CN111406069A - 抗ctla4抗体及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了抗细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA4或CTLA‑4)抗体、抗原结合片段，及其用途。

Description

抗CTLA4抗体及其用途
技术领域
本公开内容涉及细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(cytotoxic T-lymphocyte-associated protein 4，CTLA4或CTLA-4)抗体及其用途。
背景技术
癌症是目前人类死亡率最高的疾病之一。根据世界卫生组织的统计数据，2012年全球癌症发病和死亡病例数分别达到1400万和820万。在中国，新诊断的癌症病例为307万，死亡人数为220万。
抗癌抗体的最新临床和商业成功已引起对基于抗体的治疗剂的极大兴趣。需要开发用于各种基于抗体的治疗剂中的抗癌抗体以治疗癌症。
发明内容
本公开内容涉及抗CTLA4抗体、其抗原结合片段，及其用途。
在一方面，本公开内容涉及与细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA4)结合的抗体或其抗原结合片段，其包含：重链可变区(VH)，所述重链可变区(VH)包含互补决定区(CDRs)1、2和3，其中VH CDR1区包含与所选VH CDR1氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列，VH CDR2区包含与所选VH CDR2氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列，并且VHCDR3区包含与所选VH CDR3氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列；以及轻链可变区(VL)，所述轻链可变区(VL)包含CDRs 1、2和3，其中VL CDR1区包含与所选VL CDR1氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列，VLCDR2区包含与所选VL CDR2氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列，并且VL CDR3区包含与所选VL CDR3氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列，
其中所选VH CDRs 1、2和3氨基酸序列以及所选VL CDRs 1、2和3氨基酸序列是以下之一：
(1)所选VH CDR 1、2、3氨基酸序列分别在SEQ ID NO:1、2、3中示出，并且所选VLCDR 1、2、3氨基酸序列分别在SEQ ID NO:4、5、6中示出；
(2)所选VH CDR 1、2、3氨基酸序列分别在SEQ ID NO:7、8、9中示出，并且所选VL CDR1、2、3氨基酸序列分别在SEQ ID NO:10、11、12中示出；
(3)所选VH CDR 1、2、3氨基酸序列分别在SEQ ID NO:45、46、47中示出，并且所选VLCDR 1、2、3氨基酸序列分别在SEQ ID NO:48、49、50中示出；
(4)所选VH CDR 1、2、3氨基酸序列分别在SEQ ID NO:51、52、53中示出，并且所选VLCDR 1、2、3氨基酸序列分别在SEQ ID NO:54、55、56中示出。
在一些实施方案中，VH包含分别具有SEQ ID NO:1、2和3中所示氨基酸序列的CDR1、2、3，并且VL包含分别具有SEQ ID NO:4、5和6中所示氨基酸序列的CDR 1、2、3。
在一些实施方案中，VH包含分别具有SEQ ID NO:7、8和9中所示氨基酸序列的CDR1、2、3，并且VL包含分别具有SEQ ID NO:10、11和12中所示氨基酸序列的CDR 1、2、3。
在一些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段与人CTLA4特异性结合。在一些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段是人源化的抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段是单链可变片段(scFV)。
在一方面，本公开内容涉及一种核酸，其包含编码多肽的多核苷酸，所述多肽包含：
(1)包含重链可变区(VH)的免疫球蛋白重链或其片段，所述重链可变区(VH)包含分别包含SEQ ID NO:1、2和3中所示氨基酸序列的互补决定区(CDR)1、2和3，并且其中所述VH在与包含SEQ ID NO:18、19、20或70中所示氨基酸序列的轻链可变区(VL)配对时与CTLA4结合；
(2)包含VL的免疫球蛋白轻链或其片段，所述VL包含分别包含SEQ ID NO:4、5和6中所示氨基酸序列的CDR 1、2和3，并且其中所述VL在与包含SEQ ID NO:13、14、15、16、17或69中所示氨基酸序列的VH配对时与CTLA4结合；
(3)包含重链可变区(VH)的免疫球蛋白重链或其片段，所述重链可变区(VH)包含分别包含SEQ ID NO:7、8和9中所示氨基酸序列的CDR 1、2和3，并且其中所述VH在与包含SEQ IDNO:25、26、27、28或72中所示氨基酸序列的轻链可变区(VL)配对时与CTLA4结合；或者
(4)包含VL的免疫球蛋白轻链或其片段，所述VL包含分别包含SEQ ID NO:10、11和12中所示氨基酸序列的CDR 1、2和3，并且其中所述VL在与包含SEQ ID NO:21、22、23、24或71中所示氨基酸序列的VH配对时与CTLA4结合；
(5)包含重链可变区(VH)的免疫球蛋白重链或其片段，所述重链可变区(VH)包含分别包含SEQ ID NO:45、46和47中所示氨基酸序列的CDR 1、2和3，并且其中所述VH在与包含SEQID NO:74中所示氨基酸序列的轻链可变区(VL)配对时与CTLA4结合；
(6)包含VL的免疫球蛋白轻链或其片段，所述VL包含分别包含SEQ ID NO:48、49和50中所示氨基酸序列的CDR 1、2和3，并且其中所述VL在与包含SEQ ID NO:73中所示氨基酸序列的VH配对时与CTLA4结合；
(7)包含重链可变区(VH)的免疫球蛋白重链或其片段，所述重链可变区(VH)包含分别包含SEQ ID NO:51、52和53中所示氨基酸序列的CDR 1、2和3，并且其中所述VH在与包含SEQID NO:76中所示氨基酸序列的轻链可变区(VL)配对时与CTLA4结合；
(8)包含VL的免疫球蛋白轻链或其片段，所述VL包含分别包含SEQ ID NO:54、55和56中所示氨基酸序列的CDR 1、2和3，并且其中所述VL在与包含SEQ ID NO:75中所示氨基酸序列的VH配对时与CTLA4结合。
在一些实施方案中，所述核酸包含编码多肽的多核苷酸，所述多肽包含含有VH的免疫球蛋白重链或其片段，所述VH包含分别包含SEQ ID NO:1、2和3中所示氨基酸序列的CDR 1、2和3。
在一些实施方案中，所述核酸包含编码多肽的多核苷酸，所述多肽包含含有VL的免疫球蛋白轻链或其片段，所述VL包含分别包含SEQ ID NO:4、5和6中所示氨基酸序列的CDR 1、2和3。
在一些实施方案中，所述核酸包含编码多肽的多核苷酸，所述多肽包含含有VH的免疫球蛋白重链或其片段，所述VH包含分别包含SEQ ID NO:7、8和9中所示氨基酸序列的CDR 1、2和3。
在一些实施方案中，所述核酸包含编码多肽的多核苷酸，所述多肽包含含有VL的免疫球蛋白轻链或其片段，所述VL包含分别包含SEQ ID NO:10、11和12中所示氨基酸序列的CDR 1、2和3。
在一些实施方案中，所述VH在与VL配对时与人CTLA4特异性结合。在一些实施方案中，所述VL在与VH配对时与人CTLA4特异性结合。
在一些实施方案中，所述免疫球蛋白重链或其片段是人源化的免疫球蛋白重链或其片段，并且所述免疫球蛋白轻链或其片段是人源化的免疫球蛋白轻链或其片段。
在一些实施方案中，所述核酸编码单链可变片段(scFv)。在一些实施方案中，所述核酸是cDNA。
在另一方面，本公开内容还提供了一种载体，其包含一种或更多种如本文所述的核酸。在一些实施方案中，所述载体编码VL区和VH区，所述VL区和VH区一起结合CTLA4。
在一方面，本公开内容涉及载体对，其中每个载体包含一种如本文所述的核酸，其中所述载体对一起编码VL区和VH区，所述VL区和VH区一起结合CTLA4。
在一方面，本公开内容提供了一种细胞，其包含如本文所述的载体或如本文所述的载体对。在一些实施方案中，所述细胞是CHO细胞。
在另一方面，本公开内容涉及一种细胞，其包含如本文所述的一种或更多种核酸。
在一方面，本公开内容提供了一种细胞，其包含如本文所述的两种核酸。在一些实施方案中，所述两种核酸一起编码VL区和VH区，所述VL区和VH区一起结合CTLA4。
在一方面，本公开内容还提供了产生抗体或其抗原结合片段的方法。所述方法包括以下步骤：在足以使如本文所述的细胞产生抗体或抗原结合片段的条件下培养细胞；以及收集由细胞产生的抗体或抗原结合片段。
在一方面，本公开内容涉及与CTLA4结合的抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，所述重链可变区(VH)包含与所选VH序列具有至少90％同一性的氨基酸序列，所述轻链可变区(VL)包含与所选VL序列具有至少90％同一性的氨基酸序列，其中所选VH序列和所选VL序列是以下之一：
(1)所选VH序列是SEQ ID NO:13、14、15、16、17或69，并且所选VL序列是SEQ ID NO:18、19、20或70；
(2)所选VH序列是SEQ ID NO:21、22、23、24或71，并且所选VL序列是SEQ ID NO:25、26、27、28或72；
(3)所选VH序列是SEQ ID NO:73，并且所选VL序列是SEQ ID NO:74；
(4)所选VH序列是SEQ ID NO:75，并且所选VL序列是SEQ ID NO:76。
在一些实施方案中，VH包含SEQ ID NO:13的序列，并且VL包含SEQ ID NO:19的序列。在一些实施方案中，VH包含SEQ ID NO:14的序列，并且VL包含SEQ ID NO:19的序列。
在一些实施方案中，VH包含SEQ ID NO:21的序列，并且VL包含SEQ ID NO:25的序列。在一些实施方案中，VH包含SEQ ID NO:22的序列，并且VL包含SEQ ID NO:25的序列。
在一些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段与人CTLA4特异性结合。在一些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段是人源化的抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段是单链可变片段(scFV)。
在一方面，本公开内容还提供了抗体-药物缀合物，其包含与治疗剂共价或非共价结合的抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，治疗剂是细胞毒性剂或细胞抑制剂(例如，细胞松弛素B、短杆菌肽D、溴化乙锭、依米丁(emetine)、丝裂霉素、依托泊苷(etoposide)、替尼泊苷(tenoposide)、长春新碱、长春碱、秋水仙碱、多柔比星、柔红霉素、二羟基炭疽菌素、美登素类(例如DM-1和DM-4)、二酮(dione)、米托蒽醌(mitoxantrone)、光辉霉素(mithramycin)、放线菌素D、1-双氢睾酮、糖皮质激素、普鲁卡因(procaine)、丁卡因(tetracaine)、利多卡因(lidocaine)、普萘洛尔、嘌呤霉素、表柔比星和环磷酰胺，及类似物)。
在一方面，本公开内容提供了治疗患有癌症的对象的方法。所述方法包括以下步骤：向对象施用治疗有效量的组合物，所述组合物包含如本文所述的抗体或抗原结合片段、或者如本文所述的抗体-药物缀合物。
在一些实施方案中，所述癌症是黑素瘤。在一些实施方案中，所述癌症是不可切除的黑色素瘤或转移性黑色素瘤。
在一些实施方案中，所述癌症是非小细胞肺癌(non-small cell lungcarcinoma，NSCLC)、小细胞肺癌(small cell lung cancer，SCLC)、膀胱癌或转移性激素难治性前列腺癌。
在一方面，本公开内容还提供了降低肿瘤生长速率的方法。所述方法包括以下步骤：使肿瘤细胞与有效量的组合物接触，所述组合物包含如本文所述的抗体或其抗原结合片段。
在另一方面，本公开内容涉及杀伤肿瘤细胞的方法，所述方法包括以下步骤：使肿瘤细胞与有效量的组合物接触，所述组合物包含如本文所述的抗体或其抗原结合片段、或者如本文所述的抗体-药物缀合物。
在一方面，本公开内容提供了药物组合物，其包含如本文所述的抗体或其抗原结合片段，以及可药用载体。
在另一方面，本公开内容涉及药物组合物，其包含如本文所述的抗体药物缀合物，以及可药用载体。
如本文所用，术语“癌症”是指具有自主生长能力的细胞。这类细胞的一些实例包括具有以迅速增殖的细胞生长为特征的异常状态或状况的细胞。该术语旨在包括癌性生长物，例如肿瘤；致癌过程、转移性组织以及恶性转化的细胞、组织或器官，无论组织病理类型或浸润期如何。还包括多种器官系统的恶性病，所述器官系统例如呼吸系统、心血管系统、肾系统、生殖系统、血液系统、神经系统、肝系统、胃肠系统和内分泌系统；以及腺癌，其包括恶性病，例如大多数结肠癌、肾细胞癌、前列腺癌和/或睾丸肿瘤、肺部非小细胞癌、和小肠癌。“天然发生的”癌症包括任何不是通过将癌细胞植入对象体内而在实验上诱导的癌症，并且包括例如自发产生的癌症、由患者暴露于致癌物引起的癌症、由癌基因的插入或肿瘤抑制基因的敲除引起的癌症，以及由感染(例如病毒感染)引起的癌症。术语“癌(carcinoma)”是本领域公认的，并且是指上皮或内分泌组织的恶性病。该术语还包括癌肉瘤，其包括由癌性组织和肉瘤性组织构成的恶性肿瘤。“腺癌”是指源自腺组织或其中肿瘤细胞形成可识别的腺结构的癌。术语“肉瘤”是本领域公认的，并且是指间充质来源的恶性肿瘤。术语“造血性肿瘤性疾病(hematopoietic neoplastic disorder)”包括涉及造血起源的增生性细胞/肿瘤细胞的疾病。造血性肿瘤性疾病可由骨髓、淋巴或红系谱系、或其前体细胞引起。
如本文所用，术语“抗体”是指包含至少一个(例如，一个、两个、三个、四个、五个或六个)互补决定区(CDR)(例如，来自免疫球蛋白轻链的三个CDR中的任何或者来自免疫球蛋白重链的三个CDR中的任何)并且能够与表位特异性结合的任何抗原结合分子。抗体的非限制性实例包括：单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)、单链抗体、嵌合抗体、人抗体和人源化抗体。在一些实施方案中，抗体可包含人抗体的Fc区。术语抗体还包括衍生物，例如由抗体片段形成的双特异性抗体、单链抗体、双抗体(diabody)、线性抗体和多特异性抗体。
如本文所用，术语“抗原结合片段”是指全长抗体的一部分，其中抗体的该部分能够与抗原特异性结合。在一些实施方案中，抗原结合片段包含至少一个可变结构域(例如，重链的可变结构域或轻链的可变结构域)。抗体片段的非限制性实例包括例如Fab、Fab’、F(ab’)2和Fv片段。
如本文所用，术语“人抗体”是指由人中存在的内源核酸(例如，重排的人免疫球蛋白重链或轻链基因座)编码的抗体。在一些实施方案中，人抗体是从人收集或在人细胞培养物(例如，人杂交瘤细胞)中产生的。在一些实施方案中，人抗体是在非人细胞(例如，小鼠或仓鼠细胞系)中产生的。在一些实施方案中，人抗体是在细菌或酵母细胞中产生的。在一些实施方案中，人抗体是在含有未重排或重排的人免疫球蛋白基因座(例如，重链或轻链人免疫球蛋白基因座)的转基因非人动物(例如牛)中产生的。
如本文所用，术语“嵌合抗体”是指包含存在于至少两种不同抗体(例如，来自两种不同哺乳动物物种的抗体，例如人抗体和小鼠抗体)中的序列的抗体。嵌合抗体的非限制性实例是包含非人(例如小鼠)抗体的可变结构域序列(例如，轻链和/或重链可变结构域序列的全部或一部分)和人抗体的恒定结构域的抗体。嵌合抗体的另外实例在本文中进行了描述并且是本领域已知的。
如本文所用，术语“人源化抗体”是指非人抗体，其包含源自非人(例如，小鼠)免疫球蛋白的最小序列并且包含源自人免疫球蛋白的序列。在一些非限制性实例中，人源化抗体是人抗体(受体抗体)，其中受体抗体的高变(CDR)区残基被来自具有期望特异性、亲和力和性能的非人抗体(例如，供体抗体)(例如小鼠、大鼠或兔抗体)的高变(CDR)区残基替换。在一些实施方案中，人免疫球蛋白的Fv框架残基被相应的非人(例如，小鼠)免疫球蛋白残基替换。在一些实施方案中，人源化抗体可包含不存在于受体抗体或供体抗体中的残基。可进行这些修饰以进一步改善抗体性能。在一些实施方案中，人源化抗体包含至少一个并且通常两个可变结构域的基本上全部，其中全部或基本上全部的高变环(CDR)对应于非人(例如小鼠)免疫球蛋白的可变结构域，并且全部或基本上全部的框架区是人免疫球蛋白的框架区。人源化抗体还可包含至少一部分免疫球蛋白恒定区(Fc)，通常指人免疫球蛋白的恒定区(Fc)。可以使用本领域已知的分子生物学方法产生人源化抗体。本文描述了用于产生人源化抗体的方法的非限制性实例。
如本文所用，术语“单链抗体”是指能够与抗原特异性结合的包含至少两个免疫球蛋白可变结构域(例如，哺乳动物免疫球蛋白重链或轻链的可变结构域)的单个多肽。单链抗体的非限制性实例在本文中进行了描述。
如本文所用，术语“多聚体抗体”是指包含四个或更多个(例如六个、八个或十个)免疫球蛋白可变结构域的抗体。在一些实施方案中，多聚体抗体能够使一个靶分子(例如CTLA4)与哺乳动物细胞(例如人T细胞)表面上的至少一个第二靶分子(例如PD1)交联。
如本文所用，术语“对象”和“患者”在整个说明书中可互换使用，并且描述了根据本发明的方法提供治疗的人或非人动物。本发明考虑了兽医和非兽医应用。人患者可以是成人或未成年人(例如小于18岁的人)。除人外，患者还包括但不限于小鼠、大鼠、仓鼠、豚鼠、兔、雪貂、猫、狗和灵长类。包括例如非人灵长类(例如猴、黑猩猩、大猩猩等)、啮齿动物(例如大鼠、小鼠、沙鼠、仓鼠、雪貂、兔)、兔类动物(lagomorph)、猪类(例如猪、微型猪(miniature pig))、马、犬、猫、牛和其他家养、农场和动物园动物。
如本文所用，当提及抗体时，短语“与…特异性结合”和“特异性结合…”是指由于相互作用取决于靶分子上特定结构(即抗原决定簇或表位)的存在而相对于其他分子抗体优先与其靶分子(例如，CTLA4)相互作用；换句话说，该试剂识别并结合包含特定结构的分子，而不是一般的所有分子。与靶分子特异性结合的抗体可以称为靶标特异性抗体。例如，可将与CTLA4分子特异性结合的抗体称为CTLA4特异性抗体或抗CTLA4抗体。
如本文所用，术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”可互换使用，是指至少两个氨基酸的任意长度的氨基酸聚合物。
如本文所用，术语“多核苷酸”、“核酸分子”和“核酸序列”在本文可互换使用，是指至少两个核苷酸的任意长度的核苷酸聚合物，并且包括但不限于DNA、RNA、DNA/RNA杂交体，及其修饰物。
除非另有定义，否则本文所用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同的含义。本文描述了用于本发明的方法和材料；但也可以使用本领域已知的其他合适方法和材料。材料、方法和实例仅是举例说明性的，并且不旨在限制。本文提及的所有出版物、专利申请、专利、序列、数据库条目和其他参考文献均通过引用整体并入。在发生冲突的情况下，以本说明书(包括定义)为准。
根据以下具体实施方式和附图以及权利要求书，本发明的其他特征和优点将变得明显。
附图说明
图1是显示制备抗CTLA4抗体的示例性方案的第一部分的流程图。
图2是显示制备抗CTLA4抗体的示例性方案的第二部分的流程图。
图3是一组流式细胞术图，显示了抗CTLA4抗体阻断CTLA4与CD80之间的结合。
图4是一组流式细胞术图，显示了抗CTLA4抗体阻断CTLA4与CD86之间的结合。
图5是一组图，显示了抗CTLA4抗体针对猴CTLA4(rmCTLA4)、小鼠CTLA4(mCTLA4)和人-小鼠嵌合CTLA4(chiCTLA4)的交叉反应性的流式细胞术结果。
图6是显示了用抗CTLA4抗体13A4和4G12处理的植入MC-38肿瘤的B-hCTLA-4人源化小鼠随时间的体重的图。
图7是显示了用抗CTLA4抗体13A4和4G12处理的植入MC-38肿瘤的B-hCTLA-4人源化小鼠随时间的体重百分比变化的图。
图8是显示了用抗CTLA4抗体13A4和4G12处理的植入MC-38肿瘤的B-hCTLA-4人源化小鼠中随时间的肿瘤体积的图。
图9是显示了用Yervoy和13A4处理的植入MC-38肿瘤的B-hCTLA-4人源化小鼠随时间的体重的图。
图10是显示了用Yervoy和13A4处理的植入MC-38肿瘤的B-hCTLA-4人源化小鼠随时间的体重百分比变化的图。
图11是显示了用Yervoy和13A4处理的植入MC-38肿瘤的B-hCTLA-4人源化小鼠中随时间的肿瘤体积的图。
图12是显示了用Yervoy、人源化抗hCTLA4抗体4G12-H1K1-IgG1和4G12-H2K1-IgG1处理的植入MC-38肿瘤的B-hCTLA-4人源化小鼠随时间的体重的图。
图13是显示了用Yervoy、人源化抗hCTLA4抗体4G12-H1K1-IgG1和4G12-H2K1-IgG1处理的植入MC-38肿瘤的B-hCTLA-4人源化小鼠随时间的体重百分比变化的图。
图14是显示了用Yervoy、人源化抗hCTLA4抗体4G12-H1K1-IgG1和4G12-H2K1-IgG1处理的植入MC-38肿瘤的B-hCTLA-4人源化小鼠中随时间的肿瘤体积的图。
