leu Tyr Ile 115 120 125 Cys Lys Val Glu Leu Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Tyr Leu Gly Ile Gly 130 135 140 Asn Gly Thr Gln Ile Tyr Val Ile Asp Pro Glu Pro Cys Pro Asp Ser 145 150 155 160 Asp Phe Leu Leu Trp Ile Leu Ala Ala Val Ser Ser Gly Leu Phe Phe 165 170 175 Tyr Ser Phe Leu Leu Thr Ala Val Ser Leu Ser Lys Met Leu Lys Lys 180 185 190 Arg Ser Pro Leu Thr Thr Gly Val Tyr Val Lys Met Pro Pro Thr Glu 195 200 205 Pro Glu Cys Glu Lys Gln Phe Gln Pro Tyr Phe Ile Pro Ile Asn 210 215 220 <210> 42 <211> 223 <212> PRT <213> Mouse <400> 42 Met Ala Cys Leu Gly Leu Arg Arg Tyr Lys Ala Gln Leu Gln Leu Pro 1 5 10 15 Ser Arg Thr Trp Pro Phe Val Ala Leu Leu Thr Leu Leu Phe Ile Pro 20 25 30 Val Phe Ser Glu Ala Ile Gln Val Thr Gln Pro Ser Val Val Leu Ala 35 40 45 Ser Ser His Gly Val Ala Ser Phe Pro Cys Glu Tyr Ser Pro Ser His 50 55 60 Asn Thr Asp Glu Val Arg Val Thr Val Leu Arg Gln Thr Asn Asp Gln 65 70 75 80 Met Thr Glu Val Cys Ala Thr Thr Phe Thr Glu Lys Asn Thr Val Gly 85 90 95 Phe Leu Asp Tyr Pro Phe Cys Ser Gly Thr Phe Asn Glu Ser Arg Val 100 105 110 Asn Leu Thr Ile Gln Gly Leu Arg Ala Val Asp Thr Gly Leu Tyr Leu 115 120 125 Cys Lys Val Glu Leu Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Phe Val Gly Met Gly 130 135 140 Asn Gly Thr Gln Ile Tyr Val Ile Asp Pro Glu Pro Cys Pro Asp Ser 145 150 155 160 Asp Phe Leu Leu Trp Ile Leu Val Ala Val Ser Leu Gly Leu Phe Phe 165 170 175 Tyr Ser Phe Leu Val Thr Ala Val Ser Leu Ser Lys Met Leu Lys Lys 180 185 190 Arg Ser Pro Leu Thr Thr Gly Val Tyr Val Lys Met Pro Pro Thr Glu 195 200 205 Pro Glu Cys Glu Lys Gln Phe Gln Pro Tyr Phe Ile Pro Ile Asn 210 215 220 <210> 43 <211> 223 <212> PRT <213> Monkey <400> 43 Met Ala Cys Leu Gly Phe Gln Arg His Lys Ala Arg Leu Asn Leu Ala 1 5 10 15 Thr Arg Thr Arg Pro Tyr Thr Leu Leu Phe Ser Leu Leu Phe Ile Pro 20 25 30 Val Phe Ser Lys Ala Met His Val Ala Gln Pro Ala Val Val Leu Ala 35 40 45 Asn Ser Arg Gly Ile Ala Ser Phe Val Cys Glu Tyr Ala Ser Pro Gly 50 55 60 Lys Ala Thr Glu Val Arg Val Thr Val Leu Arg Gln Ala Asp Ser Gln 65 70 75 80 Val Thr Glu Val Cys Ala Ala Thr Tyr Met Met Gly Asn Glu Leu Thr 85 90 95 Phe Leu Asp Asp Ser Ile Cys Thr Gly Thr Ser Ser Gly Asn Gln Val 100 105 110 Asn Leu Thr Ile Gln Gly Leu Arg Ala Met Asp Thr Gly Leu Tyr Ile 115 120 125 Cys Lys Val Glu Leu Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Tyr Met Gly Ile Gly 130 135 140 Asn Gly Thr Gln Ile Tyr Val Ile Asp Pro Glu Pro Cys Pro Asp Ser 145 150 155 160 Asp Phe Leu Leu Trp Ile Leu Ala Ala Val Ser Ser Gly Leu Phe Phe 165 170 175 Tyr Ser Phe Leu Leu Thr Ala Val Ser Leu Ser Lys Met Leu Lys Lys 180 185 190 Arg Ser Pro Leu Thr Thr Gly Val Tyr Val Lys Met Pro Pro Thr Glu 195 200 205 Pro Glu Cys Glu Lys Gln Phe Gln Pro Tyr Phe Ile Pro Ile Asn 210 215 220 <210> 44 <211> 223 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 44 Met Ala Cys Leu Gly Leu Arg Arg Tyr Lys Ala Gln Leu Gln Leu Pro 1 5 10 15 Ser Arg Thr Trp Pro Phe Val Ala Leu Leu Thr Leu Leu Phe Ile Pro 20 25 30 Val Phe Ser Glu Ala Ile Gln Val Ala Gln Pro Ala Val Val Leu Ala 35 40 45 Ser Ser Arg Gly Ile Ala Ser Phe Val Cys Glu Tyr Ala Ser Pro Gly 50 55 60 Lys Ala Thr Glu Val Arg Val Thr Val Leu Arg Gln Ala Asp Ser Gln 65 70 75 80 Val Thr Glu Val Cys Ala Ala Thr Tyr Met Met Gly Asn Glu Leu Thr 85 90 95 Phe Leu Asp Asp Ser Ile Cys Thr Gly Thr Ser Ser Gly Asn Gln Val 100 105 110 Asn Leu Thr Ile Gln Gly Leu Arg Ala Met Asp Thr Gly Leu Tyr Ile 115 120 125 Cys Lys Val Glu Leu Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Tyr Leu Gly Ile Gly 130 135 140 Asn Gly Thr Gln Ile Tyr Val Ile Asp Pro Glu Pro Cys Pro Asp Ser 145 150 155 160 Asp Phe Leu Leu Trp Ile Leu Val Ala Val Ser Leu Gly Leu Phe Phe 165 170 175 Tyr Ser Phe Leu Val Thr Ala Val Ser Leu Ser Lys Met Leu Lys Lys 180 185 190 Arg Ser Pro Leu Thr Thr Gly Val Tyr Val Lys Met Pro Pro Thr Glu 195 200 205 Pro Glu Cys Glu Lys Gln Phe Gln Pro Tyr Phe Ile Pro Ile Asn 210 215 220 <210> 45 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 45 Asp Tyr Glu Met His 1 5 <210> 46 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 46 Thr Ile Asp Pro Glu Thr Gly Gly Thr Ala Tyr Asn Gln Lys Phe Lys 1 5 10 15 Gly <210> 47 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 47 Arg Gly Lys Tyr Gly Asn Tyr Asp Tyr Val Met Asp Tyr 1 5 10 <210> 48 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 48 Arg Ala Ser Gly Asn Ile His Asn Tyr Leu Ala 1 5 10 <210> 49 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 49 Asn Ala Lys Thr Leu Ala Asp 1 5 <210> 50 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 50 Gln His Phe Trp Ser Thr Pro Trp Thr 1 5 <210> 51 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 51 Asp Tyr Trp Met Asn 1 5 <210> 52 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 52 Gln Ile Arg Asn Lys Pro Tyr Asn Tyr Glu Thr His Tyr Ser Asp Ser 1 5 10 15 Val Lys Gly <210> 53 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 53 Thr Phe Ala Tyr 1 <210> 54 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 54 Gly Thr Ser Glu Asn Ile Tyr Gly Gly Leu Asn 1 5 10 <210> 55 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 55 Gly Ala Thr Asn Leu Ala Asp 1 5 <210> 56 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 56 Gln Asn Val Leu Ser Thr Pro Tyr Thr 1 5 <210> 57 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 57 Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr Glu Met His 1 5 10 <210> 58 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 58 Asp Pro Glu Thr Gly Gly 1 5 <210> 59 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 59 Arg Gly Lys Tyr Gly Asn Tyr Asp Tyr Val Met Asp Tyr 1 5 10 <210> 60 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 60 Arg Ala Ser Gly Asn Ile His Asn Tyr Leu Ala 1 5 10 <210> 61 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 61 Asn Ala Lys Thr Leu Ala Asp 1 5 <210> 62 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 62 Gln His Phe Trp Ser Thr Pro Trp Thr 1 5 <210> 63 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 63 Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr Trp Met Asn 1 5 10 <210> 64 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 64 Arg Asn Lys Pro Tyr Asn Tyr Glu 1 5 <210> 65 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 65 Thr Phe Ala Tyr 1 <210> 66 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 66 Gly Thr Ser Glu Asn Ile Tyr Gly Gly Leu Asn 1 5 10 <210> 67 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 67 Gly Ala Thr Asn Leu Ala Asp 1 5 <210> 68 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 68 Gln Asn Val Leu Ser Thr Pro Tyr Thr 1 5 <210> 69 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 69 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Thr Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Glu Met His Trp Val Lys Gln Thr Pro Val His Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Val Ile Asp Pro Glu Thr Gly Gly Thr Ala Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Arg Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Arg Gly Thr Thr Val Val Gly Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Thr Leu Thr Val Ser Ser 115 <210> 70 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 70 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Glu Ser Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gly Asn Ile His Asn Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Gln Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Val 35 40 45 Tyr Lys Glu Lys Thr Leu Thr Asp Thr Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Ser Leu Lys Ile Asn Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Gly Ser Tyr Tyr Cys Gln His Phe Trp Ser Thr Pro Trp 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Asn Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 71 <211> 122 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 71 Asp Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Thr Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Thr