图15是显示了用Yervoy、人源化抗hCTLA4抗体13A4-H1K2-IgG1、13A4-H2K2-IgG1、13A4-H1K2-IgG4和13A4-H1K2-IgG1-N297A处理的植入MC-38肿瘤的B-hCTLA-4人源化小鼠随时间的体重的图。
图16是显示了用Yervoy、人源化抗hCTLA4抗体13A4-H1K2-IgG1、13A4-H2K2-IgG1、13A4-H1K2-IgG4和13A4-H1K2-IgG1-N297A处理的植入MC-38肿瘤的B-hCTLA-4人源化小鼠随时间的体重百分比变化的图。
图17是显示了用Yervoy、人源化抗hCTLA4抗体13A4-H1K2-IgG1、13A4-H2K2-IgG1、13A4-H1K2-IgG4和13A4-H1K2-IgG1-N297A处理的植入MC-38肿瘤的B-hCTLA-4人源化小鼠中随时间的肿瘤体积的图。
图18是一组流式细胞术图，显示了抗CTLA4抗体阻断CTLA4与人CD86之间的结合。
图19是一组图，显示了抗CTLA4抗体针对猴、小鼠和人-小鼠嵌合CTLA4的交叉反应性的流式细胞术结果。
图20是显示了用CT4-04-13A4、CT4-20-6D2和CT4-20-7E12处理的植入MC-38肿瘤的B-hCTLA-4人源化小鼠随时间的体重的图。
图21是显示了用CT4-04-13A4、CT4-20-6D2和CT4-20-7E12处理的植入MC-38肿瘤的B-hCTLA-4人源化小鼠随时间的体重百分比变化的图。
图22是显示了用CT4-04-13A4、CT4-20-6D2和CT4-20-7E12处理的植入MC-38肿瘤的B-hCTLA-4人源化小鼠中随时间的肿瘤体积的图。
图23列出了通过Kabat编号定义的抗CTLA4抗体13A4、4G12、6D2、7E12、及其人源化抗体的CDR序列。
图24列出了通过Chothia编号定义的抗CTLA4抗体13A4、4G12、6D2、7E12、及其人源化抗体的CDR序列。
图25列出了人源化抗CTLA4抗体的重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列。
图26列出了人CTLA4、小鼠CTLA4、猴CTLA4和嵌合CTLA4的氨基酸序列。
图27示出了数种小鼠抗hCTLA4抗体的重链和轻链可变区的氨基酸序列。
具体实施方式
本公开内容提供了与细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4、CTLA4，也称为CD152)结合的抗体、其抗原结合片段的一些实例。
CTLA4是由活化的T细胞表达并向T细胞传递抑制信号的免疫球蛋白超家族的成员。其为免疫检查点，并且当与CD80或CD86结合时充当“关闭”开关，从而下调免疫应答。
本公开内容还提供了人源化抗CTLA4抗体的序列以及制备和使用所述抗体的方法。
CTLA4和癌症
免疫系统可以区分体内的正常细胞与其视为“外来”的那些细胞，这使免疫系统能够攻击外来细胞，而正常细胞不受影响。这种机制有时涉及被称为免疫检查点的蛋白质。免疫检查点是免疫系统中调高信号(共刺激分子)或调低信号的分子。
检查点抑制因子可防止免疫系统攻击正常组织，从而防止自身免疫病。许多肿瘤细胞也表达检查点抑制因子。这些肿瘤细胞通过选择某些免疫检查点途径来逃避免疫监视，特别是在对肿瘤抗原具有特异性的T细胞中(Creelan,Benjamin C.“Update on immunecheckpoint inhibitors in lung cancer.”Cancer Control 21.1(2014):80-89)。由于许多免疫检查点是由配体-受体相互作用引发的，因此它们容易可被针对配体和/或其受体的抗体所阻断。
免疫检查点途径涉及一系列复杂的细胞相互作用，其防止正常条件下T细胞过度激活的效应活性。该途径的一部分是被称为细胞毒性T淋巴细胞抗原4(CTLA4、CD152)的细胞表面受体。CTLA4是仅在T细胞上表达的免疫球蛋白超家族的成员。CTLA4起到抑制T细胞活化的作用，并且据报道抑制辅助性T细胞活性并增强调节性T细胞免疫抑制活性。因此，CTLA-4充当“关闭”开关，并且调低免疫应答。一旦细胞毒性T细胞变得活跃，其在其细胞表面表达CTLA-4，CTLA-4然后与共刺激分子CD28竞争它们在APC上共同配体B7-1(CD80)或B7-2(CD86)。这种“阴阳”平衡将细胞毒性活性牵制，同时允许T细胞功能以自我限制的方式进行(Creelan,Benjamin C."Update on immune checkpoint inhibitors in lungcancer."Cancer Control 21.1(2014):80-89)。
许多癌细胞可以刺激T细胞中CTLA-4的异常表达，而这些CTLA-4异常T细胞表现出无能表型。因此，癌细胞可以选择CTLA-4途径逃避巡逻的T细胞。抑制CTLA-4的单克隆抗体的引入可在数种癌症(例如黑素瘤)中实现一致且持久的抗肿瘤响应。这些抗CTLA4抗体(例如替西木单抗(tremelimumab)和伊匹单抗(ipilimumab)(Yervoy))与CTLA4结合，从而阻断抑制信号，这使细胞毒性T淋巴细胞破坏癌细胞。因此，抗CTLA4抗体可用于治疗癌症。
本公开内容提供了数种抗CTLA4抗体、其抗原结合片段，以及使用这些抗CTLA4抗体和抗原结合片段来治疗癌症的方法。
抗体和抗原结合片段
本公开内容提供了抗CTLA4抗体及其抗原结合片段。通常，抗体(也称为免疫球蛋白)由轻链和重链两类多肽链构成。本公开内容的非限制性抗体可以是包含两条重链和两条轻链的完整的四免疫球蛋白链抗体。抗体的重链可以是任何同种型，包括IgM、IgG、IgE、IgA或IgD；或者亚同种型，包括IgG1、IgG2、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgG4、IgE1、IgE2等。轻链可以是κ轻链或λ轻链。抗体可包含轻链的两个相同拷贝和重链的两个相同拷贝。各自包含一个可变结构域(或可变区，VH)和多个恒定结构域(或恒定区)的重链通过其恒定结构域内的二硫键相互结合以形成抗体的“柄”。各自包含一个可变结构域(或可变区，VL)和一个恒定结构域(或恒定区)的轻链各自通过二硫键结合与一条重链结合。每个轻链的可变区与其所结合的重链的可变区配对。轻链和重链二者的可变区都包含位于在更保守的框架区(FR)之间的三个高变区。
这些高变区，称为互补决定区(CDR)，形成包含抗体的主要抗原结合表面的环。四个框架区主要采用β-折叠构象，并且CDR形成环状连接，所述环状连接β-折叠结构并且在某些情况下形成β-折叠结构的一部分。每条链中的CDR通过框架区保持紧密靠近，并且与来自另一条链的CDR一起帮助形成抗原结合区。
通过分析抗体的氨基酸序列来鉴定抗体的CDR区的方法是公知的，并且CDR的许多定义是常用的。Kabat定义基于序列变异性，Chothia定义基于结构环区域的位置。这些方法和定义在以下中描述：例如Martin,"Protein sequence and structure analysis ofantibody variable domains,"Antibody engineering,Springer Berlin Heidelberg,2001.422-439；Abhinandan,et al."Analysis and improvements to Kabat andstructurally correct numbering of antibody variable domains,"Molecularimmunology45.14(2008):3832-3839；Wu,T.T.and Kabat,E.A.(1970)J.Exp.Med.132:211-250；Martin et al.,Methods Enzymol.203:121-53(1991)；Morea et al.,BiophysChem.68(1-3):9-16(Oct.1997)；Morea et al.,J Mol Biol.275(2):269-94(Jan.1998)；Chothia et al.,Nature 342(6252):877-83(Dec.1989)；Ponomarenko and Bourne,BMCStructural Biology 7:64(2007)；其各自通过引用整体并入本文。
CDR对于识别抗原表位是重要的。如本文所用，“表位”是靶分子能够被抗体的抗原结合结构域特异性结合的最小部分。表位的最小尺寸可以为约3、4、5、6或7个氨基酸，但这些氨基酸不必位于抗原一级结构的连续线性序列中，因为表位可依赖于基于抗原的二级和三级结构的抗原的三维构象。
在一些实施方案中，抗体是完整的免疫球蛋白分子(例如，IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgM、IgD、IgE、IgA)。IgG亚类(IgG1、IgG2、IgG3和IgG4)是高度保守的，不同之处在于其恒定区，尤其是其铰链和上CH2结构域。IgG亚类的序列和差异是本领域已知的，并且描述在例如以下中：Vidarsson,Gestur,Gillian Dekkers,and Theo Rispens."IgGsubclasses and allotypes:from structure to effector functions."Frontiers inimmunology 5(2014)；Irani,Vashti,et al."Molecular properties of human IgGsubclasses and their implications for designing therapeutic monoclonalantibodies against infectious diseases."Molecular immunology 67.2(2015):171-182；Shakib,Farouk,ed.The human IgG subclasses:molecular analysis ofstructure,function and regulation.Elsevier,2016；其各自通过引用整体并入本文。
抗体也可以是来源于任何物种(例如人、啮齿动物、小鼠、骆驼科)的免疫球蛋白分子。本文公开的抗体还包括但不限于多克隆抗体、单克隆抗体、单特异性抗体、多特异性抗体以及包含与另一多肽融合的免疫球蛋白结合结构域的嵌合抗体。术语“抗原结合结构域”或“抗原结合片段”是保留了完整抗体的特异性结合活性的抗体部分，即抗体的能够与完整抗体的靶分子上的表位特异性结合的任何部分。其包括例如Fab、Fab'、F(ab')2以及这些片段的变体。因此，在一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段可以是例如由抗体片段形成的scFv、Fv、Fd、dAb、双特异性抗体、双特异性scFv、双抗体、线性抗体、单链抗体分子、多特异性抗体，以及包含为抗体结合结构域或与抗体结合结构域同源的结合结构域的任何多肽。抗原结合结构域的非限制性实例包括，例如，完整抗体的重链和/或轻链CDR、完整抗体的重链和/或轻链可变区、完整抗体的全长重链或轻链，或来自完整抗体的重链或轻链的单个CDR。
在一些实施方案中，抗原结合片段可以形成嵌合抗原受体(chimeric antigenreceptor，CAR)的一部分。在一些实施方案中，嵌合抗原受体是与CD3-ζ跨膜和胞内结构域融合的本文所述的单链可变片段(scFv)的融合体。在一些实施方案中，嵌合抗原受体还包含来自多种共刺激蛋白受体(例如，CD28、41BB、ICOS)的细胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，嵌合抗原受体包含多个信号传导结构域，例如CD3z-CD28-41BB或CD3z-CD28-OX40，以增强效力。因此，在一方面，本公开内容还提供了表达如本文所述的嵌合抗原受体的细胞(例如，T细胞)。
在一些实施方案中，scFV具有一个重链可变结构域和一个轻链可变结构域。
抗CTLA4抗体和抗原结合片段
本公开内容提供了与CTLA4特异性结合的抗体及其抗原结合片段。本文所述的抗体和抗原结合片段能够与CTLA4结合并且可以抑制CTLA4抑制途径，从而提高免疫应答。本公开内容提供了小鼠抗CTLA4抗体CT4-04-13A4(“13A4”)、CT4-03-4G12(“4G12”)、CT4-20-6D2(“6D2”)和CT4-20-7E12(“7E12”)，及其人源化抗体。
如通过Kabat编码定义的，13A4和13A4衍生抗体(例如人源化抗体)的CDR序列包含重链可变结构域的CDR，SEQ ID NO:1-3，和轻链可变结构域的CDR，SEQ ID NO:4-6。CDR也可以由Chothia系统定义。在Chothia编码下，重链可变结构域的CDR序列在SEQ ID NO:29-31中示出，并且轻链可变结构域的CDR序列在SEQ ID NO:32-34中示出。
类似地，如通过Kabat编码定义的，4G12和4G12衍生抗体的CDR序列包含重链可变结构域的CDR，SEQ ID NO:7-9，和轻链可变结构域的CDR，SEQ ID NO:10-12。在Chothia编码下，重链可变结构域的CDR序列在SEQ ID NO:35-37中示出，并且轻链可变结构域的CDR在SEQ ID NO:38-40中示出。
如通过Kabat编码定义的，6D2和6D2衍生抗体的CDR序列包含重链可变结构域的CDR，SEQ ID NO:45-47，和轻链可变结构域的CDR，SEQ ID NO:48-50。在Chothia编码下，重链可变结构域的CDR序列在SEQ ID NO:57-59中示出，并且轻链可变结构域的CDR在SEQ IDNO:60-62中示出。
如通过Kabat编码定义的，7E12和7E12衍生抗体的CDR序列包含重链可变结构域的CDR，SEQ ID NO:51-53，和轻链可变结构域的CDR，SEQ ID NO:54-56。在Chothia编码下，重链可变结构域的CDR序列在SEQ ID NO:63-65中示出，并且轻链可变结构域的CDR在SEQ IDNO:66-68中示出。
还提供了人源化抗体的重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列。由于存在不同的使小鼠抗体人源化的方法(例如，序列可以被不同的氨基酸替换)，因此抗体的重链和轻链可以具有多于一种形式的人源化序列。人源化13A4抗体的重链可变区的氨基酸序列在SEQID NO:13-17中示出。人源化13A4抗体的轻链可变区的氨基酸序列在SEQ ID NO:18-20中示出。这些重链可变区序列(SEQ ID NO:13-17)中的任一个可与这些轻链可变区序列(SEQ IDNO:18-20)中的任一个配对。
类似地，人源化4G12抗体的重链可变区的氨基酸序列在SEQ ID NO:21-24中示出。人源化4G12抗体的轻链可变区的氨基酸序列在SEQ ID NO:25-28中示出。这些重链可变区序列(SEQ ID NO:21-24)中的任一个可与这些轻链可变区序列(SEQ ID NO:25-28)中的任一个配对。
如图25所示，人源化百分比是指与国际免疫遗传学信息系统(InternationalImmunogenetics Information System，IMGT)数据库中的人抗体序列相比的重链或轻链可变区序列的百分比同一性。最高命中(top hit)是指相对于其他物种，重链或轻链可变区序列更接近特定物种。例如，最高命中于人是指相对于其他物种，序列更接近人。最高命中于人和食蟹猴(Macaca fascicularis)意味着序列与人序列和食蟹猴序列具有相同的百分比同一性，并且与其他物种的序列相比，这些百分比同一性最高。在一些实施方案中，人源化百分比为大于80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％或95％。关于如何确定人源化百分比以及如何确定最高命中的详细描述在本领域中是已知的，并且描述在例如以下中：Jones,Tim D.,et al."The INNs and outs ofantibody nonproprietary names."MAbs.Vol.8.No.1.Taylor&Francis,2016，其通过引用整体并入本文。
此外，在一些实施方案中，本文所述的抗体或其抗原结合片段还可包含一个、两个或三个重链可变区CDR，其选自SEQ ID NO:1-3、SEQ ID NO:7-9、SEQ ID NO:29-31、SEQ IDNO:35-37、SEQ ID NO:45-47、SEQ ID NO:51-53、SEQ ID NO:57-59和SEQ ID NO:63-65；和/或一个、两个或三个轻链可变区CDR，其选自SEQ ID NO:4-6、SEQ ID NO:10-12、SEQ ID NO:32-34、SEQ ID NO:38-40、SEQ ID NO:48-50、SEQ ID NO:54-56、SEQ ID NO:60-62和SEQ IDNO:66-68。
在一些实施方案中，抗体可具有包含互补决定区(CDR)1、2、3的重链可变区(VH)，其中CDR1区包含或由与所选VH CDR1氨基酸序列具有至少80％、85％、90％或95％同一性的氨基酸序列组成，CDR2区包含或由与所选VH CDR2氨基酸序列具有至少80％、85％、90％或95％同一性的氨基酸序列组成，并且CDR3区包含与所选VH CDR3氨基酸序列具有至少80％、85％、90％或95％同一性的氨基酸序列或由其组成；以及包含CDR 1、2、3的轻链可变区(VL)，其中CDR1区包含或由与所选VL CDR1氨基酸序列具有至少80％、85％、90％或95％同一性的氨基酸序列组成，CDR2区包含或由与所选VLCDR2氨基酸序列具有至少80％、85％、90％或95％同一性的氨基酸序列组成，并且CDR3区包含或由与所选VL CDR3氨基酸序列具有至少80％、85％、90％或95％同一性的氨基酸序列组成。所选VH CDR 1、2、3氨基酸序列和所选VL CDR 1、2、3氨基酸序列在图23(Kabat CDR)和图24(Chothia CDR)中示出。
在一些实施方案中，本文所述的抗体或抗原结合片段可包含重链可变结构域，所述重链可变结构域包含以下CDR中的一个、两个或三个：具有0、1或2个氨基酸插入、缺失或替换的SEQ ID NO:1；具有0、1或2个氨基酸插入、缺失或替换的SEQ ID NO:2；具有0、1或2个氨基酸插入、缺失或替换的SEQ ID NO:3。
在一些实施方案中，本文所述的抗体或抗原结合片段可包含重链可变结构域，所述重链可变结构域包含以下CDR中的一个、两个或三个：具有0、1或2个氨基酸插入、缺失或替换的SEQ ID NO:7；具有0、1或2个氨基酸插入、缺失或替换的SEQ ID NO:8；具有0、1或2个氨基酸插入、缺失或替换的SEQ ID NO:9。
在一些实施方案中，本文所述的抗体或抗原结合片段可包含重链可变结构域，所述重链可变结构域包含以下CDR中的一个、两个或三个：具有0、1或2个氨基酸插入、缺失或替换的SEQ ID NO:29；具有0、1或2个氨基酸插入、缺失或替换的SEQ ID NO:30；具有0、1或2个氨基酸插入、缺失或替换的SEQ ID NO:31。
在一些实施方案中，本文所述的抗体或抗原结合片段可包含重链可变结构域，所述重链可变结构域包含以下CDR中的一个、两个或三个：具有0、1或2个氨基酸插入、缺失或替换的SEQ ID NO:35；具有0、1或2个氨基酸插入、缺失或替换的SEQ ID NO:36；具有0、1或2个氨基酸插入、缺失或替换的SEQ ID NO:37。
在一些实施方案中，本文所述的抗体或抗原结合片段可包含重链可变结构域，所述重链可变结构域包含以下CDR中的一个、两个或三个：具有0、1或2个氨基酸插入、缺失或替换的SEQ ID NO:45；具有0、1或2个氨基酸插入、缺失或替换的SEQ ID NO:46；具有0、1或2个氨基酸插入、缺失或替换的SEQ ID NO:47。
在一些实施方案中，本文所述的抗体或抗原结合片段可包含重链可变结构域，所述重链可变结构域包含以下CDR中的一个、两个或三个：具有0、1或2个氨基酸插入、缺失或替换的SEQ ID NO:51；具有0、1或2个氨基酸插入、缺失或替换的SEQ ID NO:52；具有0、1或2个氨基酸插入、缺失或替换的SEQ ID NO:53。
在一些实施方案中，本文所述的抗体或抗原结合片段可包含重链可变结构域，所述重链可变结构域包含以下CDR中的一个、两个或三个：具有0、1或2个氨基酸插入、缺失或替换的SEQ ID NO:57；具有0、1或2个氨基酸插入、缺失或替换的SEQ ID NO:58；具有0、1或2个氨基酸插入、缺失或替换的SEQ ID NO:59。
在一些实施方案中，本文所述的抗体或抗原结合片段可包含重链可变结构域，所述重链可变结构域包含以下CDR中的一个、两个或三个：具有0、1或2个氨基酸插入、缺失或替换的SEQ ID NO:63；具有0、1或2个氨基酸插入、缺失或替换的SEQ ID NO:64；具有0、1或2个氨基酸插入、缺失或替换的SEQ ID NO:65。
在一些实施方案中，本文所述的抗体或抗原结合片段可包含轻链可变结构域，所述轻链可变结构域包含以下CDR中的一个、两个或三个：具有0、1或2个氨基酸插入、缺失或替换的SEQ ID NO:4；具有0、1或2个氨基酸插入、缺失或替换的SEQ ID NO:5；具有0、1或2个氨基酸插入、缺失或替换的SEQ ID NO:6。
在一些实施方案中，本文所述的抗体或抗原结合片段可包含轻链可变结构域，所述轻链可变结构域包含以下CDR中的一个、两个或三个：具有0、1或2个氨基酸插入、缺失或替换的SEQ ID NO:10；具有0、1或2个氨基酸插入、缺失或替换的SEQ ID NO:11；具有0、1或2个氨基酸插入、缺失或替换的SEQ ID NO:12。
在一些实施方案中，本文所述的抗体或抗原结合片段可包含轻链可变结构域，所述轻链可变结构域包含以下CDR中的一个、两个或三个：具有0、1或2个氨基酸插入、缺失或替换的SEQ ID NO:32；具有0、1或2个氨基酸插入、缺失或替换的SEQ ID NO:33；具有0、1或2个氨基酸插入、缺失或替换的SEQ ID NO:34。
在一些实施方案中，本文所述的抗体或抗原结合片段可包含轻链可变结构域，所述轻链可变结构域包含以下CDR中的一个、两个或三个：具有0、1或2个氨基酸插入、缺失或替换的SEQ ID NO:38；具有0、1或2个氨基酸插入、缺失或替换的SEQ ID NO:39；具有0、1或2个氨基酸插入、缺失或替换的SEQ ID NO:40。
在一些实施方案中，本文所述的抗体或抗原结合片段可包含轻链可变结构域，所述轻链可变结构域包含以下CDR中的一个、两个或三个：具有0、1或2个氨基酸插入、缺失或替换的SEQ ID NO:48；具有0、1或2个氨基酸插入、缺失或替换的SEQ ID NO:49；具有0、1或2个氨基酸插入、缺失或替换的SEQ ID NO:50。
在一些实施方案中，本文所述的抗体或抗原结合片段可包含轻链可变结构域，所述轻链可变结构域包含以下CDR中的一个、两个或三个：具有0、1或2个氨基酸插入、缺失或替换的SEQ ID NO:54；具有0、1或2个氨基酸插入、缺失或替换的SEQ ID NO:55；具有0、1或2个氨基酸插入、缺失或替换的SEQ ID NO:56。
在一些实施方案中，本文所述的抗体或抗原结合片段可包含轻链可变结构域，所述轻链可变结构域包含以下CDR中的一个、两个或三个：具有0、1或2个氨基酸插入、缺失或替换的SEQ ID NO:60；具有0、1或2个氨基酸插入、缺失或替换的SEQ ID NO:61；具有0、1或2个氨基酸插入、缺失或替换的SEQ ID NO:62。
在一些实施方案中，本文所述的抗体或抗原结合片段可包含轻链可变结构域，所述轻链可变结构域包含以下CDR中的一个、两个或三个：具有0、1或2个氨基酸插入、缺失或替换的SEQ ID NO:66；具有0、1或2个氨基酸插入、缺失或替换的SEQ ID NO:67；具有0、1或2个氨基酸插入、缺失或替换的SEQ ID NO:68。
插入、缺失和替换可在CDR序列内，或在CDR序列的一个或两个末端。
本公开内容还提供了与CTLA4结合的抗体或其抗原结合片段。抗体或其抗原结合片段包含：重链可变区(VH)，所述重链可变区(VH)包含与所选VH序列具有至少80％、85％、90％或95％同一性的氨基酸序列或由其组成；以及轻链可变区(VL)，所述轻链可变区(VL)包含与所选VL序列具有至少80％、85％、90％或95％同一性的氨基酸序列或由其组成。在一些实施方案中，所选VH序列是SEQ ID NO:13、14、15、16、17或69，并且所选VL序列是SEQ IDNO:18、19、20或70。在一些实施方案中，所选VH序列是SEQ ID NO:21、22、23、24或71，并且所选VL序列是SEQ ID NO:25、26、27、28或72。在一些实施方案中，所选VH序列是SEQ ID NO:73，并且所选VL序列是SEQ ID NO:74。在一些实施方案中，所选VH序列是SEQ ID NO:75，并且所选VL序列是SEQ ID NO:76。
为了确定两个氨基酸序列或两个核酸序列的同一性百分数，将序列出于最佳比较目的而对齐(例如，可在第一和第二氨基酸或核酸序列中的一个或两个中引入缺口以用于最佳对齐，并且出于比较目的可忽略非同源序列)。出于比较目的而对齐的参考序列的长度为参考序列的长度的至少80％，并且在一些实施方案中为至少90％、95％或100％。然后比较在相应氨基酸位置或核苷酸位置的氨基酸残基或核苷酸。当第一序列中的位置与第二序列中的相应位置被相同的氨基酸残基或核苷酸占据时，则分子在该位置处相同。两个序列之间的百分比同一性是在考虑为了两个序列的最佳对齐而需要引入的缺口数目和每个缺口的长度的情况下，序列共有的相同位置的数目的函数。为了本公开内容的目的，序列的比较和两个序列之间同一性百分数的确定可以使用Blossum 62评分矩阵来完成，其中空位罚分12，空位延伸罚分4并且移码空位罚分5。
本公开内容还提供了核酸，其包含编码多肽的多核苷酸，所述多肽包含免疫球蛋白重链或免疫球蛋白重链。免疫球蛋白重链或免疫球蛋白轻链包含如图23或图24中所示的CDR，或者具有如图25或图27中所示的序列。当多肽与相应的多肽(例如，相应的重链可变区或相应的轻链可变区)配对时，配对的多肽与CTLA4结合。
抗CTLA4抗体和抗原结合片段也可以是抗体或抗体片段的抗体变体(包括衍生物和缀合物)，和多特异性(例如双特异性)抗体或抗体片段。本文提供的另外的抗体是多克隆抗体、单克隆抗体、多特异性抗体(多聚体抗体，例如双特异性抗体)、人抗体、嵌合抗体(例如人-小鼠嵌合体)、单链抗体、细胞内产生的抗体(即胞内抗体(intraboies))，及其抗原结合片段。抗体或其抗原结合片段可以是任何类型(例如，IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)、类别(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或亚类。在一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段是IgG抗体或其抗原结合片段。
抗体的片段适合用于所提供的方法，只要其保留了全长抗体的期望亲和力和特异性即可。因此，与CTLA-4结合的抗体的片段将保留与CTLA-4结合的能力。Fv片段是包含完整抗原识别和结合位点的抗体片段。该区域由紧密缔合的一个重链可变结构域和一个轻链可变结构域的二聚体组成，所述缔合在性质上可以是共价的，例如在scFv中。以此配置，每个可变结构域的三个CDR相互作用以限定在VH-VL二聚体的表面上的抗原结合位点。六个CDR或其子集共同为抗体赋予抗原结合特异性。然而，即使单个可变结构域(或Fv的仅包含三个对抗原具有特异性的CDR的一半)也可具有识别和结合抗原的能力，但是通常亲和力低于整个结合位点。
单链Fv或(scFv)抗体片段包含抗体的VH和VL结构域(或区域)，其中这些结构域存在于单个多肽链中。通常，Fv多肽在VH和VL结构域之间还包含多肽接头，其使得scFv能够形成用于抗原结合的期望结构。
Fab片段包含轻链的可变结构域和恒定结构域以及重链的可变结构域和第一恒定结构域(CH1)。F(ab')2抗体片段包含一对Fab片段，它们通常在其羧基末端附近通过其之间的铰链半胱氨酸共价连接。抗体片段的其他化学偶联在本领域中也是已知的。
双抗体是具有两个抗原结合位点的小抗体片段，该片段包含在同一条多肽链中的与VL连接的VH(VH和VL)。通过使用太短以至于不允许同一条链上的两个结构域之间配对的接头，这些结构域被迫与另一条链的互补结构域配对并产生两个抗原结合位点。
线性抗体包含一对串联的Fd区段(VH-CH1-VH-CH1)，其与互补的轻链多肽一起形成一对抗原结合区。线性抗体可以是双特异性或单特异性的。
本公开内容的抗体和抗体片段可在Fc区中进行修饰以提供期望的效应功能或血清半衰期。
抗体的多聚化可通过抗体的天然聚集或通过本领域已知的化学或重组连接技术来实现。例如，一定百分比的纯化的抗体制备物(例如，纯化的IgG1分子)自发形成包含抗体同二聚体和其他更高阶抗体多聚体的蛋白质聚集体。
或者，可通过本领域已知的化学连接技术形成抗体同型二聚体。例如，可使用异型双功能交联剂来形成抗体多聚体，所述交联剂包括但不限于SMCC(琥珀酰亚胺基4-(马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸酯)和SATA
(N-琥珀酰亚胺基S-乙酰基硫代-乙酸酯)。Ghetie et al.(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.94:7509-7514,1997)描述了用于形成抗体同型二聚体的示例性方案。可通过用胃蛋白酶消化将抗体同型二聚体转化为Fab’2同型二聚体。形成抗体同型二聚体的另一种方法是通过使用Zhao et al.(J.Immunol.25:396-404,2002)中所述的自亲性(autophilic)T15肽。
在一些实施方案中，多特异性抗体是双特异性抗体。双特异性抗体可通过改造一对抗体分子之间的界面以使从重组细胞培养物中回收的异二聚体的百分比最大化来制备。例如，界面可包含抗体恒定结构域的CH3结构域的至少一部分。在该方法中，将来自第一抗体分子的界面的一个或多个小氨基酸侧链替换为较大的侧链(例如，酪氨酸或色氨酸)。针对大侧链的相同或相似尺寸的补偿性“腔”在第二抗体分子的界面上通过将较大的氨基酸侧链替换为较小的侧链(例如，丙氨酸或苏氨酸)产生。这提供了一种提高异二聚体相对于其他不需要的最终产物(例如同二聚体)的产量的机制。例如在WO 96/27011中描述了该方法，其通过引用整体并入。
双特异性抗体包括交联抗体或“异缀合物”抗体。例如，异缀合物中的一种抗体可与抗生物素蛋白偶联，并且另一种与生物素偶联。异缀合物抗体也可使用任何方便的交联方法制备。合适的交联剂和交联技术在本领域中是公知的，并且在美国专利No.4,676,980中公开，该专利通过引用整体并入本文。
由抗体片段产生双特异性抗体的方法也是本领域已知的。例如，可使用化学连接来制备双特异性抗体。Brennan et al.(Science 229:81,1985)描述了将完整抗体经蛋白水解切割以产生F(ab’)2片段的方法。在二硫醇络合剂亚砷酸钠的存在下使这些片段还原，以稳定邻位二硫醇并防止分子间二硫化物的形成。然后将产生的Fab’片段转化为硫代硝基苯甲酸酯(TNB)衍生物。然后通过用巯基乙胺将一种Fab’TNB衍生物还原重新转化为Fab’硫醇，并与等摩尔量的另一种Fab’TNB衍生物混合以形成双特异性抗体。
本文所述的任何抗体或抗原结合片段可与稳定化分子(例如，提高抗体或其抗原结合片段在对象体内或溶液中的半衰期的分子)缀合。稳定化分子的非限制性实例包括：聚合物(例如，聚乙二醇)或蛋白质(例如，血清白蛋白，例如人血清白蛋白)。稳定化分子的缀合可延长抗体或抗原结合片段在体外(例如，在组织培养物中或当以药物组合物形式储存时)或在体内(例如，在人中)的半衰期或提高其生物活性。
抗体特性
本文所述的抗体或其抗原结合片段可阻断CTLA4与CD80之间的结合和/或CTLA4与CD86之间的结合。通过阻断CTLA4与CD80之间的结合和/或CTLA4与CD86之间的结合，抗CTLA4抗体破坏CTLA4抑制途径并上调免疫应答。
在一些实施方式中，抗体(或其抗原结合片段)以以下解离常数(Kd)与CTLA4(例如人CTLA4、猴CTLA4、小鼠CTLA4和/或嵌合CTLA4)特异性结合：小于1x 10-6M、小于1x 10-7M、小于1x 10-8M、小于1x 10-9M、或小于1x 10-10M。在一些实施方案中，Kd为小于20nM、15nM、10nM、9nM、8nM、7nM、6nM、5nM、4nM、3nM、2nM或1nM。
在一些实施方案中，Kd大于1x 10-7M、大于1x 10-8M、大于1x 10-9M、大于1x 10-10M、大于1x 10-11M或大于1x 10-12M。
用于测量抗体对抗原的亲和力的一般技术包括例如ELISA、RIA和表面等离子体共振(surface plasmon resonance，SPR)。在一些实施方案中，抗体与人CTLA4(SEQ ID NO:41)、猴CTLA4(例如恒河猴CTLA4，SEQ ID NO:43)、嵌合CTLA4(SEQ ID NO:44)和/或小鼠CTLA4(SEQ ID NO:42)结合。在一些实施方案中，抗体不与人CTLA4(SEQ ID NO:41)、猴CTLA4(例如恒河猴CTLA4，SEQ ID NO:43)、嵌合CTLA4(SEQ ID NO:44)和/或小鼠CTLA4(SEQID NO:42)结合。
在一些实施方案中，抗体的肿瘤生长抑制百分比(TGI％)为大于10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、110％、120％、130％、140％、150％、160％、170％、180％、190％、或200％。在一些实施方案中，抗体的肿瘤生长抑制百分比为小于60％、70％、80％、90％、100％、110％、120％、130％、140％、150％、160％、170％、180％、190％、或200％。TGI％可例如在治疗开始之后3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30天时或者在治疗开始之后1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个月时确定。如本文所用，使用下式计算肿瘤生长抑制百分比(TGI％)：
TGI(％)＝[1-(Ti-T0)/(Vi-V0)]×100
Ti是第i天治疗组的平均肿瘤体积。T0是第0天治疗组的平均肿瘤体积。Vi是第i天对照组的平均肿瘤体积。V0是第0天对照组的平均肿瘤体积。
制备抗CTLA4抗体的方法
可使用用于多克隆抗体和单克隆抗体制备的标准技术将人CTLA4的分离片段用作免疫原以产生抗体。可通过多次注射(例如皮下或腹膜内注射)抗原性肽或蛋白质在动物中产生多克隆抗体。在一些实施方案中，抗原肽或蛋白质与至少一种佐剂一起注射。在一些实施方案中，抗原肽或蛋白质可与在待免疫接种的物种中具有免疫原性的试剂缀合。可向动物注射抗原肽或蛋白质多于一次(例如两次、三次或四次)。
可使用全长多肽或蛋白质，或者替代地，可使用抗原肽片段作为免疫原。蛋白质的抗原肽包含CTLA4的氨基酸序列的至少8(例如，至少10、15、20或30)个氨基酸残基，并且包含蛋白质的表位，使得针对该肽产生的抗体与蛋白质形成特异性免疫复合物。如上所述，人CTLA4的全长序列是本领域已知的(SEQ ID NO:41)。
免疫原通常用于通过免疫接种合适的对象(例如人或表达至少一个人免疫球蛋白基因座的转基因动物)来制备抗体。合适的免疫原性制备物可包含例如重组表达或化学合成的多肽(例如人CTLA4的片段)。该制备物可进一步包含佐剂，例如弗氏完全或不完全佐剂，或类似的免疫刺激剂。
可如上所述通过用CTLA4多肽或其抗原肽(例如，CTLA4的一部分)作为免疫原对合适的对象进行免疫接种来制备多克隆抗体。可通过标准技术随时间监测经免疫接种对象中的抗体效价，例如使用固定化CTLA4多肽或肽的酶联免疫吸附测定(ELISA)。如果需要，可从哺乳动物中(例如从血液中)分离抗体分子，并通过公知的技术例如蛋白A或蛋白G色谱进一步纯化以获得IgG部分。在免疫接种之后的适当时间，例如，当特异性抗体效价最高时，可从对象获得产生抗体的细胞，并用于通过标准技术制备单克隆抗体，例如Kohler et al.(Nature 256:495-497,1975)最初所述的杂交瘤技术、人B细胞杂交瘤技术(Kozbor etal.,Immunol.Today 4:72,1983)、EBV-杂交瘤技术(Cole et al.,Monoclonal Antibodiesand Cancer Therapy,Alan R.Liss,Inc.,pp.77-96,1985)或三瘤体(trioma)技术。用于产生杂交瘤的技术是公知的(一般参见，Current Protocols in Immunology,1994,Coliganet al.(Eds.),John Wiley&Sons,Inc.,New York,NY)。通过例如使用标准ELISA测定筛选杂交瘤培养物上清液中结合目标多肽或表位的抗体来筛选产生单克隆抗体的杂交瘤细胞。
可通过将适当的核苷酸改变引入编码本文所述的人抗体、人源化抗体或嵌合抗体、或其抗原结合片段的DNA中或通过肽合成来制备本文所述的抗体或抗原结合片段的变体。这类变体包括例如构成抗体或抗原结合结构域的抗原结合位点的氨基酸序列中残基的缺失、插入或替换。在这类变体的群体中，一些抗体或抗原结合片段将对靶蛋白(例如CTLA4)具有提高的亲和力。可进行缺失、插入和/或组合的任意组合以获得对靶标具有提高的结合亲和力的抗体或其抗原结合片段。引入抗体或抗原结合片段中的氨基酸变化也可改变抗体或抗原结合片段或向其中引入新的翻译后修饰，例如改变(例如，增加或减少)糖基化位点的数量、改变糖基化位点的类型(例如，改变氨基酸序列以使通过细胞中存在的酶附着不同的糖)，或引入新的糖基化位点。
本文公开的抗体可来源于任何动物物种，包括哺乳动物。天然抗体的非限制性实例包括来源于以下的抗体：人、灵长类(例如猴和猿)、牛、猪、马、绵羊、骆驼科(例如骆驼和美洲驼)、鸡、山羊和啮齿动物(例如大鼠、小鼠、仓鼠和兔)，包括经过基因改造以产生人抗体的转基因啮齿动物。
人和人源化抗体包括具有来源于人种系免疫球蛋白序列(或来源于具有相同氨基酸序列)的可变区和恒定区的抗体。人抗体可包含不由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如，通过体外随机或位点特异性诱变或通过体内体细胞突变引入的突变)，例如在CDR中。
人源化抗体通常具有移植有非人CDR的人框架(FR)。因此，人源化抗体具有从非人来源引入其中的一个或多个氨基酸序列。这些非人氨基酸残基通常被称为“输入(import)”残基，其通常取自“输入”可变结构域。人源化可基本上通过例如用啮齿动物CDR或CDR序列替代人抗体的相应序列来进行。这些方法在例如以下中描述：Jones et al.,Nature,321:522-525(1986)；Riechmann et al.,Nature,332:323-327(1988)；Verhoeyen et al.,Science,239:1534-1536(1988)；其各自通过引用整体并入本文。因此，“人源化”抗体是嵌合抗体，其中基本上少于完整的人V结构域已被来自非人物种的相应序列替换。实际上，人源化抗体通常是小鼠抗体，其中一些CDR残基和一些FR残基被来自人抗体中类似位点的残基替换。
用于制备人源化抗体的人VH和VL结构域的选择对于降低免疫原性非常重要。根据所谓的“最佳拟合”方法，针对已知人结构域序列的整个文库筛选小鼠抗体的V结构域的序列。然后将最接近小鼠的序列的人序列作为人源化抗体的人FR(Sims et al.,J.Immunol.,151:2296(1993)；Chothia et al.,J.Mol.Biol.,196:901(1987))。
进一步重要的是将抗体进行人源化，同时保留对抗原的高特异性和亲和力以及其他有利的生物学特性。为了实现该目的，可通过使用亲本序列和人源化序列的三维模型对亲本序列和各种概念性人源化产物进行分析的过程来制备人源化抗体。三维免疫球蛋白模型是普遍可获得的并且为本领域技术人员所熟悉。说明并展示所选候选免疫球蛋白序列的可能三维构象结构的计算机程序是可获得的。对这些展示的检查允许分析残基在候选免疫球蛋白序列的功能中的可能作用，即，分析影响候选免疫球蛋白与其抗原结合的能力的残基。以这种方式，可从接受体序列和输入序列中选择FR残基并进行组合，从而获得期望的抗体特征，例如对靶抗原的提高的亲和力。
通常，人、人源化或嵌合抗CTLA4抗体的氨基酸序列变体将包含与原始抗体的轻链或重链中存在的序列具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％百分比同一性的氨基酸序列。
相对于原始序列的同一性或同源性通常是在将序列对齐并引入缺口(如果必要的话)以实现最大百分比序列同一性并且不将任何保守替换视为序列同一性的一部分的情况下，候选序列中存在的与人、人源化或嵌合抗CTLA4抗体或片段中存在的序列相同的氨基酸残基的百分比。抗体序列的N端、C端或内部延伸、缺失或插入均不应解释为影响序列同一性或同源性。
可以对抗CTLA4抗体或抗原结合片段进行另外的修饰。例如，可将半胱氨酸残基引入Fc区域中，从而允许在该区域中形成链间二硫键。由此产生的同型二聚体抗体可具有任何提高的体外和/或体内半衰期。还可使用异双官能交联剂制备具有延长的体外和/或体内半衰期的同二聚体抗体，如例如，Wolff et al.(Cancer Res.53:2560-2565,1993)中所述。或者，可以改造具有两个Fc区的抗体(参见，例如，Stevenson et al.,Anti-Cancer DrugDesign 3:219-230,1989)。
在一些实施方案中，可以对抗CTLA4抗体或其抗原结合片段进行共价修饰。这些共价修饰可通过化学或酶促合成，或通过酶促或化学裂解来进行。通过使抗体或片段的所靶向氨基酸残基与能够与所选侧链或者N或C末端残基反应的有机衍生剂反应，将抗体或抗体片段的其他类型的共价修饰引入分子中。
重组载体
本公开内容还提供了包含本文公开的分离的多核苷酸(例如，编码本文公开的多肽的多核苷酸)的重组载体(例如表达载体)，其中引入重组载体的宿主细胞(即，使得宿主细胞包含多核苷酸和/或含有多核苷酸的载体)，以及通过重组技术的重组抗体多肽或其片段的产生。
如本文所用，“载体”是当将载体引入宿主细胞中时能够将一种或更多种目的多核苷酸递送至宿主细胞的任何构建体。“表达载体”能够递送一种或更多种目的多核苷酸并且在已引入表达载体的宿主细胞中将一种或更多种目的多核苷酸表达为编码的多肽。因此，在表达载体中，通过与在载体中或在宿主细胞基因组中的调控元件例如启动子、增强子和/或poly-A尾可操作地连接，将目的多核苷酸定位用于在载体中表达，所述调控元件在目的多核苷酸的整合位点处或附近或侧翼，使得目的多核苷酸将在引入了表达载体的宿主细胞中翻译。
可通过本领域已知的方法例如电穿孔、化学转染(例如DEAE-葡聚糖)、转化、转染和感染和/或转导(例如用重组病毒进行)来将载体引入宿主细胞中。因此，载体的非限制性实例包括病毒载体(其可用于产生重组病毒)、裸DNA或RNA、质粒、黏粒、噬菌体载体以及与阳离子凝缩剂缔合的DNA或RNA表达载体。