Ile Ser Arg Gly Gly Gly Tyr Thr Ser Tyr Pro Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Ser Ser Leu Gln Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Asp Tyr Gly Ser Ser Tyr Val His Trp Phe Ala Tyr Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala 115 120 <210> 72 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 72 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Gly Glu Asn Ile Tyr Ser Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Gln Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Val 35 40 45 Tyr Asn Ala Arg Thr Leu Ala Glu Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Ser Leu Lys Ile Asn Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Gly Ser Tyr Tyr Cys Gln His His Tyr Gly Ser Pro Arg 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 73 <211> 141 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 73 Met Glu Trp Ser Trp Val Phe Leu Phe Leu Leu Ser Val Ile Ala Gly 1 5 10 15 Val Gln Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg 20 25 30 Pro Gly Ala Ser Val Thr Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe 35 40 45 Thr Asp Tyr Glu Met His Trp Val Lys Gln Thr Pro Val His Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Ile Gly Thr Ile Asp Pro Glu Thr Gly Gly Thr Ala Tyr Asn 65 70 75 80 Gln Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Thr Asp Lys Ser Ser Ser 85 90 95 Thr Ala Tyr Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val 100 105 110 Tyr Tyr Cys Thr Arg Arg Gly Lys Tyr Gly Asn Tyr Asp Tyr Val Met 115 120 125 Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 130 135 140 <210> 74 <211> 127 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 74 Met Ser Val Leu Thr Gln Val Leu Ala Leu Leu Leu Leu Trp Leu Thr 1 5 10 15 Gly Ala Arg Cys Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser 20 25 30 Ala Ser Val Gly Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gly Asn 35 40 45 Ile His Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Gln Gly Lys Ser Pro 50 55 60 Gln Leu Leu Val Phe Asn Ala Lys Thr Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser 65 70 75 80 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Tyr Ser Leu Lys Ile Asn 85 90 95 Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Gly Asn Tyr Tyr Cys Gln His Phe Trp 100 105 110 Ser Thr Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 115 120 125 <210> 75 <211> 134 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 75 Met Tyr Leu Gly Leu Ser Cys Val Phe Ile Val Phe Leu Leu Lys Gly 1 5 10 15 Val Gln Cys Glu Val Lys Leu Asp Glu Thr Gly Gly Gly Leu Val Gln 20 25 30 Pro Gly Arg Pro Met Lys Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Phe 35 40 45 Ser Asp Tyr Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ser Pro Glu Lys Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Val Ala Gln Ile Arg Asn Lys Pro Tyr Asn Tyr Glu Thr His 65 70 75 80 Tyr Ser Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser 85 90 95 Lys Ser Ser Val Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Arg Gly Glu Asp Met 100 105 110 Gly Ile Tyr Tyr Cys Thr Gly Thr Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 115 120 125 Leu Val Thr Val Ser Ala 130 <210> 76 <211> 126 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 76 Met Gly Val Pro Thr Gln Leu Leu Leu Leu Trp Leu Thr Val Val Val 1 5 10 15 Val Arg Cys Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Thr Ser Leu Ser Ala 20 25 30 Ser Val Gly Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys Gly Thr Ser Glu Asn Ile 35 40 45 Tyr Gly Gly Leu Asn Trp Tyr Gln Arg Lys Gln Gly Lys Ser Pro Gln 50 55 60 Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Thr Asn Leu Ala Asp Gly Met Ser Ser Arg 65 70 75 80 Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Arg Gln Tyr Ser Leu Lys Ile Ser Ser 85 90 95 Leu His Pro Asp Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Asn Val Leu Ser 100 105 110 Thr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 115 120 125