在一些实施方式中，使用病毒表达系统(例如牛痘病毒或其他痘病毒、逆转录病毒或腺病毒)引入本文公开的多核苷酸(例如，编码本文公开的多肽的多核苷酸)，这可涉及使用非致病性(缺陷型)的可复制型病毒，或可使用复制缺陷型病毒。在后一种情况下，病毒繁殖通常只会在互补的病毒包装细胞中发生。合适的系统公开于例如以下中：Fisher-Hochet al.,1989,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:317-321；Flexner et al.,1989,Ann.N.Y.Acad Sci.569:86-103；Flexner et al.,1990,Vaccine,8:17-21；U.S.Pat.No.4,603,112、4,769,330和5,017,487；WO 89/01973；U.S.Pat.No.4,777,127；GB 2,200,651；EP0,345,242；WO 91/02805；Berkner-Biotechniques,6:616-627,1988；Rosenfeld et al.,1991,Science,252:431-434；Kolls et al.,1994,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,91:215-219；Kass-Eisler et al.,1993,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:11498-11502；Guzman et al.,1993,Circulation,88:2838-2848；以及Guzman et al.,1993,Cir.Res.,73:1202-1207。将DNA并入这类表达系统中的技术是本领域普通技术人员公知的。DNA也可以是“裸”的，如例如Ulmer et al.,1993,Science,259:1745-1749和Cohen,1993,Science,259:1691-1692中所述。可通过将DNA包被在生物可降解的珠上来提高裸DNA的摄取，所述珠有效地转运到细胞中。
为了表达，可将包含本文公开的编码抗体或编码多肽的多核苷酸的DNA插入物有效连接至合适的启动子(例如异源启动子)，例如噬菌体λPL启动子，大肠杆菌(E.coli)lac、trp和tac启动子，SV40早期和晚期启动子以及逆转录病毒LTR的启动子等。其他合适的启动子是技术人员已知的。表达构建体可进一步包含用于转录起始、终止的位点，以及在转录区域中的用于翻译的核糖体结合位点。由构建体表达的成熟转录物的编码部分可以包含在起始处的翻译起点和适当地位于待翻译多肽末端的终止密码子(UAA、UGA或UAG)。
如所示的，表达载体可包含至少一种选择标记。这类标记包括用于真核细胞培养的二氢叶酸还原酶或新霉素抗性，以及用于在大肠杆菌和其他细菌中培养的四环素或氨苄青霉素抗性基因。合适宿主的一些代表性实例包括但不限于细菌细胞，例如大肠杆菌、链霉菌(Streptomyces)和鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)的细胞；真菌细胞，例如酵母细胞；昆虫细胞，例如果蝇(Drosophila)S2和夜蛾(Spodoptera)Sf9细胞；动物细胞，例如CHO、COS、Bowes黑色素瘤和HK 293细胞；和植物细胞。本文所述宿主细胞的合适培养基和条件是本领域已知的。
用于细菌的非限制性载体包括可获自Qiagen的pQE70、pQE60和pQE-9；可获自Stratagene的pBS载体、Phagescript载体、Bluescript载体、pNH8A、pNH16a、pNH18A、pNH46A；以及可获自Pharmacia的ptrc99a、pKK223-3、pKK233-3、pDR540、pRIT5。非限制性的真核载体包括可获自Stratagene的pWLNEO、pSV2CAT、pOG44、pXT1和pSG；以及可获自Pharmacia的pSVK3、pBPV、pMSG和pSVL。其他合适的载体对于技术人员将是显而易见的。
适合使用的非限制性细菌启动子包括大肠杆菌lacI和lacZ启动子、T3和T7启动子、gpt启动子、λPR和PL启动子以及trp启动子。合适的真核启动子包括CMV立即早期启动子、HSV胸苷激酶启动子、SV40早期和晚期启动子、逆转录病毒LTR的启动子，例如劳斯肉瘤病毒(Rous sarcoma virus，RSV)的启动子，以及金属硫蛋白启动子，例如小鼠金属硫蛋白-I启动子。
在酵母酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中，可使用许多含有组成型或诱导型启动子(例如α因子、醇氧化酶和PGH)的载体。综述参见Ausubel et al.(1989)CURRENTPROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY,John Wiley&Sons,New York,N.Y,以及Grant et al.,Methods Enzymol.,153:516-544(1997)。
可通过磷酸钙转染、DEAE-葡聚糖介导的转染、阳离子脂质介导的转染、电穿孔、转导、感染或其他方法实现将构建体引入宿主细胞中。在许多标准实验室手册中描述了这类方法，例如Davis et al.,BASIC METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY(1986)。
可通过将增强子序列插入载体中来提高高等真核生物对编码本公开内容的抗体的DNA的转录。增强子是DNA的顺式作用元件，通常约10至300bp，其在给定宿主细胞类型中起提高启动子的转录活性的作用。增强子的一些实例包括于碱基对100至270处位于复制起点的后侧的SV40增强子、巨细胞病毒早期启动子增强子、位于复制起点的后侧的多瘤病毒增强子，和腺病毒增强子。
为了将翻译的蛋白质分泌到内质网腔中、周质空间中或细胞外环境中，可将合适的分泌信号并入表达的多肽中。信号可以针对多肽是内源性的，或者其可以是异源信号。
多肽(例如抗体)可以以经修饰形式表达，例如融合蛋白(例如GST-融合体)或具有组氨酸标签，并且不仅可包含分泌信号，还可包含另外的异源性功能区。例如，可向多肽的N末端添加额外的氨基酸，特别是带电荷氨基酸区域，以改善在宿主细胞中、纯化期间或在随后的处理和储存期间的稳定性和持久性。另外，可以向多肽添加肽部分以便于纯化。可在最终制备多肽之前除去这些区域。向多肽添加肽部分以产生分泌或排泄、以提高稳定性和便于纯化等是本领域熟知且常规的技术。
治疗方法
本公开内容的抗体或其抗原结合片段可用于多种治疗目的。一方面，本公开内容提供了用于治疗对象中癌症的方法、降低对象中肿瘤体积随时间增大的速率的方法、降低发生转移的风险的方法、或降低在对象中发生额外转移的风险的方法。在一些实施方案中，治疗可停止、减慢、延迟或抑制癌症的进展。在一些实施方案中，治疗可导致对象中癌症的一种或更多种症状的数量、严重程度和/或持续时间降低。
在一方面，本公开内容的特征在于方法，所述方法包括将治疗有效量的本文公开的抗体或其抗原结合片段施用于有此需要的对象(例如，患有癌症或被鉴定或诊断为患有癌症的对象)，例如，乳腺癌(例如三阴性乳腺癌)、类癌、宫颈癌、子宫内膜癌、胶质瘤、头颈癌、肝癌、肺癌、小细胞肺癌、淋巴瘤、黑色素瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、肾癌、结直肠癌、胃癌、睾丸癌、甲状腺癌、膀胱癌、尿道癌或恶性血液病。在一些实施方案中，癌症是不可切除的黑色素瘤或转移性黑色素瘤、非小细胞肺癌(NSCLC)、小细胞肺癌(SCLC)、膀胱癌或转移性激素难治性前列腺癌。
在一些实施方案中，本文公开的组合物和方法可以用于治疗有癌症风险的患者。可通过本领域已知的多种方法来鉴定患有癌症的对象。
如本文所用，“有效量”意指足以产生有益或期望结果(包括停止、减慢、延迟或抑制疾病例如癌症的进展)的量或剂量。有效量将根据例如以下而变化：待施用抗体、抗原结合片段、编码抗体的多核苷酸、包含多核苷酸的载体、和/或其组合物的个体的年龄和体重，症状的严重程度和施用途径，并且因此可根据个人情况决定施用。
可一次或多次施用有效量。举例来说，抗体或抗原结合片段的有效量是足以改善、停止、稳定、逆转、抑制、减慢和/或延迟患者中癌症进展的量，或者是在体外足以改善、停止、稳定、逆转、减慢和/或延迟细胞(例如，活检细胞、本文所述的任何癌细胞、或细胞系(例如，癌细胞系))的增殖的量。如本领域所理解的，抗体或抗原结合片段的有效量可以变化，这尤其取决于患者的病史以及其他因素，例如所使用的抗体的类型(和/或剂量)。
可凭经验确定施用本文公开的抗体、编码抗体的多核苷酸和/或组合物的有效量和时间表，进行这类确定在本领域技术范围内。本领域技术人员将理解，必须施用的剂量将根据例如以下而变化：例如，将接受本文公开的抗体、编码抗体的多核苷酸和/或组合物的哺乳动物，施用途径，使用的本文公开的抗体、编码抗体的多核苷酸、抗原结合片段和/或组合物的具体类型，以及哺乳动物施用的其他药物。选择抗体或抗原结合片段的合适剂量的指南可在关于抗体和抗原结合片段的治疗用途的文献中找到，例如，Handbook ofMonoclonal Antibodies,Ferrone et al.,eds.,Noges Publications,Park Ridge,N.J.,1985,ch.22and pp.303-357；Smith et al.,Antibodies in Human Diagnosis andTherapy,Haber et al.,eds.,Raven Press,New York,1977,pp.365-389。
抗体的有效量的典型日剂量为0.01mg/kg至100mg/kg。在一些实施方案中，剂量可以为小于100mg/kg、10mg/kg、9mg/kg、8mg/kg、7mg/kg、6mg/kg、5mg/kg、4mg/kg、3mg/kg、2mg/kg、1mg/kg、0.5mg/kg或0.1mg/kg。在一些实施方案中，剂量可以为大于10mg/kg、9mg/kg、8mg/kg、7mg/kg、6mg/kg、5mg/kg、4mg/kg、3mg/kg、2mg/kg、1mg/kg、0.5mg/kg、0.1mg/kg、0.05mg/kg或0.01mg/kg。在一些实施方案中，剂量为约10mg/kg、9mg/kg、8mg/kg、7mg/kg、6mg/kg、5mg/kg、4mg/kg、3mg/kg、2mg/kg、1mg/kg、0.9mg/kg、0.8mg/kg、0.7mg/kg、0.6mg/kg、0.5mg/kg、0.4mg/kg、0.3mg/kg、0.2mg/kg或0.1mg/kg。
在本文描述的任何方法中，至少一种抗体、其抗原结合片段或药物组合物(例如，本文所述的任何抗体、抗原结合片段或药物组合物)和任选地至少一种另外的治疗剂可至少一周一次(例如，一周一次、一周两次、一周三次、一周四次、一天一次、一天两次或一天三次)向对象施用。在一些实施方案中，在相同组合物(例如液体组合物)中施用至少两种不同的抗体和/或抗原结合片段。在一些实施方案中，在相同组合物(例如液体组合物)中施用至少一种抗体或抗原结合片段和至少一种另外的治疗剂。在一些实施方案中，至少一种抗体或抗原结合片段和至少一种另外的治疗剂在两种不同的组合物(例如，包含至少一种抗体或抗原结合片段的液体组合物和包含至少一种另外的治疗剂的固体经口组合物)中施用。在一些实施方案中，所述至少一种另外的治疗剂以丸剂、片剂或胶囊剂施用。在一些实施方案中，所述至少一种另外的治疗剂为缓释口服制剂。
在一些实施方案中，可在施用至少一种抗体、抗原结合抗体片段或药物组合物(例如，本文所述的任何抗体、抗原结合抗体片段或药物组合物)之前或之后向对象施用一种或更多种另外的治疗剂。在一些实施方案中，向对象施用一种或更多种另外的治疗剂和至少一种抗体、抗原结合抗体片段或药物组合物(例如，本文所述的任何抗体、抗原结合抗体片段或药物组合物)，使得在对象中一种或更多种另外的治疗剂与至少一种抗体或抗原结合片段(例如，本文所述的任何抗体或抗原结合片段)的生物活性期存在重叠。
在一些实施方案中，可在延长的时间段内(例如，在至少1周、2周、3周、1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、12个月、1年、2年、3年、4年或5年的时间段内)向对象施用至少一种抗体、抗原结合抗体片段或药物组合物(例如，本文所述的任何抗体、抗原结合抗体片段或药物组合物)。熟练的医学专业人员可使用本文所述的用于诊断或追踪治疗的有效性的任何方法(例如，观察癌症的至少一种症状)来确定治疗期的长度。如本文所述，基于对治疗有效性的评估(例如使用本文所述和本领域已知的任何方法)，熟练的医学专业人员还可改变施用于对象的抗体或抗原结合抗体片段(和/或一种或更多种另外的治疗剂)的身份和数量(例如，增加或减少)，并且还可调整(例如，提高或降低)向对象施用至少一种抗体或抗原结合抗体片段(和/或一种或更多种另外的治疗剂)的剂量或频率。
药物组合物和施用途径
本文还提供了包含至少一种(例如，一种、两种、三种或四种)本文所述的抗体或抗原结合片段的药物组合物。两种或更多种(例如，两种、三种或四种)本文所述的任何抗体或抗原结合片段可以以任意组合存在于药物组合物中。可以以本领域已知的任何方式配制药物组合物。
将药物组合物配制成与其预期相应的施用途径(例如静脉内、动脉内、肌内、皮内、皮下或腹腔内)。组合物可包含无菌稀释剂(例如无菌水或盐水)、不挥发性油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他合成溶剂；抗菌剂或抗真菌剂，例如苄醇或对羟基苯甲酸甲酯、氯丁醇、酚、抗坏血酸、硫柳汞等；抗氧化剂，例如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂，例如乙二胺四乙酸；缓冲剂，例如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐；以及等渗剂，例如糖(例如葡萄糖)、多元醇(例如甘露醇或山梨糖醇)或盐(例如氯化钠)；或其任意组合。脂质体悬浮液也可用作可药用载体(参见，例如，美国专利号4,522,811)。可配制组合物的制剂并将其封装在安瓿、一次性注射器或多剂量小瓶中。在需要时(如在例如可注射制剂中)，可通过例如使用包衣(例如卵磷脂)或表面活性剂来维持适当的流动性。可通过包含延迟吸收的试剂(例如单硬脂酸铝和明胶)来延长抗体或其抗原结合片段的吸收。或者，可通过植入物和微囊化的递送系统来实现控制释放，该植入物和微囊化的递送系统可包含生物可降解的生物相容性聚合物(例如，乙烯乙酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯和聚乳酸；Alza Corporation和NovaPharmaceutical,Inc.)。
包含一种或更多种本文所述的任何抗体或抗原结合片段的组合物可配制成以剂量单位形式(即，包含预定量的活性化合物的物理分散单元，以易于施用和剂量均匀)进行肠胃外(例如静脉内、动脉内、肌内、皮内、皮下或腹腔内)施用。
组合物的毒性和治疗效力可在细胞培养物或实验动物(例如猴)中通过标准药学操作来确定。例如，可以确定LD50(对50％的群体致死的剂量)和ED50(在50％的群体中治疗有效的剂量)：治疗指数为LD50:ED50的比率。表现出高治疗指数的药剂是优选的。如果药剂表现出不期望的副作用，则应注意将潜在危害降到最低(即降低不想要的副作用)。毒性和治疗效力可通过其他标准药学操作确定。
从细胞培养测定和动物研究获得的数据可用于配制合适剂量的任何给定药剂以用于对象(例如人)。一种或更多种(例如，一种、两种、三种或四种)抗体或其抗原结合片段(例如，本文所述的任何抗体或抗体片段)的治疗有效量是这样的量：其在对象(例如被确定为患有癌症的人对象)中，或者被确定为处于疾病发生风险之中的对象(例如先前曾发生癌症但是现在已经治愈的对象)中治疗对象中的疾病(例如杀伤癌细胞)，降低对象(例如人)中疾病的一种或更多种症状的严重程度、频率和/或持续时间。可以由健康护理专业人员或兽医专业人员使用本领域已知的方法以及通过观察对象(例如，人)中疾病的一种或多种症状来确定本文所述的任何抗体或抗原结合片段的有效性和剂量。某些因素可影响有效治疗对象所需的剂量和时机(例如，疾病或病症的严重程度、先前的治疗、对象的总体健康和/或年龄以及其他疾病的存在)。
示例性剂量包括每千克对象体重的数毫克或微克量的本文所述的任何抗体或抗原结合片段(例如，约1μg/kg至约500mg/kg；约100μg/kg至约500mg/kg；约100μg/kg至约50mg/kg；约10μg/kg至约5mg/kg；约10μg/kg至约0.5mg/kg；或约1μg/kg至约50μg/kg)。尽管这些剂量涵盖了广泛的范围，但是本领域普通技术人员将理解，包括抗体及其抗原结合片段在内的治疗剂的功效不同，并且可通过本领域已知的方法确定有效量。通常，首先施用相对较低的剂量，并且主治健康护理专业人员或兽医专业人员(在治疗应用的情况下)或研究人员(在仍处于研发阶段时)可随后逐渐增加剂量，直到获得适当的响应。另外，应当理解，任何特定对象的具体剂量水平将取决于多种因素，包括所用特定化合物的活性，对象的年龄、体重、总体健康、性别和饮食，施用时间、施用途径、排泄速率以及抗体或抗体片段在体内的半衰期。
药物组合物可与施用说明书一起包含在容器、包装或分配器中。
实施例
在以下实施例中进一步描述本发明，这些实施例不限制权利要求书中描述的本发明的范围。
实施例1.产生小鼠抗hCTLA4抗体
为了产生针对人CTLA4(hCTLA4；SEQ ID NO:41)的小鼠抗体，用人CTLA4免疫接种6-8周大的雌性BALB/c小鼠。通过如下所述的方法收集抗hCTLA4抗体(图1和图2)。
小鼠的免疫接种
以100μg/ml的浓度以20μg/小鼠用经his标记的人CTLA4蛋白免疫接种6-8周大的雌性BALB/c小鼠。将经his标记的人CTLA4蛋白用佐剂乳化，并注射在小鼠背部的四个位置。对于第一次皮下(s.c.)注射，将稀释的抗原用等体积的完全弗氏佐剂(CFA)乳化。在随后的皮下注射中，将蛋白质用等体积的不完全弗氏佐剂(IFA)乳化。在第三次注射或加强免疫接种之后三天，收集血液(血清)并使用ELISA分析抗体效价。
在另一个实验中，通过将编码人CTLA4的表达质粒注射到小鼠中来免疫接种6-8周大的雌性BALB/c小鼠。通过使用基因枪以1000μg/μl的浓度以每只小鼠60μg将编码抗原的质粒注射到小鼠的胫骨前肌中(肌内注射；i.m.注射)。进行至少四次注射，每次注射之间间隔至少14天。在最后一次免疫接种之后7天收集血液(血清)，并通过ELISA测试血清的抗体效价。
在前一次免疫接种之后至少十四天还进行了增强免疫接种的程序(通过注射质粒或通过注射蛋白质)。将在表面表达CTLA4抗原的CHO细胞通过尾静脉静脉内注射到小鼠体内。然后在注射之后四天收集脾。
SP2/0细胞与脾细胞的融合
研磨脾组织。首先通过CD3ε微珠和抗小鼠IgM微珠选择脾细胞，然后使其与SP2/0细胞融合。然后将细胞平板接种在具有次黄嘌呤-氨基蝶呤-胸苷(HAT)培养基的96孔板中。
杂交瘤的初步筛选
根据标准程序，使用荧光激活细胞分选(Fluorescence-Activated CellSorting，FACS)对96孔板中的杂交瘤上清液进行初步筛选。在筛选之前，将中国仓鼠卵巢(Chinese hamster ovary，CHO)细胞添加到96孔板中(每孔2×104个细胞)。使用50μl上清液。实验中使用的抗体是：
(1)荧光素(FITC)缀合的AffiniPure F(ab)2片段山羊抗小鼠IgG，Fcγ片段特异性的；和
(2)Alexa
Figure BDA0002417675950000351
647缀合的AffiniPure F(ab)2片段山羊抗人IgG，Fcγ片段特异性的。
亚克隆
使用ClonePix2进行亚克隆。简单地说，将在初步筛选中鉴定出的阳性孔转移到半固体培养基中，并鉴定和测试IgG阳性克隆。使用FITC抗小鼠IgG Fc抗体。
腹水抗体
将1×106个阳性杂交瘤细胞腹腔注射至
Figure BDA0002417675950000352
小鼠(北京百奥赛图，中国北京(Beijing Biocytogen,Beijing,China))。通过使杂交瘤细胞在小鼠腹腔内生长来产生单克隆抗体。杂交瘤细胞在小鼠腹部扩增并产生腹水。腹水含有高浓度的抗体，可将其收获以备后用。
抗体纯化
使用GE AKTA蛋白色谱(GE Healthcare,Chicago,Illinois,United States)纯化腹水中的抗体。CT4-04-13A4(“13A4”)、CT4-03-4G12(“4G12”)、CT4-20-6D2(“6D2”)和CT4-20-7E12(“7E12”)在通过上述方法产生的小鼠抗体之中。这些抗体的重链和轻链可变区的氨基酸序列在图27中提供。
实施例2.小鼠抗体的人源化
人源化的起点是小鼠抗体(例如13A4和4G12)。确定这些小鼠抗体的重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列。构建了13A4的五种人源化重链可变区变体(SEQ ID NO:13-17)和三种人源化轻链可变区变体(SEQ ID NO:18-20)，其包含不同的替换排列(图25)。人源化13A4的重链和轻链CDR1、CDR2和CDR3氨基酸序列显示在SEQ ID NO:1-6(Kabat编号)或SEQID NO:29-34(Chothia编号)中。
构建了4G12的四种人源化重链可变区变体(SEQ ID NO:21-24)和四种人源化轻链可变区变体(SEQ ID NO:25-28)，其包含不同的替换排列(图25)。人源化4G12的重链和轻链CDR1、CDR2和CDR3氨基酸序列显示在SEQ ID NO:7-12(Kabat编号)或SEQ ID NO:35-40(Chothia编号)中。
这些人源化抗体是通过标准程序产生的，并使用BioLuminate 1.0
(Schrodinger，中国上海)。
实施例3.小鼠抗hCTLA4抗体的体外测试：阻断CD80和CD86与CTLA4结合
进行阻断测定以确定抗CTLA4抗体是否可阻断CTLA4与CD80之间的结合以及CTLA4与CD86之间的结合。
从小鼠腹水中收集抗CTLA4抗体，并通过色谱纯化。将25μl用人CTLA4瞬时转染的CHO细胞加入板中的每个孔中。将纯化的抗体滴定至终浓度为50、5、0.5、0.05、0.005μg/ml。在4℃下每孔添加25μl滴定的抗体，并孵育30分钟。
将生物素-hCD80或生物素-hCD86滴定至0.4μg/ml。将每个孔加入50μl的配体溶液，使生物素-hCD80或生物素-hCD86的终浓度为0.2μg/ml。将具有生物素-hCD80或生物素-hCD86的细胞在4℃下孵育15分钟。
在用磷酸缓冲盐水(PBS)洗涤之后，在4℃下将50μl抗小鼠IgG Fc抗体异硫氰酸荧光素缀合物(IgG Fc-FITC)和链霉抗生物素蛋白-藻红蛋白(链霉抗生物素蛋白-PE)以1:100的稀释度添加到每个孔中，并孵育15分钟，然后用PBS洗涤。通过流式细胞术确定FITC和PE的信号。
如图3所示，当小鼠抗hCTLA4抗体(CT4-04-13A4和CT4-03-4G12)的浓度提高时，PE的信号降低，表明CT4-04-13A4和CT4-03-4G12抗体阻断了人CTLA4与生物素-hCD80之间的结合。
类似地，在图4中，当抗hCTLA4抗体(CT4-04-13A4和CT4-03-4G12)的浓度提高时，PE的信号降低，表明CT4-04-13A4和CT4-03-4G12抗体阻断了人CTLA4与生物素-hCD86之间的结合。
实施例4.嵌合抗hCTLA抗体针对猴、小鼠和人-小鼠嵌合CTLA4的交叉反应性
用恒河猴CTLA4(rmCTLA4，SEQ ID NO:43)、小鼠CTLA4(mCTLA4，SEQ ID NO:42)和嵌合(小鼠和人)CTLA4(chiCTLA4，SEQ ID NO:44)转染CHO细胞。
将每个孔添加25μl CHO细胞。每个孔中加入25μl纯化的嵌合抗hCTLA抗体(1μg/ml)(CT4-03-4G12-mHvKv-IgG1和CT4-04-13A4-mHvKv-IgG1)，并在4℃下孵育30分钟。CT4-03-4G12-mHvKv-IgG1和CT4-04-13A4-mHvKv-IgG1是嵌合抗hCTLA抗体。CT4-03-4G12-mHvKv-IgG1具有来自小鼠抗体4G12的重链可变结构域和轻链可变结构域，以及人IgG1抗体恒定结构域(CL、CH1、CH2、CH3)。类似地，CT4-04-13A4-mHvKv-IgG1具有来自小鼠抗体13A4的重链可变结构域和轻链可变结构域，以及人IgG1抗体恒定结构域(CL、CH1、CH2、CH3)。
在用PBS(1200rmp，5分钟)洗涤两次之后，将50μl抗人IgG Fc抗体异硫氰酸荧光素缀合物(IgG Fc-FITC)以1:100的稀释度添加到每个孔中，并在4℃孵育30分钟，然后用PBS洗涤。通过流式细胞术确定FITC的信号。
如图5所示，CT4-04-13A4-mHvKv-IgG1与小鼠CTLA4没有交叉反应，并且与rmCTLA4和嵌合CTLA4具有强交叉反应性。类似地，CT4-03-4G12-mHvKv-IgG1与小鼠CTLA4没有交叉反应，并且与rmCTLA4和嵌合CTLA4具有强交叉反应性。在图5中，NC代表阴性对照，而PC代表阳性对照。
实施例5.小鼠抗hCTLA4抗体的体内测试
为了在体内测试抗hCTLA4抗体并预测这些抗体在人体中的作用，产生了CTLA-4人源化小鼠模型。设计CTLA4人源化小鼠模型以表达嵌合CTLA4蛋白(SEQ ID NO:44)，其中小鼠CTLA4蛋白的细胞外区域的一部分被人CTLA4细胞外区域替代。来自SEQ ID NO:44的第41-143位的氨基酸残基来源于人CTLA4。人源化小鼠模型(B-hCTLA-4人源化小鼠)可通过显著降低人与表达小鼠CTLA4的普通小鼠中临床结局之间的差异来为在临床环境中测试新的治疗提供新的工具。
在结肠癌模型中测试了抗hCTLA4抗体以显示其对体内肿瘤生长的作用。在B-hCTLA-4人源化小鼠中皮下注射MC-38癌肿瘤细胞(结肠腺癌细胞)。当小鼠中的肿瘤达到150±50mm3的体积时，根据肿瘤的体积将小鼠随机分为不同的组。然后向小鼠静脉内注射PBS和抗hCTLA4抗体。每三天给予抗体，共15天(共注射6次)。根据小鼠的体重以10μl/g计算注射体积。每周两次测量肿瘤的长轴和短轴的长度，并且将肿瘤的体积作为0.5×(长轴)×(短轴)2计算。还在注射前、在将小鼠分为不同组时(第一次抗体注射前)、在抗体注射期期间每周两次、以及在安乐死前测量小鼠的体重。
使用下式计算肿瘤生长抑制百分比(TGI％)：TGI(％)＝[1-(Ti-T0)/(Vi-V0)]×100。Ti是第i天处理组的平均肿瘤体积。T0是第0天处理组的平均肿瘤体积。Vi是第i天对照组的平均肿瘤体积。V0是第0天对照组的平均肿瘤体积。
进行t检验以进行统计学分析。TGI％高于60％表明肿瘤生长的显著抑制。p<0.05是指示显著差异的阈值。
小鼠抗hCTLA4抗体13A4和4G12的体内结果
在整个处理期期间监测小鼠的体重。不同组中小鼠的体重全部增加(图6和图7)。在对照组和抗hCTLA4处理组之间未观察到体重的显著差异。结果表明，小鼠对抗hCTLA4抗体耐受良好，并且无毒性。
然而，在用抗体13A4和4G12处理的组中肿瘤尺寸显示出显著差异(图8)。如图8所示，13A4和4G12以剂量依赖性方式抑制肿瘤生长。令人感兴趣的是，与剂量为1mg/kg的4G12相比，剂量为0.3mg/kg的4G12具有更好的结果，表明相对较低剂量(例如，小于0.5mg/kg，或0.1mg/kg至0.5mg/kg)的4G12可实现最佳结果。
如下表所示，还计算了每个治疗组在第22天的TGI％。
表1
组 抗体 TGI％
G2 13A4(3mg/kg) 103.00％
G3 13A4(1mg/kg) 82.90％
G4 13A4(0.3mg/kg) 69.00％
G5 4G12(3mg/kg) 45.20％
G6 4G12(1mg/kg) 10.10％
G7 4G12(0.3mg/kg) 73.60％
13A4和Yervoy的体内结果
为了比较CTLA4抗体的功效，将Yervoy与13A4在同一实验中使用。在给药期间，不同组中小鼠的体重全部增加(图9和图10)。没有观察到毒性作用。
13A4和Yervoy治疗全部导致肿瘤尺寸显著减小(图11)。值得注意的是，与Yervoy相比，13A4治疗结果相当。两个治疗组在第28天的TGI％示于下文。
表2
组 抗体 TGI%
G3 Yervoy 104.60％
G5 13A4 104.70％
实施例6.人源化抗hCTLA4抗体的体内结果
通过如实施例2中所述的方法产生人源化抗体。为了确定人源化抗体的治疗作用，在B-hCTLA-4人源化小鼠中测试了六种人源化抗hCTLA4抗体(4G12-H1K1-IgG1；4G12-H2K1-IgG1；13A4-H1K2-IgG1；13A4-H2K2-IgG1；13A4-H1K2-IgG4；13A4-H1K2-IgG1-N297A)，以显示其对体内肿瘤生长的作用(图12-17)。此外，为了降低聚糖异质性，将人源化抗体13A4-H1K2-IgG1的Fc区进一步改造以用丙氨酸代替在第297位的天冬酰胺(图17)。抗体的轻链和重链可变区示于下表中。
表3
Figure BDA0002417675950000401
使用与实施例5中描述的相似的程序。在B-hCTLA-4人源化小鼠中皮下注射MC-38肿瘤细胞(结肠腺癌细胞)。当小鼠中的肿瘤达到150±50mm3的体积时，根据肿瘤的体积将小鼠随机分为不同的组。然后向小鼠静脉内注射PBS和抗hCTLA4抗体。每周两次(每周的第1、4天)给予抗体，持续3周(共注射6次)。根据小鼠的体重以10mg/kg计算剂量。每周两次测量肿瘤的长轴和短轴的长度，并且将肿瘤的体积作为0.5×(长轴)×(短轴)2计算。还在注射之前以及在将小鼠分为不同组时(在第一次抗体注射之前)测量小鼠的体重。还在抗体注射期期间每周两次以及在安乐死前的时间点测量体重。
使用下式计算肿瘤生长抑制百分比(TGI％)：TGI(％)＝[1-(Ti-T0)/(Vi-V0)]×100。Ti是第i天治疗组的平均肿瘤体积。T0是第0天治疗组的平均肿瘤体积。Vi是第i天对照组的平均肿瘤体积。V0是第0天对照组的平均肿瘤体积。
进行t检验以进行统计学分析。TGI％高于60％表明肿瘤生长的显著抑制。p<0.05被认为指示显著差异。
4G12-H1K1-IgG1和4G12-H2K1-IgG1的体内结果
将小鼠分为4组：1)在G1中，将人IgG用作对照；2)在G4中，向小鼠施用Yervoy以用于比较目的；3)在G10中，向小鼠施用4G12-H1K1-IgG1；以及4)在G11中，向小鼠施用4G12-H2K1-IgG1。
在整个给药期间监测四组小鼠的体重(图12和图13)。每组中的小鼠总体上都是健康的，并且结果表明小鼠对抗CTLA4抗体耐受良好且无毒。
然而，在用Yervoy、4G12-H1K1-IgG1和4G12-H2K1-IgG1处理的组中，肿瘤尺寸显著更小(图14)。如图14所示，4G12-H1K1-IgG1(P＝0.002)和4G12-H2K1-IgG1(P＝0.002)与对照组相比抑制了肿瘤的生长，并且与Yervoy(P＝0.007)相比具有更好的结果。每个处理组在第21天的TGI％示于下文。
表4
组 抗体 TGI％
G4 Yervoy 82.20％
G10 4G12-H1K1-IgG1 90.50％
G11 4G12-H2K1-IgG1 90.50％
13A4-H1K2-IgG1、13A4-H2K2-IgG1，13A4-H1K2-IgG4和13A4-H1K2-IgG1-N297A的体内 结果
将小鼠分为6组：1)在G1中，将人IgG用作对照组；2)在G4中，向小鼠施用Yervoy以用于比较目的；3)在G6中，向小鼠施用13A4-H1K2-IgG1；4)在G7中，向小鼠施用13A4-H2K2-IgG1；5)在G8中，向小鼠施用13A4-H1K2-IgG4；以及6)在G9中，向小鼠施用13A4-H1K2-IgG1-N297A。
在整个给药期间监测六组小鼠的体重(图15和图16)。结果表明，每组小鼠均健康，并且抗CTLA4抗体对小鼠无毒性。
然而，每组的肿瘤体积不同。如图17所示，与对照组相比，所有抗CTLA4抗体都可以抑制肿瘤生长。特别地，与Yervoy相比，13A4-H1K2-IgG1和13A4-H2K2-IgG1具有更好的结果。
每个处理组在第21天的TGI％示于下文。
表5
组 抗体 TGI％
G4 Yervoy 82.20％
G6 13A4-H1K2-IgG1 99.00％
G7 13A4-H2K2-IgG1 96.60％
G8 13A4-H1K2-IgG4 56.10％
G9 13A4-H1K2-IgG1-N297A 47.30％
实施例7.小鼠抗hCTLA4抗体的体外测试：CT4-20-6D2(“6D2”)和CT4-20-7E12(“7E12”)
从小鼠腹水中收集抗CTLA4抗体，并通过色谱纯化。将25μl用人CTLA4瞬时转染的CHO细胞加入板中的每个孔中。将纯化的抗体滴定至终浓度为50、5、0.5、0.05、0.005μg/ml。在4℃下每个孔中添加25μl滴定的抗体，并孵育30分钟。将生物素-hCD86滴定至0.4μg/ml。将50μl的配体溶液加入每个孔中，使生物素-hCD86的终浓度为0.2μg/ml。将具有生物素-hCD86的细胞在4℃下孵育15分钟。在用磷酸缓冲盐水(PBS)洗涤后，在4℃下将50μl抗小鼠IgG Fc抗体异硫氰酸荧光素缀合物(IgG Fc-FITC)和链霉抗生物素蛋白-藻红蛋白(链霉抗生物素蛋白-PE)以1∶100的稀释度添加到每个孔中，并孵育15分钟，然后用PBS洗涤。通过流式细胞术确定FITC和PE的信号。
如图18所示，当抗hCTLA4抗体(CT4-20-6D2和CT4-20-7E12)的浓度提高时，PE的信号降低，表明CT4-20-6D2和CT4-20-7E12抗体阻断了人CTLA4与生物素-hCD86之间的结合。
实施例8.抗hCTLA抗体针对猴、小鼠和人-小鼠嵌合CTLA4的交叉反应性
用恒河猴CTLA4(rmCTLA4，SEQ ID NO:43)、小鼠CTLA4
(mCTLA4，SEQ ID NO:42)和嵌合(小鼠和人)CTLA4(chiCTLA4，SEQ ID NO:44)转染CHO细胞。
将25μl CHO细胞添加至每个孔。将25μl纯化的小鼠抗hCTLA抗体(1μg/ml)(CT4-20-6D2和CT4-20-7E12)加入每个孔中，并在4℃下孵育30分钟。
在用PBS(1200rmp，5分钟)洗涤两次后，将50μl抗人IgG Fc抗体异硫氰酸荧光素缀合物(IgG Fc-FITC)以1:100的稀释度添加到每个孔中，并在4℃孵育30分钟，然后用PBS洗涤。通过流式细胞术确定FITC的信号。
如图19所示，CT4-20-6D2和CT4-20-7E12不与小鼠CTLA4交叉反应，对嵌合CTLA4具有弱的交叉反应性，并且对rmCTLA4具有相对较强的交叉反应性。
实施例9.小鼠抗hCTLA4抗体的体内测试
在结肠癌模型中测试了抗hCTLA4抗体以显示其对体内肿瘤生长的作用。在B-hCTLA-4人源化小鼠中皮下注射MC-38肿瘤细胞(结肠腺癌细胞)。当小鼠中的肿瘤达到150±50mm3的体积时，根据肿瘤的体积将小鼠随机分为不同的组。然后向小鼠静脉内注射PBS和抗hCTLA4抗体。每周两次给予抗体(总共6次注射)。在对照组中，向小鼠施用盐水。根据小鼠的体重以10μl/g计算注射体积。每周两次测量肿瘤的长轴和短轴的长度，并且将肿瘤的体积作为0.5×(长轴)×(短轴)2计算。还在注射之前、在将小鼠分成不同的组时(在第一次抗体注射之前)、在抗体注射期期间每周两次和在安乐死前测量了小鼠的体重。
进行t检验以进行统计学分析。TGI％高于60％表明肿瘤生长的显著抑制。p<0.05被认为指示显著差异。
在整个给药期间监测小鼠的体重。不同组中小鼠的体重全部都增加(图20和图21)。在对照组和抗hCTLA4处理组之间未观察到体重的显著差异。结果表明抗hCTLA4抗体对小鼠无毒。
然而，在用抗体13A4、6D2和7E12处理的组中，肿瘤尺寸显示出显著差异(图22)。如图22所示，13A4、6D2和7E12全部抑制了小鼠的肿瘤生长。
每个治疗组在第21天的TGI％示于下文。
表6
组 抗体 TGI％
G2 13A4 109.70％
G3 6D2 69.80％
G4 7E12 65.60％
其他实施方案
应当理解，尽管已经结合本发明的具体实施方式描述了本发明，但是前述描述旨在举例说明而不是限制本发明的范围，本发明的范围由所附权利要求书的范围限定。其他方面、优点和修改方案在所附权利要求书的范围内。
序列表
<110> 祐和医药科技（北京）有限公司
<120> 抗CTLA4抗体及其用途
<130> MP2002366P
<160> 76
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 1
Asp Tyr Glu Met His
1 5
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<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 2
Val Ile Asp Pro Glu Thr Gly Gly Thr Ala Tyr Asn Gln Lys Phe Lys
1 5 10 15
Gly
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<212> PRT
<213> 人工序列
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Gly Thr Thr Val Val Gly Leu Asp Tyr
1 5
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<212> PRT
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<212> PRT
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1 5
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<211> 17
<212> PRT
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<400> 8
Thr Ile Ser Arg Gly Gly Gly Tyr Thr Ser Tyr Pro Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
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<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 9
Glu Asp Tyr Gly Ser Ser Tyr Val His Trp Phe Ala Tyr
1 5 10
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<212> PRT
<213> 人工序列
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Arg Ala Gly Glu Asn Ile Tyr Ser Tyr Leu Ala
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<212> PRT
<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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Gln His His Tyr Gly Ser Pro Arg Thr
1 5
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<212> PRT
<213> 人工序列
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Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Glu Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Val Ile Asp Pro Glu Thr Gly Gly Thr Ala Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Leu Thr Ala Asp Thr Ser Thr Asp Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg Gly Thr Thr Val Val Gly Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Thr Leu Thr Val Ser Ser
115
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<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 14
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Thr Val Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Glu Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Val Ile Asp Pro Glu Thr Gly Gly Thr Ala Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Leu Thr Ala Asp Thr Ser Thr Asp Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg Gly Thr Thr Val Val Gly Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Thr Leu Thr Val Ser Ser
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<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 15
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Thr Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Glu Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Val Ile Asp Pro Glu Thr Gly Gly Thr Ala Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Leu Thr Ala Asp Thr Ser Thr Asp Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg Gly Thr Thr Val Val Gly Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Thr Leu Thr Val Ser Ser
115
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<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 16
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Glu Met His Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Val Ile Asp Pro Glu Thr Gly Gly Thr Ala Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Leu Thr Ala Asp Arg Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg Gly Thr Thr Val Val Gly Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Thr Leu Thr Val Ser Ser