Claims (42)

  1. CTLA4(cytotoxic T-lymphocyte-associated protein 4)에 결합하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편으로서,
    CDR(complementarity determining region)1, CDR2, 및 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH); 및 CDR1, CDR2, 및 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하는, 항체 또는 그의 항원-결합 단편:
    (1) 상기 VH CDR1, CDR2, 및 CDR3 아미노산 서열은 각각 Kabat 번호표기에 의해 정의된 서열번호 1, 2, 3이고, 상기 VL CDR1, CDR2, 및 CDR3 아미노산 서열은 각각 Kabat 번호표기에 의해 정의된 서열번호 4, 5, 6이거나;
    상기 VH CDR1, CDR2, 및 CDR3 아미노산 서열은 각각 Chothia 번호표기에 의해 정의된 서열번호 29, 30, 31을 포함하고, 상기 VL CDR1, CDR2, 및 CDR3 아미노산 서열은 각각 Chothia 번호표기에 의해 정의된 서열번호 32, 33, 34을 포함하거나;
    (2) 상기 VH CDR1, CDR2, 및 CDR3 아미노산 서열은 각각 Kabat 번호표기에 의해 정의된 서열번호 7, 8, 9이고, 상기 VL CDR1, CDR2, 및 CDR3 아미노산 서열은 각각 Kabat 번호표기에 의해 정의된 서열번호 10 11, 12이거나;
    상기 VH CDR1, CDR2, 및 CDR3 아미노산 서열은 각각 Chothia 번호표기에 의해 정의된 서열번호 35, 36, 37을 포함하고, 상기 VL CDR1, CDR2, 및 CDR3 아미노산 서열은 각각 Chothia 번호표기에 의해 정의된 서열번호 38, 39, 40을 포함한다.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 VH는 각각 Kabat 번호표기에 의해 정의된 서열번호 1, 2, 3으로 기재된 아미노산 서열을 갖는 CDR1, CDR2, 및 CDR3을 포함하고, 상기 VL은 각각 Kabat 번호표기에 의해 정의된 서열번호 4, 5, 6으로 기재된 아미노산 서열을 갖는 CDR1, CDR2, 및 CDR3을 포함하는 것인 항체, 또는 그의 항원-결합 단편.
  3. 청구항 1에 있어서, 상기 VH는 각각 Kabat 번호표기에 의해 정의된 서열번호 7, 8, 및 9로 기재된 아미노산 서열을 갖는 CDR1, CDR2, 및 CDR3을 포함하고, 상기 VL은 각각 Kabat 번호표기에 의해 정의된 서열번호 10, 11, 및 12로 기재된 아미노산 서열을 갖는 CDR1, CDR2, 및 CDR3을 포함하는 것인 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  4. 청구항 1 내지 3 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 항원-결합 단편은 인간화 항체 또는 그의 항원-결합 단편이거나, 또는 scFV(single-chain variable fragment)인 것인 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  5. 하기를 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 핵산:
    (1) 각각 서열번호 1, 2, 및 3으로 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR(complementarity determining region) 1, 2, 및 3을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH)를 포함하고, 상기 VH는, 서열번호 19, 또는 70으로 기재된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL)과 쌍을 이루면, CTLA4에 결합하는 것인 면역글로불린 중쇄 또는 그의 단편;
    (2) 각각 서열번호 4, 5, 및 6으로 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR 1, 2, 및 3을 포함하는 VL을 포함하고, 상기 VL은, 서열번호 13, 14, 또는 69로 기재된 아미노산 서열을 포함하는 VH와 쌍을 이루면, CTLA4에 결합하는 것인 면역글로불린 경쇄 또는 그의 단편;
    (3) 각각 서열번호 7, 8, 및 9로 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR 1, 2, 및 3을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH)을 포함하고, 상기 VH는, 서열번호 25, 또는 72로 기재된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL)과 쌍을 이루면, CTLA4에 결합하는 것인 면역글로불린 중쇄 또는 그의 단편; 또는
    (4) 각각 서열번호 10, 11, 및 12로 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR 1, 2, 및 3을 포함하는 VL을 포함하고, 상기 VL은, 서열번호 21, 22, 또는 71로 기재된 아미노산 서열을 포함하는 VH와 쌍을 이루면, CTLA4에 결합하는 것인 면역글로불린 경쇄 또는 그의 단편.
  6. 하나 이상의 청구항 5의 핵산을 포함하는 벡터.
  7. 하나 이상의 청구항 5의 핵산을 포함하는 세포.
  8. 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 생산하는 방법으로서, 상기 방법은
    (a) 청구항 7의 세포가 상기 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 생산하기에 충분한 조건 하에서 상기 세포를 배양하는 단계; 및
    (b) 상기 세포에 의해 생산된 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 수집하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  9. 중쇄 가변 영역 (VH), 및 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함하는, CTLA4에 결합하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편:
    (1) 상기 VH 서열은 서열번호 13, 또는 14 이고, 상기 VL 서열은 서열번호 19 이거나;
    (2) 상기 VH 서열은 서열번호 69의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 VL 서열은 서열번호 70의 아미노산 서열을 포함하거나;
    (3) 상기 VH 서열은 서열번호 21, 또는 22 이고, 상기 VL 서열은 서열번호 25이거나;
    (4) 상기 VH 서열은 서열번호 71의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 VL 서열은 서열번호 72의 아미노산 서열을 포함한다.
  10. 청구항 9에 있어서,
    (1) 상기 VH 서열은 서열번호 13, 또는 14, 15 이고, 상기 VL 서열은 서열번호 19 이거나;
    (2) 상기 VH 서열은 서열번호 21, 또는 22 이고, 상기 VL 서열은 서열번호 25인 것인, 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  11. 청구항 10에 있어서, 상기 VH는 서열번호 13의 서열을 포함하고, 상기 VL은 서열번호 19의 서열을 포함하는 것인 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  12. 청구항 10에 있어서, 상기 VH는 서열번호 14의 서열을 포함하고, 상기 VL은 서열번호 19의 서열을 포함하는 것인 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  13. 청구항 10에 있어서, 상기 VH는 서열번호 21의 서열을 포함하고, 상기 VL은 서열번호 25의 서열을 포함하는 것인 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  14. 청구항 10에 있어서, 상기 VH는 서열번호 22의 서열을 포함하고, 상기 VL은 서열번호 25의 서열을 포함하는 것인 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  15. 청구항 9 내지 14 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 인간화 항체 또는 그의 항원-결합 단편이거나, 또는 scFV(single-chain variable fragment)인 것인 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  16. 치료제에 공유결합에 의해 결합된 청구항 1 내지 4 중 어느 한 항의 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 포함하는 항체-약물 접합체.
  17. 청구항 16에 있어서, 상기 치료제는 세포독성제 또는 세포증식 억제제(cytostatic agent)인 것인 항체-약물 접합체.
  18. 청구항 1 내지 4 중 어느 한 항의 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 포함하는, 암의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
  19. 청구항 18에 있어서, 상기 암은 유방암, 유암종(carcinoid cancer), 자궁경부암, 자궁내막암, 신경교종, 두경부암, 간암, 폐암, 비-소세포폐암종, 소세포폐암, 림프종, 흑색종, 난소암, 췌장암, 전립선암, 신장암, 대장암, 위암, 고환암, 갑상선암, 방광암, 요도암, 또는 혈액암(hematologic malignancy)인 것인 조성물.
  20. 청구항 19에 있어서, 상기 암은 간암 또는 소세포폐암인 것인 조성물.
  21. 삭제
  22. 삭제
  23. 삭제
  24. 삭제
  25. 삭제
  26. 삭제
  27. 삭제
  28. 삭제
  29. 삭제
  30. 삭제
  31. 삭제
  32. 삭제
  33. 삭제
  34. 삭제
  35. 삭제
  36. 삭제
  37. 삭제
  38. 삭제
  39. 삭제
  40. 삭제
  41. 삭제
  42. 삭제
KR1020207008876A 2017-09-21 2017-09-21 항―ｃｔｌａ４ 항체 및 그의 용도 KR102543719B1 (ko)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PCT/CN2017/102816 WO2019056281A1 (en) 2017-09-21 2017-09-21 ANTI-CTLA4 ANTIBODIES AND USES THEREOF