115
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<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 17
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Thr Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Glu Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Val Ile Asp Pro Glu Thr Gly Gly Thr Ala Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Ala Thr Leu Thr Ala Asp Arg Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg Gly Thr Thr Val Val Gly Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Thr Leu Thr Val Ser Ser
115
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<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 18
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gly Asn Ile His Asn Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Leu
35 40 45
Tyr Lys Glu Lys Thr Leu Thr Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Gln Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Phe Trp Ser Thr Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Asn Leu Glu Ile Lys Arg
100 105
<210> 19
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 19
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gly Asn Ile His Asn Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Val
35 40 45
Tyr Lys Glu Lys Thr Leu Thr Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Phe Trp Ser Thr Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Asn Leu Glu Ile Lys Arg
100 105
<210> 20
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 20
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gly Asn Ile His Asn Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Val
35 40 45
Tyr Lys Glu Lys Thr Leu Thr Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Phe Trp Ser Thr Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Asn Leu Glu Ile Lys Arg
100 105
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<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 21
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Thr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Thr Ile Ser Arg Gly Gly Gly Tyr Thr Ser Tyr Pro Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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Ala Arg Glu Asp Tyr Gly Ser Ser Tyr Val His Trp Phe Ala Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala
115 120
<210> 22
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 22
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Thr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Thr Ile Ser Arg Gly Gly Gly Tyr Thr Ser Tyr Pro Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Asp Tyr Gly Ser Ser Tyr Val His Trp Phe Ala Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala
115 120
<210> 23
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 23
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Thr Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Gly Lys Arg Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Thr Ile Ser Arg Gly Gly Gly Tyr Thr Ser Tyr Pro Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Asp Tyr Gly Ser Ser Tyr Val His Trp Phe Ala Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala
115 120
<210> 24
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 24
Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Thr Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Thr Ile Ser Arg Gly Gly Gly Tyr Thr Ser Tyr Pro Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Asp Tyr Gly Ser Ser Tyr Val His Trp Phe Ala Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala
115 120
<210> 25
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 25
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Gly Glu Asn Ile Tyr Ser Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asn Ala Arg Thr Leu Ala Glu Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His His Tyr Gly Ser Pro Arg
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
100 105
<210> 26
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 26
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Gly Glu Asn Ile Tyr Ser Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Gln Gly Lys Ser Pro Lys Leu Leu Val
35 40 45
Tyr Asn Ala Arg Thr Leu Ala Glu Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His His Tyr Gly Ser Pro Arg
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
100 105
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<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 27
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Gly Glu Asn Ile Tyr Ser Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Gln Gly Lys Ser Pro Lys Leu Leu Val
35 40 45
Tyr Asn Ala Arg Thr Leu Ala Glu Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His His Tyr Gly Ser Pro Arg
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
100 105
<210> 28
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 28
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Gly Glu Asn Ile Tyr Ser Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Gln Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Val
35 40 45
Tyr Asn Ala Arg Thr Leu Ala Glu Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His His Tyr Gly Ser Pro Arg
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
100 105
<210> 29
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 29
Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr Glu Met His
1 5 10
<210> 30
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 30
Asp Pro Glu Thr Gly Gly
1 5
<210> 31
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 31
Gly Thr Thr Val Val Gly Leu Asp Tyr
1 5
<210> 32
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 32
Arg Ala Ser Gly Asn Ile His Asn Tyr Leu Ala
1 5 10
<210> 33
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 33
Lys Glu Lys Thr Leu Thr Asp
1 5
<210> 34
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 34
Gln His Phe Trp Ser Thr Pro Trp Thr
1 5
<210> 35
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 35
Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Thr Met Ser
1 5 10
<210> 36
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 36
Ser Arg Gly Gly Gly Tyr
1 5
<210> 37
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 37
Glu Asp Tyr Gly Ser Ser Tyr Val His Trp Phe Ala Tyr
1 5 10
<210> 38
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 38
Arg Ala Gly Glu Asn Ile Tyr Ser Tyr Leu Ala
1 5 10
<210> 39
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 39
Asn Ala Arg Thr Leu Ala Glu
1 5
<210> 40
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 40
Gln His His Tyr Gly Ser Pro Arg Thr
1 5
<210> 41
<211> 223
<212> PRT
<213> 人
<400> 41
Met Ala Cys Leu Gly Phe Gln Arg His Lys Ala Gln Leu Asn Leu Ala
1 5 10 15
Thr Arg Thr Trp Pro Cys Thr Leu Leu Phe Phe Leu Leu Phe Ile Pro
20 25 30
Val Phe Cys Lys Ala Met His Val Ala Gln Pro Ala Val Val Leu Ala
35 40 45
Ser Ser Arg Gly Ile Ala Ser Phe Val Cys Glu Tyr Ala Ser Pro Gly
50 55 60
Lys Ala Thr Glu Val Arg Val Thr Val Leu Arg Gln Ala Asp Ser Gln
65 70 75 80
Val Thr Glu Val Cys Ala Ala Thr Tyr Met Met Gly Asn Glu Leu Thr
85 90 95
Phe Leu Asp Asp Ser Ile Cys Thr Gly Thr Ser Ser Gly Asn Gln Val
100 105 110
Asn Leu Thr Ile Gln Gly Leu Arg Ala Met Asp Thr Gly Leu Tyr Ile
115 120 125
Cys Lys Val Glu Leu Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Tyr Leu Gly Ile Gly
130 135 140
Asn Gly Thr Gln Ile Tyr Val Ile Asp Pro Glu Pro Cys Pro Asp Ser
145 150 155 160
Asp Phe Leu Leu Trp Ile Leu Ala Ala Val Ser Ser Gly Leu Phe Phe
165 170 175
Tyr Ser Phe Leu Leu Thr Ala Val Ser Leu Ser Lys Met Leu Lys Lys
180 185 190
Arg Ser Pro Leu Thr Thr Gly Val Tyr Val Lys Met Pro Pro Thr Glu
195 200 205
Pro Glu Cys Glu Lys Gln Phe Gln Pro Tyr Phe Ile Pro Ile Asn
210 215 220
<210> 42
<211> 223
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 42
Met Ala Cys Leu Gly Leu Arg Arg Tyr Lys Ala Gln Leu Gln Leu Pro
1 5 10 15
Ser Arg Thr Trp Pro Phe Val Ala Leu Leu Thr Leu Leu Phe Ile Pro
20 25 30
Val Phe Ser Glu Ala Ile Gln Val Thr Gln Pro Ser Val Val Leu Ala
35 40 45
Ser Ser His Gly Val Ala Ser Phe Pro Cys Glu Tyr Ser Pro Ser His
50 55 60
Asn Thr Asp Glu Val Arg Val Thr Val Leu Arg Gln Thr Asn Asp Gln
65 70 75 80
Met Thr Glu Val Cys Ala Thr Thr Phe Thr Glu Lys Asn Thr Val Gly
85 90 95
Phe Leu Asp Tyr Pro Phe Cys Ser Gly Thr Phe Asn Glu Ser Arg Val
100 105 110
Asn Leu Thr Ile Gln Gly Leu Arg Ala Val Asp Thr Gly Leu Tyr Leu
115 120 125
Cys Lys Val Glu Leu Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Phe Val Gly Met Gly
130 135 140
Asn Gly Thr Gln Ile Tyr Val Ile Asp Pro Glu Pro Cys Pro Asp Ser
145 150 155 160
Asp Phe Leu Leu Trp Ile Leu Val Ala Val Ser Leu Gly Leu Phe Phe
165 170 175
Tyr Ser Phe Leu Val Thr Ala Val Ser Leu Ser Lys Met Leu Lys Lys
180 185 190
Arg Ser Pro Leu Thr Thr Gly Val Tyr Val Lys Met Pro Pro Thr Glu
195 200 205
Pro Glu Cys Glu Lys Gln Phe Gln Pro Tyr Phe Ile Pro Ile Asn
210 215 220
<210> 43
<211> 223
<212> PRT
<213> 猴
<400> 43
Met Ala Cys Leu Gly Phe Gln Arg His Lys Ala Arg Leu Asn Leu Ala
1 5 10 15
Thr Arg Thr Arg Pro Tyr Thr Leu Leu Phe Ser Leu Leu Phe Ile Pro
20 25 30
Val Phe Ser Lys Ala Met His Val Ala Gln Pro Ala Val Val Leu Ala
35 40 45
Asn Ser Arg Gly Ile Ala Ser Phe Val Cys Glu Tyr Ala Ser Pro Gly
50 55 60
Lys Ala Thr Glu Val Arg Val Thr Val Leu Arg Gln Ala Asp Ser Gln
65 70 75 80
Val Thr Glu Val Cys Ala Ala Thr Tyr Met Met Gly Asn Glu Leu Thr
85 90 95
Phe Leu Asp Asp Ser Ile Cys Thr Gly Thr Ser Ser Gly Asn Gln Val
100 105 110
Asn Leu Thr Ile Gln Gly Leu Arg Ala Met Asp Thr Gly Leu Tyr Ile
115 120 125
Cys Lys Val Glu Leu Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Tyr Met Gly Ile Gly