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20200054220A KR20200054220A (ko) 2020-05-19
KR102543719B1 true KR102543719B1 (ko) 2023-06-16

Family

ID=65810881

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020207008876A KR102543719B1 (ko) 2017-09-21 2017-09-21 항―ｃｔｌａ４ 항체 및 그의 용도

Country Status (12)

Country Link
US (2) US11034764B2 (ko)
EP (1) EP3684812A4 (ko)
JP (2) JP7155270B2 (ko)
KR (1) KR102543719B1 (ko)
CN (1) CN111406069B (ko)
AU (1) AU2017432728A1 (ko)
BR (1) BR112020005496A2 (ko)
CA (1) CA3073984A1 (ko)
IL (2) IL272993A (ko)
MX (1) MX2020003132A (ko)
SG (1) SG11202001604UA (ko)
WO (1) WO2019056281A1 (ko)

Families Citing this family (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
MD3551660T2 (ro) 2016-12-07 2024-03-31 Agenus Inc Anticorpi anti-CTLA-4 și procedee de utilizare a acestora
CA3084394A1 (en) * 2017-11-24 2019-05-31 Eucure (Beijing) Biopharma Co., Ltd Anti-ox40 antibodies and uses thereof
WO2020127377A1 (en) 2018-12-21 2020-06-25 Ose Immunotherapeutics Bifunctional anti-pd-1/il-7 molecule
WO2020165374A1 (en) 2019-02-14 2020-08-20 Ose Immunotherapeutics Bifunctional molecule comprising il-15ra
WO2021098851A1 (en) * 2019-11-20 2021-05-27 Eucure (Beijing) Biopharma Co., Ltd Anti-ctla4/ox40 bispecific antibodies and uses thereof
AU2020406083A1 (en) 2019-12-17 2022-06-16 Ose Immunotherapeutics Bifunctional molecules comprising an IL-7 variant
CN111789954B (zh) * 2020-09-08 2020-12-15 北京百奥赛图基因生物技术有限公司 延缓衰老的方法和药物
WO2022112198A1 (en) 2020-11-24 2022-06-02 Worldwide Innovative Network Method to select the optimal immune checkpoint therapies
WO2022169269A1 (ko) * 2021-02-03 2022-08-11 주식회사 유틸렉스 항 ctla-4 항체 및 이의 용도
WO2022214652A1 (en) 2021-04-09 2022-10-13 Ose Immunotherapeutics Scaffold for bifunctioanl molecules comprising pd-1 or cd28 and sirp binding domains
JP2024515263A (ja) 2021-04-09 2024-04-08 オーエスイー・イミュノセラピューティクス 改善された特性を有する二機能性分子のための新規足場構造
CN112921005B (zh) * 2021-04-14 2023-07-07 中国农业科学院兰州兽医研究所 一株杂交瘤细胞株及其产生的犬细小病毒vp2蛋白单克隆抗体和应用
CN113754770B (zh) * 2021-10-21 2023-11-03 江苏诺迈博生物医药科技有限公司 一种特异性结合人ctla4的抗体及包含其的药物和试剂盒
WO2023235504A2 (en) * 2022-06-01 2023-12-07 Syncromune, Inc. A method for the treatment of cancer via tumor cell lysis and intratumoral administration of combinations of immunotherapeutic ingredients
WO2024003360A1 (en) 2022-07-01 2024-01-04 Institut Curie Biomarkers and uses thereof for the treatment of neuroblastoma
WO2024028386A1 (en) 2022-08-02 2024-02-08 Ose Immunotherapeutics Multifunctional molecule directed against cd28
WO2024049203A1 (ko) * 2022-09-02 2024-03-07 주식회사 시클리드 항 ctla-4 모노클로날 항체 및 이의 용도
WO2024088424A1 (zh) * 2022-10-28 2024-05-02 嘉和生物药业有限公司 新型抗ctla4抗体