130 135 140
Asn Gly Thr Gln Ile Tyr Val Ile Asp Pro Glu Pro Cys Pro Asp Ser
145 150 155 160
Asp Phe Leu Leu Trp Ile Leu Ala Ala Val Ser Ser Gly Leu Phe Phe
165 170 175
Tyr Ser Phe Leu Leu Thr Ala Val Ser Leu Ser Lys Met Leu Lys Lys
180 185 190
Arg Ser Pro Leu Thr Thr Gly Val Tyr Val Lys Met Pro Pro Thr Glu
195 200 205
Pro Glu Cys Glu Lys Gln Phe Gln Pro Tyr Phe Ile Pro Ile Asn
210 215 220
<210> 44
<211> 223
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 44
Met Ala Cys Leu Gly Leu Arg Arg Tyr Lys Ala Gln Leu Gln Leu Pro
1 5 10 15
Ser Arg Thr Trp Pro Phe Val Ala Leu Leu Thr Leu Leu Phe Ile Pro
20 25 30
Val Phe Ser Glu Ala Ile Gln Val Ala Gln Pro Ala Val Val Leu Ala
35 40 45
Ser Ser Arg Gly Ile Ala Ser Phe Val Cys Glu Tyr Ala Ser Pro Gly
50 55 60
Lys Ala Thr Glu Val Arg Val Thr Val Leu Arg Gln Ala Asp Ser Gln
65 70 75 80
Val Thr Glu Val Cys Ala Ala Thr Tyr Met Met Gly Asn Glu Leu Thr
85 90 95
Phe Leu Asp Asp Ser Ile Cys Thr Gly Thr Ser Ser Gly Asn Gln Val
100 105 110
Asn Leu Thr Ile Gln Gly Leu Arg Ala Met Asp Thr Gly Leu Tyr Ile
115 120 125
Cys Lys Val Glu Leu Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Tyr Leu Gly Ile Gly
130 135 140
Asn Gly Thr Gln Ile Tyr Val Ile Asp Pro Glu Pro Cys Pro Asp Ser
145 150 155 160
Asp Phe Leu Leu Trp Ile Leu Val Ala Val Ser Leu Gly Leu Phe Phe
165 170 175
Tyr Ser Phe Leu Val Thr Ala Val Ser Leu Ser Lys Met Leu Lys Lys
180 185 190
Arg Ser Pro Leu Thr Thr Gly Val Tyr Val Lys Met Pro Pro Thr Glu
195 200 205
Pro Glu Cys Glu Lys Gln Phe Gln Pro Tyr Phe Ile Pro Ile Asn
210 215 220
<210> 45
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 45
Asp Tyr Glu Met His
1 5
<210> 46
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 46
Thr Ile Asp Pro Glu Thr Gly Gly Thr Ala Tyr Asn Gln Lys Phe Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 47
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 47
Arg Gly Lys Tyr Gly Asn Tyr Asp Tyr Val Met Asp Tyr
1 5 10
<210> 48
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 48
Arg Ala Ser Gly Asn Ile His Asn Tyr Leu Ala
1 5 10
<210> 49
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 49
Asn Ala Lys Thr Leu Ala Asp
1 5
<210> 50
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 50
Gln His Phe Trp Ser Thr Pro Trp Thr
1 5
<210> 51
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 51
Asp Tyr Trp Met Asn
1 5
<210> 52
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 52
Gln Ile Arg Asn Lys Pro Tyr Asn Tyr Glu Thr His Tyr Ser Asp Ser
1 5 10 15
Val Lys Gly
<210> 53
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 53
Thr Phe Ala Tyr
1
<210> 54
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 54
Gly Thr Ser Glu Asn Ile Tyr Gly Gly Leu Asn
1 5 10
<210> 55
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 55
Gly Ala Thr Asn Leu Ala Asp
1 5
<210> 56
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 56
Gln Asn Val Leu Ser Thr Pro Tyr Thr
1 5
<210> 57
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 57
Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr Glu Met His
1 5 10
<210> 58
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 58
Asp Pro Glu Thr Gly Gly
1 5
<210> 59
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 59
Arg Gly Lys Tyr Gly Asn Tyr Asp Tyr Val Met Asp Tyr
1 5 10
<210> 60
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 60
Arg Ala Ser Gly Asn Ile His Asn Tyr Leu Ala
1 5 10
<210> 61
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 61
Asn Ala Lys Thr Leu Ala Asp
1 5
<210> 62
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 62
Gln His Phe Trp Ser Thr Pro Trp Thr
1 5
<210> 63
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 63
Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr Trp Met Asn
1 5 10
<210> 64
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 64
Arg Asn Lys Pro Tyr Asn Tyr Glu
1 5
<210> 65
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 65
Thr Phe Ala Tyr
1
<210> 66
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 66
Gly Thr Ser Glu Asn Ile Tyr Gly Gly Leu Asn
1 5 10
<210> 67
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 67
Gly Ala Thr Asn Leu Ala Asp
1 5
<210> 68
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 68
Gln Asn Val Leu Ser Thr Pro Tyr Thr
1 5
<210> 69
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 69
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Thr Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Glu Met His Trp Val Lys Gln Thr Pro Val His Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Val Ile Asp Pro Glu Thr Gly Gly Thr Ala Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Arg Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg Gly Thr Thr Val Val Gly Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Thr Leu Thr Val Ser Ser
115
<210> 70
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 70
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Glu Ser Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gly Asn Ile His Asn Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Gln Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Val
35 40 45
Tyr Lys Glu Lys Thr Leu Thr Asp Thr Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Ser Leu Lys Ile Asn Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Gly Ser Tyr Tyr Cys Gln His Phe Trp Ser Thr Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Asn Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 71
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 71
Asp Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Thr Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Thr Ile Ser Arg Gly Gly Gly Tyr Thr Ser Tyr Pro Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Ser Ser Leu Gln Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Asp Tyr Gly Ser Ser Tyr Val His Trp Phe Ala Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala
115 120
<210> 72
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 72
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Gly Glu Asn Ile Tyr Ser Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Gln Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Val
35 40 45
Tyr Asn Ala Arg Thr Leu Ala Glu Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Ser Leu Lys Ile Asn Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Gly Ser Tyr Tyr Cys Gln His His Tyr Gly Ser Pro Arg
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 73
<211> 141
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 73
Met Glu Trp Ser Trp Val Phe Leu Phe Leu Leu Ser Val Ile Ala Gly
1 5 10 15
Val Gln Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg
20 25 30
Pro Gly Ala Ser Val Thr Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe
35 40 45
Thr Asp Tyr Glu Met His Trp Val Lys Gln Thr Pro Val His Gly Leu
50 55 60
Glu Trp Ile Gly Thr Ile Asp Pro Glu Thr Gly Gly Thr Ala Tyr Asn
65 70 75 80
Gln Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Thr Asp Lys Ser Ser Ser
85 90 95
Thr Ala Tyr Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val
100 105 110
Tyr Tyr Cys Thr Arg Arg Gly Lys Tyr Gly Asn Tyr Asp Tyr Val Met
115 120 125
Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
130 135 140
<210> 74
<211> 127
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 74
Met Ser Val Leu Thr Gln Val Leu Ala Leu Leu Leu Leu Trp Leu Thr
1 5 10 15
Gly Ala Arg Cys Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser
20 25 30
Ala Ser Val Gly Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gly Asn
35 40 45
Ile His Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Gln Gly Lys Ser Pro
50 55 60
Gln Leu Leu Val Phe Asn Ala Lys Thr Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser
65 70 75 80
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Tyr Ser Leu Lys Ile Asn
85 90 95
Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Gly Asn Tyr Tyr Cys Gln His Phe Trp
100 105 110
Ser Thr Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
115 120 125
<210> 75
<211> 134
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 75
Met Tyr Leu Gly Leu Ser Cys Val Phe Ile Val Phe Leu Leu Lys Gly
1 5 10 15
Val Gln Cys Glu Val Lys Leu Asp Glu Thr Gly Gly Gly Leu Val Gln
20 25 30
Pro Gly Arg Pro Met Lys Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Phe
35 40 45
Ser Asp Tyr Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ser Pro Glu Lys Gly Leu
50 55 60
Glu Trp Val Ala Gln Ile Arg Asn Lys Pro Tyr Asn Tyr Glu Thr His
65 70 75 80
Tyr Ser Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser
85 90 95
Lys Ser Ser Val Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Arg Gly Glu Asp Met
100 105 110
Gly Ile Tyr Tyr Cys Thr Gly Thr Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
115 120 125
Leu Val Thr Val Ser Ala
130
<210> 76
<211> 126
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 76
Met Gly Val Pro Thr Gln Leu Leu Leu Leu Trp Leu Thr Val Val Val
1 5 10 15
Val Arg Cys Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Thr Ser Leu Ser Ala
20 25 30
Ser Val Gly Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys Gly Thr Ser Glu Asn Ile
35 40 45
Tyr Gly Gly Leu Asn Trp Tyr Gln Arg Lys Gln Gly Lys Ser Pro Gln
50 55 60
Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Thr Asn Leu Ala Asp Gly Met Ser Ser Arg
65 70 75 80
Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Arg Gln Tyr Ser Leu Lys Ile Ser Ser
85 90 95
Leu His Pro Asp Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Asn Val Leu Ser
100 105 110
Thr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
115 120 125

Claims (42)

1.与细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA4)结合的抗体或其抗原结合片段，其包含：