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20170226211A1 (en) 2016-05-10 2017-08-10 Agency For Science, Technology And Research Anti-ctla-4 antibodies

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP5416338B2 (ja) * 2003-05-09 2014-02-12 デューク ユニバーシティ Ｃｄ２０特異的抗体およびその使用方法
CN1964739A (zh) 2004-03-26 2007-05-16 辉瑞产品公司 抗ctla－4抗体的用途
JP2009111655A (ja) * 2007-10-30 2009-05-21 Alaxala Networks Corp ネットワーク管理システム
GB201103955D0 (en) * 2011-03-09 2011-04-20 Antitope Ltd Antibodies
CN105296433B (zh) * 2014-08-01 2018-02-09 中山康方生物医药有限公司 一种ctla4抗体、其药物组合物及其用途
CN113603784A (zh) * 2015-05-29 2021-11-05 艾吉纳斯公司 抗-ctla-4抗体及其使用方法
WO2017062797A1 (en) * 2015-10-07 2017-04-13 The University Of North Carolina At Chapel Hill The methods for treatment of tumors
WO2021098851A1 (en) * 2019-11-20 2021-05-27 Eucure (Beijing) Biopharma Co., Ltd Anti-ctla4/ox40 bispecific antibodies and uses thereof
IL297545A (en) * 2020-04-26 2022-12-01 Biocytogen Pharmaceuticals Beijing Co Ltd Modified immunoglobulins

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20170226211A1 (en) 2016-05-10 2017-08-10 Agency For Science, Technology And Research Anti-ctla-4 antibodies

Also Published As

Publication number Publication date
BR112020005496A2 (pt) 2020-09-29
US20210188981A1 (en) 2021-06-24
RU2020111428A (ru) 2021-10-21
WO2019056281A1 (en) 2019-03-28
CN111406069A (zh) 2020-07-10
EP3684812A1 (en) 2020-07-29
EP3684812A4 (en) 2021-09-08
IL304144A (en) 2023-09-01
IL272993A (en) 2020-04-30
JP2022179611A (ja) 2022-12-02
US20200291117A1 (en) 2020-09-17
SG11202001604UA (en) 2020-04-29
JP7155270B2 (ja) 2022-10-18
AU2017432728A1 (en) 2020-02-27
US11034764B2 (en) 2021-06-15
KR20200054220A (ko) 2020-05-19
MX2020003132A (es) 2020-07-28
CN111406069B (zh) 2022-12-30
JP2021503294A (ja) 2021-02-12
CA3073984A1 (en) 2019-03-28
RU2020111428A3 (ko) 2021-10-21

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR102543719B1 (ko) 항―ｃｔｌａ４ 항체 및 그의 용도
KR102608723B1 (ko) 항―ｐｄ－１ 항체 및 그의 용도
US10934365B2 (en) Anti-OX40 antibodies and uses thereof
US20220324978A1 (en) Anti-pd-1 antibodies and uses thereof
US20220169728A1 (en) Bispecific antibodies and uses thereof
RU2779312C2 (ru) Антитела против ctla4 и их применения
RU2783314C2 (ru) Антитела против ox40 и их применения

Legal Events

Date Code Title Description
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right