重链可变区(VH)，所述重链可变区(VH)包含互补决定区(CDRs)1、2和3，其中VH CDR1区包含与所选VH CDR1氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列，VH CDR2区包含与所选VH CDR2氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列，并且VH CDR3区包含与所选VHCDR3氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列；以及
轻链可变区(VL)，所述轻链可变区(VL)包含CDR 1、2和3，其中VL CDR1区包含与所选VLCDR1氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列，VLCDR2区包含与所选VL CDR2氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列，并且VLCDR3区包含与所选VL CDR3氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列；
其中所述所选VH CDR 1、2和3氨基酸序列以及所述所选VL CDR 1、2和3氨基酸序列是以下之一：
(1)所述所选VH CDR 1、2、3氨基酸序列分别在SEQ ID NO:1、2、3中示出，并且所述所选VL CDR 1、2、3氨基酸序列分别在SEQ ID NO:4、5、6中示出；
(2)所述所选VH CDR 1、2、3氨基酸序列分别在SEQ ID NO:7、8、9中示出，并且所述所选VL CDR 1、2、3氨基酸序列分别在SEQ ID NO:10、11、12中示出；
(3)所述所选VH CDR 1、2、3氨基酸序列分别在SEQ ID NO:45、46、47中示出，并且所述所选VL CDR 1、2、3氨基酸序列分别在SEQ ID NO:48、49、50中示出；
(4)所述所选VH CDR 1、2、3氨基酸序列分别在SEQ ID NO:51、52、53中示出，并且所述所选VL CDR 1、2、3氨基酸序列分别在SEQ ID NO:54、55、56中示出。
2.权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述VH包含分别具有SEQ ID NO:1、2和3中所示氨基酸序列的CDR 1、2、3，并且所述VL包含分别具有SEQ ID NO:4、5和6中所示氨基酸序列的CDR 1、2、3。
3.权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述VH包含分别包含SEQ ID NO:7、8和9中所示氨基酸序列的CDR 1、2、3，并且所述VL包含分别包含SEQ ID NO:10、11和12中所示氨基酸序列的CDR 1、2、3。
4.权利要求1至3中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段与人CTLA4特异性结合。
5.权利要求1至4中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段是人源化的抗体或其抗原结合片段。
6.权利要求1至5中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段是单链可变片段(scFV)。
7.一种核酸，其包含编码多肽的多核苷酸，所述多肽包含：
(1)包含重链可变区(VH)的免疫球蛋白重链或其片段，所述重链可变区(VH)包含分别包含SEQ ID NO:1、2和3中所示氨基酸序列的互补决定区(CDR)1、2和3，并且其中所述VH在与包含SEQ ID NO:18、19、20或70中所示氨基酸序列的轻链可变区(VL)配对时与CTLA4结合；
(2)包含VL的免疫球蛋白轻链或其片段，所述VL包含分别包含SEQ ID NO:4、5和6中所示氨基酸序列的CDR 1、2和3，并且其中所述VL在与包含SEQ ID NO:13、14、15、16、17或69中所示氨基酸序列的VH配对时与CTLA4结合；
(3)包含重链可变区(VH)的免疫球蛋白重链或其片段，所述重链可变区(VH)包含分别包含SEQ ID NO:7、8和9中所示氨基酸序列的CDR 1、2和3，并且其中所述VH在与包含SEQ IDNO:25、26、27、28或72中所示氨基酸序列的轻链可变区(VL)配对时与CTLA4结合；或者
(4)包含VL的免疫球蛋白轻链或其片段，所述VL包含分别包含SEQ ID NO:10、11和12中所示氨基酸序列的CDR 1、2和3，并且其中所述VL在与包含SEQ ID NO:21、22、23、24或71中所示氨基酸序列的VH配对时与CTLA4结合；
(5)包含重链可变区(VH)的免疫球蛋白重链或其片段，所述重链可变区(VH)包含分别包含SEQ ID NO:45、46和47中所示氨基酸序列的CDR 1、2和3，并且其中所述VH在与包含SEQID NO:74中所示氨基酸序列的轻链可变区(VL)配对时与CTLA4结合；
(6)包含VL的免疫球蛋白轻链或其片段，所述VL包含分别包含SEQ ID NO:48、49和50中所示氨基酸序列的CDR 1、2和3，并且其中所述VL在与包含SEQ ID NO:73中所示氨基酸序列的VH配对时与CTLA4结合；
(7)包含重链可变区(VH)的免疫球蛋白重链或其片段，所述重链可变区(VH)包含分别包含SEQ ID NO:51、52和53中所示氨基酸序列的CDR 1、2和3，并且其中所述VH在与包含SEQID NO:76中所示氨基酸序列的轻链可变区(VL)配对时与CTLA4结合；
(8)包含VL的免疫球蛋白轻链或其片段，所述VL包含分别包含SEQ ID NO:54、55和56中所示氨基酸序列的CDR 1、2和3，并且其中所述VL在与包含SEQ ID NO:75中所示氨基酸序列的VH配对时与CTLA4结合。
8.权利要求7所述的核酸，其中所述核酸包含编码多肽的多核苷酸，所述多肽包含含有VH的免疫球蛋白重链或其片段，所述VH包含分别包含SEQ ID NO:1、2和3中所示氨基酸序列的CDR 1、2和3。
9.权利要求7所述的核酸，其中所述核酸包含编码多肽的多核苷酸，所述多肽包含含有VL的免疫球蛋白轻链或其片段，所述VL包含分别包含SEQ ID NO:4、5和6中所示氨基酸序列的CDR 1、2和3。
10.权利要求7所述的核酸，其中所述核酸包含编码多肽的多核苷酸，所述多肽包含含有VH的免疫球蛋白重链或其片段，所述VH包含分别包含SEQ ID NO:7、8和9中所示氨基酸序列的CDR 1、2和3。
11.权利要求7所述的核酸，其中所述核酸包含编码多肽的多核苷酸，所述多肽包含含有VL的免疫球蛋白轻链或其片段，所述VL包含分别包含SEQ ID NO:10、11和12中所示氨基酸序列的CDR 1、2和3。
12.权利要求7至11中任一项所述的核酸，其中所述VH在与VL配对时与人CTLA4特异性结合，或者所述VL在与VH配对时与人CTLA4特异性结合。
13.权利要求7至12中任一项所述的核酸，其中所述免疫球蛋白重链或其片段是人源化的免疫球蛋白重链或其片段，并且所述免疫球蛋白轻链或其片段是人源化的免疫球蛋白轻链或其片段。
14.权利要求7至13中任一项所述的核酸，其中所述核酸编码单链可变片段(scFv)。
15.权利要求7至14中任一项所述的核酸，其中所述核酸是cDNA。
16.一种载体，其包含权利要求7至15中任一项所述的一种或更多种核酸。
17.一种载体，其包含权利要求7至15中任一项所述核酸的两种，其中所述载体编码VL区和VH区，所述VL区和VH区一起结合CTLA4。
18.载体对，其中每个载体包含权利要求7至15中任一项所述的一种核酸，其中所述载体对一起编码VL区和VH区，所述VL区和VH区一起结合CTLA4。
19.一种细胞，其包含权利要求16或17所述的载体或权利要求19所述的载体对。
20.权利要求19所述的细胞，其中所述细胞是CHO细胞。
21.一种细胞，其包含权利要求7至15中任一项所述的一种或更多种核酸。
22.一种细胞，其包含权利要求7至15中任一项所述核酸的两种。
23.权利要求22所述的细胞，其中所述两种核酸一起编码VL区和VH区，所述VL区和VH区一起结合CTLA4。
24.产生抗体或其抗原结合片段的方法，所述方法包括：
(a)在足以使权利要求19至23中任一项所述的细胞产生所述抗体或抗原结合片段的条件下培养所述细胞；以及
(b)收集由所述细胞产生的所述抗体或抗原结合片段。
25.与CTLA4结合的抗体或其抗原结合片段，其包含：
重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，所述重链可变区(VH)包含与所选VH序列具有至少90％同一性的氨基酸序列，所述轻链可变区(VL)包含与所选VL序列具有至少90％同一性的氨基酸序列，其中所述所选VH序列和所述所选VL序列是以下之一：
(1)所述所选VH序列是SEQ ID NO:13、14、15、16、17或69，并且所述所选VL序列是SEQID NO:18、19、20或70；
(2)所述所选VH序列是SEQ ID NO:21、22、23、24或71，并且所述所选VL序列是SEQ IDNO:25、26、27、28或72；
(3)所述所选VH序列是SEQ ID NO:73，并且所述所选VL序列是SEQ ID NO:74；
(4)所述所选VH序列是SEQ ID NO:75，并且所述所选VL序列是SEQ ID NO:76。
26.权利要求25所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述VH包含SEQ ID NO:13的序列，并且所述VL包含SEQ ID NO:19的序列。
27.权利要求25所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述VH包含SEQ ID NO:14的序列，并且所述VL包含SEQ ID NO:19的序列。
28.权利要求25所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述VH包含SEQ ID NO:21的序列，并且所述VL包含SEQ ID NO:25的序列。
29.权利要求25所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述VH包含SEQ ID NO:22的序列，并且所述VL包含SEQ ID NO:25的序列。
30.权利要求25至29中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段与人CTLA4特异性结合。
31.权利要求25至30中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段是人源化的抗体或其抗原结合片段。
32.权利要求25至31中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段是单链可变片段(scFV)。
33.抗体-药物缀合物，其包含与治疗剂共价结合的权利要求1至6和25至32中任一项所述的抗体或其抗原结合片段。
34.权利要求33所述的抗体药物缀合物，其中所述治疗剂是细胞毒性剂或细胞抑制剂。
35.治疗患有癌症的对象的方法，所述方法包括向所述对象施用治疗有效量的组合物，所述组合物包含权利要求1至6和25至32中任一项所述的抗体或其抗原结合片段、或者权利要求33或34所述的抗体-药物缀合物。
36.权利要求35所述的方法，其中所述癌症是黑色素瘤。
37.权利要求35所述的方法，其中所述癌症是不可切除的黑色素瘤或转移性黑色素瘤。
38.权利要求35所述的方法，其中所述癌症是非小细胞肺癌(NSCLC)、小细胞肺癌(SCLC)、膀胱癌或转移性激素难治性前列腺癌。
39.一种降低肿瘤生长速率的方法，所述方法包括：
使肿瘤细胞与有效量的组合物接触，所述组合物包含权利要求1至6和25至32中任一项所述的抗体或其抗原结合片段、或者权利要求33或34所述的抗体-药物缀合物。
40.杀伤肿瘤细胞的方法，所述方法包括：
使肿瘤细胞与有效量的组合物接触，所述组合物包含权利要求1至6和25至32中任一项所述的抗体或其抗原结合片段、或者权利要求33或34所述的抗体-药物缀合物。
41.一种药物组合物，其包含权利要求1至6和25至32中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，以及可药用载体。
42.一种药物组合物，其包含权利要求33或34所述的抗体药物缀合物，以及可药用载体。
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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111789954A (zh) * 2020-09-08 2020-10-20 北京百奥赛图基因生物技术有限公司 延缓衰老的方法和药物
CN112921005A (zh) * 2021-04-14 2021-06-08 中国农业科学院兰州兽医研究所 一株杂交瘤细胞株及其产生的犬细小病毒vp2蛋白单克隆抗体和应用
WO2023066401A1 (zh) * 2021-10-21 2023-04-27 江苏诺迈博生物医药科技有限公司 一种特异性结合人ctla4的抗体及包含其的药物和试剂盒

Families Citing this family (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EA201991383A1 (ru) 2016-12-07 2019-12-30 Эйдженус Инк. Антитела против ctla-4 и способы их применения
EP3713958A4 (en) * 2017-11-24 2021-11-03 Eucure (Beijing) Biopharma Co., Ltd ANTI-OX40 ANTIBODIES AND USES THEREOF
JP2022514702A (ja) 2018-12-21 2022-02-14 オーエスイー・イミュノセラピューティクス 二機能性抗ｐｄ－１／ｉｌ－７分子
WO2020165374A1 (en) 2019-02-14 2020-08-20 Ose Immunotherapeutics Bifunctional molecule comprising il-15ra
WO2021098851A1 (en) * 2019-11-20 2021-05-27 Eucure (Beijing) Biopharma Co., Ltd Anti-ctla4/ox40 bispecific antibodies and uses thereof
AU2020406083A1 (en) 2019-12-17 2022-06-16 Ose Immunotherapeutics Bifunctional molecules comprising an IL-7 variant
WO2022112198A1 (en) 2020-11-24 2022-06-02 Worldwide Innovative Network Method to select the optimal immune checkpoint therapies
WO2022169269A1 (ko) * 2021-02-03 2022-08-11 주식회사 유틸렉스 항 ctla-4 항체 및 이의 용도
IL307419A (en) 2021-04-09 2023-12-01 Ose Immunotherapeutics A new scaffold for bifunctional molecules with improved properties
EP4320156A1 (en) 2021-04-09 2024-02-14 Ose Immunotherapeutics Scaffold for bifunctioanl molecules comprising pd-1 or cd28 and sirp binding domains
WO2023235504A2 (en) * 2022-06-01 2023-12-07 Syncromune, Inc. A method for the treatment of cancer via tumor cell lysis and intratumoral administration of combinations of immunotherapeutic ingredients
WO2024003360A1 (en) 2022-07-01 2024-01-04 Institut Curie Biomarkers and uses thereof for the treatment of neuroblastoma
WO2024028386A1 (en) 2022-08-02 2024-02-08 Ose Immunotherapeutics Multifunctional molecule directed against cd28
WO2024049203A1 (ko) * 2022-09-02 2024-03-07 주식회사 시클리드 항 ctla-4 모노클로날 항체 및 이의 용도
WO2024088424A1 (zh) * 2022-10-28 2024-05-02 嘉和生物药业有限公司 新型抗ctla4抗体

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1802388A (zh) * 2003-05-09 2006-07-12 杜克大学 Cd20特异抗体及使用它们的方法
CN103547595A (zh) * 2011-03-09 2014-01-29 安迪拓普有限公司 人源化ctla-4抗体
CN105296433A (zh) * 2014-08-01 2016-02-03 中山康方生物医药有限公司 一种ctla4抗体、其药物组合物及其用途
WO2016196237A1 (en) * 2015-05-29 2016-12-08 Agenus Inc. Anti-ctla-4 antibodies and methods of use thereof
US20170226211A1 (en) * 2016-05-10 2017-08-10 Agency For Science, Technology And Research Anti-ctla-4 antibodies

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2346702C2 (ru) 2004-03-26 2009-02-20 Пфайзер Продактс Инк. Применение антител к ctla-4
JP2009111655A (ja) * 2007-10-30 2009-05-21 Alaxala Networks Corp ネットワーク管理システム
US20180296561A1 (en) * 2015-10-07 2018-10-18 The University Of North Carolina At Chapel Hill The Methods For Treatment Of Tumors
WO2021098851A1 (en) * 2019-11-20 2021-05-27 Eucure (Beijing) Biopharma Co., Ltd Anti-ctla4/ox40 bispecific antibodies and uses thereof
KR20230005841A (ko) * 2020-04-26 2023-01-10 바이오사이토젠 파마슈티컬스 (베이징) 컴퍼니 리미티드 변형된 면역글로불린

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1802388A (zh) * 2003-05-09 2006-07-12 杜克大学 Cd20特异抗体及使用它们的方法
CN103547595A (zh) * 2011-03-09 2014-01-29 安迪拓普有限公司 人源化ctla-4抗体
CN105296433A (zh) * 2014-08-01 2016-02-03 中山康方生物医药有限公司 一种ctla4抗体、其药物组合物及其用途
WO2016196237A1 (en) * 2015-05-29 2016-12-08 Agenus Inc. Anti-ctla-4 antibodies and methods of use thereof
US20170226211A1 (en) * 2016-05-10 2017-08-10 Agency For Science, Technology And Research Anti-ctla-4 antibodies

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111789954A (zh) * 2020-09-08 2020-10-20 北京百奥赛图基因生物技术有限公司 延缓衰老的方法和药物
CN112921005A (zh) * 2021-04-14 2021-06-08 中国农业科学院兰州兽医研究所 一株杂交瘤细胞株及其产生的犬细小病毒vp2蛋白单克隆抗体和应用
CN112921005B (zh) * 2021-04-14 2023-07-07 中国农业科学院兰州兽医研究所 一株杂交瘤细胞株及其产生的犬细小病毒vp2蛋白单克隆抗体和应用
WO2023066401A1 (zh) * 2021-10-21 2023-04-27 江苏诺迈博生物医药科技有限公司 一种特异性结合人ctla4的抗体及包含其的药物和试剂盒

Also Published As

Publication number Publication date
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